專利名稱：生物標(biāo)志的制作方法
生物標(biāo)志本申請(qǐng)涉及生物標(biāo)志，具體而言，涉及膀胱癌和肺癌的生物標(biāo)志。膀胱癌是男性中的第四位最常見癌癥和女性中的第十位最常見癌癥；每年在英國(guó)有10，000例新病例，而在美國(guó)有63，000例。目前，通過檢查尿液中已經(jīng)自膀胱壁解附的細(xì)胞(細(xì)胞學(xué))，或者通過自膀胱取出組織進(jìn)行活組織檢查來(lái)做出診斷。細(xì)胞學(xué)是非常特異性的但是具有低靈敏度，而且這兩種技術(shù)是昂貴且費(fèi)時(shí)的。針對(duì)膀胱癌的可靠的生物化學(xué)標(biāo)志物對(duì)于患者會(huì)具有極大的益處。關(guān)于膀胱癌的類型，病例的90%是移行細(xì)胞癌(TCC)，其源自膀胱的內(nèi)部襯里，即尿路上皮。膀胱癌剩余的10%是鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肉瘤或小細(xì)胞癌。肺癌是全世界最常見的癌癥，每年有135萬(wàn)新病例，其中38，000例在英國(guó)。沒有可靠的用于診斷肺癌的生物化學(xué)方法可用；目前通過X射線，接著為支氣管鏡檢查法和/或計(jì)算機(jī)化斷層攝影術(shù)(CT)掃描進(jìn)行診斷?；谘寤蛱抵械膯我粯?biāo)志物的可靠的生物化學(xué)測(cè)試對(duì)于患者會(huì)有極大的益處，因?yàn)樗鼤?huì)加速診斷。另外，此類測(cè)試有可能遠(yuǎn)比現(xiàn)有方法便宜。肺癌有多種類型。將非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)分組在一起，因?yàn)槠漕A(yù)后和管理相似。 它們由鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌組成。NSCLC是肺癌的最普遍形式，構(gòu)成病例的 80.4%。小細(xì)胞肺癌(SCLC)構(gòu)成病例的16.8%。SCLC經(jīng)常具有作為該疾病的重要組成的內(nèi)分泌功能。類癌和肉瘤癌癥分別構(gòu)成病例的0. 8%和0. 1%，其中病例的1. 9%是未規(guī)定的類型。發(fā)明概述依照本發(fā)明的一方面，提供了膀胱癌特異性生物標(biāo)志或肺癌特異性生物標(biāo)志，所述生物標(biāo)志包含(i)包含SEQ ID NO :1或其片段或變體的核酸序列，或包含所述核酸序列的核酸分子；或(ii)包含SEQ ID NO 2或其片段或變體的氨基酸序列，或包含所述氨基酸序列的
氨基酸分子。在此方面，SEQ ID NO :1對(duì)應(yīng)于Engrailed-2(EN2)基因的核酸序列(GenBank 參考號(hào)NM_001427)，而SEQ ID NO :2對(duì)應(yīng)于由其編碼的EN2蛋白(NCBI登錄號(hào)P19622， gi21903415)。令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 EN2基因在膀胱癌和肺癌中顯著上調(diào)。EN2基因編碼含有同源域的轉(zhuǎn)錄因子，其在早期發(fā)育中具有許多重要功能，包括軸突導(dǎo)向和邊界形成(綜述見 Morgan R, (2006) · Engrailed Complexity and economy of a multi-functional transcription factor. FEBS letters580, 2531-2533, fflilH^M^If ^ 完整收入本文)。其NCBI/GenBank參考號(hào)是匪001427。先前報(bào)告了其在乳腺癌中起癌基因的作用，盡管尚未將診斷意義歸于它(Martin, N. L.，Saba-El-Leil, M. K.，Sadekova, S. , Meloche,S.及 Sauvageau, G. (2005)EN~2is a candidate oncogene in human breast cancer. Oncogene 24，6890-6901，通過提及而將其完整收入本文)。EN2基因產(chǎn)物是33kDa蛋白(EN2)。優(yōu)選地，所述其片段或變體包含(i)與SEQ ID NO :1具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約 75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%核酸序列同一性的核酸序列，在嚴(yán)格條件下與其可雜交的核酸序列，和/或與其互補(bǔ)的核酸序列；(ii)與SEQ ID NO 2具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約 75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(iii)由(i)的核酸序列編碼的氨基酸序列。換言之，依照上文的部分(iii)，優(yōu)選的是，所述其片段或變體包含(A)由核酸序列編碼的氨基酸序列，其中所述核酸序列與SEQ ID NO :1具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90 %、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 % 核酸序列同一性；(B)由核酸序列編碼的氨基酸序列，其中所述核酸序列在嚴(yán)格條件下同與SEQ ID NO :1具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、 或至少約99%核酸序列同一性的核酸序列可雜交；或(C)由核酸序列編碼的氨基酸序列，其中所述核酸序列同與SEQ IDNO :1具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90 %、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 % 核酸序列同一性的核酸序列互補(bǔ)。優(yōu)選地，所述其片段包含(i)來(lái)自SEQ ID NO :2的至少4個(gè)、優(yōu)選地至少5個(gè)、優(yōu)選地至少6個(gè)、優(yōu)選地至少7個(gè)、優(yōu)選地至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸或(ii)核酸序列SEQ ID NO=I 中編碼來(lái)自SEQ ID NO 2的至少4個(gè)、優(yōu)選地至少5個(gè)、優(yōu)選地至少6個(gè)、優(yōu)選地至少7個(gè)、 優(yōu)選地至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸的片段。更長(zhǎng)的片段也是優(yōu)選的，例如SEQ ID N0:2的至少約 10、15、20、25、30、50、75、100、150、200、225 和多至至少約 250 個(gè)氨基酸或 SEQ ID NO 1 的相應(yīng)的編碼片段。片段還可以包括自N端和/或C端刪除χ個(gè)氨基酸的截短的肽。在此類截短物中，χ 可以是 SEQ ID N0:2 的 1 個(gè)或多個(gè)(即 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、 40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè))，但是優(yōu)選地小于150個(gè)氨基酸或SEQ ID N0:1的相應(yīng)的編碼片段。優(yōu)選地，所述其片段或變體是其功能性片段或變體。依照本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于診斷患者中的膀胱癌或肺癌或者用于鑒定有風(fēng)險(xiǎn)形成膀胱癌或肺癌的患者的方法，該方法包括(a)測(cè)定自患者獲得的樣品中的癌癥特異性生物標(biāo)志的量；(b)比較來(lái)自所述患者的樣品中測(cè)定的癌癥特異性生物標(biāo)志的量與正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量；其中與所述正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量相比，來(lái)自所述患者的樣品中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量的差異與膀胱癌或肺癌的存在有關(guān)或者與形成膀胱癌或肺癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。依照本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于監(jiān)測(cè)患者中的膀胱癌或肺癌進(jìn)展的方法，該方法包括(a)測(cè)定自患者獲得的樣品中的癌癥特異性生物標(biāo)志的量；(b)比較來(lái)自所述患者的樣品中測(cè)定的癌癥特異性生物標(biāo)志的量與正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量；并(c)在兩個(gè)或更多個(gè)時(shí)間間隔重復(fù)步驟(a)和(b)，其中來(lái)自所述患者的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量隨時(shí)間增加與膀胱癌或肺癌的進(jìn)展升高有關(guān)，且來(lái)自所述患者的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量隨時(shí)間減少與膀胱癌或肺癌的進(jìn)展降低有關(guān)。因而，可以使用本發(fā)明的方法來(lái)檢測(cè)膀胱癌或肺癌的發(fā)作、進(jìn)展、穩(wěn)定、改善 (amelioration)禾口 / 或減退(remission)。優(yōu)選地，對(duì)照可以來(lái)自與先前樣品相同的患者，以如此監(jiān)測(cè)發(fā)作或進(jìn)展。然而，還優(yōu)選的是，可以相對(duì)于群體，特別是沒有膀胱癌或肺癌的健康或正常群體使對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化。換言之，對(duì)照可以由在來(lái)自正常受試者的正常對(duì)照樣品中找到的生物標(biāo)志水平組成。因而，在本發(fā)明的一個(gè)例子中，提供了一種診斷或監(jiān)測(cè)膀胱癌或肺癌進(jìn)展的方法， 包括檢測(cè)和/或量化自患者獲得的生物學(xué)流體中的癌癥特異性生物標(biāo)志。如上文所討論的，優(yōu)選的是，提供了在時(shí)間上間隔分開的至少兩個(gè)檢測(cè)和/或量化步驟。優(yōu)選地，所述步驟間隔分開幾天、幾周、幾年或幾個(gè)月，以測(cè)定癌癥特異性生物標(biāo)志的水平是否已經(jīng)改變，如此指明癌癥的進(jìn)展是否已經(jīng)有變化，使得能夠在兩個(gè)或更多個(gè)時(shí)機(jī)采集的樣品中的生物標(biāo)志水平間進(jìn)行比較，因?yàn)樯飿?biāo)志水平隨時(shí)間的升高指明癌癥的發(fā)作或進(jìn)展，而生物標(biāo)志水平的降低可以指明癌癥的改善和/或減退。優(yōu)選地，生物標(biāo)志水平的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，這通過使用“t檢驗(yàn)”確定，所述 "t檢驗(yàn)”提供優(yōu)選地至少約80 %、優(yōu)選地至少約85 %、優(yōu)選地至少約90 %、優(yōu)選地至少約95%、優(yōu)選地至少約99%、優(yōu)選地至少約99. 5%、優(yōu)選地至少約99. 95%、優(yōu)選地至少約 99. 99%的置信區(qū)間。本發(fā)明的生物標(biāo)志和方法特別可用于檢測(cè)早期階段癌癥，而且比用于檢測(cè)早期階段膀胱癌和肺癌的已知方法更靈敏。如此，本發(fā)明的生物標(biāo)志和方法特別可用于在已經(jīng)使用常規(guī)方法測(cè)得患者在癌癥方面呈陰性時(shí)確認(rèn)癌癥。預(yù)后和治療的選擇取決于癌癥的階段和患者的一般健康狀態(tài)。關(guān)于膀胱癌，階段以癌癥是否僅存在于膀胱的襯里中或者是否已經(jīng)擴(kuò)散至其它區(qū)域來(lái)定義。為了計(jì)劃治療，期望知道疾病的階段。如此，一旦已經(jīng)診斷出膀胱癌，一般便實(shí)施其它測(cè)試來(lái)測(cè)定癌癥的階段。0期是極早期癌癥。在此階段中，僅在膀胱的內(nèi)部襯里上找到癌癥。在除去癌癥后，在內(nèi)部檢查過程中不會(huì)觀察到腫脹或腫塊。在I期中，癌細(xì)胞已經(jīng)略深地?cái)U(kuò)散入膀胱的內(nèi)部襯里中，但是尚未擴(kuò)散至膀胱的肌肉壁。在II期中，癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散至給膀胱做襯里的肌肉的內(nèi)部襯里。在III期中，癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散遍及膀胱的肌肉壁，至膀胱周圍的組織層
8和/或至附近的生殖器官。在此階段中，即使在已經(jīng)手術(shù)除去癌性組織后仍可以觀察到腫脹或腫塊。在IV期中，癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散至骨盆或腹壁或至附近的淋巴結(jié)。淋巴結(jié)是遍及身體找到的小的豆形結(jié)構(gòu)；它們生成并貯存抗感染細(xì)胞。癌癥也可以已經(jīng)擴(kuò)散至遠(yuǎn)離膀胱的淋巴結(jié)和身體的其它部分。關(guān)于肺癌，分期對(duì)于非小細(xì)胞對(duì)小細(xì)胞肺癌是不同的。非小細(xì)胞癌分成四個(gè)階段。I期是非常局限性的癌癥，淋巴結(jié)中沒有癌癥。在II 期中，癌癥已經(jīng)擴(kuò)散至受累及肺頂部的淋巴結(jié)。在III期中，癌癥已經(jīng)在癌癥開始的地方附近擴(kuò)散。這可以是至胸壁、肺的覆蓋物(胸膜)、胸腔中間(縱隔)或其它淋巴結(jié)。IV期癌癥已經(jīng)擴(kuò)散至身體的另一部分。小細(xì)胞肺癌分成兩組。這是因?yàn)樾〖?xì)胞肺癌經(jīng)常相當(dāng)早期擴(kuò)散。即使癌癥擴(kuò)散在掃描時(shí)不可見，但有可能的是，一些癌細(xì)胞會(huì)已經(jīng)脫離，而且經(jīng)由血流或淋巴系統(tǒng)傳播。因而，經(jīng)常優(yōu)選的是，無(wú)論是否看到任何繼發(fā)性癌癥，就像它們已經(jīng)擴(kuò)散了一樣治療小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌的兩個(gè)階段是受限性疾病(其是僅可以在一個(gè)肺中和在附近的淋巴結(jié)中看到的癌癥)和廣泛性疾病(其是已經(jīng)在肺外部擴(kuò)散至胸腔或身體的其它部分的癌癥)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“早期階段”可以被說(shuō)成指膀胱癌的0期、I期和/或II期或非小細(xì)胞肺癌的I期和/或II期，或小細(xì)胞肺癌的受限性疾病階段，如上文所討論的。如本文中所使用的，關(guān)于術(shù)語(yǔ)“晚期階段”，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，此術(shù)語(yǔ)可以被說(shuō)成指膀胱癌或非小細(xì)胞肺癌的III期和/或IV期，或小細(xì)胞肺癌的廣泛性疾病階段，如上文所討論的。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，癌癥疾病狀態(tài)的“早期階段”和“晚期階段”本質(zhì)是內(nèi)科醫(yī)師能確定的。 還涵蓋的是，它們可以分別與非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)。在一方面，提供了依照本發(fā)明的方法，其用于檢測(cè)早期階段癌癥，其中對(duì)照與自患者獲得的樣品間的升高指明早期階段癌癥。優(yōu)選地，升高是至少約100%、優(yōu)選地至少約125%、優(yōu)選地至少約150%、優(yōu)選地至少約200%、優(yōu)選地至少約250%、優(yōu)選地至少約 300%、優(yōu)選地至少約500%。還提供了依照本發(fā)明的方法，其用于檢測(cè)晚期階段癌癥，其中對(duì)照與自患者獲得的樣品間的升高指明晚期階段癌癥。優(yōu)選地，升高是至少約100%、優(yōu)選地至少約125%、優(yōu)選地至少約150%、優(yōu)選地至少約200%、優(yōu)選地至少約250%、優(yōu)選地至少約300%、優(yōu)選地至少約500%、優(yōu)選地至少約750%、優(yōu)選地至少約1000%、優(yōu)選地至少約1500%。進(jìn)一步提供了依照本發(fā)明的方法，其用于監(jiān)測(cè)癌癥階段的變化，其中相對(duì)于較早階段的樣品或?qū)φ?，升高指明癌癥從疾病的較早階段進(jìn)展至較晚階段，例如自0期至I期、 自I期至II期、自II期至III期、自III期至IV期、自早期階段至晚期階段、或自受限性疾病階段至廣泛性疾病階段。優(yōu)選地，升高是至少約100%、優(yōu)選地至少約125%、優(yōu)選地至少約150%、優(yōu)選地至少約200%、優(yōu)選地至少約250%、優(yōu)選地至少約300%、優(yōu)選地至少約 500%、優(yōu)選地至少約750%、優(yōu)選地至少約1000%、優(yōu)選地至少約1500%。在涉及膀胱癌的方法中，優(yōu)選的是，在以正常對(duì)照水平的至少約2倍、優(yōu)選地至少約5倍、優(yōu)選地至少約10倍、優(yōu)選地至少約20倍、優(yōu)選地至少約50倍、優(yōu)選地至少約100 倍、優(yōu)選地至少約200倍、優(yōu)選地至少約500倍、優(yōu)選地至少約750倍、優(yōu)選地至少約1000 倍的水平存在時(shí)，膀胱癌特異性生物標(biāo)志指明膀胱癌的存在或形成膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)。
在涉及肺癌的方法中，優(yōu)選的是，在以正常對(duì)照水平的至少約2倍、優(yōu)選地至少約 5倍、優(yōu)選地至少約10倍、優(yōu)選地至少約15倍、優(yōu)選地至少約20倍、優(yōu)選地至少約25倍、優(yōu)選地至少約30倍的水平存在時(shí)，肺癌特異性生物標(biāo)志指明肺癌的存在或形成肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還提供了一種用于監(jiān)測(cè)治療對(duì)膀胱癌或肺癌的功效的方法，包括檢測(cè)和/ 或量化自患者獲得的生物學(xué)樣品中的癌癥特異性生物標(biāo)志的存在。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，膀胱癌和肺癌(melanoma)特異性生物標(biāo)志的檢測(cè)和/或量化通過下列一項(xiàng)或多項(xiàng)進(jìn)行MALDI-T0F、SELDI、經(jīng)由與一種或多種配體的相互作用、基于I-D或2-D凝膠的分析系統(tǒng)、液相層析、組合的液相層析和質(zhì)譜術(shù)技術(shù)(包括 ICAT(R)或iTRAQ(R))、薄層層析、NMR光譜學(xué)、三明治式免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (ELISA)、放射性免疫測(cè)定法(RAI)、酶免疫測(cè)定法(EIA)、側(cè)流/免疫層析條測(cè)試、Western 印跡、免疫沉淀、基于顆粒的免疫測(cè)定法(包括使用金、銀、或乳膠顆粒)、磁性顆?；騋點(diǎn)、 和組織切片上的免疫組織化學(xué)。優(yōu)選地，在微量滴定板、條形式、陣列或芯片上實(shí)施癌癥特異性生物標(biāo)志的檢測(cè)和
/或量化。優(yōu)選地，癌癥特異性生物標(biāo)志的檢測(cè)和/或量化通過包含對(duì)癌癥特異性生物標(biāo)志特異性的抗體，優(yōu)選地與報(bào)告物連接的抗體的ELISA進(jìn)行。優(yōu)選地，癌癥特異性生物標(biāo)志的檢測(cè)和/或量化通過生物傳感器進(jìn)行。優(yōu)選地，樣品包括自患者獲得的生物學(xué)流體或組織。優(yōu)選地，生物學(xué)流體或組織包括細(xì)胞液、腦脊液(CSF)、精液、尿液、血液、痰或唾液。在涉及膀胱癌的優(yōu)選的實(shí)施方案中， 樣品是自患者獲得的尿液。在涉及肺癌的優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品是自患者獲得的痰。優(yōu)選地，生物標(biāo)志在細(xì)胞表面上可檢出。還優(yōu)選的是，生物學(xué)流體基本上或完全沒有全/完整細(xì)胞。優(yōu)選地，生物學(xué)流體沒有血小板和細(xì)胞碎片(諸如在細(xì)胞裂解時(shí)生成的)。優(yōu)選地，生物學(xué)流體沒有原核和真核細(xì)胞兩者。此類樣品可以通過本領(lǐng)域中已知的許多手段(諸如對(duì)于技術(shù)人員會(huì)顯而易見的) 任一來(lái)獲得。例如，尿液和痰樣品容易地可得到，而血液或血清樣品可以例如通過使用針頭和注射器在胃腸外獲得?？梢酝ㄟ^將樣品進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)，包括但不限于離心和過濾來(lái)獲得沒有細(xì)胞或基本上沒有細(xì)胞的樣品。雖然一般優(yōu)選的是，不使用侵入技術(shù)來(lái)獲得樣品，但獲得諸如組織勻漿物、組織切片和活組織檢查標(biāo)本等樣品仍可以是優(yōu)選的。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于治療膀胱癌或肺癌患者的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的(i)本發(fā)明的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于對(duì)患者中的膀胱癌或肺癌成像的方法，該方法包括對(duì)患者施用特異性結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段。優(yōu)選地，所述抗體與可檢測(cè)標(biāo)志物，例如熒光標(biāo)志物或標(biāo)簽綴合。優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體。優(yōu)選地，所述抗體與生長(zhǎng)抑制劑綴合。優(yōu)選地，所述抗體與細(xì)胞毒劑，例如毒素、抗生素、分解酶或放射性同位素綴合。本發(fā)明的另一方面涉及一種組合物，其包含本發(fā)明的生物標(biāo)志或結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段。優(yōu)選地，所述組合物是藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種疫苗，其包含本發(fā)明的生物標(biāo)志或結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段。本發(fā)明的另一方面涉及在體液中可檢出的癌癥特異性生物標(biāo)志作為膀胱癌或肺癌生物標(biāo)志的用途。優(yōu)選地，所述用途是在選自下組的方法中臨床篩選，預(yù)后評(píng)估的方法，監(jiān)測(cè)療法的結(jié)果，用于鑒定最有可能響應(yīng)特定治療性處理的患者的方法，和藥物篩選和開發(fā)。本發(fā)明的另一方面涉及(i)本發(fā)明的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段在制造用于治療膀胱癌或肺癌的藥物中的用途。還提供了一種組合物，其包含(i)本發(fā)明的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段，其中所述組合物供膀胱癌或肺癌的治療中使用。本發(fā)明的另一方面涉及特異性結(jié)合本發(fā)明的生物標(biāo)志的抗體或其片段，其供對(duì)患者中的膀胱癌或肺癌成像的方法中使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療或診斷早期階段(例如在疾病癥狀出現(xiàn)前)的疾病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療或診斷臨床階段的疾病。依照本發(fā)明的另一方面，提供了供上文所描述的方法或用途中使用的試劑盒，其中所述試劑盒包含能夠結(jié)合或特異性識(shí)別在體液中可檢出的癌癥特異性生物標(biāo)志的配體和報(bào)告手段。優(yōu)選地，試劑盒是陣列或芯片。優(yōu)選地，試劑盒包含微量滴定板、測(cè)試條、陣列或芯片。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的例示性實(shí)施方案現(xiàn)在會(huì)參照附圖進(jìn)行描述。

圖1顯示了對(duì)來(lái)自患者的尿液中的EN2蛋白的分析，所述患者因疑似膀胱癌而進(jìn)行膀胱鏡檢查(cytoscopic examination)；圖2顯示了肺癌中的EN2表達(dá)；圖3顯示了 EN2存在于膀胱癌細(xì)胞的表面上；圖4顯示了 EN2的核酸序列(SEQ ID NO 1)；禾口圖5顯示了 EN2的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及膀胱癌特異性生物標(biāo)志和肺癌特異性生物標(biāo)志。在本說(shuō)明書內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“包含”解釋為指“包括，等等”。這些術(shù)語(yǔ)并不意圖解釋為“僅由...組成”。在本說(shuō)明書內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“約”指加或減20 %，更優(yōu)選地加或減10 %，甚至更優(yōu)選地加或減5 %，最優(yōu)選地加或減2 %。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指減輕源自所討論疾病的至少一種狀況或癥狀的嚴(yán)重性和/或改善源自所討論疾病的至少一種狀況或癥狀所需要的組合物的量。在本說(shuō)明書內(nèi)，已經(jīng)以如下的方式描述了實(shí)施方案，所述方式使得能夠?qū)懗銮宄液?jiǎn)明的說(shuō)明書，但是意圖并應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，實(shí)施方案可以在不背離本發(fā)明的前提下進(jìn)行各種組合或者分拆。對(duì)于臨床使用，將依照本發(fā)明的化合物或其前藥形式配制成藥物組合物，其配制為與其意圖的施用路徑，例如口服、直腸、胃腸外或其它施用模式相容。通常，通過混合活性物質(zhì)與常規(guī)的藥學(xué)可接受稀釋劑或載體來(lái)制備藥物配制劑。如本文中所使用的，語(yǔ)言“藥學(xué)可接受載體”意圖包括與藥物施用相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、等等。藥學(xué)可接受稀釋劑或載體的例子有水、明膠、阿拉伯樹膠、 乳糖、微晶纖維素、淀粉、羥基乙酸淀粉鈉、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、滑石、膠體二氧化硅、等等。 此類介質(zhì)和藥劑對(duì)藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域中公知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容，涵蓋其在組合物中的用途。此類配制劑也可以含有其它藥學(xué)活性劑和常規(guī)的添加劑，諸如穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、增香劑、緩沖劑、等等?？梢酝ㄟ^已知的方法，諸如?；?、壓縮、微囊化、噴霧涂層、等等來(lái)進(jìn)一步制備配制劑。可以通過常規(guī)的方法以片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、糖漿劑、懸浮液、栓劑或注射劑的劑量形式制備配制劑?？梢酝ㄟ^將活性物質(zhì)在水或其它合適的媒介物中溶解或懸浮來(lái)制備液體配制劑?？梢砸猿Ｒ?guī)的方式給片劑和顆粒劑加涂層。用于胃腸外、皮內(nèi)、或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括下列成分無(wú)菌稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑諸如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩沖劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及供調(diào)節(jié)張力用的藥劑諸如氯化鈉或右旋糖。PH可以用酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)，諸如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量管形瓶中。適合于可注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(在水溶性的情況中)或分散體和供即時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散體用的無(wú)菌粉劑。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，組合物必須是無(wú)菌的，而且應(yīng)當(dāng)是流體的，其程度使得存在容易的可注射性。它在制造和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，而且必須針對(duì)微生物諸如細(xì)菌和真菌的污染作用提供防護(hù)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇、等等)、及其合適的混合物?？梢岳缤ㄟ^使用涂層諸如卵磷脂、在分散體的情況中通過維持所要求的粒度、及通過使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑(例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞、等等)可以實(shí)現(xiàn)阻止微生物的作用。在許多情況中，組合物中包含等張劑(例如糖，多元醇諸如甘露醇、山梨醇、氯化鈉)會(huì)是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^在組合物中包含延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來(lái)引起可注射組合物的吸收延長(zhǎng)?？梢匀缦轮苽錈o(wú)菌可注射溶液，即根據(jù)需要在具有上文所列舉的一種組分或組分組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物(例如依照本發(fā)明的實(shí)施方案的化合物)，接著過濾滅菌。一般而言，通過將活性化合物摻入無(wú)菌媒介物中來(lái)制備分散體，所述無(wú)菌媒介物含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)及來(lái)自那些上文所列舉的組分的其它所需組分。在供制備無(wú)菌可注射溶液用的無(wú)菌粉劑的情況中，制備的優(yōu)選方法是自其先前無(wú)菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分和任何其它想要組分的粉末的真空干燥和冷凍干燥。一般而言，口服組合物包含惰性稀釋劑或可食用載體?？梢詫⑺鼈兎庋b入明膠膠囊中或者壓縮成片劑。出于口服治療性施用的目的，可以與賦形劑一起摻入活性化合物，并以片劑、錠劑、或膠囊劑形式使用。也可以使用流體載體來(lái)制備口服組合物而作為漱口液使用，其中口腔應(yīng)用流體載體中的化合物，嗖嗖漱口，并吐出或吞下?？梢园帉W(xué)相容的結(jié)合劑和/或輔助材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以含有任何下列組分或具有相似性質(zhì)的化合物粘合劑諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑諸如淀粉或乳糖；崩解劑諸如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；滑潤(rùn)劑諸如硬脂酸鎂或Merotes ；助流劑諸如膠體二氧化硅；甜味劑諸如蔗糖或糖精；或增香劑諸如薄荷、水楊酸甲酯、或桔味劑。對(duì)于通過吸入進(jìn)行的施用，從含有合適推進(jìn)劑(例如氣體諸如二氧化碳)的加壓容器或分配器，或噴霧器以氣溶膠噴射形式投遞化合物。系統(tǒng)施用也可以是通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮手段。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，在配制劑中使用適合于要滲透的屏障的滲透劑。一般而言，此類滲透劑是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如用于經(jīng)粘膜施用的去污劑、膽汁鹽、和梭鏈孢酸衍生物。可以經(jīng)由使用鼻噴霧或栓劑來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)粘膜施用。對(duì)于經(jīng)皮施用，將活性化合物配制成軟膏劑、油膏劑、凝膠劑、或乳膏，如本領(lǐng)域中普遍知道的。也可以以用于直腸投遞的栓劑(例如用常規(guī)栓劑基質(zhì)，諸如可可脂和其它甘油酯)或保留灌腸劑形式制備化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物與會(huì)保護(hù)該化合物免于從身體內(nèi)快速消除的載體一起制備，諸如受控釋放配制劑，包括植入物和微囊化投遞系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯、聚(酸)酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯 (polyorthoester)、和聚乳酸。用于制備此類配制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。材料也可以購(gòu)自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc0脂質(zhì)體懸浮液(包括用針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)可接受載體。這些可以依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備。為了容易施用和劑量的一致性以劑量單位形式配制口服或胃腸外組合物是特別有利的。如本文中所使用的，劑量單位形式指物理上離散的單元，其適合作為要治療的受試者的單一劑量；每個(gè)單元含有與所需要的藥學(xué)載體聯(lián)合的，預(yù)先確定數(shù)量的活性化合物，其根據(jù)計(jì)算，產(chǎn)生想要的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由下述各項(xiàng)規(guī)定，并直接依賴于下述各項(xiàng)所述活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和要實(shí)現(xiàn)的特定治療效果，和本領(lǐng)域中配合此類活性化合物以治療個(gè)體所固有的限制。可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)規(guī)程，例如用于測(cè)定LD50(群體 50%致死的劑量)和ED50(群體50%的治療有效劑量)的，從而測(cè)定此類化合物的毒性和治療功效。毒性與治療效果之間的劑量比率是治療系數(shù)，并且它可以以比率LD50/ED50表示。優(yōu)選展現(xiàn)出較大治療系數(shù)的化合物。雖然可以使用展現(xiàn)出毒性副作用的化合物，但是應(yīng)當(dāng)注意設(shè)計(jì)如下的投遞系統(tǒng)，其將此類化合物靶向受累及組織部位以使對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害最小化，并且由此降低副作用?？梢栽谂渲迫擞脛┝糠秶惺褂米约?xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，此類化合物的劑量位于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，其包括具有少許毒性或沒有毒性的ED50。劑量可以在此范圍內(nèi)變化，這取決于所采用的劑量形式和所利用的施用路徑。對(duì)于在本發(fā)明的方法中所使用的任何化合物，最初可以自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法評(píng)估治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量以實(shí)現(xiàn)循環(huán)血漿濃度范圍，其包括IC50(即實(shí)現(xiàn)對(duì)癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物濃度)，如在細(xì)胞培養(yǎng)物中所測(cè)定的?？梢允褂么祟愋畔?lái)更準(zhǔn)確地確定人中有用的劑量。可以例如通過高效液相層析來(lái)測(cè)量血漿中的水平。藥物組合物可以與施用指令一起包含在容器、包裝、或分配器中。在本說(shuō)明書內(nèi)，如本領(lǐng)域已知的，“同一性”是兩種或更多種多肽序列或兩種或更多種多核苷酸序列之間的關(guān)系，如通過比較所述序列所確定的。在本領(lǐng)域中，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列(視情況而定)之間的序列關(guān)聯(lián)性程度，如通過此類序列的串之間的匹配所確定的?？梢酝ㄟ^已知的方法來(lái)容易地計(jì)算百分比同一性，包括但不限于那些記載于 Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ.編，Oxford University Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith,D. W.編，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, I 部分，Griffin, A. M.禾口 Griffin, H. G.編，Humana Press, New Jersey,1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ； 及 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.禾口 Devereux, J.編，M Stockton Press, New York, 1991 ；及 Carillo, H.禾口 Lipman，D.，SIAM J. Applied Math. ,48 :1073(1988)的，通過提及而將它們都完整收入本文。用于測(cè)定同一性的優(yōu)選的方法設(shè)計(jì)為給出所測(cè)試序列間的最大匹配。在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼了用于測(cè)定同一性的方法。用于測(cè)定兩種序列間的百分比同一性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(1) :387 (1984)，通過提及而將其完整收入本文)、BLASTP、BLASTN、和 FASTA (Atschul， S. F.等，J. Molec. Biol. 215 :403-410(1990)，通過提及而將其完整收入本文)。BLAST X程序公眾自NCBI和其它來(lái)源可獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894 ；Altschul, S.等，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)，通過提及而將其完整收入本文)。作為例示，通過具有與參照核苷酸序列“SEQ ID NO :A”具有至少例如95% “同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，意圖該多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，只是該多核苷酸序列可以包含參照核苷酸序列“SEQ ID NO :A”的每100個(gè)核苷酸的多至5處點(diǎn)突變。換言之，為了獲得具有與參照核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以將參照序列中的多至5%的核苷酸刪除或者用另一種核苷酸替代，或者可以將參照序列中的總核苷酸的多至5%的許多核苷酸插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些突變可以在參照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置間的任何地方發(fā)生，其個(gè)別地點(diǎn)綴于參照序列中的核苷酸間或者以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組點(diǎn)綴在參照序列內(nèi)。類似地，通過具有與參照氨基酸序列“SEQ ID NO :B”具有至少例如95%同一性的氨基酸序列的多肽，意圖該多肽的氨基酸序列與參照序列相同，只是該多肽序列可以包含參照氨基酸序列“SEQ ID Ν0:Β”的每 100個(gè)氨基酸的多至5處氨基酸變化。換言之，為了獲得具有與參照氨基酸序列至少95% 相同的氨基酸序列的多肽，可以將參照序列中的多至5%的氨基酸殘基刪除或者用另一種氨基酸替代，或者可以將參照序列中的總氨基酸殘基的多至5 %的許多氨基酸插入?yún)⒄招蛄兄?。參照序列的這些變化可以在參照氨基酸序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置間
14的任何地方發(fā)生，其個(gè)別地點(diǎn)綴于參照序列中的殘基間或者以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組點(diǎn)綴在參照序列內(nèi)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”意圖描述彼此至少50%同源的編碼受體的核苷酸序列通常仍彼此雜交的雜交和清洗條件。該條件可以使得彼此至少約65%、 至少約70%、或至少約75%或更多同源的序列通常仍彼此雜交。此類嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且可以參見 Current Protocols m Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6，通過提及而將其完整收入本文。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)例子是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45°C雜交，接著在0. 2X SSC，0. 1 % SDS中于 50-65°C進(jìn)行一次或多次清洗。在一個(gè)實(shí)施方案中，在嚴(yán)格條件下與序列SEQ ID N0:1雜交的分離的受體核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文中所使用的，“天然存在的”核酸分子指具有自然界中存在的核苷酸序列(例如編碼天然蛋白質(zhì))的RNA或DNA分子。在本說(shuō)明書內(nèi)，“抗體或抗體片段”指無(wú)論自天然生成抗體的任何物種衍生，還是通過重組DNA技術(shù)創(chuàng)建；無(wú)論自血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌分離的抗體(例如 IgG, IgM, IgA, IgD 或 IgE)或片段(諸如 Fab、F(ab，)2、Fv、二硫化物連接的 Fv、scFv、 閉合構(gòu)象多特異性抗體、二硫化物連接的scFv、雙抗體)。在本說(shuō)明書內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“治療/處理”指對(duì)現(xiàn)有疾病的治療/處理和/或?yàn)榱祟A(yù)防疾病發(fā)生的預(yù)防性處理。因此，可以使用本發(fā)明的方法來(lái)進(jìn)行疾病的治療、預(yù)防、進(jìn)展抑制或發(fā)作延遲。術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志”遍及本領(lǐng)域使用，并且指過程、事件或狀況的獨(dú)特的生物學(xué)或生物學(xué)衍生的指示物。換言之，生物標(biāo)志指明某種生物學(xué)狀態(tài)，諸如癌性組織的存在。在一些情況中，不同形式的生物標(biāo)志可以指明某些疾病狀態(tài)，但是不限于理論，認(rèn)為僅僅本發(fā)明的生物標(biāo)志在體液諸如痰或尿液中的水平升高的存在分別指明肺癌或膀胱癌。雖然目前沒有設(shè)想分泌例如EN2肽的不同糖形，然而，這些被本發(fā)明所涵蓋。例如，還可以對(duì)EN2測(cè)定不同糖形，諸如改變的糖形結(jié)構(gòu)或糖含量，但是這些被涵蓋，而且甚至還可以指明膀胱癌或肺癌的進(jìn)展。還涵蓋EN2肽或其片段的截短、突變、或刪除、或連接。如上文所討論的，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了與正常組織相比，膀胱和肺腫瘤中的EN2 基因的表達(dá)顯著升高。此外，在膀胱癌患者的尿液中找到EN2。認(rèn)為EN-2可以被分泌或者可以由于自受損傷的或死亡的細(xì)胞泄漏而在體液中可檢出。此類升高的水平指明早期階段和晚期階段膀胱癌和肺癌。雖然對(duì)照或正常水平與早期階段膀胱癌和肺癌之間有顯著升高，但早期與晚期階段膀胱癌和肺癌之間也有非常顯著的升高。廣泛地，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以檢出該物質(zhì)和還有癌癥的狀態(tài)。這幫助預(yù)后和合適療法的供應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能在不訴諸于令人不快的且潛在有害的侵入規(guī)程(其還可能是不準(zhǔn)確的)的情況中提供準(zhǔn)確的診斷。此外，本發(fā)明是特別靈敏的。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以在任何其它檢測(cè)方法前和癌癥的明顯癥狀發(fā)作前檢測(cè)癌癥的發(fā)作。如此，癌癥可以在早期階段即在其更易受此類治療影響且不太可能已經(jīng)進(jìn)入轉(zhuǎn)移階段時(shí)治療?？梢栽谠\斷方法(例如臨床篩選)中及在預(yù)后評(píng)估、監(jiān)測(cè)療法的結(jié)果、鑒定最有可能響應(yīng)特定治療性處理的患者、和藥物篩選和開發(fā)的方法中使用本發(fā)明的生物標(biāo)志。此外， 本發(fā)明的生物標(biāo)志及其用途對(duì)于鑒定新的藥物治療及對(duì)于發(fā)現(xiàn)藥物治療的新靶物是有價(jià)值的。
15
術(shù)語(yǔ)“診斷”涵蓋鑒定、確認(rèn)、和/或表征膀胱癌或肺癌的存在或缺失，及其發(fā)展階段，諸如早期階段或晚期階段，或者良性或轉(zhuǎn)移性癌癥。
實(shí)施例膀胱癌中的EN2我們已經(jīng)研究了膀胱癌中的EN2表達(dá)。使用半定量PCR來(lái)比較三種不同TCC腫瘤中的EN2mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目與腫瘤鄰近的正常組織(“NAT”)中的數(shù)目。這揭示EN2在腫瘤中比在NAT中以大1457倍的水平表達(dá)。實(shí)施進(jìn)一步的研究以建立基因表達(dá)的此差異是否在膀胱癌患者的尿液中存在的 EN2蛋白的實(shí)際量中得到反映。為此，自因疑似膀胱癌而進(jìn)行膀胱鏡檢查的患者收集尿液。 使用20μ 1尿液來(lái)測(cè)定ΕΝ2蛋白，其使用下文所描述的方法經(jīng)由Western印跡來(lái)進(jìn)行。檢查總共62名患者，其中僅三名隨后診斷為患有膀胱癌。所有這三名個(gè)體在其尿液中都具有 EN2蛋白，而被發(fā)現(xiàn)沒有該疾病的59名個(gè)體沒有可檢出量的EN2蛋白。圖1中顯示了結(jié)果。肺癌中的EN2我們已經(jīng)研究了肺癌中的EN2表達(dá)。使用半定量PCR來(lái)比較三種不同NSCLC腫瘤中的EN2mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目與腫瘤鄰近的正常組織(“NAT”)和A549 (即一種自NSCLC腫瘤衍生的細(xì)胞系)中的數(shù)目。這揭示相對(duì)于NAT，EN2在腫瘤中和在A549細(xì)胞中分別以高觀.9倍和14. 6倍的水平表達(dá)。圖2中顯示了結(jié)果。所使用的方法1.來(lái)自尿液樣品的EN2蛋白的檢測(cè)(膀胱癌)通過Western印跡進(jìn)行的EN2蛋白檢測(cè)以10，OOOg將1. 5ml尿液離心5分鐘以除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后，將20μ1上清液與5μ1 LDL凝膠運(yùn)行緩沖液(Invitrogen) 禾口 2 μ 1還原劑(Invitrogen)直接混合，并加熱至70°C達(dá)10分鐘。通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)解析蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。以0. 5μ g/ml的濃度使用抗 EN2 抗體(Abcam，UK)。2.來(lái)自組織樣品的EN2RNA的檢測(cè)(膀胱和肺癌)定量PCR 首先通過加熱至65°C達(dá)5分鐘來(lái)使RNA變性。將1_5 μ g RNA在50 μ 1 體積中于37°C與終濃度IOmM DTTUmM dNTP混合物、及100ng/mlpolyT引物、200個(gè)單位的逆轉(zhuǎn)錄酶 Gnvitrogen，USA)和 40 個(gè)單位的 RNaseOUT (Invitrogen，USA) —起溫育 1 小時(shí)。 通過將管于80°C放置5分鐘來(lái)終止cDNA合成反應(yīng)。使用Mratagene MX4000實(shí)時(shí)PCR儀來(lái)實(shí)施RT-PCR，通過STOR綠色熒光在反應(yīng)的指數(shù)期期間測(cè)量PCR產(chǎn)物積累。相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白基因(其表達(dá)在許多細(xì)胞類型中是相對(duì)恒定的)的表達(dá)計(jì)算ΕΝ2的表達(dá)。3.膀胱癌細(xì)胞表面上的ΕΝ2的檢測(cè)將4種自膀胱癌衍生的細(xì)胞系與抗ΕΝ2抗體一起，接著與具有熒光標(biāo)簽的二抗一起溫育。然后，通過FACS分選細(xì)胞。圖3中顯示了結(jié)果。黑線顯示了僅用二抗處理的細(xì)胞， 而灰線顯示了用這兩者處理的細(xì)胞?；疑€向右移動(dòng)指明ΕΝ2蛋白在細(xì)胞表面上可用于一抗結(jié)合。這些結(jié)果顯示細(xì)胞系“TCC”、“EJ”和“BHK”而非“T24”在細(xì)胞表面上具有EN2 蛋白。組織取得膀胱和肺腫瘤RNA及來(lái)自正常鄰近組織的RNA購(gòu)自Ambion Inc, USA。
QPCR引物序列β-肌動(dòng)蛋白(人)HsBeta-ActinF :5，ATGTACCCTGGCATTGCCGAC 3，(SEQ ID NO 3)HsBeta-ActinR :5，GACTCGTCATACTCCTGCTTG 3' (SEQ ID NO 4)ΕΝ2(人)HsEN2F:5，GAACCCGAACAAAGAGGACA 3，(SEQ ID NO :5)HsEN2R:5，CGCTTGTTCTGGAACCAAAT 3，(SEQ ID NO :6)應(yīng)當(dāng)理解，本文中所描述的目前優(yōu)選的實(shí)施方案的各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的?？梢栽诓槐畴x本發(fā)明的精神和范圍的前提下及在不減少其附隨優(yōu)點(diǎn)的情況中進(jìn)行此類變化和修改。因此，意圖所附權(quán)利要求書覆蓋此類變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種膀胱癌特異性生物標(biāo)志，其包含(i)包含SEQ ID NO :1或其片段或變體的核酸序列，或包含所述核酸序列的核酸分子；或( )包含SEQ ID NO :2或其片段或變體的氨基酸序列，或包含所述氨基酸序列的氨基酸分子。
2.依照權(quán)利要求1的生物標(biāo)志，其中所述其片段或變體包含(i)與SEQID NO :1具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、 或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約 97%、或至少約98%、或至少約99%核酸序列同一性的核酸序列，在嚴(yán)格條件下與其可雜交的核酸序列，和/或與其互補(bǔ)的核酸序列；(ii)與SEQID NO :2具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、 或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約 97%、或至少約98%、或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(iii)由(i)的核酸序列編碼的氨基酸序列。
3.依照權(quán)利要求1或2的生物標(biāo)志，其中所述其片段包含(i)來(lái)自SEQIDNO 2的至少 4個(gè)、優(yōu)選地至少5個(gè)、優(yōu)選地至少6個(gè)、優(yōu)選地至少7個(gè)、優(yōu)選地至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸或 (ii)核酸序列SEQ ID NO 1中編碼來(lái)自SEQID NO 2的至少4個(gè)、優(yōu)選地至少5個(gè)、優(yōu)選地至少6個(gè)、優(yōu)選地至少7個(gè)、優(yōu)選地至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸的片段。
4.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，其中所述其片段或變體是其功能性片段或變體。
5.一種用于診斷患者中的膀胱癌或用于鑒定有風(fēng)險(xiǎn)形成膀胱癌的患者的方法，該方法包括(a)測(cè)定自患者獲得的樣品中的依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的量；(b)比較來(lái)自所述患者的樣品中測(cè)定的癌癥特異性生物標(biāo)志的量與正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量；其中與所述正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量相比，來(lái)自所述患者的樣品中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量的差異與膀胱癌的存在有關(guān)或者與形成膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。
6.依照權(quán)利要求5的方法，其用于檢測(cè)早期階段癌癥，其中所述對(duì)照與自所述患者獲得的樣品之間的增加指明早期階段癌癥。
7.依照權(quán)利要求5的方法，其用于檢測(cè)晚期階段癌癥，其中所述對(duì)照與自所述患者獲得的樣品之間的增加指明晚期階段癌癥。
8.一種用于監(jiān)測(cè)患者中的膀胱癌進(jìn)展的方法，該方法包括(a)測(cè)定自患者獲得的樣品中的依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的量；(b)比較來(lái)自所述患者的樣品中測(cè)定的癌癥特異性生物標(biāo)志的量與正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量；并(c)在兩個(gè)或更多個(gè)時(shí)間間隔重復(fù)步驟(a)和(b)，其中來(lái)自所述患者的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量隨時(shí)間增加與膀胱癌的進(jìn)展升高有關(guān)，且來(lái)自所述患者的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量隨時(shí)間減少與膀胱癌的進(jìn)展降低有關(guān)。
9.依照權(quán)利要求8的方法，其用于監(jiān)測(cè)癌癥階段的變化，其中相對(duì)于較早階段樣品或?qū)φ?，增加指明所述癌癥自疾病的較早階段進(jìn)展至較晚階段。
10.一種用于監(jiān)測(cè)治療對(duì)膀胱癌的功效的方法，包括檢測(cè)和/或量化自患者獲得的樣品中的依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的存在。
11.依照權(quán)利要求5至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包括自所述患者獲得的生物學(xué)流體或組織。
12.依照權(quán)利要求11的方法，其中所述生物學(xué)流體或組織包括尿液。
13.一種用于治療膀胱癌患者的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的(i)依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段。
14.依照權(quán)利要求13的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒劑綴合。
15.一種用于對(duì)患者中的膀胱癌成像的方法，該方法包括對(duì)患者施用特異性結(jié)合依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段。
16.依照權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體與可檢測(cè)標(biāo)志物綴合。
17.—種組合物，其包含依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或結(jié)合依照權(quán)利要求l·至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段。
18.一種藥物組合物，其包含依照權(quán)利要求17的組合物。
19.一種膀胱癌疫苗，其包含依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志。
20.在體液中可檢出的依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志作為膀胱癌生物標(biāo)志的用途。
21.(i)依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合依照權(quán)利要求1 至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段在制造用于治療膀胱癌的藥物中的用途。
22.—種組合物，其包含(i)依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段，其中所述組合物供膀胱癌治療中使用。
23.一種特異性結(jié)合依照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段，其供對(duì)患者中的膀胱癌成像的方法中使用。
24.一種試劑盒，其供依照權(quán)利要求5至16中任一項(xiàng)的方法或依照權(quán)利要求20的用途中使用，其中所述試劑盒包含能夠結(jié)合或特異性識(shí)別在體液中可檢出的依照權(quán)利要求1至 4中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的配體和報(bào)告手段。
25.一種肺癌特異性生物標(biāo)志，其包含(i)包含SEQID NO :1或其片段或變體的核酸序列，或包含所述核酸序列的核酸分子；或(ii)包含SEQID NO :2或其片段或變體的氨基酸序列，或包含所述氨基酸序列的氨基酸分子。
26.依照權(quán)利要求25的生物標(biāo)志，其中所述其片段或變體包含(i)與SEQID NO :1具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、 或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約 97 %、或至少約98 %、或至少約99 %核酸序列同一性的核酸序列，在嚴(yán)格條件下與其可雜交的核酸序列，和/或與其互補(bǔ)的核酸序列；(ii)與SEQID NO :2具有至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、 或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約 97%、或至少約98%、或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(iii)由(i)的核酸序列編碼的氨基酸序列。
27.依照權(quán)利要求25或沈的生物標(biāo)志，其中所述其片段包含(i)來(lái)自SEQIDNO :2的至少4個(gè)、優(yōu)選地至少5個(gè)、優(yōu)選地至少6個(gè)、優(yōu)選地至少7個(gè)、優(yōu)選地至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸或(ii)核酸序列SEQ ID NO 1中編碼來(lái)自SEQID NO 2的至少4個(gè)、優(yōu)選地至少5個(gè)、優(yōu)選地至少6個(gè)、優(yōu)選地至少7個(gè)、優(yōu)選地至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸的片段。
28.依照權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，其中所述其片段或變體是其功能性片段或變體。
29.一種用于診斷患者中的肺癌或用于鑒定有風(fēng)險(xiǎn)形成肺癌的患者的方法，該方法包括(a)測(cè)定自患者獲得的樣品中的依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的量；(b)比較來(lái)自所述患者的樣品中測(cè)定的癌癥特異性生物標(biāo)志的量與正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量；其中與所述正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量相比，來(lái)自所述患者的樣品中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量的差異與肺癌的存在有關(guān)或者與形成肺癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。
30.依照權(quán)利要求四的方法，其用于檢測(cè)早期階段癌癥，其中所述對(duì)照與自所述患者獲得的樣品之間的增加指明早期階段癌癥。
31.依照權(quán)利要求四的方法，其用于檢測(cè)晚期階段癌癥，其中所述對(duì)照與自所述患者獲得的樣品之間的增加指明晚期階段癌癥。
32.一種用于監(jiān)測(cè)患者中的肺癌進(jìn)展的方法，該方法包括(a)測(cè)定自患者獲得的樣品中的依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的量；(b)比較來(lái)自所述患者的樣品中測(cè)定的癌癥特異性生物標(biāo)志的量與正常對(duì)照中的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量；并(c)在兩個(gè)或更多個(gè)時(shí)間間隔重復(fù)步驟(a)和(b)，其中來(lái)自所述患者的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量隨時(shí)間增加與肺癌的進(jìn)展升高有關(guān)，且來(lái)自所述患者的所述癌癥特異性生物標(biāo)志的量隨時(shí)間減少與肺癌的進(jìn)展降低有關(guān)。
33.依照權(quán)利要求32的方法，其用于監(jiān)測(cè)癌癥階段的變化，其中相對(duì)于較早階段樣品或?qū)φ眨黾又该魉霭┌Y從疾病的較早階段進(jìn)展至較晚階段。
34.一種用于監(jiān)測(cè)治療對(duì)肺癌的功效的方法，包括檢測(cè)和/或量化自患者獲得的樣品中的依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的存在。
35.依照權(quán)利要求四至34中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包括自所述患者獲得的生物學(xué)流體或組織。
36.依照權(quán)利要求35的方法，其中所述生物學(xué)流體或組織包括痰。
37.一種用于治療肺癌患者的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的(i)依照權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合依照權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段。
38.依照權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒劑綴合。
39.一種用于對(duì)患者中的肺癌成像的方法，該方法包括對(duì)患者施用特異性結(jié)合依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段。
40.依照權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體與可檢測(cè)標(biāo)志物綴合。
41.一種組合物，其包含依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或結(jié)合依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段。
42.一種藥物組合物，其包含依照權(quán)利要求41的組合物。
43.一種肺癌疫苗，其包含依照權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志。
44.在體液中可檢出的依照權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志作為肺癌生物標(biāo)志的用途。
45.(i)依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合依照權(quán)利要求 25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段在制造用于治療肺癌的藥物中的用途。
46.一種組合物，其包含(i)依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志，或(ii)特異性結(jié)合依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段，其中所述組合物供肺癌治療中使用。
47.一種特異性結(jié)合依照權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)的生物標(biāo)志的抗體或其片段，其供對(duì)患者中的肺癌成像的方法中使用。
48.一種試劑盒，其供依照權(quán)利要求四至40中任一項(xiàng)的方法或依照權(quán)利要求44的用途中使用，其中所述試劑盒包含能夠結(jié)合或特異性識(shí)別在體液中可檢出的依照權(quán)利要求25 至28中任一項(xiàng)的癌癥特異性生物標(biāo)志的配體和報(bào)告手段。
全文摘要
描述了膀胱癌特異性生物標(biāo)志和肺癌特異性生物標(biāo)志，其包含Engrailed-2(EN2)基因的核酸序列或編碼的EN2蛋白的氨基酸序列。還描述了所述生物標(biāo)志在膀胱癌和肺癌的治療、診斷、監(jiān)測(cè)和成像中的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102301006SQ200980155785
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者H.S.潘達(dá), R.摩根 申請(qǐng)人:薩里大學(xué)