專利名稱：用于煙草imp分子標(biāo)記的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，涉及一種基于微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件 (Miniatureinverted-repeat transposable element)的分子標(biāo)記技術(shù)。具體為用于煙草 IMP分子標(biāo)記的引物。
背景技術(shù)：
普通煙草(Nicotiana tabacum)屬于茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)植 物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。盡管煙草在生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域作為轉(zhuǎn)基因模式植物發(fā) 揮重要作用，但其自身的遺傳研究相對落后，至今還未建成一張高密度、覆蓋整個基因組的 遺傳圖譜，嚴(yán)重限制了對煙草重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)和遺傳規(guī)律的研究。針對煙草染色 體多、基因組大，加之遺傳背景狹窄的事實(shí)，常規(guī)分子標(biāo)記手段如SSR，RAPD不能高效穩(wěn)定 檢測栽培煙草不同品種間遺傳多態(tài)性。迫切需要利用一種高效、可靠的分子標(biāo)記技術(shù)，開發(fā) 穩(wěn)定性高、均勻分布基因組的分子標(biāo)記。IMP(Inter-MITE Polymorphism)即微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件間多態(tài)性，是一種 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，擴(kuò)增相鄰兩MITEs間序列 長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposableelements, MITEs)是一類廣泛分布于動植物基因組中的DNA轉(zhuǎn)座元件，其特 征是(1)序列長度不超過600個核苷酸堿基；(2)序列5’和3’端具有11個核苷酸堿基的 末端反向重復(fù)(Terminal Inverted Repeat,TIR)和多以TAA或TA為靶標(biāo)位點(diǎn)重復(fù)(Target SiteDuplication, TSD)的序列結(jié)構(gòu)；(3)這類DNA轉(zhuǎn)座元件拷貝數(shù)較高并偏好插入到基因 編碼區(qū)。利用末端反向重復(fù)和靶標(biāo)位點(diǎn)重復(fù)序列來進(jìn)行引物選擇，已經(jīng)在豆類和大麥等作 物上得到很好應(yīng)用(Chang et al. Theo Appl Genet 2001,102:773-781)。但在煙草上還 未見應(yīng)用的報(bào)道。同時，在煙草全基因組查找MITE并利用其進(jìn)行分子標(biāo)記的開發(fā)還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物。本發(fā)明解決其技術(shù)問題的手段是通過利用美國煙草基因組測序計(jì)劃釋放的基因 組序列，采用生物信息學(xué)手段，獲得一批煙草MITE序列。然后根據(jù)IMP標(biāo)記策略，進(jìn)行煙草 IMP標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用研究，得到一批用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物。本發(fā)明中，所述用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物分別具有SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 10所示的序列。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是一種煙草新生物分子標(biāo)記技術(shù)，提供的這些引物可用于煙草IMP分子標(biāo) 記。而這些標(biāo)記可以利用的領(lǐng)域主要包括(1)煙草分子標(biāo)記輔助選擇育種。也就是用于煙草品種的選育；(2)煙草遺傳圖譜的構(gòu)建；(3)煙草重要功能基因的定位和發(fā)現(xiàn)；(4)煙 草特定性狀早期診斷、早期篩選；(5)煙草親緣關(guān)系判斷(如煙草品種混雜、煙草與及其野 生種的分析等)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中，有關(guān)煙草IMP分子標(biāo)記引物的完成步驟如下第一步煙草基因組數(shù)據(jù)獲得對美國煙草基因組測序計(jì)劃釋放的原始序列進(jìn)行去冗余、拼接整理，獲得查找 MITE的原始數(shù)據(jù)；第二步煙草候選MITE查找根據(jù)MITE的結(jié)構(gòu)特征末端反向重復(fù)(TIR)和靶標(biāo)位點(diǎn)重復(fù)(TSD)，利用生物信 息學(xué)方法獲取煙草候選MITE序列；第三步基于MITE的引物選擇依據(jù)上一步獲得的候選MITE序列，將其具有相同TIR結(jié)構(gòu)MITE序列劃為一個子 集，并對這個子集中的序列進(jìn)行多序列聯(lián)配，找到MITE結(jié)構(gòu)中保守結(jié)構(gòu)域，以此為核心選 擇18 20個核苷酸長度的引物，例如本發(fā)明核苷酸或氨基酸序列表中的SEQ ID N0:1至 SEQ ID NO 10所示的引物序列。第四步多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將上步選擇的引物，在烤煙品種Hicks Broad Leaf上測試，考察各條單引物的最 適PCR反應(yīng)條件，并對不同引物進(jìn)行兩兩組合，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件；第五步PCR擴(kuò)增及其遺傳多態(tài)性統(tǒng)計(jì)依照上步成功擴(kuò)增的IMP單引物及其有效組合引物對，在8個煙草主栽品種紅花 大金元、K326、Hicks Broad Leaf、Florida 301、Samsun、Burley 21、TN86 和土耳其巴斯瑪 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性PAGE膠分離、銀染，統(tǒng)計(jì)品種間的多態(tài)性條帶。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不 限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO1所示的序列。
2.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :2所示的 序列。
3.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :3所示的 序列。
4.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID N0:4所示的 序列。
5.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :5所示的 序列。
6.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :6所示的 序列。
7.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :7所示的 序列。
8.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :8所示的 序列。
9.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID NO :9所示的 序列。
10.一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，該引物具有SEQ ID N0:10所示 的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，旨在提供一種用于煙草IMP分子標(biāo)記的引物。該引物具有SEQ ID NO1至SEQ ID NO10所示的核苷酸序列。本發(fā)明是一種煙草新生物分子標(biāo)記技術(shù)，提供的這些引物可用于煙草IMP分子標(biāo)記。而這些標(biāo)記可以利用的領(lǐng)域主要包括(1)煙草分子標(biāo)記輔助選擇育種。也就是用于煙草品種的選育；(2)煙草遺傳圖譜的構(gòu)建；(3)煙草重要功能基因的定位和發(fā)現(xiàn)；(4)煙草特定性狀早期診斷、早期篩選；(5)煙草親緣關(guān)系判斷(如煙草品種混雜、煙草與及其野生種的分析等)。
文檔編號C12N15/11GK101899436SQ201010136819
公開日2010年12月1日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者桂毅杰, 樊龍江, 童治軍, 肖炳光 申請人:浙江大學(xué);云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院