專利名稱：微生物催化法制備2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物催化法制備2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，以及在生 產(chǎn)過程中用到的新菌株。
背景技術(shù)：
2-氨基-2，3- 二 甲基丁酰胺，英文名 2-amino_2，3_dimethylbutyamide，外觀為白 色片狀晶體，熔點(diǎn)為84°C，能溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑。是咪唑啉酮類超高效除草劑如咪唑 乙煙酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草煙等的通用中間體，市場(chǎng)需求廣闊。其中咪唑乙煙酸和咪唑 喹啉酸曾占據(jù)美國(guó)大豆除草劑市場(chǎng)主導(dǎo)地位達(dá)10年之久；而我國(guó)自從1990年大批量進(jìn)口 咪唑乙煙酸并在黑龍江省大面積應(yīng)用以來，用量持續(xù)增加。特別是在國(guó)內(nèi)該除草劑產(chǎn)品問 世以后，由于其價(jià)格低廉，除草效果良好，故而被大范圍使用，成為黑龍江與內(nèi)蒙古地區(qū)大 豆田除草劑的主導(dǎo)品種。2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺目前主要通過化學(xué)法生產(chǎn)。其生產(chǎn)過程可分為兩個(gè)部 分3_甲基-2-丁酮通過斯特雷克(Strecker)反應(yīng)得到氨基腈，后者在酸或堿催化下水解
得到產(chǎn)物(見下式)。
NaCN
NH4Cl
H2SO4
NH4OH
NH2 O
NH7孫曉紅等(西北大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，24 (3) :227_234)報(bào)道了該氨基腈的合成方法，先 將氯化銨溶于水后，加入氰化鈉和氨水，攪拌均勻后，加少量芐基三乙基氯化銨，滴加甲基 異丙基甲酮，攪拌回流4 6小時(shí)，用二氯甲烷提純后，得無色透明液體，純度為95%，收率 為 90%。Peter J.等(US 6339158)報(bào)道了由2_氨基_2，3_ 二甲基丁腈制備2_氨基_2， 3- 二甲基酰胺的方法，首先加入29. 7ml濃硫酸，慢慢加入11. Sg 2-氨基-2，3- 二甲基丁 腈，保證反應(yīng)體系溫度不超過25°C，加熱至IOCTC并在該溫度下反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后冷卻， 加入85ml濃氨水，過程中控制體系溫度不超過75°C，然后用二氯甲烷萃取、結(jié)晶，最終得 到11.2g 2-氨基-2，3-二甲基酰胺，收率為81.7%。呂曉東等(遼寧化工，2001，30 (10) 455-456)報(bào)道將2-氨基-2，3- 二甲基丁腈在一定的溫度下滴加入95%的濃硫酸中，升溫， 反應(yīng)數(shù)小時(shí)。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，滴加濃氨水中和至弱堿性，加萃取劑，攪拌一定時(shí) 間，過濾，濾出物用萃取劑洗滌，并將洗液合并入濾液。濾液相分離，有機(jī)層蒸出萃取劑，釜 底物加入石油醚，冷凍結(jié)晶，濾出的固體干燥后得到2-氨基-2，3-二甲基酰胺，最終收率為 95%，產(chǎn)物純度達(dá)到96%。由上可知，化學(xué)法生產(chǎn)2-氨基-2，3_二甲基酰胺的主要缺點(diǎn)是反應(yīng)需要高溫、強(qiáng) 酸等條件，能耗原料消耗高，產(chǎn)品易受副產(chǎn)物污染，提純步驟繁瑣，周期長(zhǎng)，收率低，產(chǎn)生大量含腈污水，不符合環(huán)保要求等。腈水合酶(Nitrile Hydratase)是一種在自然界中廣泛存在的微生物酶，它可催 化多種腈化合物水解生成酰胺。微生物腈水合酶可廣泛地應(yīng)用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍 生物的合成。1980 年，Asano 等(Agricultural andBiological Chemistry, 1982,46 (5) 1183-1189)首次發(fā)現(xiàn)微生物Rhodocococcus sp. N-774可降解有毒的乙腈，不久即被成功 地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺。近年來，腈水合酶也被用于制備手性藥物，如Gilligan等 (Applied Microbiology and Biotechnology，1993，39 :720_725)成功地用 Rhodocococcus equi TG328腈水合酶和酰胺酶催化外消旋2_苯基丙腈立體選擇性水解，生成了非留體類 抗炎藥S-(+)-2-苯基丙酸。現(xiàn)有的研究表明，腈水合酶催化的反應(yīng)具有高選擇性、高效性、 條件溫和、環(huán)境污染小、成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，符合原子經(jīng)濟(jì)和綠色化學(xué)的發(fā)展 方向，有著化學(xué)方法無可比擬的優(yōu)越性，從而促進(jìn)了精細(xì)化工產(chǎn)品和手性藥物的研制和開 發(fā)。因此利用腈水合酶的高效性、高選擇性和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)來催化生產(chǎn)2-氨基-2， 3_ 二甲基丁酰胺，將可以提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本和減小環(huán)境污染。據(jù)報(bào)道，α-氨基腈在水溶液中極不穩(wěn)定，容易自發(fā)水解生產(chǎn)HCN和酮(醛)等物 質(zhì)(Engineering in Life Sciences，2004. 4 :547_556)。這些副產(chǎn)物特別是 HCN 是腈水合 酶的強(qiáng)烈抑制劑，它通過與腈水合酶活性中心的金屬離子Fe2+或Co2+絡(luò)合而使腈水合酶失 活。Nagasawa 等(EuropeanJournal of Biochemistry，1991. 196 :581_589) 艮道，作為生 產(chǎn)丙烯酰胺的高效催化劑Rhodococcus rhodochrous Jl生產(chǎn)的腈水合酶，在氰離子濃度為 0. OlmM時(shí)即酶活損失62%。因此篩選得到耐受氰離子的腈水合酶，將有利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生 產(chǎn)2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺，提高產(chǎn)物濃度。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述化學(xué)合成法的缺陷，本發(fā)明提供了一種微生物催化水合2-氨基-2， 3_ 二甲基丁腈制備2-氨基-2，3-二甲基酰胺(ADBA)的方法，及制備過程中所用的新菌株。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種微生物催化法制備2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在 以2-氨基-2，3-二甲基丁腈為底物，以慶笙紅球菌(Rhodococcusqingshengii) CCTCC No :M 2010050、小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC No :M 209214 或紅平紅球菌 (Rhodococcus erythropolis)CCTCCNo =M 209244發(fā)酵產(chǎn)生的腈水合酶為催化劑的反應(yīng)體 系中，于PH6.0 10.0、20 40°C下進(jìn)行催化水合反應(yīng)，制得所述的2-氨基-2，3-二甲基 丁酰胺。所述腈水合酶存在于菌體細(xì)胞中，具體制備時(shí)，可直接將發(fā)酵獲得的含菌體細(xì)胞 的發(fā)酵液作為催化劑參與反應(yīng)，也可以將菌體細(xì)胞分離后，作為催化劑參與反應(yīng)，所述腈水 合酶用于催化2-氨基-2，3- 二甲基丁腈制備2-氨基-2，3- 二甲基酰胺的反應(yīng)原理如下列
反應(yīng)式所示
所述反應(yīng)在水或pH6. 0 10. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、 Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進(jìn)行。所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為0.03 0.3M。反應(yīng)過程中，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?0. OlM時(shí)，可以繼續(xù)補(bǔ)入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈至濃度為0. 03 0. 3M，以達(dá)到連續(xù) 生產(chǎn)的效果。優(yōu)選的，所述腈水合酶來自慶笙紅球菌CCTCC No =M 2010050、小球諾卡氏菌CCTCC No =M 209214或紅平紅球菌CCTCC No =M 209244經(jīng)發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞，所述含酶菌 體細(xì)胞在反應(yīng)體系中添加量以含酶細(xì)胞濕重計(jì)為5 50g/L。所述含酶菌體細(xì)胞可由上述 三種菌株在適用于菌種慶笙紅球菌、小球諾卡氏菌和紅平紅球菌的培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng) 獲得。所述適用于本發(fā)明慶笙紅球菌、小球諾卡氏菌和紅平紅球菌培養(yǎng)基，可以是一些含有 可以被慶笙紅球菌、小球諾卡氏菌和紅平紅球菌利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的常規(guī)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中 合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無機(jī)鹽等。作為碳源的有蔗糖、葡萄糖、乳糖、 檸檬酸鈉、淀粉；作為氮源的有酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉、玉米漿、銨鹽等；另可 加入氨基酸類(如甘氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸等)、維生素(如 VBi、VB2、VB12、Ve、VE、煙酸等)、核酸類(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用1. OM HCl或NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值為6. 0 8. 0。為提高產(chǎn)酶效率，可在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑可為 下列之一谷氨酸鈉、2，2_ 二甲基環(huán)丙甲酰胺、己內(nèi)酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺、尿素。發(fā)酵培 養(yǎng)可以是搖瓶培養(yǎng)或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)；可以在搖瓶中進(jìn)行也可以在發(fā)酵罐中進(jìn)行。搖瓶培養(yǎng)在三角搖瓶中分別裝入適量的種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基(10 40%， ν/ν)，121°C滅菌20min。用接種環(huán)挑入一定量的斜面菌種，接入種子培養(yǎng)基中，于20 40°C 下培養(yǎng)24 48h，獲得種子液；將種子液以2. 5%體積比接入含誘導(dǎo)劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 20 40°C，轉(zhuǎn)速100 300rpm下培養(yǎng)48 96h，獲得含腈水合酶的發(fā)酵液。發(fā)酵罐培養(yǎng)在5L種子罐中裝入適量的發(fā)酵培養(yǎng)基(30 65%，v/v)，實(shí)罐消毒 后接入一定量的斜面菌種，在溫度20 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速100 300rpm下培養(yǎng)24 48h， 得到種子液；在50L發(fā)酵罐中裝入適量的產(chǎn)酶培養(yǎng)基(30 65%，ν/ν)，實(shí)罐消毒后接入 2. 5%體積比的種子液，在通氣比0. 1 1.0 1(每分鐘內(nèi)通過的空氣體積與培養(yǎng)液體積 之比)，溫度20 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速100 300rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48 96h，獲得含 腈水合酶的發(fā)酵液。得到菌體培養(yǎng)液后可采用離心或過濾等方式分離出菌體細(xì)胞，利用該濕菌體或固 定化細(xì)胞或從該細(xì)胞中破碎分離出的腈水合酶催化2-氨基-2，3- 二甲基丁腈制備2-氨 基-2，3-二甲基丁酰胺。發(fā)酵液在12000rpm、4°C條件下離心，棄上清，細(xì)胞用0. 9%生理鹽水洗滌后再離 心收集菌體；或者發(fā)酵液用膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾分離，并加入2倍發(fā)酵液體積的0. 9%生理 鹽水洗滌，收集菌體。其中的膜過濾系統(tǒng)可以是中空纖維膜或卷式膜或陶瓷膜或超濾膜。優(yōu)選的，所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到(1)將經(jīng)斜面活化的慶笙紅球菌CCTCC No =M 2010050、小球諾卡氏菌CCTCC No: M 209214或紅平紅球菌CCTCC No =M 209244接入種子培養(yǎng)基中，于20 40°C下培養(yǎng)24 48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉2 8. Og/L，蛋白胨 1 4. Og/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L，NaCl 0. 5 3. Og/L,己內(nèi)酰胺 0. 5 2. Og/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/ L，溶劑為水，pH 6.0 8.0 ；(2)將種子液以1 10%體積比接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于20 40°C下培養(yǎng)48 96h，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離，得所述含酶菌體細(xì)胞；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組 成如下蔗糖5. 0 10. Og/L,檸檬酸鈉2. 0 5. Og/L,牛肉膏2. 0 8. Og/L,酵母粉2. 0 8. Og/L,氯化鈉0. 5 2. 0g/L,磷酸二氫鉀0. 5 2. 5g/L，氯化鈷0. 005 0. 01g/L,氯化 鐵0. 005 0. 01g/L,氯化錳0. 005 0. 01g/L,誘導(dǎo)劑1. 0 3. 0g/L,溶劑為水，pH 6. 0 8.0;所述誘導(dǎo)劑為下列之一谷氨酸鈉、2，2_ 二甲基環(huán)丙甲酰胺、己內(nèi)酰胺、丙烯酰胺、乙 酰胺或尿素。所述方法如下將所述含酶菌體細(xì)胞用生理鹽水洗滌后，懸浮于水或PH6.0 10.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、TriS-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉 緩沖液中，加入底物2-氨基_2，3- 二甲基丁腈至底物濃度為0. 03 0. 3M，于15 40°C、 100 200rpm下反應(yīng)10 60min ；反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述2-氨基-2，
3_ 二甲基丁酰胺。優(yōu)選的，所述分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液12000rpm離心lOmin， 收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉(zhuǎn)入真空抽濾裝置抽濾，得到脫色 清液；脫色清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在真空度-0. IMpa，水浴加熱溫度40 60°C、轉(zhuǎn)速60 IOOrpm條件下減壓蒸發(fā)除去底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3-二 甲基丁酰胺粗品；將2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品溶于20 65°C的乙酸乙酯，加入體 積為乙酸乙酯體積10%鹽析劑正己烷，于0 4°C保溫結(jié)晶；過濾，取濾渣用正己烷洗滌，干 燥得到2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺晶體。本發(fā)明還涉及制備過程中所用的3株新的菌株，該產(chǎn)生的腈水合酶均具有良好的 氰離子耐受性，在KCN濃度高達(dá)IOmM時(shí)，轉(zhuǎn)化丙烯腈仍能保持80%以上的腈水合酶活力慶笙紅球菌(Rhodococcus qingshengii)ZJB-09153，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo =M 2010050，保藏日期2010年 3月10日。小球諾卡氏菌(Nocardia globerula) ZJB-09141，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo =M 209214，保藏日期2009年9 月27日。紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ZJB-0910，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo =M 209244，保藏日期2009年 10月26日。該菌株已在在先中國(guó)專利申請(qǐng)201010107481. 8中作為新菌株予以保護(hù)。上述三個(gè)菌株均由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所從土壤中分離獲得。酶活定義30°C下，每分鐘催化生成1 μ mo 1的2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺所需的 酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。腈水合酶的活力以每克干細(xì)胞所含有的酶活力單位表示 (U/g dew)ο本發(fā)明中2-氨基-2，3-二甲基丁腈和2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的含量通過氣 相色譜法測(cè)定。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在
(1)反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短?；瘜W(xué)水解法需要在100°C左右進(jìn)行，必須配備加熱和 溫控裝置，反應(yīng)條件苛刻，能耗高而且對(duì)設(shè)備要求高，耗費(fèi)時(shí)間達(dá)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天；而生物 催化法在常溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)在Ih之內(nèi)即可完成；(2)廢水產(chǎn)量少。用化學(xué)水解法會(huì)排放大量含酸廢水，而且廢水中還含有 (NH4)2SO4, Na2SO4等難處理的鹽類；用腈水合酶生物催化法生產(chǎn)2-氨基_2，3-二甲基丁酰 胺，廢水中難處理的雜質(zhì)含量少，更利于實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)；(3)成本低。化學(xué)法的原料除了 2-氨基-2，3-二甲基丁腈外還有濃硫酸、濃氨水、 Na2CO3和NaOH等，所需原料多，成本高。而生物催化法一般只需2_氨基-2，3- 二甲基丁腈 作為原料和產(chǎn)腈水合酶細(xì)胞作為催化劑，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率都可達(dá)95%以上，原料簡(jiǎn)單易得，成 本低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 小球諾卡氏菌ZJB-09141 (CCTCC No =M 209214)和紅平紅球菌 ZJB-0910(CCTCC No :M 209244)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基葡萄糖10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1. Og/L，K2HPO4 1. Og/L，NaCl 1. Og/L，己內(nèi)酰胺 1. 0g/L，MgSO4O. lg/L，CoCl2O. 01g/L， FeSO4O. 01g/L，溶劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7. 5，121°C滅菌20min。冷卻 至室溫后接入斜面菌種，在溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm下培養(yǎng)24h，得到種子液。分別配制搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基A、B、C、D、E，其培養(yǎng)基成分如下A 蔗糖4. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0g/L,牛肉膏3. 0g/L,酵母粉3. 0g/L,己內(nèi)酰胺0. 5g/ L,氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀0. 5g/L，氯化鈷0. 005g/L,氯化鐵0. 005g/L,氯化錳0. 005g/ L,溶劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6. 0 ；B 蔗糖5. 0g/L，檸檬酸鈉2. 5g/L，牛肉膏4. 0g/L，酵母粉4. 0g/L,己內(nèi)酰胺1. Og/ L，氯化鈉1. 0g/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，氯化鈷0. 01g/L，氯化鐵0. 01g/L，氯化錳0. 01g/L，溶 劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6. 5 ；C 蔗糖6. 0g/L，檸檬酸鈉3. 0g/L，牛肉膏5. 0g/L，酵母粉5. 0g/L,己內(nèi)酰胺1. 5g/ L，氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀1. 5g/L，氯化鈷0. 015g/L,氯化鐵0. 015g/L,氯化錳0. 015g/ L,溶劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7. 0 ；D 蔗糖7. 0g/L，檸檬酸鈉3. 5g/L，牛肉膏6. 0g/L，酵母粉6. 0g/L,己內(nèi)酰胺2. Og/ L，氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀2. 0g/L,氯化鈷0. 02g/L,氯化鐵0. 02g/L,氯化錳0. 02g/L,溶 劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7. 5 ；E 蔗糖8. 0g/L，檸檬酸鈉4. 0g/L，牛肉膏7. 0g/L，酵母粉7. 0g/L,己內(nèi)酰胺2. 5g/ L,氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀2. 5g/L，氯化鈷0. 025g/L,氯化鐵0. 025g/L,氯化錳0. 025g/ L，溶劑為水，用1.0M HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8.0。分別將上述配制好的培養(yǎng)基以40ml/瓶倒入5個(gè)250ml搖瓶中，121°C滅菌20min。 冷卻至室溫后分別以2. 5%的體積比接入上述種子液，于30°C，150rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72h。發(fā) 酵培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集發(fā)酵液，SOOOrpm離心收集菌體。分別稱取0. 05g濕菌體懸浮于5ml去離子水中，于30°C ISOrpm轉(zhuǎn)速下預(yù)熱5min后加入2-氨基-2，3-二甲基丁腈(終濃度為 0. 1M)開始反應(yīng)，20min后取樣1000 μ 1，加入30 μ 1 5Μ HCl終止反應(yīng)。通過氣相色譜法測(cè) 定轉(zhuǎn)化液中的2-氨基_2，3-二甲基丁酰胺含量，計(jì)算酶活，結(jié)果如表1所示表1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液的酶活 實(shí)施例2 慶笙紅球菌ZJB-09153(CCTCC No =M 2010050)的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基葡萄糖10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1. Og/L，K2HPO4 1. 0g/L，NaCl 1. Og/L，己內(nèi)酰胺 1. Og/L, MgSO4O. lg/L，CoCl2 0. 01g/L，F(xiàn)eSO4 0.01g/L，溶劑為水，用1.0M HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7. 5。在5L發(fā)酵罐中加入3L種子 培養(yǎng)基，實(shí)罐消毒后接入菌種，在溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm的條件下培養(yǎng)24h，得到種子 液。分別配制發(fā)酵罐產(chǎn)酶培養(yǎng)基A、B、C、D、E，其培養(yǎng)基成分如下A 蔗糖4. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0g/L,牛肉膏3. 0g/L,酵母粉3. 0g/L,己內(nèi)酰胺0. 5g/ L,氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀0. 5g/L，氯化鈷0. 005g/L,氯化鐵0. 005g/L,氯化錳0. 005g/ L,溶劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6. 0 ；B 蔗糖5. 0g/L，檸檬酸鈉2. 5g/L，牛肉膏4. 0g/L，酵母粉4. 0g/L,己內(nèi)酰胺1. Og/ L，氯化鈉1. 0g/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，氯化鈷0. 01g/L，氯化鐵0. 01g/L，氯化錳0. 01g/L，溶 劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6. 5 ；C 蔗糖6. 0g/L，檸檬酸鈉3. 0g/L，牛肉膏5. 0g/L，酵母粉5. 0g/L,己內(nèi)酰胺1. 5g/ L，氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀1. 5g/L，氯化鈷0. 015g/L,氯化鐵0. 015g/L,氯化錳0. 015g/ L,溶劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7. 0 ；D 蔗糖7. 0g/L，檸檬酸鈉3. 5g/L，牛肉膏6. 0g/L，酵母粉6. 0g/L,己內(nèi)酰胺2. Og/ L，氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀2. 0g/L,氯化鈷0. 02g/L,氯化鐵0. 02g/L,氯化錳0. 02g/L,溶 劑為水，用1. OM HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7. 5 ；E 蔗糖8. 0g/L，檸檬酸鈉4. 0g/L，牛肉膏7. 0g/L，酵母粉7. 0g/L,己內(nèi)酰胺2. 5g/ L,氯化鈉1. 0g/L,磷酸二氫鉀2. 5g/L，氯化鈷0. 025g/L,氯化鐵0. 025g/L,氯化錳0. 025g/ L，溶劑為水，用1.0M HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8.0。在50L發(fā)酵罐中分別加入以上各組產(chǎn)酶培養(yǎng)基30L，實(shí)罐消毒，冷卻至室溫后分別 以2. 5%的體積比接入上述種子液。在溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，通氣比0.5 1，罐壓 0. 06MPa的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)36h后，每隔12h分別收集發(fā)酵液，SOOOrpm離心收集菌體。按 實(shí)施例1的方法測(cè)定酶活，結(jié)果如表2所示表2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)液的酶活
實(shí)施例3 含酶細(xì)胞的收集取按照實(shí)施例1和2中C培養(yǎng)基發(fā)酵得到的發(fā)酵液1L，按以下固液分離方式進(jìn)行 處理A 低溫高速離心，在4°C，12000rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin ；B 卷式膜過濾，流量 120ml/min，壓力 12Kg/cm2 ；C 陶瓷膜過濾，流量120ml/min，壓力4Kg/cm2 ；D 中空纖維膜過濾，流量120ml/min，壓力1. OKg/cm2 ；E 平板超濾膜過濾，流量120ml/min，壓力3Kg/cm2。然后用3L 0. 9%的生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集濕菌體，按實(shí)施例1的方法測(cè)定酶活， 結(jié)果如表3所示表3 不同方式分離細(xì)胞后的細(xì)胞酶活 實(shí)施例4:按照實(shí)施例3中低溫高速離心方法獲得的小球諾卡氏菌、卷式膜過濾方法獲得 的紅平紅球菌和低溫高速離心方法獲得的慶笙紅球菌，分別取濕菌體0. 05g懸浮于5ml pH8. 9的Tris-HCl緩沖液中，加入底物終濃度為0. 09M的2-氨基_2，3-二甲基丁腈，分別 在15、20、25、30、35、40、451，轉(zhuǎn)速150rpm條件下轉(zhuǎn)化。按實(shí)施例1的方法測(cè)定酶活，結(jié)果 如表4所示
表4 靜息細(xì)胞在不同溫度下的催化活性 實(shí)施例5 按照實(shí)施例3低溫高速離心方法獲得的小球諾卡氏菌、卷式膜過濾方法獲得的紅 平紅球菌和低溫高速離心方法獲得的慶笙紅球菌，分別取濕菌體0. 05g懸浮于5ml不同pH 值的緩沖液中。緩沖液的PH值和類型如表5所示表5 緩沖液的pH值和類型 加入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈，使2-氨基_2，3_ 二甲基丁腈的終濃度為 0. 09M。按實(shí)施例1的方法測(cè)定酶活，結(jié)果如表6所示表6 靜息細(xì)胞在不同pH條件下的催化活性 實(shí)施例6 按照實(shí)施例3低溫高速離心方法獲得的小球諾卡氏菌，取濕菌體3. Og懸浮于 180ml pH7. 8的磷酸鹽緩沖液中，在30°C，轉(zhuǎn)速180rpm的條件下預(yù)熱5min，加入底物2-氨 基-2，3- 二甲基丁腈，使其終濃度達(dá)到0. 2M,反應(yīng)40min，取樣氣相測(cè)定轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物2-氨 基-2，3-二甲基丁酰胺的濃度。檢測(cè)結(jié)果2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺濃度0. 191M，產(chǎn)率為 95. 5%。實(shí)施例7 按照實(shí)施例3卷式膜過濾方法獲得的紅平紅球菌，取濕菌體3. Og懸浮于200ml pH7. 2的磷酸鹽緩沖液中，在35°C，轉(zhuǎn)速150rpm的條件下預(yù)熱5min，加入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈，使其終濃度達(dá)到0. 15M，反應(yīng)60min，取樣氣相測(cè)定轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物2-氨 基-2，3- 二甲基丁酰胺的濃度。檢測(cè)結(jié)果2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺濃度0. 133M，2-氨 基-2，3-二甲基點(diǎn)酰胺產(chǎn)率為88. 67%。實(shí)施例8 按照實(shí)施例3低溫高速離心方法獲得的慶笙紅球菌，取濕菌體20g懸浮于IL去離 子水或緩沖液，裝入2L的三口反應(yīng)瓶中，加入IOml底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈，使其終 濃度約為0. 075M，在10°C，轉(zhuǎn)速180rpm的條件下反應(yīng)。每隔20min添加IOml 2-氨基-2， 3- 二甲基丁腈，累計(jì)加入10次。反應(yīng)結(jié)束后取樣氣相檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物2-氨基-2，3- 二 甲基丁酰胺的濃度。檢測(cè)結(jié)果2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺濃度0. 638M，產(chǎn)率為85. 1%。實(shí)施例9 按照實(shí)施例8的方法獲得的含有2-氨基-2，3_ 二甲基丁酰胺的轉(zhuǎn)化液， 12000rpm離心lOmin，收集含ADBA的上清液；加入粉末活性炭(0. 5%，m/v)，加熱攪拌脫 色30min ；轉(zhuǎn)入真空抽濾裝置抽濾，得到含ADBA脫色清液；脫色清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在真 空度-0. IMpa,水浴加熱溫度40 60°C，轉(zhuǎn)速60 IOOrpm減壓蒸發(fā)除去底物2-氨基-2， 3_ 二甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品。該粗品溶于熱的乙酸乙 酯，加入10% (ν/ν)鹽析劑正己烷，于O 4°C保溫結(jié)晶；過濾，正己烷洗滌，干燥得到2-氨 基-2，3-二甲基丁酰胺晶體(收率90.5%，純度98.5%)。所得晶體做1H NMR、紅外光譜 和質(zhì)譜分析結(jié)果如下FT-IR 3521/3372/1602 (vNH)，2973 (vCH)，1675 (acyl, Vc = 0)，1399 (vc_N)， 708 (amino，vNH)；1H NMR δ H (500MHz ；CDCl3) 0. 86 (3H, d, Me) ,0. 90 (3H, d, Me)，1. 3 (3H, s, Me)， 2.2(lH，m，CH)，5.5(lH，br s, NH) ,7. 4(1H, br s，NH) ；ESI—MS :m/z 283(100%, [2M+Na].)， 261 (82，[2M+H]+)，131 (6. 4，M+)。
權(quán)利要求
一種微生物催化法制備2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈為底物，以慶笙紅球菌(Rhodococcusqingshengii)CCTCC NoM 2010050、小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC NoM 209214或紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCNoM 209244發(fā)酵產(chǎn)生的腈水合酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于pH6.0～10.0、20～40℃下進(jìn)行催化水合反應(yīng)，制得所述的2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)在水或pH6.O 10. O的檸檬酸-檸 檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進(jìn)行
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為0.03 0. 3M。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水合酶來自慶笙紅球菌CCTCCNo =M 2010050、小球諾卡氏菌CCTCC No :M 209214或紅平紅球菌CCTCC No :M 209244經(jīng)發(fā)酵獲得 的含酶菌體細(xì)胞，所述含酶菌體細(xì)胞在反應(yīng)體系中添加量以含酶細(xì)胞濕重計(jì)為5 50g/L。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到(1)將經(jīng)斜面活化的慶笙紅球菌CCTCCNo =M 2010050、小球諾卡氏菌CCTCC No =M 209214或紅平紅球菌CCTCC No =M 209244接入種子培養(yǎng)基中，于20 40°C下培養(yǎng)24 48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉2 8. Og/L，蛋白 胨 1 4. Og/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L, NaCl 0. 5 3. 0g/L,己內(nèi)酰胺 0. 5 2. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L，溶劑為 水，pH 6. 0 8. 0 ；(2)將種子液以1 10%體積比接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于20 40°C下培養(yǎng)48 96h，培 養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離，得所述含酶菌體細(xì)胞；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成如下 蔗糖5. 0 10. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L, 氯化鈉0. 5 2. 0g/L,磷酸二氫鉀0. 5 2. 5g/L，氯化鈷0. 005 0. 01g/L,氯化鐵0. 005 0. 01g/L，氯化錳0. 005 0. 01g/L，誘導(dǎo)劑1. 0 3. 0g/L，溶劑為水，pH 6. 0 8. 0 ；所述誘 導(dǎo)劑為下列之一谷氨酸鈉、2，2_ 二甲基環(huán)丙甲酰胺、己內(nèi)酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下將所述含酶菌體細(xì)胞用 生理鹽水洗滌后，懸浮于水或pH6. 0 10. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、 Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，加入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈至底物 濃度為0. 03 0. 3M，于15 40°C、100 200rpm下反應(yīng)10 60min ；反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液 經(jīng)分離純化得到所述2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化 液12000rpm離心lOmin，收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉(zhuǎn)入真空抽 濾裝置抽濾，得到脫色清液；脫色清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在真空度-0. IMpa，水浴加熱溫度 40 60°C、轉(zhuǎn)速60 IOOrpm條件下減壓蒸發(fā)除去底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈和水，冷 卻得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺粗品；將2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺粗品溶于20 65°C的乙酸乙酯，加入體積為乙酸乙酯體積10%鹽析劑正己烷，于0 4°C保溫結(jié)晶；過濾， 取濾渣用正己烷洗滌，干燥得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺晶體。
8.慶笙紅球菌(Rhodococcusqingshengii)ZJB_09153，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo =M 2010050，保藏日期2010年3月10日。
9.小球諾卡氏菌(Nocardiagloberula)ZJB_09141，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo =M 209214，保藏日期2009年9月27曰。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物法生產(chǎn)咪唑啉酮類超高效除草劑中間體2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法及其過程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2，3-二甲基丁腈為原料，以通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物慶笙紅球菌(Rhodococcus qingshengii)CCTCC NoM 2010050、小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC NoM 209214或紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC NoM 209244生產(chǎn)的腈水合酶為催化劑生產(chǎn)2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。本方法反應(yīng)條件溫和，廢水排放少，環(huán)境友好；產(chǎn)率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，成本低，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/02GK101886096SQ20101020453
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者林志堅(jiān), 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國(guó) 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)