專利名稱：：具有纖維素分解增強活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述纖維素是單糖葡萄糖通過β-1，4_鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。本領(lǐng)域中有利的是改進(jìn)酶法降解木素纖維素原料的能力。WO2005/074647公開了來自土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽和它的多核苷酸。WO2005/074656公開了來自桔橙嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽和它的多核苷酸。WO2007/089290公開了來自里氏木霉(Trichodermareesei)的具有纖維素分解增強活性的多肽和它的多核苷酸。本發(fā)明提供具有纖維素分解增強活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列同一性；和(d)SEQIDNO2的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的成熟多肽的變體。本發(fā)明還涉及編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組(a)多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多核苷酸，其在至少高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列或(iii)(i)或()的全長互補鏈；(c)多核苷酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列同一性；和(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生具有纖維素分解增強活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制具有纖維素分解增強活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，所述方法包括對細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包括本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及這種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在存在本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽的情況下，用酶組合物處理纖維素材料。在一個優(yōu)選的方面，本方法進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)在存在本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽的情況下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在存在本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽的情況下，用酶組合物糖化纖維素材料。在一個優(yōu)選的方面，所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有纖維素分解增強活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強活性的多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至21，或由SEQIDNO2的氨基酸1至21組成；涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；并涉及產(chǎn)生蛋白的方法。附圖簡述圖1顯示具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌CGMCC0670GH61B多肽基因的基因組DNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQIDNO=I和2)。圖2顯示pXYG1051_ND0018601ong的限制圖譜。圖3顯示pXYZ1473的限制圖譜。圖4顯示具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽對由基礎(chǔ)纖維素酶混合物進(jìn)行的PCS水解的作用。所述基礎(chǔ)纖維素酶混合物的性能由實線所示。添加增加量的大約25kDaGH61B多肽至最低濃度的基礎(chǔ)纖維素酶混合物(1.0的相對蛋白加載)由帶圓圈的線顯示，而添加大約50kDaGH61B多肽由帶方塊的線代表。定義纖維素分解增強活性術(shù)語“纖維素分解增強活性”在本文中定義為增強具有纖維素分解活性的多肽水解纖維素材料的生物學(xué)活性。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素分解蛋白在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性l-50mg總蛋白/gPCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強活性的蛋白質(zhì)，在50-65°C歷時1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進(jìn)行的對照水解相比。在一個優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質(zhì)量的3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST1.5L(NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽具有GH61多肽的成熟多肽的纖維素分解增強活性的優(yōu)選至少20%，更優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。具有纖維素分解增強活性的多肽通過降低達(dá)到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。家族61糖苷水解酶術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.，禾口BairochΑ.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。纖維素分解活性術(shù)語“纖維素分解活性”在本文中定義為水解纖維素材料的生物學(xué)活性。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶)，如^iang等，OutlookforcellulaseimprovementScreeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvancesM:452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括WhatmanNo.1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用WhatmanNo.1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由hternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解蛋白/g的PCS中纖維素在50-65°C進(jìn)行3-7日，與未添加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。通常條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，ImMMnSO4,50-65°C，72小時，通過AMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)進(jìn)行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為內(nèi)切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合的β-1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006，BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)(ihose，1987，PureandApp1.Chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纖維素(CMC)水解來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶術(shù)語“纖維二糖水解酶”在本文中定義為l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(Ε.C.No.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含β_1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri，1997，Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofeellobiohydrolases,TrendsinBiotechnology15160-167；Teeri等，1998,Trichodermareeseieellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters149152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters187:283-288描述的方法使用熒光性二糖衍生物4-甲基傘形基-β-D-乳糖苷來測定纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶術(shù)語“β-葡糖苷酶”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(Ε.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非還原β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum!production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66^基本方法確定葡糖苷酶活性。一個單位的葡糖苷酶活性定義為在40°C，pH5，在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中由作為底物ImM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1.O微摩爾對硝基苯酚。木聚糖降解活性術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定義為水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(1)測定總木聚糖分解活性，和(測定單獨的木聚糖分解活性(內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronylesterase)).最近在木聚糖分解酶測定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個公開文獻(xiàn)中，包括Biely禾口Puchard，Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova禾口Biely，2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune，F(xiàn)EBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely禾口Kubicek，1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321375-381?？偰揪厶墙到饣钚钥赏ㄟ^確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalCo.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的Iml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)測定法進(jìn)行糖分析。木聚糖酶活性術(shù)語“木聚糖酶活性”在本文中定義為l，4-i3_D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)活性(Ε.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用樺木木聚糖作為底物確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在50°C，pH5從每升2g樺木木聚糖作為底物在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉中水解的起始時間過程中每分鐘產(chǎn)生1.Oμmol還原糖(以葡萄糖當(dāng)量(glucoseequivalents)測定，如Lever，1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述)。β-木糖苷酶活性術(shù)語“β-木糖苷酶活性”在本文中定義為β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(Ε.C.3.2.1.37)，其催化短β(1—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的β-木糖苷酶活性定義為在40°C，pH5從ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷作為底物在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生l.Oymol對硝基苯酚。乙酰木聚糖酯酶活性術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定義為羧基酯酶活性(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶?、乙?；咎恰⒁阴；咸烟恰⒁宜幡?萘酯(alpha-napthylacetate)禾口乙酸對石肖基苯酉旨(p—nitrophenylacetate)的水角軍。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.O中確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶活性定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。阿魏酸酯酶活性術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)活性”在本文中定義為4-羥基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶酶活性(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放出Iymol對硝基苯酚陰離子的酶量。α-葡糖醛酸糖苷酶活性術(shù)語“α-葡糖醛酸糖苷酶活性”在本文中定義為α_D_葡ft^f酸葡ftIl酸水角軍Bl舌f生(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998，J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個單位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出Iymol葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性術(shù)語“α_L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”在本文中定義為α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶活性(EC3.2.1.55)，其催化對α_L_阿拉伯糖苷中的末端非還原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶活性對α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200μ1中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘性小麥阿拉伯木MW(MegazymeInternationalIreland,Ltd.，Bray,Co.fficklow)^t400Cii^f30yM^,接著通過AMINEXHPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。纖維素材料纖維素材料可以是包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesΕ·Wyman編)，pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25695-719;Mosier等，，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65,pp.23-40，Springer-Verlag，NewYork)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素。在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面，纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭(cotton1inter)0在另一個方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法，如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸稈術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸稈“在本文中定義為通過用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸稈的纖維素材料。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，SignalP軟件(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1_6)預(yù)測SEQIDNO2的氨基酸1至21是信號肽，根據(jù)該預(yù)測，成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸22至354。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有纖維素分解增強活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個方面，SignalP軟件(Nielsen等，1997，見上)預(yù)測SEQIDNO:1的核苷酸1至63編碼信號肽，根據(jù)該預(yù)測，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸64至1112。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)使用EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)的Needle程序來測定，優(yōu)選3.0.0版或更高版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)使用EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序來測定，優(yōu)選3.0.0版或更高版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為在用SEQIDNO:2的具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌多肽進(jìn)行的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols中，S.Misener禾口S.A.Krawetz編，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的預(yù)測蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纖維素分解增強活性。在一個優(yōu)選方面，所述片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少285個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少300個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少315個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選的方面，所述片段約為25kDa。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽片段。在一個優(yōu)選方面，所述亞序列含有SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少855個核苷酸，更優(yōu)選至少900個核苷酸，并且最優(yōu)選至少945個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開的多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)0修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽，或由SEQIDNO:2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是具有纖維素分解增強活性的多肽，所述多肽由表達(dá)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:1或它們的同源序列的核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述具有纖維素分解增強活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性程度，所述多肽具有纖維素分解增強活性(下文中的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸22至354，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸22至354。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸22至3M或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸22至3M組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO=I的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測相應(yīng)的基因(例如，用％P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有纖維素分解增強活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含于SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列；其全長互補鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸64至1112。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)DSM22075中的質(zhì)粒PXYZ1473中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌DSM22075中的質(zhì)粒pXYZ1473中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在450C(非常低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴(yán)格性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比牛艮據(jù)Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二S1I內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至M小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的分離的多肽，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%的序列同一性程度，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四個方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸,如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn.Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，ScienceM4:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，纖維素分解增強活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton15等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.30959-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53-57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或W095/2^25公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837；美國專利No.5，223，409；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有纖維素分解增強活性的多肽的來源本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)>^LIf菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維素分解增強活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬O^eudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)屬多肽，其具有纖維素分解增強活性。在一個優(yōu)選方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、！軍^^I包If胃(BacillusamyIoliquefaciens)、fe|孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculms)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有纖維素分解增強活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium,鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)>MSM(Lentinula)、Leptospaeria>lifM(Magnaporthe)、Melanocarpus>多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有纖維素分解增強活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的解纖維枝頂？包霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、^^ffiβ(Aspergillusawamori)>ft#(Aspergillusfumigatus)>Iffiβ(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatumλ桿抱狀,廉抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓,廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米漂毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfunniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多月太。在更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌多肽。在一個最優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌CGMCC0670多肽，例如包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融18合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-ffilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過lector)(a蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割Gtevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1或由SEQIDNO1組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌DSM22075中所含質(zhì)粒pXYZ1473中所含的序列，或由大腸桿菌DSM22075中所含質(zhì)粒ρΧΥΖ1473中所含的序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸64至1112或由SEQIDNO:1的核苷酸64至1112組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌DSM22075中所含質(zhì)粒ρΧΥΖ1473中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌DSM22075中所含質(zhì)粒ΡΧΥΖ1473中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還涵蓋編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列分別不同于SEQIDNO1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強活性的SEQIDNO2的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變的核苷酸組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮氖葻嶙幽揖鷮倬辏蚱渌蛳嚓P(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可為例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%的序列同一性程度，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991,ProteinExpressionandPurification2:95一107。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Curminghan^Pflfells，1989，見上文)來鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的纖維素分解增強活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)格條件下，優(yōu)選低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴(yán)格條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)格條件下，將DNA群體與以下雜交⑴SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α_淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtac(DeBoerφ,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21—25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"TScientificAmerican，1980，242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其包含在曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實例包括修飾的啟動子，其包含在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉和米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號。可以將在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的信號肽，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可為必需的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至21，或者由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成。在另一個優(yōu)選方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至63，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至63組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)。或者，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。23細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthraniIatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霄的amdS禾口pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，可有利地用于具有纖維素分解增強活性的多肽的重組生產(chǎn)中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使載體如前所述作為染色體整體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742_751)或接合(參見，例如，Koehler禾口Thorne，1987，JournalofBacteriologyl69:5771_5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上文)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽角質(zhì)金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngu)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是米曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是Chrysosporiumlucknowense細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是嗜熱毀絲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是里氏木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是嗜熱子囊菌屬的細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是桔橙嗜熱子囊菌。在最優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是桔橙嗜熱子囊菌CGMCC0670。27本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)如本文所述，在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個(幾個)表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155_1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275_303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708_711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在W091/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995,Molecularandgeneralgenetics248:668_674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573_588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10:667_674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩個獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽；和(b)回收所述多肽。在實施方案中，除了直接用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過將具有本發(fā)明的構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的構(gòu)建體或其部分通過雜交而引入特定植物品種，而根本無需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，還包括此類植物的后裔(progeny)。如用于本文，后裔可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后代(offspring)。此種后裔可包含依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體，或依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體的一部分。在實施方案中，雜交導(dǎo)致本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因通過將起始種系與包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實例進(jìn)一步闡述于美國專利7，151，204號。涵蓋了包含本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽的植物包括通過回交轉(zhuǎn)化方法生成的植物。舉例而言，本發(fā)明的植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體(inbred)或雜交體(hybrid)的植物。在實施方案中，可使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對于常規(guī)育種的優(yōu)勢，在于其可用于避免由表型變異導(dǎo)致的錯誤。進(jìn)一步，遺傳標(biāo)記可在特定雜交的個體后裔中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當(dāng)本不(otherwise)具有非農(nóng)藝學(xué)所需的遺傳背景但具有所需性狀的植物與良種親本雜交時，可使用遺傳標(biāo)記來選擇不僅具有目標(biāo)性狀，還具有相對較大比例所需種質(zhì)的后裔。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。去除或減少纖維素分解增強活性本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。可以通過向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來進(jìn)行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時，通常通過如下方法來進(jìn)行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個或多個(幾個)核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件可以實現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細(xì)胞表達(dá)的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。在特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標(biāo)記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列?；蛘?，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術(shù)來進(jìn)行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細(xì)胞的表達(dá)，所述序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。由此在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和/或異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語“異源多肽”在本文中定義為對宿主細(xì)胞不是天然的多肽，進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術(shù)對宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵可產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞來生產(chǎn)基本上無纖維素分解增強活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法在發(fā)酵之前、過程中或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制纖維素分解增強活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標(biāo)產(chǎn)物，并且任選地將回收的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。在另一方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無纖維素分解增強活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法在允許產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行組合的PH和溫度處理以基本上減少纖維素分解增強活性，和從發(fā)酵液中回收產(chǎn)物?；蛘撸梢詫呐囵B(yǎng)液回收的酶制備物進(jìn)行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與用纖維素分解增強抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個方面，可能去除至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少99%的纖維素分解增強活性?？墒褂么朔椒ǐ@得纖維素分解增強活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11范圍內(nèi)的pH和至少60_70°C范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行一段足夠的時間以達(dá)到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無纖維素分解增強活性的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(anxiolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。纖維素分解增強-缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上感興趣的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長因子、受體等?？衫斫獾氖切g(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無纖維素分解增強活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。抑制具有纖維素分解增強活性的多肽表達(dá)的方法本發(fā)明還涉及抑制具有纖維素分解增強活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對細(xì)胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的雙鏈體核苷酸。dsRNA優(yōu)選是小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA(SiRNA)。在另一個優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的小RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中具有纖維素分解增強活性的多肽表達(dá)的這些雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的部分。本發(fā)明不受限于任何特定作用機制，dsRNA能進(jìn)入細(xì)胞，并引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內(nèi)源mRNA。當(dāng)細(xì)胞接觸dsRNA時，來自同源基因的mRNA選擇性地受到稱為RNA干擾(RNAi)的過程的降解。本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默。在一個方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述過程可以在體外、在活體外(exvivo)或在體內(nèi)進(jìn)行。在一個方面，dsRNA分子能夠用于產(chǎn)生細(xì)胞、器官或動物中的功能缺失突變(loss-of-functionmutation)。制備或使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領(lǐng)域中公知，參見，例如，美國專利No.6，506，559；美國專利No.6，511，824；美國專利No.6，515，109；和美國專利No.6，489，127。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的纖維素分解增強活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。纖維素材料的加工本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在存在本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽的情況下，用酶組合物處理纖維素材料。在一個優(yōu)選方面，所述方法還包括回收已降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)在存在本發(fā)明的具有纖維素分解增強活性的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在存在具有纖維素分解增強活性的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個優(yōu)選的方面，方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可以用于將纖維素材料糖化成可發(fā)酵糖，并且將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成很多有用的物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料的處理可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)過程完成。此外，本發(fā)明的方法能使用經(jīng)配置以依照發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)處理設(shè)備進(jìn)行。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個步驟中組合(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.，和Himmel，Μ.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15=817-827)0HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨的水解步驟，所述步驟可以在同一個反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，S卩，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個或多個(幾個)步驟中組合了所有三個過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將木素纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd，L.R.，ffeimer,P.J.，vanZyl,W.H.,禾口Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506_577)。在本文可以理解的是，本領(lǐng)域中任何已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實施本34發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel，2003，Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33_38；Gusakov,A.V.，禾口Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess，Enz.Microb.Technol.7:346_352)、研磨反應(yīng)器(Ryu,S.K.，和Lee，J.Μ.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor，Biotechnol·Bioeng·25:53_65)，或者具有由電磁場引起的強烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov，Α.V.，Sinitsyn,Α.P.，Davydkin,I.Y.，Davydkin,V.Y.，Protas，0.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield，Appl.Biochem.Biotechnol.56:141_153)。其它反應(yīng)器類型包括流化床、升流層(iipflowblmket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機型的反應(yīng)器。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料組分(Chmdra等，2007，SubstratepretreatmentThekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67_93；Galbe禾口Zacchi，2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41_65；Hendriks禾口Zeeman，2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.10010-18；Mosier等，2005，F(xiàn)eaturesofpromisingtechnologiesforpretreatmentof1ignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96673-686；Taherzadeh禾口Karimi,2008,Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651；Yang禾口Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costeellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.226-40)。纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行預(yù)浸泡、潤濕或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界吐0、臭氧和、輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行。或者，預(yù)處理可以與酶水解同時進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它部分，例如，半纖維素。將纖維素材料通過或穿過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170-190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于加入的任何化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理的停留時間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時間依賴于溫度范圍和加入的任何化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理允許相對較高的固體加載量，使纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff禾口Murray,1996，BioresourceTechnology8551-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618_628；美國專利申請No.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F(tuán)，并且得到的酸自催化纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等·，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756_762)。化學(xué)預(yù)處理術(shù)語“化學(xué)處理“指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻?yīng)器設(shè)計進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流式反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91179-188;Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93_115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85_150°C的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時間從1小時到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.961959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673_686)。WO2006/11089UW02006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-220°C進(jìn)行5_15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt禾口Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64139-151；Palonen等，2004,Appl.Biochem.Biotechnol.1171-17；Varga^,2004,Biotechnol.Bioeng.88567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.811669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨處理纖維素材料5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23_35；Chundawat等，2007,Biotechnol.Bioeng.96219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133_1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014_2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素_糖復(fù)合物得到切割。有機溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇(40-60%乙醇)在160_200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473_481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851_861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85，和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686，和美國專利公開申請2002/0164730所述。在一個方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進(jìn)行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的PH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至IOwt%酸，甚至更優(yōu)選0.1至5襯％酸，并且最優(yōu)選0.2至2.0wt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持?jǐn)?shù)秒到數(shù)分鐘，例如1秒-60分鐘的時間。在另一個方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)性30-60wt%，如約50wt%的量存在。預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機械預(yù)處理術(shù)語“機械預(yù)處理”指各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動球磨)。物理預(yù)處理術(shù)語“物理預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面，高壓指優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C的溫度。在一個優(yōu)選的方面，機械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進(jìn)行。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理可以對纖維素材料進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機械預(yù)處理。因此，在一個優(yōu)選的方面，對纖維素材料進(jìn)行機械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理術(shù)語“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)37素的微生物(參見，例如，Hsu,Τ.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass，于HandbookonBioethanol-ProductionandUtilization，Wyman，C.E編，Taylor&Francis，Washington，DC,179-212；Ghosh禾口Singh，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295_333；McMillan，J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomassareview，于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction，Himmel,Μ.E.，Baker，J.0.，禾口Overend，R.P.，編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC，第15章；Gong,C.S.，Cao,N.J.，Du,J.，禾口Tsao，G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.，編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal，1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312_331；禾口Vallander禾口Eriksson，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63_95)。糖化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將預(yù)處理的纖維素材料水解以將纖維素和任選地也將半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下進(jìn)行。所述組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。組合物的酶還可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最優(yōu)的條件下進(jìn)行。水解可以以補料批式或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將預(yù)處理的纖維素材料(底物)逐漸補入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時間、溫度和PH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達(dá)200小時，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約96小時，更優(yōu)選約16至約72小時，并且最優(yōu)選約24至約48小時。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且最優(yōu)選約40°C至約60°C，特別是約50°C。pH優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6，特別是約pH5。干燥固體含量優(yōu)選約5至約50wt%，更優(yōu)選約10至約40wt%，并且最優(yōu)選約20至約30wt%。所述酶組合物優(yōu)選包含具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性。在一個方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)木聚糖降解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和一種或多種(幾種)木聚糖降解酶。所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶優(yōu)選選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。所述一種或多種(幾種)木聚糖降解酶優(yōu)選選自下組木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。在另一個方面，所述酶組合物可進(jìn)一步或甚至進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)其他酶活性以改善含纖維素材料的降解。其他優(yōu)選的酶為半纖維素酶(例如α-D-葡糖酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、內(nèi)切-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯酶(glucuronoylesterases))，果膠酶，蛋白酶，木質(zhì)素水解酶(ligninolyticenzyme)(例如漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、H2O2產(chǎn)生酶、氧化還原酶)，棒曲霉素(expansin)、膨脹素(swollenin)或其組合。在本發(fā)明的方法中，其他酶可在發(fā)酵之前或之中添加，例如在糖化之中或在發(fā)酵微生物繁殖之中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)一種或多種(幾種)酶組合物的其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適用于本文中所述工藝的形式，如例如去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機酸來穩(wěn)定化。具有纖維素分解增強活性的酶和多肽的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶的混合物、含纖維素底物、含纖維素底物的濃度、含纖維素底物的預(yù)處理、溫度、時間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個優(yōu)選的方面，纖維素分解酶對于纖維素材料的有效量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.Omg,優(yōu)選約0.01至約40mg，更優(yōu)選約0.01至約30mg，更優(yōu)選約0.01至約20mg，更優(yōu)選約0.01至約10mg，更優(yōu)選約0.01至約5mg，更優(yōu)選約0.025至約1.5mg,更優(yōu)選約0.05至約1.25mg,更優(yōu)選約0.075至約1.25mg,更優(yōu)選約0.1至約1.25mg,甚至更優(yōu)選約0.15至約1.25mg,并且最優(yōu)選約0.25至約1.Omg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對于纖維素分解酶的有效量是約0.005至約1.Og,優(yōu)選約0.01至約1.Og,更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g，更優(yōu)選約0.1至約0.5g，甚至更優(yōu)選約0.1至約0.5g，并且最優(yōu)選約0.05至約0.2g每g纖維素分解酶。酶可源自或獲得自任何合適的來源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物來源。術(shù)語“獲得”在本文中意指該酶可從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物分離。術(shù)語“獲得”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生，其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個或多個(幾個)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過本領(lǐng)域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來酶的含義中涵蓋的是重組(如通過定位誘變或重排)獲得的變體具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽，其具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬蠟菌屬、Chaetomidium、金孢子菌屬、Claviceps>Cochliobolus、Coprinopsis>Coptotermes>Corynascus>Cryphonectria、β急球菌屬、Diplodia、Exidia、Filibasidium、鍵抱屬、赤霄屬、Holomastigotoides、腐質(zhì)霄屬、奉巴菌屬、Lentinula、L印tospaeria、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孑L菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、Trichophaea、輪枝孢屬、Volvariella或Xylaria多肽，其具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、Thielaviaachromatica,Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa>Thielaviaaustraleinsis>Thielaviafimeti>Thielaviamicrospora>Thielaviaovispora>Thielaviaperuviana、；)^—冑、毛梭孢殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木MTrichophaeasaccat已還可以使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述纖維素分解酶組合物的一種或多種組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨組分的DNA序列并隨即用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對宿主是異源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對宿主是同源的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白質(zhì)來制備。適用于本發(fā)明的商業(yè)性的纖維素分解蛋白制備物的實例包括，舉例而言，CELLICCtec(NovozymesA/S),CELLUCLAST(NovozymesA/S)、N0V0ZYM188(NovozymesA/S)、CELLUZYME(NovozymesA/S),CEREFL0(NovozymesA/S)和ULTRAFLO(NovozymesA/S)，ACCELERASE(GenencorInt.)、LAMINEX(GenencorInt.)、SPEZYMECP(GenencorInt.)，ROHAMENT7069W(RohmGmbH),FIBREZYMELDI(DyadicInternational，Inc.)、FIBREZYMELBR(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.Owt.%，更優(yōu)選固體的0.025到約4.Owt.%，且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.Owt.%的有效量添加。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.Owt.%，更優(yōu)選固體的0.025到約4.Owt.%，且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.Owt.%的有效量添加?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039;W093/15186；美國專利5，275，944；WO96/02551；美國專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)；和Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253_263；GENBANK登錄號M15665)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene6311-22;GENBANK登錄號M19373)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555_563；GENBANK登錄號AB003694)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249584-591；GENBANK登錄號Y11113)；以及里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219_228；GENBANK登錄號Z33381)；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch185884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439)；Erwiniacarotovara內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9_14)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號L29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號MAL515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號XM_324477)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V；嗜41熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號M15665)?？捎糜诒景l(fā)明的方法的纖維二糖水解酶的示例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I；里氏木霉纖維二糖水解酶II；特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II、土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II?？捎糜诒景l(fā)明的方法的葡糖苷酶的實例包括但不僅限于米曲霉葡糖苷酶；煙曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶;黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)WO2002/095014獲取。具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)WO2005/047499獲取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)WO2007/019442獲取。具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275=4973-4980獲取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287_288獲取。所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個方面，所述β-葡糖苷酶是根據(jù)WO2008/057637得到的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白或米曲霉β_葡糖苷酶變體BG融合蛋白。其它內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根據(jù)HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosy1hydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316禾口HenrissatB.禾口BairochΑ.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316695-696的分類公開于許多糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257、EP531，315、EP531,372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、W096/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、W098/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792、WO2002/101078、W02003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、W02004/048592、WO2005/001065,WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利No.4，435，307、美國專利No.5，457，046、美國專利No.5，648，263、美國專利No.5，686，593、美國專利No.5，691，178、美國專利No.5，763，254以及美國專利No.5，776，757。適用于本發(fā)明的商業(yè)性木聚糖降解酶制備物的實例包括，例如SHEARZYME(NovozymesA/S)、CELLICHtec(NovozymesA/S)、VISCOZYME(NovozymesA/S)、ULTRAFLO(NovozymesA/S)、PULPZYMEHC(NovozymesA/S)、MULTIFECTXylanase(Genencor)、ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM),DEP0L333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)、DEP0L740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEPOL762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;W094/21785)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(WO2006/078256)和土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)NRRL8126木聚糖酶(WO2009/079210)?？捎糜诒景l(fā)明方法的β-木糖苷酶的實例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)，埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號Q8X212)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登錄號Q7S0W4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO2005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q2GWX4)、細(xì)麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登錄號AAB82124)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2009/073709)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號Q9HGR3)和費希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號A1D9T4)。可用于本發(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登錄號AAR94170)。可用于本發(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號alccl2)、里氏木霉(Trichodermareesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q99024)、埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號Q8X211)、黑曲霉(Aspergillusniger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q0CJP9)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過在含有合適碳源和氮源和無機鹽，使用本領(lǐng)域己知方法(參見，例如Bennett,J.W.禾口LaSure，L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA，1991)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Bailey,J.Ε.禾口Ollis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。發(fā)璧?？赏ㄟ^一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)預(yù)處理和水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨或同時的。在本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(；和/或C5發(fā)酵生物體，或它們的組合。C6和C5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品。可產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627_642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773；假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，如運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)；克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大腸桿菌的菌株，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌菌株。在一個優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母44屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopimtiae)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentarmophilus)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.Ε.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運動發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996，見上文)。在一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED酵母(可從RedStar/Lesaffre，USA獲得)、FALI(可從Fleischmann，sYeast,BurnsPhilpFoodInc.,USA的部門獲得)、SUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(可從EthanolTechnology,WI,USA獲得)、BIOFERMAFT和XR(可從NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB,Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen禾口Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.641852-1859；Kotter禾口Ciriacy,1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776_783；Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.614184~4190；Kuyper等，2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4655-664；Beall等，1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296_303;Ingram等，1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:204_214；Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267240-243；Deanda^,1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabo1icpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.624465~4470；WO2003/062430,xyloseisomerase)。在一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0在另一個優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時，如約24至約60小時發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5,6或7。在一個優(yōu)選的方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時，如通常為24-60小時發(fā)酵。在一個優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且PH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4_7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOiq,特別是約2xl08活細(xì)胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“TheAlcoholTextbook"(K.Jacques,Τ.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通過提述并入本文。對于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾發(fā)酵的漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D禾口Ε。參見，例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebvavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002)，其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(C0))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖牵g(shù)語“醇”包括包含一個或多個羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,禾口Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Silveira,Μ.Μ.,禾口Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam,P.,禾口Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2)117-124；Ezeji,Τ.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603o在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435_4480在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮?？衫斫獾氖切g(shù)語“酮”包括含有一個或多個酮基的物質(zhì)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見上文。在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard，Α.,禾口Margaritis,Α.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47；禾口GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1—2)，pp.83—114，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。_可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。洗滌劑組合物本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽可添加至洗滌劑組合物而成為洗滌劑組合物的組分。本發(fā)明的洗滌劑組合物可配制為例如手洗或機洗的洗衣洗滌劑組合物，其包含適于預(yù)處理玷污的織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑(softener)組合物，或可配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或可配制為用于手動或機械洗碗操作。在一個具體方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多肽的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑以及所述洗滌劑組合物可包含一種或多種酶如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或過氧化物酶。一般而言所選酶的性質(zhì)應(yīng)與所選洗滌劑相容(即最適pH，與其他酶或非酶成分的相容性等)，且所述酶應(yīng)以有效量存在。^MMM合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如US4,435，307,US5，648，263,US5，691，178,US5，776，757號和WO89/09259中公開的，由特異腐質(zhì)酶、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有色彩維護(hù)(colourcare)益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的例子有EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中記載的纖維素酶。其它例子有纖維素酶變體，如WO94/07998、EP0531315、US5，457，046、US5，686，593、US5，763，254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中記載的那些。商業(yè)性使用的纖維素酶包括CELLUZYME和CAREZYME(NovozymesA/S)、CLAZINASE禾口PURADAXHA(GenencorInternationalInc.)禾口KAC—500(B)(KaoCorporation)。蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。優(yōu)選微生物來源。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和WO89/06270和WO9V25583中所述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實例是WO92/19729,WO98/20115,WO98/20116和WO98/34946中所述的變體，特別是在下述一個或多個位置有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE和KANNASE(NovozymesA/S)、MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE、PURAFECT、PURAFECTOXP、FN2和FN3(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶合適的脂肪酶包括那㈣細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬(Thermomyces))的脂肪酶，例如記載于EP258068和EP305216的來自疏棉狀腐質(zhì)霉(H.lanuginosa)(細(xì)毛嗜熱霉(T.Ianuginosus))或來自記載于WO96/13580的特異腐質(zhì)霉的脂肪酶，假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，024)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和W096/27002)、威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)的脂肪酶，或芽孢桿菌屬的脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，BiochemicaetBiophysicaacta1131，253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)的脂肪酶。其它實例為脂肪酶變體，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中記載的那些。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的脂肪酶包括LIP0LASE和LIP0LASEULTRA(NovozymesA/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括那些細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。淀粉酶包括例如得自芽孢桿菌屬例如在GB1，296，839中更詳細(xì)所述的地衣芽孢桿菌特定菌株的α-淀粉酶。有用的淀粉酶的實例為WO94/02597,WO94/18314,WO96/23873和WO97/43424中所述的變體，尤其是在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上可獲得的淀粉酶有DURAMYL、TERMAMYL、FUNGAMYL和BAN(NovozymesA/S)、RAPIDASE和PURASTAR(來自GenencorInternationalInc.)。過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的過氧化物酶的例子包括來自鬼傘屬(Coprinus)的過氧化物酶，例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變體，如WO93/24618、WO95/10602、和W098/15257中記載的那些。商業(yè)上可獲得的過氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)。可以通過添加分開的、含有一種或多種酶的添加劑或通過添加組合的、包含所有這些酶的添加劑將洗滌劑酶包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即單獨的添加劑或組合的添加劑，可配制為例如顆粒、液體、漿料等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制物是顆粒，特別是無粉塵的顆粒、液體特別是穩(wěn)定化的液體，或漿料。無粉塵的顆粒可以例如如US4，106，991和4，661，452中公開的產(chǎn)生，并且可以任選地通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法進(jìn)行包覆。蠟質(zhì)包覆材料的實例是具有1000至20000的平均摩爾重量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20個碳原子且其中存在15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。適于通過流化床技術(shù)施用的成膜包覆材料的實例在GB1483591中給出。例如，可以通過根據(jù)已確立的方法添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來使液體酶制備物穩(wěn)定。受保護(hù)的酶可根據(jù)EP238，216中公開的方法來制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉末、顆粒(granule)、糊劑(paste)或液體。液體洗滌劑可以是水性的，通常含有多至70%水和0-30%有機溶劑，或是非水性的。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是非離子的(包括半-極性的)和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。表面活性劑通常以按重量計0.1%至60%的水平存在。當(dāng)包含于其中時，洗滌劑通常會含有約至約40%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate),α-鏈烯烴磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondaryalkanesulfonate),α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂類(soap)。當(dāng)包含于其中時，洗滌劑將通常含有約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)，，)。洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增效劑(builder)或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽/酯、三磷酸鹽/酯、膦酸鹽/酯(phosphonate)、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例是羧甲基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸鹽/酯(polycarboxylate)例如聚丙烯酸鹽/酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可含有漂白體系，所述體系可包含H2A源例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，可將其與形成過酸的漂白活化劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?；蛘撸左w系可包含過氧酸，例如酰胺、二酰亞胺或砜型的過氧酸?？梢允褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑使本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶穩(wěn)定化，所述穩(wěn)定劑例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，并且所述組合物可按例如TO92/19709和WO92/19708中所述配制。洗滌劑也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分例如織物調(diào)節(jié)劑，包括粘土、泡沫促進(jìn)劑(foambooster)、抑泡劑(sudssuppressor)、抗腐燭劑、懸污劑(soil-suspendingagent)、防污物再沉積劑(anti-soilredepositionagent)、染料、殺菌劑、光學(xué)增亮劑、助水溶物(hydrotrope)、晦暗抑制劑(tarnishinhibitors)或香料。在洗滌劑組合物中，可以以相當(dāng)于0.Ol-IOOmg酶蛋白每升洗滌液，優(yōu)選0.05_5mg酶蛋白每升洗滌液，特別是0.I-Img酶蛋白每升洗滌液的量添加任何酶。在洗滌劑組合物中，可以以相當(dāng)于每升洗滌液0.OOl-IOOmg蛋白、優(yōu)選0.005-50mg蛋白，更優(yōu)選0.01_25mg蛋白，甚至更優(yōu)選0.05_10mg蛋白，最優(yōu)選0.05_5mg蛋白，且甚至最優(yōu)選0.Ol-Img蛋白的量添加本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽。還可將本發(fā)明具有纖維素分解增強活性的多肽并入WO97/07202中公開的洗滌劑配制物，將WO97/07202通過提述并入本文。信號月太本發(fā)明還涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至21，或由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成。本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因可操作地連接于此種多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含SEQIDNO2的氨基酸1至21，或由SEQIDNO2的氨基酸1至21組成的信號肽，其中所述基因?qū)幋a所述信號肽的多核苷酸是外源的。在一個優(yōu)選的方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO=I的核苷酸1至63，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至63組成。本發(fā)明還涉及包含這種核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼蛋白的基因，所述基因可操作地連接于此種編碼信號肽的多核苷酸，其中所述基因?qū)幋a所述信號肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質(zhì)獲得，其中一個或多個(幾個)對于宿主細(xì)胞可以是異源或天然的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)的天然存在的等位基因變異和工程的變異。優(yōu)選蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報告蛋白(reporter)。在一個更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶。在一個更加優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑等級的商業(yè)產(chǎn)品。菌株將桔橙嗜熱子囊菌CGMCC0670用作具有纖維素分解增強活性的多肽的來源。將米曲霉JaL355菌株(W02005/070962)用于表達(dá)具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌CGMCC0670多肽。培養(yǎng)基PDA平板由39克的馬鈴薯右旋糖瓊脂和去離子水加至1升組成。YG培養(yǎng)基由5.Og的酵母提取物、10.Og的葡萄糖和去離子水加至1升組成。YG瓊脂平板由5.Og的酵母提取物、10.Og的葡萄糖、20.Og的瓊脂和去離子水加至1升組成。YPM培養(yǎng)基由IOg的酵母提取物、20g的細(xì)菌蛋白胨、20g的麥芽糖和去離子水加至1升組成。麥麩固體培養(yǎng)基由30g的麥麩、0.18g的酵母提取物、0.045g的KH2P04、0.225g的MgSO4·7H20、0.675g的葡萄糖和去離子水加至1升組成。LB平板由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、IOg的氯化鈉、15g的瓊脂和去離子水加至1升組成。SOC培養(yǎng)基由2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl,2.5mMKClUOmMMgCl2和IOmMMgSO4組成；通過高壓滅菌來除菌，然后添加經(jīng)過濾滅菌的葡萄糖至20mM。實施例1制備桔橙嗜熱子囊菌菌株CGMCC0670菌絲體用于cDNA文庫產(chǎn)生將桔橙嗜熱子囊菌菌株CGMCC0670接種至YG瓊脂平板上，并在黑暗中在45°C溫育4日。將幾個菌絲體-YG瓊脂栓接種入含有100mlYG培養(yǎng)基的500ml搖瓶。將燒瓶在450C以^Orpm攪拌溫育2日。然后將大約2ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含有麥麩固體培養(yǎng)基的500ml搖瓶，并將接種的搖瓶在45°C不攪拌地溫育3日。收集來自固體培養(yǎng)基的菌絲體，并將其凍結(jié)于液氮中，然后在-80°C冷凍器中儲藏直至使用。實施例2桔橙嗜熱子囊菌菌株CGMCC0670RNA分離將冷凍的菌絲體轉(zhuǎn)移至經(jīng)液氮預(yù)冷的杵和研缽，并用少量經(jīng)烘焙的石英砂磨碎至細(xì)粉。根據(jù)Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5四4_5299從粉末狀菌絲體通過用硫氰酸胍提取然后通過5.7MCsCl墊超離心來制備總RNA0根據(jù)Aviv等，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:1408-1412通過寡聚(dT)-纖維素親和層析來分離富含polyA的RNA。實施例3桔橙嗜熱子囊菌菌株CGMCC0670cDNA文庫的構(gòu)建雙鏈cDNA是根據(jù)Gubler和Hoffman，1983，Gene25:263-269；Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch,E.F.禾口Maniantis,T.MolecularCloning-ΛLaboratoryManual,2nded.,1989,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork；以及Kofod等，1994,J.Biol.ChemJ69:29182-29189的一般方法，使用NotI-(dT)18引物(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway，NJ,USA)合成的。在合成之后，cDNA用綠豆核酸酶處理，用T4DNA聚合酶平端化，并連接于EcoRI銜接頭(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)。將cDNA用NotI切割，并將cDNA通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳使用44mMTris堿、44mM硼酸和0.5mMEDTA(TBE)緩沖液進(jìn)行大小分級。將700bp和更大的cDNA級分從凝膠切出，并使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行純化。然后對制備的cDNA進(jìn)行定向克隆，即使用T4連接酶(Promega，Madison，WI，USA)依照生產(chǎn)商的指示將其連接入經(jīng)EcoRI-NotI切割的pMHas5(W02004/013350)。將連接混合物使用GENEPULSER禾口PulseController(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)以200歐姆，25mF，1.8kV和2mm間隙(gap)小杯依照生產(chǎn)商的指示電穿孔入大腸木干胃DHlOBMM(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN,USA)。將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞鋪板于補充每ml10(^8氨芐青霉素的1^平板。從起始？1^狀5載體連接液的總共30000個轉(zhuǎn)化體制備cDNA質(zhì)粒匯集庫(pool)。直接從菌落的匯集庫使用QIAGEN-tip10(KQIAGENGmbHCorporation,Hilden,Germany)制備質(zhì)粒DNA。實施例4構(gòu)建含有β-內(nèi)酰胺酶報道基因的SigA4轉(zhuǎn)座子從含有WO2001/77315中描述的質(zhì)粒的pSigA2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建含有命名為pSigA4的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子，以創(chuàng)建具有減少的選擇背景的信號俘獲轉(zhuǎn)座子(signaltrappingtransposon)pSigA2的改善形式。所述pSigA2轉(zhuǎn)座子含有在該轉(zhuǎn)座子自身上編碼的無信號的β-內(nèi)酰胺酶構(gòu)建體。將PCR用于構(gòu)建見于質(zhì)粒骨架上的完整內(nèi)酰胺酶基因的缺失，使用校正讀碼的PROOFSTARTDNA聚合酶^jIAGENGmbHCorporation,Hilden,Germany)和下述5’磷酸化的引物(TAGCopenhagen,Denmark)采用PCR以產(chǎn)生存在于質(zhì)粒骨架上的完整β-內(nèi)酰胺酶基因的缺失SigA2NotU-P5，-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3，(SEQIDNO3)SigA2NotD-P5，-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3，(SEQIDNO4)所述擴增反應(yīng)物由1μ1的pSigA2(10ng/l·!υ、5μ1的IOXPROOFSTARTBuffHQIAGENGmbHCorporation,Hilden,Germany),2.5μ1的dNTP混合物(20mM)、0.5μ1的SigA2NotU-P(IOmM)、0·5μ1的SigA2NotD_P(IOmM)、10μ1的Q溶液(QIAGENGmbHCorporation,Hilden,Germany)和31.25μ1的去離子水。將擴增反應(yīng)物在PTC-200DNAENGINEThermalCycler(MJResearchInc.，Waltham，MA，USA)中溫育，其程序為1循環(huán)，在95°C進(jìn)行5分鐘；和20個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，62°C進(jìn)行30秒和72°C進(jìn)行4分鐘。通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳使用40mMTris堿_20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉(TAE)緩沖液和每升0.Iyg的溴乙錠分離3.91ΛPCR反應(yīng)產(chǎn)物。DNA條帶用EAGLEEYEImagingSystem(Stratagene,LaJolla,CA,USA)協(xié)助在360nm顯現(xiàn)。將3.9kbDNA條帶53從凝膠切出，并使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行純化。將該3.9kb片段在16°C用10單位T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Inc.，Beverly,MA,USA)、9μ1的該3.9kbPCR片段禾口1μ1的IOX連接緩沖液(NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA,USA)自連接過夜。將連接反應(yīng)物在65°C熱失活10分鐘，然后用DpnI在37°C消化2小時。在溫育之后，使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit純化消化液。然后將純化的物質(zhì)依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于補充每ml25μg的氯霉素的LB平板之上。從幾個轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒小量制備物，并用BglII消化。選擇一個具有正確構(gòu)建的質(zhì)粒。將質(zhì)粒命名為pSigA4。質(zhì)粒pSigA4含有與WO01/77315中公開的相同的側(cè)翼為BglII的轉(zhuǎn)座子SigA2。將質(zhì)粒pSigA4DNA(0.3μg/μ1)的60μ1樣品用BglII消化，并使用TBE緩沖液通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將21Λ的SigA2轉(zhuǎn)座子DNA條帶用200μ1的EB緩沖液toIAGENGmbHCorporation,Hilden,Germany)洗脫，并使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行純化，并在200μ1的EB緩沖液中洗脫。將SigA2用于轉(zhuǎn)座子協(xié)助的信號俘獲。實施例5桔橙嗜熱子囊菌CGMCC0670的轉(zhuǎn)座子協(xié)助的信號俘獲對于轉(zhuǎn)座子協(xié)助的信號俘獲的完整描述可見于WO2001/77315。從起始cDNA-pMHas5載體連接液的總共50000個轉(zhuǎn)化體制備cDNA質(zhì)粒匯集庫。質(zhì)粒DNA是從由補充了每ml100μg氨芐青霉素的LB平板回收的菌落匯集物使用QIAPREPSpinMidi/MaxiprepKit(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)直接制備的。用轉(zhuǎn)座子SigA2和MuA轉(zhuǎn)座酶(FirmzymesΟΥ,Espoo,Finland)依照生產(chǎn)商的指示處理所述質(zhì)粒匯集庫。對于桔橙嗜熱子囊菌CGMCCNO.0670cDNA文庫的體外轉(zhuǎn)座子標(biāo)記，將含有大約IOOng的DNA的4μ1SigA2轉(zhuǎn)座子與含有3μg的DNA，1μ1的MuA轉(zhuǎn)座酶(0.22μg/μ1)和4μ1的5Χ緩沖液(FinnzymesΟΥ,Espoo,Finland)的桔橙嗜熱子囊菌CGMCCNO.0670cDNA文庫的5μ1質(zhì)粒DNA匯集庫在總體積20μ1中混合，并在37°C溫育2.5小時，然后在70°C熱失活10分鐘。將DNA通過添加2μ1的3M乙酸鈉ρΗ5和55μ1的96%乙醇沉淀，并以10000xg，4°C離心30分鐘。將沉淀在70%乙醇中洗滌，并在室溫干燥，并重懸于7μ1去離子水。將1.5μ1體積的轉(zhuǎn)座子標(biāo)記質(zhì)粒匯集庫依照生產(chǎn)商的步驟使用GENEPULSER和PulseController以25uF，25mAmp,2.5kV用2mm間隔小杯電穿孔入40μ1的大腸桿菌ElectroMAXDH10B細(xì)胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)。將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞在37°C在SOC培養(yǎng)基中以225rpm攪拌溫育1小時，然后鋪板于下述選擇培養(yǎng)基補充了50μg每ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基；補充了50μg每ml卡那霉素和15μg每ml氯霉素的LB培養(yǎng)基；和補充了50μg每ml卡那霉素、15μg每ml氯霉素和15μg每ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。從將電穿孔液鋪板于補充了50μg每ml卡那霉素、15μg每ml氯霉素和15μg每ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在30°C3日之后觀察到大約269個菌落。將所有菌落平板復(fù)制(replicaplate)至補充了50μg每ml卡那霉素、15μg每ml氯霉素和50μg每ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。在該選擇條件下回收了總共188個菌落。進(jìn)行進(jìn)一步的電穿孔和鋪板實驗直至從該三重選擇下回收了總共550個菌落。使用QIAPREP96TurboMiniprepKit(QIAGENGmbHCorporation，Hilden，Germany)小量制備所述菌落。用下述所示的轉(zhuǎn)座子正向和反向引物(引物A和B)依照WO01/77315(頁)公開的步驟對質(zhì)粒進(jìn)行測序。引物A:5，-AGCGTTTGCGGCCGCGATCC-3，(SEQIDNO5)引物B:5，-TTATTCGGTCGAAAAGGATCC_3，(SEQIDNO6)實施例6序列匯編(assembly)和注釋(annotataion)獲取DNA序列以供在MEGABACE500DNAAnalysisSystem(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)上的反應(yīng)。修整對于每個質(zhì)粒讀取的(readsforeachplasmid)引物A和引物B序列以去除載體和轉(zhuǎn)座子序列，產(chǎn)生了208個經(jīng)匯編的序列，通過使用程序PhredPhrap(Ewing等，1998,GenomeResearch8:175-185；Ewing禾PGreen,1998,GenomeResearch8:186-194)將其分組為83個重疊群(contig)。隨后將所有83個重疊群與在標(biāo)準(zhǔn)的公共DNA和蛋白序列數(shù)據(jù)庫(TrEMBL，SffALL,PDB,EnsemblP印，GeneSeqP)可獲得的序列使用程序BLASTX2.0al9MP-ffashU[14-Jul-1998][Buildlinux_x8618:514430-Jul-1998](Gish等，1993，Nat.Genet.3:266-72)進(jìn)行比較。通過分析BlastX結(jié)果直接鑒定了家族GH6IB候選物。實施例7從基因組DNA克隆桔橙嗜熱子囊菌gh61b基因基于cDNA序列，涉及了下述所示的寡核苷酸引物以從桔橙嗜熱子囊菌菌株CGMCC0670的基因組DNA擴增gh61b基因。有義引物5'-TATCAATTGATGTCGTTCTCGAAGATTGCTG-3'(SEQIDNO7)反義引物5'-TATGCGGCCGCTCTGTTCAGCGCATGTCGTT-3'(SEQIDNO8)擴增反應(yīng)物由IXREDDYMIXPCRBuffer(ThermoFisherScientificlnc.，ffaltham,MA,USA)、0·75單位的ThermoPrimeTaqDNAPolymerase(ThermoFisherScientificInc.，ffaltham,MA,USA)、75mMTris-HCl(在25°CpH為8.8)、20mM(NH4)2S04、0.01%(v/v)TWEEN20、0.2mMdNTPs禾口1.5mMMgCl2以及0.2μM的每種引物和0.5-1μg的桔橙嗜熱子囊菌基因組DNA(使用標(biāo)準(zhǔn)方法分離)組成。將擴增反應(yīng)物在PTC-200DNAENGINEThermalCycler中溫育，其程序為在94°C的2分鐘起始變性，然后35個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行15秒，并在60°C進(jìn)行組合的退火和延伸2分鐘。將大約1.Ikb的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳使用TAE緩沖液進(jìn)行純化，從凝膠切出，并使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行純化。然后將純化的DNA條帶克隆入用MfeI/NotI消化的質(zhì)粒pXYG1051(W02005/080559)。對四個所得的質(zhì)粒插入物使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行Sanger測序。所有質(zhì)粒含有明顯由PCR擴增引入的突變。選擇一個僅在編碼區(qū)具有沉默突變的質(zhì)粒以供進(jìn)一步研究，并命名為pXYG1051-ND0018601ong(圖2)。表達(dá)載體pXYG1051含有來源于黑曲霉的相同的中性淀粉酶II(NA2)啟動子，以及作為PCaHj483的終止子元件(公開于WO98/00529的實施例4)。此外，PXYG1051具有供在大腸桿菌中進(jìn)行選擇和繁殖的pUC18來源的序列，以及供在曲霉屬中由米曲霉的pyrG基因所促進(jìn)的選擇和表達(dá)的pDSY82(公開于美國專利5，958，727號的實施例4)來源的序列，所述pyrG基因編碼乳清苷脫羧酶并用于補足pyrG突變的曲霉屬菌株。為了將桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽基因亞克隆入pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，將含有CDS和內(nèi)含子的長片段通過PCR從pXYG1051_ND0018601ong使用下述所示分別含有HindIII和NotI限制位點的引物ND1860-3F和ND1860-2R進(jìn)行擴增，以允許將其亞克隆入pCR2.1。ND1860-3F5，-cccaagcttatgtcgttctcgaagattgctg-3，(SEQIDNO9)ND1860-2R5，-tatgcggccgctctgttcagcgcatgtcgtt-3，(SEQIDNO:10)所述擴增反應(yīng)物由IXREDDYMIXPCRBuffer,0.75單位的ThermoPrimeiTaqDNA聚合酶、75mMTris-HCl(在25。CpH為8.8)、20mM(NH4)2S04、0.01%(ν/ν)TWEEN20、0.2mMdNTPs和1.5mMMgCl2,以及0.2μM的每種引物和0.1μg的質(zhì)粒DNA0將該擴增反應(yīng)物在PTC-200DNAENGINEThermalCycler中溫育，其程序為在94°C進(jìn)行2分鐘起始變性，然后25個循環(huán)，每個循環(huán)在94°C進(jìn)行15秒，并在65°C進(jìn)行組合的退火和延伸2分鐘。將擴增產(chǎn)物使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行凝膠純化。然后將經(jīng)HindIII和NotI消化的PCR產(chǎn)物通過連接入使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆入經(jīng)HindIII-NotI消化的pCR2.1以得至IjpXYZ1473(圖3)。通過Sanger測序確證了PXYZ1473中的桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽基因插入物。將大腸桿菌pXYZ1473在2008年12月2日保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)，并分配登錄號DSM22075。實施例8編碼具有纖維素分解增強活性的家族GH61B多肽的桔橙嗜熱子囊菌基因組序列的表征具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽的基因組DNA序列的核苷酸序列(SEQIDNO1)和推出的氨基酸序列(SEQIDNO2)示于圖1。該基因組多核苷酸為IlMbp(包含終止密碼子)，由一個50bp的內(nèi)含子中斷，并編碼3M個氨基酸的多肽。包含內(nèi)含子的全長編碼序列和成熟編碼序列的％G+C含量，分別為55.2%和55.8%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1_6)預(yù)測了21個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白含有333個氨基酸，并具有34.6kDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，NucleicAcidsRes.35:D224_D228)分析具有纖維素分解增強活性的GH61B多肽的推出的氨基酸序列顯示GH61B多肽含有糖基水解酶家族6ianterPro登錄號IPR005103)的序列特征。該序列特征見于成熟多肽的大約殘基1至220(Pfam登錄號PF03443)。使用如EMBOSS的Needle程序中所實施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)及缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5和EBL0SUM62矩陣來確定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，桔橙嗜熱子囊菌GH61B成熟多肽的推定的氨基酸序列與來自桔橙嗜熱子囊菌的另一個家族61糖基水解酶蛋白的推定的氨基酸序列(UniProt登錄號AEC05922)具有77.2%的同一性(缺口除外)。實施例9具有纖維素分解增強活性的重組桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽在米曲霉中的產(chǎn)生將表達(dá)質(zhì)粒pXYG1051-ND0018601ong依照WO98/00529中所述的實驗方案轉(zhuǎn)化入米曲霉JaL355。將轉(zhuǎn)化體通過單個分生孢子在選擇平板上純化，然后將其在PDA平板上進(jìn)行孢子形成。桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽通過轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生是根據(jù)在^TC在含2%麥芽糊精的YP培養(yǎng)基中Iml96深孔靜態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)上清來分析的。通過NU-PAGE10%Bis-TrisSDS-PAGE(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)由考馬斯染色驗證表達(dá)。選取一個轉(zhuǎn)化子以供進(jìn)一步研究，并命名為米曲霉ND1860。對于更大規(guī)模的產(chǎn)生，將米曲霉ND1860孢子涂布于PDA平板上，并在34°C溫育五日。將匯集的孢子平板用5ml的0.01%TWEEN20洗滌兩次以將收集的孢子數(shù)最大化。然后將孢子懸液用于接種500ml燒瓶中的IOOmlYPM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在以200rpm的恒定振蕩進(jìn)行溫育。在接種之后第四日，通過經(jīng)由0.22μmEXPRESSPlusMembrane(Mi11ipore,Bedford,MA,USA)的過濾收集培養(yǎng)液。新鮮的培養(yǎng)液產(chǎn)生大約50kDa的GH61B蛋白條帶。在4°C對培養(yǎng)液的后續(xù)溫育后，所述大約50kDa的條帶緩慢地降解為大約37kDa和大約25kDa的主要條帶。這些條帶作為桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽的片段的身份通過質(zhì)譜法得以驗證。實施例10桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽纖維素增強活性的測定如實施例9中所述制備米曲霉ND1860的培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液使用Amicon超離心裝置(Mi11ipore,Bedfored,MA,USA；IOkDa聚醚砜膜，40psi，4°C)濃縮約20倍。將經(jīng)濃縮的培養(yǎng)液脫鹽(HIPREP26/10脫鹽柱，GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)至20mMTris-HClpH8.0，然后施于經(jīng)20mMTris-HClpH8.0平衡的20mlMONOQ柱(HR16/10，GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。將結(jié)合的蛋白用15個柱體積以20mMTris-HClpH8.0中從OmM至500mMNaCl的鹽梯度洗脫。通過8-16%SDS-PAGE凝膠檢查級分，并揭示25kDa的多肽在大約160mMNaCl洗脫，而大約50kDa多肽在大約210mMNaCl洗脫。兩者樣品通過SDS-PAGE凝膠判斷均>85%純。蛋白濃度是通過SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色之后的密度法來估計的。將玉米秸稈依照WO2005/074647作為測定底物預(yù)處理并制備以生成經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)。用于測定增強活性的基礎(chǔ)纖維素酶混合物是從里氏木霉菌株SMA135制備的(W02008/057637)。使用1.6ml深孔板(Axygen,SantaClara,CA.)，使用1.Oml的總反應(yīng)體積和ImM硫酸鎂_50mM乙酸鈉，pH5.0中50mg/ml的PCS濃度，進(jìn)行PCS的水解。以基礎(chǔ)纖維素酶混合物的蛋白濃度的0至100%范圍的濃度向基礎(chǔ)纖維素酶混合物加入每種桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽。在50°C溫育168小時。實驗通常一式三份進(jìn)行。離心等分試樣，并通過使用板式離心機(SORVALLRT7，ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)以3000rpm離心(MULTISCREENHV0.45μm,Millipore,Billerica,MA,USA)10分鐘而過濾上清液。不立即使用時，在-20°C冷凍經(jīng)過濾的水解物等分試樣。在65°C，以0.6ml/分鐘的流速從4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-IadLaboratories，Inc.，Inc.，Hercules,CA,USA)通過包含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4洗脫后，測定在包含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4中稀釋的樣品的糖濃度，通過積分使用折射率檢測(CHEMSTATION,AGILENT1100HPLC，AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)的葡萄糖和纖維二糖信號而定量，所述檢測由純糖樣品(AbsoluteStandardsInc.,Hamden,CT,USA)校準(zhǔn)。使用得到的當(dāng)量計算每個反應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化百分比。使用下式計算纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖加纖維二糖的程度(轉(zhuǎn)化率，％)轉(zhuǎn)化率(%)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xl00xl62/(纖維素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xlOO/(纖維素(mg/ml)xl.Ill)在這個等式中，因數(shù)1.111反映將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖中的重量增加，而因數(shù)1.053反映將纖維二糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖中的重量增加。通過有限消化PCS而釋放葡萄糖和纖維二糖，來確定PCS中的纖維素。向基礎(chǔ)纖維素酶混合物中加入漸增量的桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽的結(jié)果示于圖4。基礎(chǔ)纖維素酶混合物的性能在圖4中由水平線所示。添加大約25kDa的桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽允許將達(dá)到80%葡聚糖轉(zhuǎn)化率所需的總蛋白質(zhì)加載減少至少1.50倍。與之相對，添加大約50kDa桔橙嗜熱子囊菌GH61B多肽并未提供達(dá)到80%葡聚糖轉(zhuǎn)化率所需的總蛋白加載的減少，表明大約25kDa的多肽是桔橙嗜熱子囊菌GH61B的活性形式。生物材料的保藏下述的生物材料已經(jīng)依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(DSM),MascheroderWeg1B，D_38124Braunschweig，Germany，并給予下述的登錄號保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌pXYZ1473DSM220752008年12月2日所述菌株于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，依據(jù)該外國專利法律的授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律可以獲得所述保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，實施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。通過下述編號段落進(jìn)一步描述本發(fā)明[1]具有纖維素分解增強活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。[2]段1的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少80%序列同一性。[3]段2的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。[4]段3的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少90%序列同一性。[5]段4的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少95%序列同一性。[6]段5的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少97%序列同一性。[7]段1的多肽，其包含SEQIDNO2的氨基酸序列或由SEQIDNO2的氨基酸序列組成；或其具有纖維素分解增強活性的片段。[8]段7的多肽，其包含SEQIDNO2的氨基酸序列或由SEQIDNO2的氨基酸序列組成。[9]段1的多肽，其包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成。[10]段1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈。[11]段10的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少非常高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈。[12]段1的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列同一性。[13]段12的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少85%序列同一性。[14]段13的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少90%序列同一性。[15]段14的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少95%序列同一性。[16]段15的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少97%序列同一性。[17]段1的多肽，其由包含SEQIDNO1的核苷酸序列或由SEQIDNO1的核苷酸序列組成的多核苷酸；或其編碼具有纖維素分解增強活性的片段的亞序列編碼。[18]段17的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或由SEQIDNO1的核苷酸序列組成。[19]段1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。[20]段1的多肽，其中所述多肽是SEQIDNO:2的成熟多肽的包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。[21]段1的多肽，所述多肽由質(zhì)粒PXYZ1473中含有的多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒PXYZ1473包含在大腸桿菌DSM22075中。[22]段1-21中任一項的多肽，其中成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸22至354。[23]段1-22中任一項的多肽，其中成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸64至1112。[24]分離的多核苷酸，其包含編碼段1-23中任一項的多肽的核苷酸序列。[25]段M的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。[26]核酸構(gòu)建體，其包含段M或25的多核苷酸，所述多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中產(chǎn)生。[27]重組表達(dá)載體，其包含段沈的核酸構(gòu)建體。[28]重組宿主細(xì)胞，其包含段沈的核酸構(gòu)建體。[29]用于產(chǎn)生段1-23中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。[30]用于產(chǎn)生段1-23中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[31]用于產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼段1-23中任一項的多肽或其一部分的多核苷酸，其導(dǎo)致突變體與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽。[32]由段31的方法產(chǎn)生的突變細(xì)胞。[33]段32的突變細(xì)胞，其進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白的基因。[34]產(chǎn)生蛋白的方法，其包括(a)在有助于所述蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段33的突變細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白。[35]段對或25的分離的多核苷酸，其通過下述方法獲得(a)在至少高嚴(yán)格條件下將DNA群體與下述雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。[36]段35的分離的多核苷酸，其通過下述方法獲得(a)在至少非常高嚴(yán)格條件下將DNA群體與下述雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。[37]段35或36的分離的多核苷酸，其中成熟多肽編碼序列是SEQIDNO=I的核苷酸64至1112。[38]用于產(chǎn)生包含突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突變核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽，所述方法包括(a)向SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中引入至少一個突變，其中突變核苷酸序列編碼包含SEQIDNO2的成熟多肽，或者由SEQIDNO:2的成熟多肽組成的多肽；和(b)回收所述包含突變核苷酸序列的多核苷酸。[39]由段38的方法產(chǎn)生的突變多核苷酸。[40]產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含段39的編碼所述多肽的突變多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[41]產(chǎn)生段1-23中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[42]轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼段1-23中任一項的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。[43]雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子，其包含段M或25的多核苷酸的亞序列，其中dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。[44]段43的雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子，其為長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長的雙鏈體核苷酸。[45]用于抑制具有纖維素分解增強活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對細(xì)胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子，或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包括段M或25的多核苷酸的亞序列。[46]段45的方法，其中dsRNA為長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長的雙鏈體核苷酸。[47]分離的多核苷酸，其編碼信號肽，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至21或由SEQIDNO2的氨基酸1至21組成。[48]核酸構(gòu)建體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于段47的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ谒龆嗪塑账崾峭庠吹?。[49]重組表達(dá)載體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于段47的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的。[50]重組宿主細(xì)胞，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于段47的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的。[51]用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有助于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于段47的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述多肽。[52]組合物，其包含段1-23中任一項的多肽。[53]洗滌劑組合物，其包含段1-23中任一項的多肽。[54]降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在段1-23中任一項的具有纖維素分解增強活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。[55]段M的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)過預(yù)處理。[56]段討或55的方法，其中酶組合物包含選自下組的一種或多種纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[57]段Μ-56中任一項的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶木聚糖酶、半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或過氧化物酶。[58]段Μ-57中任一項的方法，其進(jìn)一步包括回收已降解的纖維素材料。[59]段58的方法，其中已降解的纖維素材料是糖。W0]段59的方法，其中糖選自下組葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，和阿拉伯糖。[61]產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)在存在段1_23中任一項的具有纖維素分解增強活性的多肽存在下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從所述發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[62]段61的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。W3]段61或62的方法，其中所述酶組合物包含選自下組的一種或多種纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[64]段61-63中任一項的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含選自下組的一種或多種酶木聚糖酶、半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或過氧化物酶。W5]段61-64中任一項的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時進(jìn)行。W6]段61-65中任一項的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。[67]發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料在存在段1-23中任一項的具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下，用酶組合物糖化。[68]段67的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[69]段68的方法，其進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[70]段67-69中任一項的方法，其中所述纖維素材料在糖化前經(jīng)過預(yù)處理。[71]段67-70中任一項的方法，其中所述酶組合物包含選自下組的一種或多種纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[72]段67-71中任一項的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含選自下組的一種或多種酶木聚糖酶、半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或過氧化物酶。[73]段67-72中任一項的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機酸、酮、氨基酸，或氣體。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因為這些方面旨在作為本發(fā)明幾個方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.具有纖維素分解增強活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(c)由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼的多肽，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列同一性；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有纖維素分解增強活性的片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。3.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽由下述質(zhì)粒中所含的多核苷酸編碼包含在大腸桿菌DSM22075中的質(zhì)粒pXYZ1473。4.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-3中任一項的多肽的核苷酸序列。5.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-3中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。6.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-3中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。7.用于產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1-3中任一項的多肽或其部分的多核苷酸，其導(dǎo)致突變體與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽。8.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-3中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。9.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼權(quán)利要求1-3中任一項的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。10.包含權(quán)利要求4的多核苷酸的亞序列的雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。11.用于抑制具有纖維素分解增強活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對所述細(xì)胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子，或者在所述細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含權(quán)利要求4的多核苷酸的亞序列。12.分離的多核苷酸，其編碼信號肽，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至21或由SEQIDNO2的氨基酸1至21組成。13.用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有助于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。14.洗滌劑組合物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項的多肽。15.用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在權(quán)利要求1-3中任一項的具有纖維素分解增強活性的多肽存在下，用酶組合物處理纖維素材料。16.權(quán)利要求15的方法，還包括回收已降解的纖維素材料。17.產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)在權(quán)利要求1-3中任一項的具有纖維素分解增強活性的多肽存在下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從所述發(fā)酵中回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。18.發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在權(quán)利要求1-3中任一項的具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下用酶組合物糖化所述纖維素材料。19.權(quán)利要求18的方法，其中纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。全文摘要本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于制備和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N15/56GK102300986SQ200980155719公開日2011年12月28日申請日期2009年12月4日優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日發(fā)明者N.斯波德斯伯格,P.哈里斯,R.克雷默申請人:諾維信公司,諾維信股份有限公司