專利名稱：PRE-rRNA比率測量分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和測定樣品中活細(xì)胞的存在。更具體來說，本發(fā)明涉及檢測樣品中以非常少的數(shù)量存在的活細(xì)胞。包括了用于檢測樣品中作為活微生物的動態(tài)指示物的核糖體RNA前體(pre-rRNA)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
微生物例如細(xì)菌病原體可能難以從復(fù)雜的臨床和環(huán)境樣品中培養(yǎng)。它們可能存在數(shù)量少，或處于鋪板效率低下的受傷和衰老的生理狀態(tài)中。樣品常常具有在非選擇性培養(yǎng)基上生長超過病原體的競爭性微生物菌群，而選擇性培養(yǎng)基可能降低收率并針對某些菌株進(jìn)行選擇。大多數(shù)基于培養(yǎng)的檢測方法需要1-3天才能產(chǎn)生結(jié)果，對于許多情況、特別是威脅生命的情況來說太慢。細(xì)菌培養(yǎng)的一種替代方案是核酸擴(kuò)增檢測(NAAT)。最常用的NAAT類型——聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，既快速又靈敏。PCR的局限性是它不能將活的病原體細(xì)胞與非活細(xì)胞、樣品中的游離核酸和檢測過程中引入的污染核酸區(qū)分開。PCR在機(jī)械上也是復(fù)雜的，并易受樣品中物質(zhì)的抑制。當(dāng)PCR被用于評估抗微生物治療、消毒(例如水處理)和凈化方法的效力時，這些限制特別成問題。為了提高用于活微生物的NAAT的靈敏度和特異性，降低或消除非活微生物和游離DNA的假陽性檢測將是有價值的。一種方法是檢測微生物的RNA而不是DNA。據(jù)認(rèn)為， RNA在溶液和死細(xì)胞中不如DNA穩(wěn)定。用于核糖體RNA(rRNA)或信使RNA(mRNA)的種特異性探針是已知的。然而，微生物的mRNA由于其不穩(wěn)定性和低豐度而難以檢測Oiedalanga 和Olson. 2009.開發(fā)定量PCR方法用于區(qū)分環(huán)境水樣中的活細(xì)菌和非活細(xì)菌(Development of a quantitative PCR method to differentiate between viable and nonviable bacteria in environmental water samples. )Appl Microbiol Biotechnol.82 587-596)。相反，成熟的rRNA相當(dāng)穩(wěn)定，并且能夠在死的細(xì)菌細(xì)胞中堅持長時間。發(fā)明概述為了提高對活細(xì)胞的靈敏度和特異性，可以使用用于微生物rRNA前體 (pre-rRNA)的測定方法。Pre-rRNA是rRNA合成中通過多順反子的rrs_rrl_rrf操縱子轉(zhuǎn)錄本的快速溶核切割而產(chǎn)生的中間體。前導(dǎo)和尾部片段隨后在與核糖體裝配相關(guān)的較慢反應(yīng)中被移除，產(chǎn)生成熟的rRNA亞基。在正在生長的細(xì)菌細(xì)胞中，pre-rRNA占總rRNA的一個大的部分。Pre-rRNA甚至比細(xì)菌中表達(dá)最強(qiáng)的mRNA分子都明顯更豐富和更容易檢測。此外，在營養(yǎng)刺激后，它們的細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)快速增加，這種動態(tài)性質(zhì)有助于解釋臨界性結(jié)果， 從而提高了對樣品中以非常少的數(shù)量存在的細(xì)胞進(jìn)行的檢測的功能靈敏度。此外，它們常
6常具有種特異性序列，便于通過NAAT在復(fù)雜樣品中對它們進(jìn)行檢測。正如在本文中所公開的，開發(fā)了檢測種特異性pre-rRNA分子的NAAT。Pre-rRNA 是成熟rRNA合成中的中間體。它們是豐富的細(xì)胞組分，具有高度種特異性的核苷酸序列。 這使得它們成為在復(fù)雜樣品中檢測微生物病原體的良好的靶。當(dāng)微生物細(xì)胞經(jīng)歷營養(yǎng)刺激時，Pre-rRNA的拷貝數(shù)增加幾個數(shù)量級。這種響應(yīng)非?？焖?< 1個代時)，并且由于受刺激細(xì)胞中pre-rRNA的豐富性而易于檢測。在受刺激和對照樣品中對pre-rRNA進(jìn)行定量 PCR測量得到數(shù)值比率。如果為正，這些比率證實了樣品中存在完整的、活的病原體細(xì)胞。 當(dāng)定量PCR信號非常弱時，正的比率增加了測定結(jié)果表示真陽性結(jié)果的可靠度。這提高了測定方法的功能靈敏度。從下面參考附圖進(jìn)行的優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述中，其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。附圖簡述

圖1顯示了在LB肉湯上從靜止期開始的生長過程中pre_16S rRNA和成熟16S rRNA 的儲量(pools)。圖2顯示了在靜止期的牛分枝桿菌(M. bovis)BCG營養(yǎng)刺激后的pre_16S rRNA儲量。圖3顯示了在水饑餓的嗜水氣單胞菌(A. hydrophila) (A)和鳥分枝桿菌 (M. avium) 104株⑶細(xì)胞中pre-rRNA的營養(yǎng)刺激的時間過程。圖4顯示了活的嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)細(xì)胞的存在與pre-rRNA刺激比率 (A)或次氯酸鹽處理的實驗室懸液中通過qPCR定量的基因組DNA(B)之間的相關(guān)性。圖5顯示了在源自于單一淡水湖樣品的配對刺激和對照等份試樣上進(jìn)行的多次 RT-qPCR反應(yīng)的結(jié)果。圖6列出了可以被本文公開的RPA方法靶向的靶微生物的屬和種的實例。圖7顯示了 qPCR引物的實例，包括用于所指稱生物體的供選的正向、反向和反轉(zhuǎn)錄酶引物。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述公開了可用于本公開的組合物和方法、可以與本公開的組合物和方法聯(lián)合使用、 可用于制備本公開的組合物和方法或者是本公開的組合物和方法的產(chǎn)物的材料、組合物和組分。在本文中公開了這些以及其他的材料，并且應(yīng)該理解，當(dāng)這些材料的組合、亞組、相互作用、組等被公開時，盡管可能沒有明確公開地具體提到這些化合物的每個不同的個體和集合性組合和排列，但它們每個都在本文中具體考慮到并描述。例如，如果公開并討論了寡核苷酸，并且討論了可以對多個分子包括寡核苷酸進(jìn)行多個修飾，那么寡核苷酸與可能的修飾的每個和所有組合和排列都被具體考慮到了，除非特別指明不是如此。這一概念適用于本申請的所有方面，包括但不限于制造和使用本公開組合物的方法中的步驟。因此，如果存在多種可以執(zhí)行的其它步驟，應(yīng)該理解這些其它步驟中的每個都可以與本公開方法的任何特定實施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合一起執(zhí)行，并且每個這樣的組合被具體考慮到了并應(yīng)該被視為已被公開。使用不超出常規(guī)的實驗，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將識別出或能夠確定本文所描述的方法和組合物的具體實施方案的等價物。這些等價物打算被所包含的權(quán)利要求書涵蓋。
應(yīng)該理解，本文中使用的術(shù)語僅僅是為了描述具體實施方案的目的而不打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只受隨附的權(quán)利要求書的限制。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有本說明書所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員所通常理解的意義。必須指出，當(dāng)在本文中和隨附的權(quán)利要求書中使用時，無具體數(shù)量的指稱物包括其復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確表明不是如此。因此，例如指稱“微生物”包括多個這樣的微生物，指稱“該(所述)微生物”是指一種或多種微生物及其本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的等價物，依此類推。本文中描述的化合物和方法利用pre-rRNA的補(bǔ)充作為對活微生物細(xì)胞特異的NAAT的基礎(chǔ)。當(dāng)微生物生長緩慢或停止時，pre-rRNA合成降低但是其加工繼續(xù)，導(dǎo)致 pre-rRNA儲量活躍而顯著的排空。當(dāng)生長受限的細(xì)胞被提供新鮮營養(yǎng)物時，pre-rRNA儲量快速得到補(bǔ)充。這種波動在完整的、活的微生物細(xì)胞中始終如一地發(fā)生。它們在具有游離核酸或具有其他類型的背景測定“噪音”的死細(xì)胞中不能看到。Pre-rRNA序列具有與成熟rRNA的最高變區(qū)相當(dāng)?shù)奶禺愋浴Ｒ虼?，通過pre_rRNA 檢測可以將給定物種與其他物種的活微生物細(xì)胞區(qū)分開。此外，通過測量已用營養(yǎng)物短暫刺激過的樣品中細(xì)胞的pre-rRNA，可以將活微生物細(xì)胞與相同物種的死細(xì)胞區(qū)分開。將刺激過的樣品中存在的pre-rRNA水平與未刺激過的對照樣品相比較，當(dāng)刺激過的樣品中種特異性pre-rRNA超過對照樣品時，表明了活細(xì)胞的存在。這種比率測量方法在本文中稱為 Pre-rRNA比率測量分析(RPA)。正如本文中所公開的，RPA可以通過將樣品分成兩份或多份等份試樣來進(jìn)行，其中至少一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激，并且至少一份等份試樣作為未刺激對照進(jìn)行處理。將營養(yǎng)刺激過的樣品中pre-rRNA的水平與對照樣品中的pre-rRNA水平進(jìn)行比較，其中在刺激過的樣品中pre-rRNA的補(bǔ)充表明了樣品中的活細(xì)胞。在一個實施方案中，RPA可以包括使用樣品的兩份相等的等份試樣，其中一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激，而另一份保留在未營養(yǎng)刺激的對照中。在< 1個代時的營養(yǎng)刺激后， 對種特異性pre-rRNA進(jìn)行經(jīng)比率測量進(jìn)行定量，以確定pre-rRNA刺激比率值。在一個實施方案中，營養(yǎng)刺激可以持續(xù)靶微生物的< 1代時、< 1/2代時、< 1/3代時、< 1/4代時和 < 1/8代時的時間。營養(yǎng)刺激步驟的持續(xù)時間對于微生物數(shù)量的甚至有限的擴(kuò)增來說都是不夠的。因此，RPA不會培養(yǎng)物富集。在一個這樣的實施方案中，pre-rRNA刺激比率值是刺激過的樣品中pre-rRNA水平相對于對照樣品的比率。在特定實施方案中，使用pre-rRNA 刺激值確定樣品中活微生物細(xì)胞的存在。例如，當(dāng)營養(yǎng)刺激過的等份試樣中的pre-rRNA值大于未刺激的對照等份試樣中的pre-rRNA值時，表明存在活微生物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在特定實施方案中，本文公開的RPA方法可用于檢測活的靶微生物，所述活微生物的數(shù)量顯著低于同物種的失活或死微生物。在一個實施方案中，可以執(zhí)行RPA 以檢測樣品中的活微生物，在所述樣品中約0.01%至99%的靶微生物是活微生物。在一個這樣的實施方案中，RPA可用于檢測活的靶微生物的存在，所述活的靶微生物在樣品中存在的水平為靶微生物總?cè)后w(活的+死的)的約0. 01%、0. 02%、0. 03%、0. 04%、0. 05%、 0. 1%,0. 5%U. 0%,2. 0%,3. 0%,4. 0%,5. 0%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%, 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和 95%。當(dāng)在本文中使用時，樣品中活的靶微生物的百分率是活的靶微生物數(shù)量與活的和失活的兩種靶微生物的總數(shù)的比較。本文描述的RPA可以在各種不同類型的特定樣品上執(zhí)行。在一個這樣的實施方案中，本文使用的樣品可以是從可能潛在地包含目標(biāo)細(xì)胞的任何所需來源或位置收集的樣品。在一個實施方案中，樣品可以從液體、固體、氣體、復(fù)合材料、組織或任何其他所需基質(zhì)獲取。樣品可以從戶外環(huán)境或戶內(nèi)環(huán)境獲取，或者在其他實施方案中，樣品可以是從對象獲取的組織、流體或拭子樣品。在一個這樣的實施方案中，組織樣品可以是血液、唾液、痰液、 糞便、尿液、毛發(fā)、皮膚或從對象身體獲取的任何其他樣品。出于本說明書的目的，術(shù)語“對象”是指人類、動物或植物對象。此外，用于采用本文描述的RPA方法進(jìn)行分析的樣品可以從自然環(huán)境、工業(yè)環(huán)境、衛(wèi)生護(hù)理環(huán)境、居住環(huán)境、農(nóng)業(yè)環(huán)境、配水環(huán)境、廢水處理環(huán)境、食品生產(chǎn)或配送環(huán)境、娛樂環(huán)境或任何所需環(huán)境或其組合來收集。樣品可以包含無機(jī)和/或有機(jī)材料，并可以從海水環(huán)境或淡水環(huán)境收集，并可以包含灰塵、巖石、土壤、植被、空氣及其組合。適合于本文描述的RPA的樣品可以包括目標(biāo)細(xì)胞，其可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在具體實施方案中，微生物可以是革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌或另一種類型的細(xì)菌。因此，本文描述的RPA方法可適用于檢測在一種或多種情形包括人類和獸醫(yī)臨床情況下具有重要性的一種或多種微生物。例如，在一個實施方案中，本文描述的RPA方法可用于檢測食源性和水源性微生物。在另一個實施方案中，本文公開的RPA可用于生物防御和檢測用于生物武器的微生物。在另一個實施方案中，本文描述的RPA方法可用于傳染病診斷或治療監(jiān)測。在另一個實施方案中，本文描述的RPA方法可用于制造過程包括但不限于食品、飲料或醫(yī)療裝置的質(zhì)量保證。在另一個實施方案中，本文描述的RPA方法可用于確保在衛(wèi)生護(hù)理中使用的裝置和材料的有效滅菌或其無菌性的維持。如圖6中所示，可以對含有一種或多種目標(biāo)微生物、包括來自許多不同屬的許多微生物種進(jìn)行RPA。本文公開的RPA方法適合于檢測種特異性pre-rRNA，并且在具體實施方案中，本文公開的RPA可以檢測來自一個或多個屬的微生物的種特異性 pre-rRNA,所述屬選自不動桿菌屬(Acinetobacter)、放線桿菌屬(Actinobaci 1 lus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、包特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、真桿菌屬(Eubacterium)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、
(Fusobacterium) > Bf ifil ff ^ M (Haemophi lus) > ff ^ M (Helicobacter) > 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、摩根氏菌屬(Morganella)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、口卜啉單胞菌屬(Porphyromonas)、 普氏菌屬(Prevotel la)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、密螺旋體屬(Tr印onema)、 韋榮球菌屬(Vei llonel la)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、放線菌屬
9(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、李其Jf特菌屬(Listeria)、微球菌屬(Micrococcus)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、消化鏈球菌屬 (Peptostreptococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口鏈霉菌屬(Streptomyces)。RPA方法包含將樣品分成兩份或多份等份試樣，其中至少一個等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激，至少一個等份試樣作為未刺激的對照進(jìn)行處理。在一個實施方案中，將營養(yǎng)刺激過的等份試樣中存在的材料沉淀、清洗并置于所需的微生物培養(yǎng)條件下。本文公開的微生物培養(yǎng)條件是本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員公知的適合于靶生物體理想生長的環(huán)境和營養(yǎng)條件。一般來說，優(yōu)化的微生物培養(yǎng)條件可以包括適合于靶微生物的營養(yǎng)培養(yǎng)基、溫度、濕度、氧張力、 存在特定微量或常量營養(yǎng)物、不存在抑制劑、和壓力。在一個這樣的實施方案中，將營養(yǎng)刺激過的等份試樣在對所述等份試樣增補(bǔ)適合靶微生物的培養(yǎng)基的條件下溫育或培養(yǎng)所需的時間長度。例如，當(dāng)靶生物體是革蘭氏陰性桿菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) 時，樣品可以用包含營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)基溫育。在另一個實例中，靶生物體是鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)，微生物培養(yǎng)條件可以包括將樣品用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基溫育。在另一個實例中，靶生物體是厭氧微生物，營養(yǎng)刺激條件可以包括低氧張力。在另一個實例中，靶生物體是病原體例如生活在鐵可用性有限的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的李斯特菌 (Listeria)，營養(yǎng)刺激條件可以包括供應(yīng)鐵。在一個實施方案中，將未營養(yǎng)刺激的對照等份試樣在被設(shè)計用于維持靶微生物狀態(tài)的對照條件下溫育。在一個這樣的實施方案中，將對照等份試樣在水或緩沖液中溫育。在另一個實施方案中，將對照等份試樣維持在不利氣氛中，例如在厭氧微生物檢測的情況下在大氣氧濃度下。本文描述的RPA方法典型地包括對已經(jīng)從樣品的靶微生物中分離的一種或多種pre-rRNA分子進(jìn)行定量。在一個這樣的實施方案中，按照本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的核酸提取技術(shù)從樣品分離pre-rRNA。例如，可以裂解樣品中的細(xì)胞并按照標(biāo)準(zhǔn)方法例如苯酚-氯仿抽提方法提取核酸。核酸提取、包括pre-rRNA提取和定量的示例性方法， 公開在 Cangelosi 等 1997 年的美國專利 5，712，095 和 Cangelosi 等，1996 (Cangelosi， G. A.和W. H. Brabant. 1997.在饑餓的大腸桿菌細(xì)胞中pre_16S『1 ^的貧化(0印16衍011 of pre_16S rRNA in starved Escherichia coli cells), J. Bacteriol. 179 :4457-4463 ； Cangelosi, G. Α.，W. H. Brabant, T. B. Britschgi 和 C. K. ffallis. 1996.使用前體 rRNA 的種特異性測定法檢測利福平和環(huán)丙沙星抗性的結(jié)核分枝桿菌(Detection of rifampin-and ciprofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis by using species-specific assays for precursor rRNA) ,Antimicrob Agents Chemother. 40 :1790-1795)中，其每個在此引為參考。Pre-rRNA分子的定量包括使用核酸擴(kuò)增技術(shù)。在一個這樣的實施方案中，核酸擴(kuò)增技術(shù)可以是基于PCR的技術(shù)。在另一個這樣的實施方案中，核酸可以通過非基于PCR的方法擴(kuò)增，例如等溫擴(kuò)增方法比如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。核酸擴(kuò)增方法的實例由 Gill和Ghaemi，2008所公開(Pooria Gill和Amir Ghaemi. 2008.核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)綜述(Nucleic acid isothermal amplification technologies—a review), Nucleosides,Nucleotides, and Nucleic Acids. 27 :2M_243)，在此引為參考。在本文描述的 RPA 的一個實施方案中，RT-qPCR可用于定量來自樣品的種特異性pre-rRNA，以確定pre_rRNA的刺激值。RT-qPCR使用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA，然后通過標(biāo)準(zhǔn)定量PCR(qPCR)對所述cDNA 進(jìn)行測量。本文公開的RPA方法可以使用被設(shè)計成靶向靶微生物的pre-rRNA序列的寡核苷酸引物，并且用于RPA的引物可以靶向任何成熟的rRNA序列或任何pre-rRNA序列。在一個實施方案中，引物可以靶向pre_rRNA5’端的前導(dǎo)區(qū)。在一個這樣的實施方案中，用于本文公開的RPA方法的引物可以靶向緊接成熟16S rRNA 5’端的上游序列，因為這些啟動子近端區(qū)域在活躍轉(zhuǎn)錄pre-rRNA的細(xì)胞中將是豐富的。在另一個這樣的實施方案中，用于RPA 的引物可以靶向16S rRNA基因下游的間隔序列。在其他實施方案中，引物對可以跨過成熟 rRNA的5’或3’端，使得擴(kuò)增需要完整的pre-rRNA作為模板。在本文描述的RPA方法中使用的反向引物可以被設(shè)計成識別成熟rRNA內(nèi)的半保守區(qū)，而正向引物可以被設(shè)計成識別 pre-rRNA內(nèi)的種特異性序列?；蛘?，在本文描述的RPA方法中使用的反向引物可以被設(shè)計成識別pre-rRNA內(nèi)的種特異性序列，而正向引物可以被設(shè)計成識別成熟rRNA內(nèi)的半保守區(qū)。引物的長度和組成對于本發(fā)明來說不重要，只要它們被設(shè)計成特異性擴(kuò)增pre-rRNA而不是成熟rRNA或DNA即可。在一個具體實施方案中，可以設(shè)計引物以定量鳥分枝桿菌(M. avium)的pre-rRNA 分子。參考圖7，在一個這樣的實施方案中，可以對正向和反向引物進(jìn)行設(shè)計以產(chǎn)生跨過成熟16S rRNA 5’末端的擴(kuò)增產(chǎn)物，使得成功的擴(kuò)增需要完整pre-16S rRNA作為模板。例如，RT-qPCR 的 cDNA 合成可以由成熟 rRNA 序列 5，-GCCCGCACGCTCACAGTTAAG-3，(SEQ ID NO 3)引發(fā)。正向和反向引物可以分別是 5，-TTGGCCATACCTAGCACTCC-3，(SEQ ID NO 1) 和 5，-GATTGCCCACGTGTTACTCA-3，(SEQ ID NO :2)。反向引物可以在成熟 rRNA 序列內(nèi)，而正向引物可以識別外部轉(zhuǎn)錄的間隔物-I(ETS-I)中的位點(diǎn)。用于RPA方法的引物的實例顯示在圖7中，包括正向、反向和反轉(zhuǎn)錄酶引物組，以及可用于參比靶微生物的供選引物。對于本文公開的方法來說，pre-rRNA刺激比率值是刺激過的樣品中pre-rRNA水平相對于對照樣品中pre-rRNA水平的比率。在具體實施方案中，本文公開的RPA方法包括對樣品中的種特異性pre-rRNA經(jīng)比率測量進(jìn)行定量的步驟。在一個實施方案中，對種特異性pre-rRNA經(jīng)比率測量進(jìn)行定量以確定pre-rRNA刺激比率值。在一個這樣的實施方案中， pre-rRNA刺激比率值是營養(yǎng)刺激過的樣品中的pre-rRNA水平相對于未營養(yǎng)刺激的對照樣品的比率，并且pre-rRNA刺激值被用于確定樣品中活靶細(xì)胞的存在。例如，當(dāng)pre-rRNA刺激比率值近似等于或大于存活性閾值時，表明存在活細(xì)胞。在一個這樣的實施方案中，當(dāng)營養(yǎng)刺激過的等份試樣中pre-rRNA水平大于未刺激的對照等份試樣中的pre-rRNA值時，通過存活性閾值指示了靶細(xì)胞的存活性。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“存活性閾值”是刺激過的樣品中pre-rRNA水平相對于對照樣品中的pre-rRNA水平的計算比率，其指示樣品中活細(xì)胞的存在。正如本文所公開的，給定樣品的存活性閾值可取決于靶生物體、樣品的類型、NAAT的分辨能力以及可能影響樣品中pre-rRNA定量的其他條件。在具體實施方案中，樣品的存活性閾值可以在約1至 100的范圍內(nèi)。閾值的選擇可以取決于具體測定方法的要求。例如，要求對病原體的存在具有最高的可能靈敏度的測試(例如醫(yī)療裝置質(zhì)量控制)，可以使用閾值為1?；蛘?，要求對活細(xì)胞的特異性而不是高度的分析靈敏度的測試?yán)缥鬯幚肀O(jiān)測，可以使用較高的閾值以最小化高代價的假陽性結(jié)果的頻率。在一個實施方案中，可以在源自于天然或體內(nèi)來源的樣品上進(jìn)行RPA。例如，本文描述的RPA方法可以在源自于組織或體液的樣品上進(jìn)行。在一個實施方案中，樣品可以從人類或動物對象的組織、血液或痰液收集。與自來水或湖水相比，血液和痰液可能是富含營養(yǎng)物的環(huán)境。這種天然樣品中的微生物可活躍復(fù)制并維持大的pre-rRNA儲量。然而，實驗室培養(yǎng)基的均衡和優(yōu)化的營養(yǎng)條件在自然界中是非常罕見的。在天然環(huán)境中，微生物生長常常受限于特定營養(yǎng)物的可得性。例如，人類具有限制組織中鐵的可得性的先天性免疫機(jī)制。因為特定營養(yǎng)物有限，微生物在天然樣品例如痰液或全血中可能即便不是完全不分裂，也是分裂較差。在這種意義上，天然環(huán)境與含有大量某些營養(yǎng)物但是貧化了其他營養(yǎng)物 (通常為碳或氮)的用過的培養(yǎng)基類似。天然樣品含有受限于可以是碳、氮、氧或微量元素的特定營養(yǎng)物的微生物，當(dāng)其在營養(yǎng)刺激下被提供了限制性營養(yǎng)物時，能夠經(jīng)歷可測量的 pre-rRNA合成的爆發(fā)。在一個實施方案中，為本文公開的RPA而收集的樣品可以包括在營養(yǎng)物可利用性、生長抑制劑的存在和宿主防御方面具有空間變化的天然樣品。例如，結(jié)核桿菌在新感染的巨噬細(xì)胞中可以最高速度復(fù)制，而在細(xì)胞外基質(zhì)或在具有非常高的桿菌載荷的宿主細(xì)胞中可能生長緩慢。在一個這樣的實施方案中，對于在對象急性感染期間收集的天然樣品來說，為樣品中所有潛在的靶生物體提供最適營養(yǎng)物混合物以確保最高細(xì)胞生長，可能是不可能的。因此，當(dāng)在營養(yǎng)刺激條件下溫育時，可以預(yù)計天然樣品中的靶微生物將合成 pre-rRNA并顯示出pre-rRNA上升。在一個實施方案中，本文公開的RPA方法可以包含收集天然樣品，所述天然樣品包含生活在營養(yǎng)物受限環(huán)境中的靶微生物。在一個這樣的實施方案中，本文描述的RPA方法可以包括確定天然樣品中的限制性營養(yǎng)物，然后用包含限制性營養(yǎng)物的富營養(yǎng)培養(yǎng)基對天然樣品的等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激。因此，富營養(yǎng)培養(yǎng)基可以通過向靶微生物提供限制性營養(yǎng)物引起靶微生物中pre-rRNA水平的上升。在一個具體實施方案中，可以對源自于人類或動物對象的樣品中的靶生物體例如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)進(jìn)行RPA。在一個這樣的實施方案中，可以從懷疑被結(jié)核分枝桿菌感染或正在經(jīng)歷結(jié)核分枝桿菌治療的對象收集痰液。可以將痰液樣品分成兩份等份試樣，其中一份可以用富集培養(yǎng)基例如Middlebrook 7H9肉湯進(jìn)行營養(yǎng)刺激，而另一份可以保持在PBS或水中作為對照。在一個實施方案中，營養(yǎng)刺激可以在37°C下進(jìn)行約3-5 小時。然后可以將刺激和對照等份試樣中的細(xì)菌裂解，并可以使用RT-qPCR對pre-rRNA進(jìn)行定量并計算pre-rRNA刺激比率值。Pre-rRNA刺激值可用于確定天然樣品中活的結(jié)核分枝桿菌的存在。在一個這樣的實施方案中，當(dāng)營養(yǎng)刺激過的等份試樣中的pre-rRNA值大于未刺激的對照等份試樣中的pre-rRNA值時，表明了活的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞的存在。在類似的實施方案中，可以用限制性營養(yǎng)物進(jìn)行營養(yǎng)刺激，通過RPA檢測衣原體屬(Chlamydia)、 李斯特菌屬(Listeria)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)等的細(xì)胞內(nèi)病原體。靶病原體不需要在體外“可培養(yǎng)”。例如，通過使用RPA可以在陰道拭子中檢測轉(zhuǎn)性細(xì)胞內(nèi)病原體例如沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)，在所述RPA中提供了在其天然細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中受限的特定營養(yǎng)物。病原體在這些條件下可能不能復(fù)制，但是它能感應(yīng)到限制性營養(yǎng)物的存在并在不成功的復(fù)制嘗試中合成pre-rRNA，因為pre-rRNA合成是細(xì)胞生長中非常早的步驟。這樣的合
12成可以通過RPA檢測。公知的手動或自動核酸提取和定量方法可用于執(zhí)行本文公開的RPA方法。在一個這樣的實施方案中，RPA可以包括使用一種或多種技術(shù)的核酸提取和/或定量，所述技術(shù)例如核酸芯片技術(shù)、微陣列、多路技術(shù)、芯片實驗室(lab-on-a-chip)、卡式實驗室 (lab-on-a-card)、微流體裝置和本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的其他核酸提取和定量技術(shù)。 當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“微流體裝置”是可用于執(zhí)行RPA的裝置，并可以包括核酸芯片技術(shù)、微陣列、多路技術(shù)、芯片實驗室、卡式實驗室和相關(guān)技術(shù)。例如，核酸提取和分析的方法公開在美國專利7，608，399和美國專利申請11/880，790中，二者在此引為參考。在一個實施方案中，本文公開的RPA方法可以包括使用核酸卡(Nucleic Acid Card)進(jìn)行RNA提取和擴(kuò)增，然后進(jìn)行比率測量分析。將從樣品獲取的等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激，同時將對照等份試樣保持在緩沖液中(步驟A)。在短暫的營養(yǎng)刺激后，將細(xì)胞裂解(步驟B)，然后上樣到成對的核酸卡上。在完成RNA提取(步驟C)后，對洗脫液進(jìn)行qPCR。當(dāng)應(yīng)用于生長緩慢的分枝桿菌時，包括營養(yǎng)刺激在內(nèi)的整個過程可能花費(fèi)6至M小時。相比較而言，分枝桿菌培養(yǎng)需要5-14天。在一個實施方案中，本文公開的RPA可以包括使用能夠快速、簡便和可靠地從血液和各種其他生物樣品中分離DNA和RNA的平板玻璃或復(fù)合材料卡進(jìn)行核酸分離和定量。 在一個實施方案中，本文公開的RPA可以使用合并了細(xì)胞裂解、核酸提取和純化以及測量提取到的核酸的裝置來進(jìn)行。在一個這樣的實施方案中，裝置可以是用于接收和處理本文所述的生物樣品的容器。在一個這樣的實施方案中，本文公開的RPA方法可以包含使用流過式玻璃壁核酸卡從樣品提取核酸。在這樣的實施方案中，卡可用于核酸定量、DNA或RNA 提取和濃度測定。在另一個實施方案中，核酸的提取和/或定量可以通過使用插入到位于核酸卡上的載樣和洗脫端口中的移液管來手動進(jìn)行?；蛘?，本文公開的核酸的提取和/或定量可以通過使用流體操縱裝置或本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的其他適合裝置來自動進(jìn)行。本文公開的RPA方法可以包括預(yù)篩選過程例如免疫分離或免疫篩選過程，以提高 RPA的特異性。在一個實施方案中，RPA可以包含可在包被有與靶微生物特異性結(jié)合的抗體或其他探針或肽的珠子或其他粒子上鑒定或捕獲一種或多種目標(biāo)靶微生物的步驟。在一個這樣的實施方案中，通過抗體或探針鑒定到的靶微生物可以進(jìn)行本文公開的RPA。例如，可以將通過初步免疫分離方法鑒定到的靶微生物分成兩份或多份獨(dú)立的等份試樣，其中對一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激，而另一份等份試樣被留作未營養(yǎng)刺激的對照等份試樣。然后可以按照本文所述對營養(yǎng)刺激過的樣品相對于對照樣品的pre-rRNA補(bǔ)充進(jìn)行定量。在一個實施方案中，本文所述的免疫分離方法可用于分離靶微生物的特定菌株或種群。例如，本文公開的RPA方法可以包含可鑒定靶微生物群體內(nèi)的特定菌株或分離物的免疫分離步驟。在一個具體實例中，本文公開的RPA方法可以包含將特定大腸桿菌菌株例如大腸桿菌0157與同種的其他微生物分離開的免疫分離步驟。在一個實施方案中，本文公開的RPA可用于提高靶微生物的檢測靈敏度。例如， RPA可與其他測試相結(jié)合，用于證實活的靶微生物的存在。作為細(xì)胞活性的動態(tài)測量，本文公開的RPA與靜態(tài)DNA檢測相比在臨界性信號中提供了更高的置信度。這可以提高用于樣品中微生物的核酸擴(kuò)增檢測的總體靈敏度、可靠性和穩(wěn)固性。生物靈敏度的提高源自于RPA的動態(tài)本質(zhì)。就像是在森林中觀察動物，其中移動的動物比靜止的動物更容易被看出。在 RPA中看到的pre-rRNA合成是由營養(yǎng)刺激可靠地誘導(dǎo)的一種細(xì)菌“移動”。此外，RPA與傳統(tǒng)的NAAT相比具有其他優(yōu)點(diǎn)。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶定量PCR(RT-qPCR) 方案具有3個步驟DNA酶消化以除去可能干擾RNA定量的基因組DNA ；反轉(zhuǎn)錄酶(RT)將 RNA轉(zhuǎn)變成cDNA ；以及最后qPCR以定量cDNA。在RPA中，DNA酶消化步驟不是必需的，因為細(xì)菌細(xì)胞中的基因組DNA的量比pre-rRNA低1_3個數(shù)量級。還預(yù)計基因組DNA以相似的量存在于刺激和對照等份試樣中。結(jié)果，基因組DNA引起很小的背景信號并且不干擾比率測量分析。在一個實施方案中，當(dāng)初步分析給出的結(jié)果是非結(jié)論性的、臨界性的或難以解釋時，RPA可用于提高初步分析結(jié)果的置信度。例如，一般來說，循環(huán)閾值(Ct) <30(即在少于 30個擴(kuò)增循環(huán)后出現(xiàn)陽性結(jié)果)的RT-qPCR無疑是陽性的。但是，Ct值>30是臨界性的，并可能難以解釋。這種信號可能由樣品污染或甚至背景噪音產(chǎn)生。在一個實施方案中，RPA可用于在Ct值> 30時驗證檢測微生物細(xì)胞存在的RT-qPCR測試的結(jié)果。當(dāng)進(jìn)行重復(fù)測量并且營養(yǎng)刺激過的等份試樣表現(xiàn)出一直強(qiáng)于對照等份試樣的RT-qPCR信號時，則該結(jié)果非?？赡芊从吵龌罴?xì)胞的存在。背景噪音、DNA污染或臨界性陽性結(jié)果的其他原因非常不可能引起這樣的結(jié)果。因此，除了提高對活微生物細(xì)胞的特異性之外，RPA能夠顯著提高NAAT對微生物細(xì)胞的功能靈敏度。NAAT的其他實例可以包括非比率測量式rRNA擴(kuò)增 (成熟或前體)和通過直接雜交的非比率測量式rRNA檢測。除了 Ct值之外，其他的定量或半定量NAAT測試讀數(shù)也可用于RPA。其實例包括凝膠電泳結(jié)果、熒光或比色信號、熱讀數(shù)、解鏈曲線和基于核酸探針雜交的讀數(shù)例如線性探針分析或核酸側(cè)向流(NALF)。在所有情況下，RPA均能夠提高對活細(xì)胞的特異性以及檢測少量存在的微生物細(xì)胞的功能靈敏度。在一個實施方案中，RPA可用于增加初步NAAT、例如被設(shè)計用于鑒定樣品中微生物存在的DNA檢測分析的靈敏度。在一個這樣的實施方案中，樣品的基因組DNA檢測分析可以與用于相同樣品的RPA同時進(jìn)行，或在隨后進(jìn)行RPA，以檢測活的靶微生物的存在。在另一個實施方案中，RPA可用于克服可能使得檢測靶微生物的方法所產(chǎn)生的臨界性結(jié)果難以解釋的背景噪音或環(huán)境DNA污染。
實施例提供下面的實施例僅僅是出于說明目的，而不打算以任何方式限制本文描述的組合物和方法的范圍。應(yīng)該理解，所公開的組合物和方法不限于本文描述的具體方法、方案和試劑。在每種情況下，除非另有指明，否則使用標(biāo)準(zhǔn)材料和方法來執(zhí)行所提供的實施例中描述的工作。在本說明書中引用的所有專利和文獻(xiàn)參考資料，在此以其全文引為參考。除非另有指明，否則本發(fā)明的實踐使用了屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)。(參見例如《微生物學(xué)中的實時PCR:從診斷到鑒定》(Real-Time PCR in Microbiology From Diagnosis to Characterization) (I. M. Makay ±H,2007) ；Nolan, T.等，(2006) 用實時 RT-PCR 對 mRNA 進(jìn)行定量(Quantification of mRNA using real-time RT-PCR)， Nature Protocols 1，1559-1582 ；Maniatis, Τ.等，(1982)《分子克隆實驗室指南》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) ； Sambrook, J.等，(2001)《分子克隆實驗室指南》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual)第二版(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) ；Ausubel, F. Μ.等(1992)《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) (J. Wiley and Sons,NY) ；Glover, D. (1985)《DNA 克隆》(DNA Cloning) I 禾口 II (Oxford Press) ；Anand, R. (1992)《復(fù)雜基因組的分析技術(shù)》(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)(Academic Press) ；Guthrie,G.禾口 Fink,G. R. (1991) 《酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南》(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology) (Academic Press) ；Harlow 禾口 Lane (1988)《抗體實驗室指南》(Antibodies :A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. ) ；Jakoby, W.B.禾口 Pastan, I. H.主編，(1979)細(xì)胞培養(yǎng)(Cell Culture)，《酶學(xué)方法》第 58 卷(Methods in Enzymology, Vol. 58) (Academic Press, Inc.，Harcourt Brace Jovanovich (NY))；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization) (B. D. Hames & S. J. Higgins 主編，1984)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription And Translation) (B. D. Hames & S. J. Higgins 主編，1984)；《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(Culture Of Animal Cells) (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.，1987)；《固定化細(xì)胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes) (IRL Press, 1986) ；B. Perbal，《分子克隆實踐指導(dǎo)》(A Practical Guide To Molecular Cloning) (1984)；《酶學(xué)方法專論》(the treatise,Methods In Enzymology) (Academic Press, Inc. ,N. Y.)；《用于喃乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells) (J. H. Miller和M. P. Calos 主編,1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ;〈〈g|學(xué)方法》(Methods In Enzymology) Vols. 1 和155 (Wu等主編)；《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology) (Mayer 禾口 Walker 主編，Academic Press, London, 1987)；《實驗免疫學(xué)手冊》(Handbook Of Experimental Immunology), I-IV 卷 (D. Μ. Weir和C. C. Blackwell主編，1986) ；Hogan等主編，(1994)《小鼠胚胎操作實驗指南》 (Manipulating the Mouse Embryo :A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y.) 除非另有指明，否則本發(fā)明的實踐使用了化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。(參見例如Maniatis 等，1982 ；Sambrook 等，2001 ；Ausubel 等，1 992 ；Glover, 1985 ；Anand, 1992 ；Guthrie 和 Fink,1991)。本文中沒有一處將被解釋為承認(rèn)本文講授的主題因為有在先發(fā)明而沒有資格表明所述公開內(nèi)容時間居先。沒有承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的討論陳述了其作者所宣稱的內(nèi)容，并且申請人保留質(zhì)詢所引用文件的準(zhǔn)確性和貼切性的權(quán)利。應(yīng)該清楚地理解，盡管本文中參考了大量出版物，但這些參考不表示承認(rèn)任何這些文件形成了本技術(shù)領(lǐng)域的公知知識的一部分。實施例1-基于Pre-rRNA的細(xì)胞存活性檢測的設(shè)計細(xì)菌在其環(huán)境中感應(yīng)到新營養(yǎng)物而快速補(bǔ)充ft~e-rRNA儲量。如圖1中所示，在大腸桿菌中，在靜止期細(xì)胞的營養(yǎng)增加后，pre-16S rRNA儲量得到補(bǔ)充。繼續(xù)參考圖1，將大腸桿菌的過夜培養(yǎng)物在零時(箭頭)在新鮮LB培養(yǎng)基中稀釋20倍。在稀釋之前和之后的時間點(diǎn)記錄光密度，并通過化學(xué)發(fā)光夾心雜交測定法對樣品的pre-rRNA和成熟16S rRNA含量進(jìn)行分析。空心圓形，培養(yǎng)物的0D600(右側(cè)軸)；空心三角形，按0D600的pre-16S rRNA(左側(cè)軸)；實心三角形，按0D600的成熟16SrRNA。圖1中顯示了三個平行培養(yǎng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。與每30分鐘分裂和倍增并具有高rRNA拷貝數(shù)的大腸桿菌相反，牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)BCG每 M小時倍增，并具有較少的rRNA拷貝。然而，在該生物體中，在營養(yǎng)增加的一個倍增時間內(nèi)，清楚地觀察到pre-rRNA的補(bǔ)充。圖2在牛分枝桿菌(M.bovis)BCG上進(jìn)行的實驗中顯示了這一現(xiàn)象，其中使用了狹縫印跡雜交測定法檢測 pre-rRNA(實心圓)。繼續(xù)參考圖2，在箭頭所指的時間點(diǎn)處將靜止期牛分枝桿菌BCG細(xì)胞在新鮮7H10肉湯中稀釋。跟蹤營養(yǎng)刺激之前和之后的I^re-rRNA拷貝數(shù)和細(xì)胞密度。實心圓顯示了 pre-rRNA與基因組DNA的比率?？招娜切物@示了牛分枝桿菌培養(yǎng)物的0D600。 因為在細(xì)菌細(xì)胞中pre-rRNA是豐富的，占總rRNA的4% -20%，因此不用擴(kuò)增進(jìn)行直接檢測是可能的。結(jié)果，pre-rRNA檢測的靈敏度超過基因組DNA檢測的靈敏度。實施例2-Pre-rRNA的比率測量分析開發(fā)了用于從飲用水獲取的懷疑引起人類疾病的兩種細(xì)菌病原體的RPA測試。模型種是快速生長的革蘭氏陰性桿菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和生長緩慢的放線菌鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)。對于這兩個菌種來說，靶向pre-rRNA的 5’前導(dǎo)區(qū)(緊接成熟16S rRNA 5’端的上游序列)，是基于這些近啟動子區(qū)域在活躍轉(zhuǎn)錄 pre-rRNA的細(xì)胞中將是豐富的這一假設(shè)。引物對跨過成熟rRNA的5’端，使得擴(kuò)增需要完整的pre-rRNA作為模板。反向引物識別成熟rRNA內(nèi)的半保守區(qū)域。正向引物識別5’前導(dǎo)區(qū)內(nèi)的種特異性序列。鳥分枝桿菌的正向和反向引物被設(shè)計成產(chǎn)生跨過成熟16S rRNA的5’端的預(yù)計 237bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，使得成功的擴(kuò)增需要完整的pre-16SrRNA作為模板。cDNA合成由成熟 rRNA 序歹Ij 5，-GCCCGCACGCTCACAGTTAAG-3，(SEQ ID NO 3)引發(fā)。正向和反向 PCR 引物分別是 5，-TTGGCCATACCTAGCACTCC-3，(SEQ ID NO :1)和 5，-GATTGCCCACGTGTTACTCA-3，(SEQ ID NO :2)。反向引物在成熟rRNA序列內(nèi)，而正向引物識別ETS-I中的位點(diǎn)。與從BLAST分析所預(yù)測的種特異性相一致，當(dāng)應(yīng)用于來自鳥分枝桿菌的15個臨床分離物和來自胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)的4個臨床分離物的核酸時，PCR以及凝膠電泳一致地產(chǎn)生了預(yù)期大小的產(chǎn)物。這兩個密切相關(guān)的種包含被稱為鳥分枝桿菌復(fù)合物(M. avium complex) (MAC)的臨床相關(guān)分型。當(dāng)反應(yīng)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌(Msmegmatis)、地分枝桿菌(M. terrae)、胃分枝桿菌(M. gastri)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)、草分枝桿菌(M.phlei)和母牛分枝桿菌(M.vaccae)時，沒有觀察到產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。這些觀察說明了 pre-rRNA分析的有用的系統(tǒng)發(fā)育特異性。嗜水氣單胞菌的正向和反向引物產(chǎn)生預(yù)計189bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。cDNA合成由成熟 rRNA 序列 5，-CTACAAGACTCTAGCTGGACAGT-3，(SEQ ID NO 6)引發(fā)。正向和反向 PCR 引物分別是 5，-ATTGAGCCGCCTTAACAGG-3，(SEQ ID NO :4)和 5，-AACTGTTATCCCCCTCGAC-3，(SEQ ID NO :5)。對NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的BLAST分析除了嗜水氣單胞菌之外沒有發(fā)現(xiàn)與正向引物的匹配。密切相關(guān)的種殺鮭氣單胞菌(A. salm0nicida)A449不具有同源序列。為了評估營養(yǎng)刺激后pre-rRNA補(bǔ)充的時間過程，將靜止期早期的嗜水氣單胞菌 ATCC 7966細(xì)胞洗滌，重新懸浮在壓熱滅菌過的自來水(ATW)中，并在下通氣溫育7天。對靜止期早期的MAH菌株HMC02的細(xì)胞進(jìn)行清洗，重懸浮在ATW中，然后在37°C下通氣溫育14天。這些條件被設(shè)計用于在模擬的供水環(huán)境中排出pre-rRNA儲量。為了進(jìn)行RPA， 將水饑餓的細(xì)菌分成兩份等份試樣并離心。將一份沉淀重懸浮在培養(yǎng)基中(營養(yǎng)刺激)，另一份重懸浮在ATW中(對照)。最終的細(xì)胞密度約為106cfu/mL。營養(yǎng)肉湯用于嗜水氣單胞菌的營養(yǎng)刺激，而增補(bǔ)有10% ADC的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基用于ΜΑΗ。在溫育不同的時間長度后，通過高能珠研磨將細(xì)胞裂解，通過酸化苯酚-氯仿分離RNA，并通過RT-qPCR測量 pre-rRNA.在針對基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線歸一化后，計算營養(yǎng)刺激樣品和對照樣品中RT-qPCR 值的比率。在兩種生物體中I^re-rRNA刺激非?？臁＜s15分鐘的營養(yǎng)刺激足以使嗜水氣單胞菌中pre-rRNA始終上升。在代時> 20小時的生長緩慢的生物體鳥分枝桿菌中，最大的 pre-rRNA刺激需要約4小時。對于這兩種生物體來說，這些時間長度< 1個代時。圖3顯示了在水饑餓的嗜水氣單胞菌㈧和鳥分枝桿菌菌株104(B)細(xì)胞中 pre-rRNA的營養(yǎng)刺激的時間過程。Pre-rRNA刺激比率值是刺激過的樣品相對于對照樣品中通過RT-qPCR測量的pre-rRNA的比率。值是每個時間點(diǎn)>兩個實驗的平均值和SD。為了在提取的 RNA 上進(jìn)行 RT-qPCR，首先使用 Superscript III 系統(tǒng)(Invitrogen Corp.， Carlsbad, CA)產(chǎn)生了互補(bǔ)DNA(cDNA)，并使用Qiagen PCR純化試劑盒(目錄號觀104， Qiagen Inc. , Valencia, CA)進(jìn)行純化。使用 Applied Biosystems (ABI)Power SYBR Green 混合物(Applied Biosystems Inc. ,Foster City,CA)進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。反應(yīng)用兩種不同的稀釋度進(jìn)行三份平行樣以確保定量讀數(shù)。擴(kuò)增在ABI Prism RT-7500上，在96孔板中如下運(yùn)行10分鐘95°C，40個循環(huán)的(15s 95°C，30s 60°C，30s 72°C )，使用“9600仿真”設(shè)置。使用ABI的SDS軟件設(shè)定Ct閾值。實施例3-Pre-rRNA刺激比率與細(xì)胞存活性之間的相關(guān)性為了評估RPA對活細(xì)胞的特異性，使用次氯酸鈉處理來產(chǎn)生具有各種活細(xì)胞和失活細(xì)胞比率的嗜水氣單胞菌細(xì)胞懸液。比率通過在暴露于氯后進(jìn)行活菌鋪板來定量，并表示成相對于約IX IO6CfuAiL的輸入密度的活力百分?jǐn)?shù)。為了在氯處理過和未處理的細(xì)胞懸液上進(jìn)行RPA，將成對等份試樣離心，并將細(xì)胞沉淀重懸浮于水(對照樣品)或營養(yǎng)肉湯 (刺激樣品)中。在營養(yǎng)刺激1小時后，測定pre-rRNA刺激比率。在一些實驗中，也通過 qPCR對刺激和對照樣品中的基因組DNA進(jìn)行定量。這允許評估RPA對活細(xì)胞的特異性，并與使用傳統(tǒng)的DNAqPCR所觀察到的特異性進(jìn)行比較。表1顯示了兩個實驗的結(jié)果，其中測量了基因組DNA以及pre-rRNA。在第一個實驗中存活性百分?jǐn)?shù)為96. 3%,26. 9%和0. 02%的樣品表現(xiàn)出彡3士 ISD的pre-rRNA刺激比率值。沒有可檢測的活細(xì)胞(存活性0%)的樣品表現(xiàn)出經(jīng)統(tǒng)計不超過1.0的pre-rRNA刺激比率。因此，在高達(dá)約99. 98%的靶微生物死亡的樣品中，RPA顯示出顯著的pre-rRNA刺激比率值。相反，嗜水氣單胞菌基因組DNA的qPCR檢測在所有樣品中都為強(qiáng)陽性，不論細(xì)胞是否存活。此外，在營養(yǎng)刺激和對照的等份試樣中，DNA信號之間沒有差異(未顯示)。在第二個實驗中看到了相似結(jié)果(表1)。本實施例說明了 RPA對活細(xì)胞的可觀靈敏性，即使是如實驗1中用2mg/l次氯酸鹽處理的樣品中當(dāng)失活細(xì)胞的數(shù)量高出5000倍以上時。表 1實驗1
1權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中的活微生物的方法，所述方法包含收集樣品；對樣品的第一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激；將樣品的第二份等份試樣維持在未營養(yǎng)刺激的對照條件下；對第一份等份試樣和第二份等份試樣進(jìn)行溫育；將來自第一份等份試樣的至少一種靶微生物的至少一種靶pre-rRNA的水平與來自第二份等份試樣中至少一種靶微生物的所述至少一種靶pre-rRNA的水平進(jìn)行比較；其中第一份等份試樣中的所述至少一種靶pre-rRNA的水平與第二份等份試樣中的所述至少一種靶pre-rRNA的水平的比，指示樣品中的活微生物。
2.權(quán)利要求1的方法，其還包含從第一份等份試樣提取RNA和從第二份等份試樣提取 RNA ；以及對第一份等份試樣中的所述至少一種靶pre-rRNA水平進(jìn)行定量，并且對第二份等份試樣中的所述至少一種靶pre-rRNA水平進(jìn)行定量。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種靶微生物在樣品中活的百分率是約0.01%、 0. 02%,0. 03%,0. 04%,0. 05 %,0. 1 % ,0. 5 % U. 0 % ,2. 0 % ,3. 0 % ,4. 0 % ,5. 0 % UO %, 15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%和95%中的至少一個。
4.權(quán)利要求2的方法，其中從第一份等份試樣和第二份等份試樣提取RNA以及對來自第一份等份試樣和第二份等份試樣的所述至少一種pre-rRNA進(jìn)行定量包括使用微流體裝置。
5.權(quán)利要求1的方法，其還包含免疫分離方法，其中對樣品篩查樣品中所述至少一種靶微生物的特定分離物的存在。
6.權(quán)利要求5的方法，其中免疫分離方法包含篩查樣品中大腸埃希氏桿菌 (E. coli)0157 的存在。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種靶微生物是選自下列的微生物屬的成員不動桿菌屬(Acinetobacter)、方文線桿菌屬(Actinobacillus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弓形桿菌屬(ArccAacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、包特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、伯克霍爾德氏菌屬(BurWiolderia)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、真桿菌屬(Eubacterium)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、 嗜血桿菌屬(Haemophilus)、螺桿菌屬(Helicobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、 軍團(tuán)菌屬(Legionella)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、摩根氏菌屬(Morganella)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、口卜啉單胞菌屬(Porphyromonas)、普氏菌屬(Prevotella)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬Gerratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、密螺旋體屬(Tr 印 onema)、韋榮球菌屬(Veillonella)、 弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、放線菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、微球菌屬(Micrococcus)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、分枝桿菌屬 (Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口鏈霉菌屬(Streptomyces)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種靶微生物是分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌種。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種靶微生物是嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)0
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種靶微生物是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎軍團(tuán)菌(Legionella pneumonia)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、父艮難梭狀芽胞桿菌 (Clostridium difficile)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)、土拉熱弗朗西絲氏菌 (Francisella tularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowasekii)、斑疫傷寒立克次體 (Rickettsia typhi)禾口幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)中的至少一種。
11.權(quán)利要求1的方法，其中第一份等份試樣的溫育時間短于所述至少一種靶微生物的倍增時間。
12.權(quán)利要求1的方法，其中對第一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激包含使第一份等份試樣富集營養(yǎng)物以促進(jìn)所述至少一種靶微生物中pre-rRNA生產(chǎn)的加速。
13.權(quán)利要求1的方法，其中第一份等份試樣中所述至少一種靶pre-rRNA的水平與第二份等份試樣中所述至少一種靶pre-rRNA的水平的比> 1。
14.一種增加核酸擴(kuò)增檢測的靈敏度以測定樣品中至少一種靶微生物存在的方法，其中所述樣品的標(biāo)準(zhǔn)(非比率測量)核酸擴(kuò)增檢測的結(jié)果對于所述至少一種靶微生物的存在可能是非結(jié)論性的，所述方法包含將樣品分成至少第一份等份試樣和第二份等份試樣； 對樣品的第一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激； 將樣品的第二份等份試樣維持在未營養(yǎng)刺激的對照條件下； 對第一份等份試樣和第二份等份試樣進(jìn)行溫育； 從第一份等份試樣提取RNA并從第二份等份試樣提取RNA ； 對來自第一份等份試樣的至少一種靶pre-rRNA的水平進(jìn)行定量； 對來自第二份等份試樣的所述至少一種靶pre-rRNA的水平進(jìn)行定量； 將第一份等份試樣中所述至少一種靶pre-rRNA的水平與第二份等份試樣中所述至少一種靶pre-rRNA的水平進(jìn)行比較；其中第一份等份試樣中至少一種靶pre-rRNA的水平與第二份等份試樣中所述靶 pre-rRNA的水平的比，被用于提高臨界性結(jié)果的置信度，并從而增加用于檢測樣品中所述至少一種微生物的存在的核酸擴(kuò)增檢測的靈敏度。
15.權(quán)利要求14的方法，其中當(dāng)?shù)谝环莸确菰嚇又兴鲋辽僖环N靶pre-rRNA的水平與第二份等份試樣中所述靶pre-rRNA的水平的比> 1時，證實樣品中存在所述至少一種靶微生物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中初步的核酸擴(kuò)增檢測是非結(jié)論性的，因為它產(chǎn)生的循環(huán)閾值> 30。
17.權(quán)利要求14的方法，其中在進(jìn)行獨(dú)立核酸擴(kuò)增檢測的同時將樣品分成至少第一份等份試樣和第二份等份試樣。
18.權(quán)利要求14的方法，其中在完成初步的核酸擴(kuò)增檢測后將樣品分成至少第一份等份試樣和第二份等份試樣。
19.權(quán)利要求14的方法，其中核酸擴(kuò)增檢測是DNA擴(kuò)增檢測。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種靶微生物在樣品中活的百分率是約 0. 01%,0. 02%,0. 03%,0. 04%,0. 05%,0. 1 %,0. 5%U. 0%,2. 0%,3. 0%,4. 0%,5. 0%, 10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%, 85%、90%和95%中的至少一個。
21.權(quán)利要求14的方法，其中從第一份等份試樣和第二份等份試樣提取RNA以及對來自第一份等份試樣和第二份等份試樣的所述至少一種pre-rRNA進(jìn)行定量，包含使用微流體裝置。
22.權(quán)利要求14的方法，其還包含免疫分離方法，其中對樣品篩查樣品中所述至少一種靶微生物的特定分離物的存在。
23.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種靶微生物是選自下列的微生物屬的成員 不動桿菌屬(Acinetobacter)、方文線桿菌屬(Actinobacillus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、 弓形桿菌屬(ArccAacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、包特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、伯克霍爾德氏菌屬(BurWiolderia)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、真桿菌屬(Eubacterium)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、 嗜血桿菌屬(Haemophilus)、螺桿菌屬(Helicobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、 軍團(tuán)菌屬(Legionella)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、摩根氏菌屬(Morganella)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、口卜啉單胞菌屬(Porphyromonas)、普氏菌屬(Prevotella)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬Gerratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、密螺旋體屬(Tr 印 onema)、韋榮球菌屬(Veillonella)、 弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、放線菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、微球菌屬(Micrococcus)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、分枝桿菌屬 (Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口鏈霉菌屬(Streptomyces)。
24.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種靶微生物是分枝桿菌屬(Mycobacterium)菌種。
25.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種靶微生物是嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)0
26.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種靶微生物是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎軍團(tuán)菌(Legionella pneumonia)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、父艮難梭狀芽胞桿菌 (Clostridium difficile)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)、土拉熱弗朗西絲氏菌 (Francisella tularensis)、普氏立克次體(Rickettsia prowasekii)、斑疫傷寒立克次體 (Rickettsia typhi)禾口幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)中的至少一種。
27.權(quán)利要求14的方法，其中第一份等份試樣的溫育時間短于所述至少一種靶微生物的倍增時間。
28.權(quán)利要求14的方法，其中對第一份等份試樣進(jìn)行營養(yǎng)刺激包含使第一份等份試樣富集營養(yǎng)物以促進(jìn)所述至少一種靶微生物中pre-rRNA生產(chǎn)的加速。
29.權(quán)利要求14的方法，其中第一份等份試樣中所述至少一種靶pre-rRNA的水平與第二份等份試樣中所述至少一種靶pre-rRNA的水平的比> 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測樣品中活細(xì)胞的存在的組合物和方法。包括了用于增加核酸擴(kuò)增檢測的靈敏度以測定樣品中至少一種靶微生物存在的組合物和方法。還公開了用于檢測作為樣品中活微生物的動態(tài)指示物的核糖體RNA前體(pre-rRNA)的組合物和方法。
文檔編號C12Q1/68GK102301004SQ200980155682
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者克里斯·唯杰爾, 杰拉德·A·坎杰洛西, 約翰·斯科特·密施克 申請人:華盛頓大學(xué), 西雅圖生物醫(yī)學(xué)研究所