專利名稱：一種山羊scd基因重組腺病毒載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種山羊S⑶基因重組腺病毒載體的構(gòu)建方 法。
背景技術(shù)：
腺病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高、感染細(xì)胞范圍廣、病毒滴度高等優(yōu)點(diǎn)，可感染處于細(xì) 胞周期中的靜止期和分裂期細(xì)胞，同時(shí)可介導(dǎo)基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移，是一種高效的基因轉(zhuǎn)移 載體。構(gòu)建重組腺病毒載體并在293細(xì)胞中包裝成熟病毒顆粒是應(yīng)用腺病毒作為媒介表達(dá) 目標(biāo)基因的前提。綠色熒光蛋白(GFP)是試驗(yàn)中廣泛應(yīng)用的一種蛋白指示劑，可作為觀察 測定病毒感染和外源基因表達(dá)水平以及檢測生物安全和載體示蹤的標(biāo)記蛋白。SCD是一種膜結(jié)合蛋白，在牛、小鼠及人上的結(jié)構(gòu)基本一致。目前，多個(gè)物種的 S⑶基因相繼被分離，包括人、小鼠、大鼠、豬、雞、綿羊和山羊等。山羊S⑶基因CDNA全長 5123bp，包含1080bp的開放閱讀框，編碼359個(gè)氨基酸，有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，位于 山羊染色體26q21區(qū)域。S⑶基因一共發(fā)現(xiàn)存在5種亞型，在脂質(zhì)代謝中具有重要意義，對(duì) 體內(nèi)三酰甘油、膽固醇酯、磷脂和蠟酯等的合成起關(guān)鍵作用，SCD的調(diào)控對(duì)維持機(jī)體正常生 理狀態(tài)和體內(nèi)脂質(zhì)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定意義重大。SCD的表達(dá)及活性受到多種因素的影響，包括飼 糧的成分、激素的不平衡、動(dòng)物發(fā)育階段、溫度變化、維生素、酚類化合物等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種山羊S⑶基因重組腺病毒載體的構(gòu)建方 法。一種山羊S⑶基因重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:A1，構(gòu)建腺病毒穿 梭載體pAdTrack-CMV-S⑶；A2，重組腺病毒載體Ad_S⑶的構(gòu)建。所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A1具體執(zhí)行以下操作All，連接反應(yīng)將pGEM-T-SCD質(zhì)粒和pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Kpn I/Xho I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系為50 y L ；瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收純化SCD小片 段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度計(jì)測定產(chǎn)物濃度，用T4 DNA連接酶于16°C連接 過夜；A12，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定取All所得的連接產(chǎn)物10 ii L加入到含T0P10感受態(tài) 細(xì)菌的離心管中，輕吹混勻，冰浴30min，42°C水浴熱激90s，快速轉(zhuǎn)移至冰上l-2min，加入 800 u L無抗性LB培養(yǎng)液，37°C溫和震蕩培養(yǎng)45min ；取適量菌液涂布于卡那霉素抗性的LB 平板上，37°C孵育過夜；挑取小的單克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中搖 菌12-14h、200r/min，提取質(zhì)粒，凝膠電泳檢測后，進(jìn)行Kpn I/Xho I雙酶切鑒定。所述的構(gòu)建方法，所述步驟All連接反應(yīng)體系為回收S⑶片段，7.0 PL;回收 pAdTrack-CMV 片段，10. Oil L ； 10 XT4DNA Ligase Buffer, 2. 0 u L ；T4 DNA 連接酶，1. 0 ii L ; 總體積20. Ou L0
所述的構(gòu)建方法，所述步驟A2具體執(zhí)行以下操作A21，制備含骨架載體 pAdEasy-Ι的感受態(tài)BJ5183菌；A22，穿梭載體pAdTrack-CMV_SCD的Pme I酶切線性化； A23，同源重組。所述的構(gòu)建方法，所述步驟A21具體執(zhí)行以下操作⑴取100μ LBJ5183菌液加 入到5mL無抗性液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 3-0. 4 ； (2)將菌液置冰上冰浴 20min，4°C，4000r/min離心IOmin ； (3)倒掉菌液，將離心管倒置于干凈吸水紙上除去殘液， 加入0. 5mL0. lmol/L CaCl2溶液重懸菌體，補(bǔ)充至20mL，混勻后冰浴20min ； (4) 4°C，4000r/ min離心IOmin,倒掉菌液，加入IOmL 0. lmol/L CaCl2溶液重懸菌體，混勻后冰浴20min ； (5)4°C，4000r/min離心lOmin，倒掉菌液，加入IOmL 0. lmol/L CaCl2溶液重懸菌體，冰浴 20min ； (6)在感受態(tài)菌液中加入終濃度10%的甘油，每管200 μ L分裝后-70°C保存?zhèn)溆谩?br> 所述的構(gòu)建方法，所述步驟A22具體執(zhí)行以下操作將鑒定正確的重組穿梭載體 pAdTrack-CMV-SCD質(zhì)粒用Pme I酶切線性化，反應(yīng)體系如下10 X NEB Buffer 4，5. 0 μ L ； 質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-SCD，彡 2 μ g ； 100 X BSA, 0. 5 μ L ；Pme I 酶，1. 0 μ L ；余量 dd H2O 至總體 積 50. 0 μ L0所述的構(gòu)建方法，所述步驟Α23具體執(zhí)行以下操作將穿梭載體 PAdTrack-CMV-S⑶的Pme I酶切線性化產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι的大 腸桿菌BJ5183，進(jìn)行同源重組；而后接種于含卡那抗性的LB平板上，37°C孵育過夜，通過平 板初步篩選鑒定具有重組子的菌落，進(jìn)行小量培養(yǎng)后，制備質(zhì)粒DNA，用內(nèi)切酶Pac I酶切鑒定。所述的構(gòu)建方法，Pac I反應(yīng)體系如下表10XNEB Buffer 1，2. OyL;重組質(zhì)粒 Ad-SCD, ^ l.Oyg ； 100XBSA，0. 2 μ L ；Pac 1,0. 5μ L ；余量 dd H2O 至總體積 20. 0 μ L ；酶切 反應(yīng)條件放置37°C水浴酶切16h ；的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將pAdEasy-Ι病毒骨架先轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183，再用酶切線性化的穿梭載體 PAdTrack-CMV-S⑶轉(zhuǎn)化BJ5183進(jìn)行同源重組，大大降低了非重組的穿梭質(zhì)粒的背景，提高 了成功率。另外，在設(shè)計(jì)引物時(shí)引入需要的酶切位點(diǎn)可使基因定向克隆的程序簡化，本發(fā) 明在引物的上下游分別引入KpnI和Xho I酶切位點(diǎn)，使目的基因按正確的方向插入穿梭載 體，并與骨架載體同源重組，成功構(gòu)建了重組腺病毒載體。本發(fā)明選用的腺病毒系統(tǒng)是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架，穿梭 載體PAdTrack-CMV攜帶有報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP，非常直觀簡便。首先構(gòu)建含有SCD 基因和GFP基因的穿梭載體pAdTrack-CMV-S⑶，然后將穿梭載體與腺病毒骨架pAdEasy-1 載體在大腸桿菌BJ5183 (重組酶缺陷型大腸桿菌)中同源重組，獲得S⑶基因和GFP基因 共表達(dá)的重組腺病毒載體Ad-S⑶，為進(jìn)一步在細(xì)胞和個(gè)體水平上研究S⑶基因?qū)χ舅岷?成代謝的調(diào)控作用提供試驗(yàn)材料。通過對(duì)SCD基因過表達(dá)，將可能引起乳腺或其它組織合 成脂肪酸含量及組成的改變，進(jìn)而提高山羊乳及其產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。


圖 1 為 pAdTrack-CMV-SCD 酶切鑒定，其中 Ml λ -Hind III digest DNAMarker ； 1,2 pAdTrack-CMV-SCD 酶切產(chǎn)物；M2 :D 2000 Marker ；圖 2pAd-SCD 酶切鑒定，其中 M λ-Hind III digest DNA Marker ； 1-4 Ad-SCD 酶切產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。1. 1. 1腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-SCD的構(gòu)建 1.1. 1.1 連接反應(yīng)由于目的基因片段兩端帶有Kpn I與Xho I酶切位點(diǎn)，將pGEM_T_S⑶質(zhì)粒和 PAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Kpn I/Xho I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系為50 μ L。1 %瓊脂 糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收純化SCD小片段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度 計(jì)測定產(chǎn)物濃度，用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，連接反應(yīng)體系如下表 1. 1. 1. 2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定取上述連接產(chǎn)物10 μ L加入到含Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)菌的離心管中，輕吹混勻，冰浴 30min, 42°C水浴熱激90s，快速轉(zhuǎn)移至冰上l-2min，加入800 μ L無抗性LB培養(yǎng)液，37°C溫 和震蕩培養(yǎng)45min。取適量菌液涂布于卡那霉素抗性(1 1000)的LB平板上，37°C孵育 過夜。挑取小的單克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性(1 1000)的液體LB培養(yǎng)基中搖菌 12-14h(200r/min)，提取質(zhì)粒，凝膠電泳檢測后，進(jìn)行Kpn I/Xho I雙酶切鑒定，從鑒定正確 的質(zhì)粒中選取2管，轉(zhuǎn)化感受態(tài)T0P10擴(kuò)增，并送測序。1. 1. 2重組腺病毒載體Ad-S⑶的構(gòu)建1. 1. 2. 1感受態(tài)BJ5183菌(含骨架載體pAdEasy-Ι)的制備BJ5183感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如下(1)取100 μ L BJ5183菌液加入到5mL無抗性液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至 OD600 = 0. 3-0. 4 ；(2)將菌液置冰上冰浴 20min, 4°C，4000r/min 離心 IOmin ；(3)倒掉菌液，將離心管倒置于干凈吸水紙上除去殘液，加入0. 5mL0. lmol/L CaCl2溶液重懸菌體，補(bǔ)充至20mL，混勻后冰浴20min ；(4) 40C，4000r/min 離心 lOmin，倒掉菌液，加入 IOmL 0. lmol/LCaCl2 溶液重懸菌 體，混勻后冰浴20min ；(5) 40C，4000r/min 離心 lOmin，倒掉菌液，加入 IOmL 0. lmol/LCaCl2 溶液重懸菌 體，冰浴20min ；(6)在感受態(tài)菌液中加入終濃度10%的甘油，每管200 μ L分裝后_70°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2. 2 穿梭載體 pAdTrack-CMV-SCD 的 Pme I 酶切線性化
將鑒定正確的重組穿梭載體pAdTrack-CMV-S⑶質(zhì)粒用Pme I酶切線性化，反應(yīng)體 系如下表試齊[J Reagent使用 Volume 10XNEB Buffer 45. 0 μ L質(zhì)粒pAdTrack-CMV-SCD 彡 2 μ g100 X BSA0. 5 μ LPme I 酶l.OyLdd H2OUp to 50. 0 μ L酶切反應(yīng)條件37°C溫浴16h。1. 1. 2. 3 同源重組將穿梭載體pAdTrack-CMV-S⑶的Pme I酶切線性化產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化含腺病毒骨 架載體pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183，進(jìn)行同源重組；而后接種于含卡那抗性(1 1000) 的LB平板上，37°C孵育過夜，通過平板初步篩選鑒定具有重組子的菌落，進(jìn)行小量培養(yǎng)后 (3mL含卡那抗性的液體LB培養(yǎng)基中搖菌12-14h)，制備質(zhì)粒DNA，用內(nèi)切酶Pac I酶切鑒定。Pac I反應(yīng)體系如下表試劑 Reagent使用量 Volume10XNEB Buffer 12. 0μ L重組質(zhì)粒Ad-SCD 彡 1. 0 μ g100 X BSA0. 2 μ LPac I0. 5 μ Ldd H2OUp to 20. 0 μ L酶切反應(yīng)條件放置37°C水浴酶切16h ；的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。從鑒定正確 的質(zhì)粒中選取2管，轉(zhuǎn)化感受態(tài)T0P10擴(kuò)增，同時(shí)送陽性克隆測序二次鑒定。1. 2結(jié)果與分析1. 2. 1腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-SCD的構(gòu)建取重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-SCD用Kpn I/Xho I雙酶切鑒定，切下約1. Ikb的目的 條帶和9kb的pAdTrack-CMV空載體兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(如圖1所示)。測序結(jié)果顯 示，腺病毒穿梭載體中所插入的序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，證明pAdTrack-CMV-S⑶重組腺 病毒穿梭載體構(gòu)建成功。1. 2. 2重組腺病毒Ad-S⑶的構(gòu)建取重組腺病毒質(zhì)粒Ad-S⑶用Pac I酶切鑒定，切下30kb和4. 5kb兩條帶，與預(yù)期 結(jié)果相符(如圖2所示)。測序結(jié)果顯示，重組腺病毒載體中所插入序列與設(shè)計(jì)序列完全一 致，證明Ad-S⑶重組腺病毒載體構(gòu)建成功。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種山羊SCD基因重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A1，構(gòu)建腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-SCD；A2，重組腺病毒載體Ad-SCD的構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A1具體執(zhí)行以下操作 All,連接反應(yīng)將pGEM-T-SCD質(zhì)粒和pAdTrack_CMV穿梭質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Kpn I/Xho I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系為50 y L ； 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收純化SCD小片段 和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度計(jì)測定產(chǎn)物濃度，用T4 DNA連接酶于16°C連接過 夜；A12，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定取All所得的連接產(chǎn)物10 ii L加入到含T0P10感受態(tài)細(xì) 菌的離心管中，輕吹混勻，冰浴30min，42°C水浴熱激90s，快速轉(zhuǎn)移至冰上l-2min，加入 800 u L無抗性LB培養(yǎng)液，37°C溫和震蕩培養(yǎng)45min ；取適量菌液涂布于卡那霉素抗性的LB 平板上，37°C孵育過夜；挑取小的單克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中搖 菌12-14h、200r/min，提取質(zhì)粒，凝膠電泳檢測后，進(jìn)行Kpn I/Xho I雙酶切鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟All連接反應(yīng)體系為回收 SCD 片段，7.0iiL;回收 pAdTrack-CMV 片段，10.0iiL;10XT4 DNA Ligase Buffer, 2. 0 u L ； T4 DNA 連接酶，1. Ou L ；總體積 20. Ou L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A2具體執(zhí)行以下操作 A21，制備含骨架載體pAdEasy-1的感受態(tài)BJ 5183菌；A22，穿梭載體pAdTrack-CMV_SCD的 Pme I酶切線性化；A23，同源重組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A21具體執(zhí)行以下操作 (1)取100iiL BJ5183菌液加入到5mL無抗性液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0. 3-0. 4 ； (2)將菌液置冰上冰浴20min,4°C,4000r/min離心lOmin ； (3)倒掉菌液，將離心 管倒置于干凈吸水紙上除去殘液，加入0. 5mL 0. lmol/L CaCl2溶液重懸菌體，補(bǔ)充至20mL， 混勻后冰浴 20min ； (4) 4°C, 4000r/min 離心 lOmin,倒掉菌液，加入 10mL 0. lmol/L CaCl2 溶液重懸菌體，混勻后冰浴20min ； (5)4°C,4000r/min離心lOmin,倒掉菌液，加入10mL0.lmol/L CaCl2溶液重懸菌體，冰浴20min ； (6)在感受態(tài)菌液中加入終濃度10%的甘油， 每管200 u L分裝后-70°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A22具體執(zhí)行以下操作 將鑒定正確的重組穿梭載體pAdTrack-CMV-S⑶質(zhì)粒用Pmel酶切線性化，反應(yīng)體系如下 10XNEB Buffer 4，5. 0 ii L ；質(zhì)粒pAdTrack-CMV-SCD，彡 2 ii g ； 100 XBSA，0. 5 ii L ;Pme I 酶，1.Ou L ；余量dd H20至總體積50. Ou L0
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟A23具體執(zhí)行以下操作 將穿梭載體pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切線性化產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架載體 pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183，進(jìn)行同源重組；而后接種于含卡那抗性的LB平板上，37°C孵 育過夜，通過平板初步篩選鑒定具有重組子的菌落，進(jìn)行小量培養(yǎng)后，制備質(zhì)粒DNA，用內(nèi)切 酶Pac I酶切鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，PacI反應(yīng)體系如下表10XNEB Buffer 1，2. Oil L ；重組質(zhì)粒 Ad-SCD，彡 1. 0u g ； 100XBSA,0. 2 u L ；Pac I，0. 5 ii L ；余量 dd H20至總體積20. Oy L ；酶切反應(yīng)條件放置37°C水浴酶切16h ； 1 %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山羊SCD基因重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟A1，構(gòu)建腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-SCD；A2，重組腺病毒載體Ad-SCD的構(gòu)建，通過對(duì)SCD基因過表達(dá)，將可能引起乳腺或其它組織合成脂肪酸含量及組成的改變，進(jìn)而提高山羊乳及其產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。由于采用細(xì)菌重組的方法不僅可以最大程度上避免野生型腺病毒的產(chǎn)生，而且重組成功率較高。另外，本方法不需要進(jìn)行多輪費(fèi)時(shí)的病毒空斑化篩選，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了成功率。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101870987SQ20101020868
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者朱越, 李君 , 林先滋, 滕炎玲, 羅軍, 趙旺生 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)