專利名稱：用于檢測等位基因變體的方法、組合物和試劑盒的制作方法
用于檢測等位基因變體的方法、組合物和試劑盒相關(guān)申請的交叉參考本申請根據(jù)35U. S. C. 119要求2009年12月17日提交的美國臨時申請?zhí)?61/138，521,2009 年 11 月 5 日提交的 61/258，582,2009 年 10 月 20 日提交的 61/253，501、 2009年10月14日提交的61/251，623,2009年6月12日提交的61/186，775以及2009年 3月27日提交的61/164，230的優(yōu)先權(quán)，所有這些文獻通過引用方式全文并入本文。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類基因組中最常見的遺傳多樣性的類型，其在人類基因組DNA中的發(fā)生頻率為在1,000個核苷酸中有大約1個SNP，或更低(Kwok，P_Y，Ann Rev Genom Hum Genet 2001，2 :235-258)。SNP牽涉于遺傳病癥、對不同疾病的易感性、對藥物的不良反應(yīng)的傾向性，以及用于法醫(yī)研究。因此，SNP (或稀少突變)的檢測為疾病早期診斷， 例如檢測血液中的循環(huán)癌細胞以進行出生前的診斷，以及用于檢測混合的細胞群體中的疾病相關(guān)突變提供了巨大的潛在可能。已經(jīng)基于涉及雜交、連接或DNA聚合酶的方法開發(fā)了多種用于SNP基因分型的方法(Chen，X.，and Sullivan, PF, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96.)。 例如，等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AS-PCR)是廣泛應(yīng)用的用來檢測DNA序列變異的策略(Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB.，Proc Natl Acad Sci U S A 1989 ；86 2757-2760)。AS-PCR，如其名稱所暗示，是基于PCR的方法，其中引物之一或兩個引物被設(shè)計為在序列變異的位點處退火，這允許能夠區(qū)分同一基因的不同的等位基因。AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度相對于以匹配的3’堿基進行的引物延伸，以錯配的3’堿基進行的引物延伸的效率要低得多，后者的效率為1/100至1/100, 000 (Chen,X. ,and Sullivan,PF, The Pharmacogeonomics Journal 2003;3:77-96)。延伸錯配引物的困難導(dǎo)致減小的 PCR 擴增，這可以容易地被檢出。然而，AS-PCR的特異性和選擇性高度依賴于PCR的指數(shù)擴增性質(zhì)，這會迅速降低等位基因區(qū)分力度。雖然引物被設(shè)計為匹配特異性變體以選擇性地僅擴增該變體，但是在實際中，經(jīng)常發(fā)生顯著的錯配的擴增。此外，AS-PCR區(qū)分等位基因變體的能力會受到突變類型或者突變或SNP周圍的序列的影響(Ayyadevara S,Thaden JJ, Shmookler Reis RJ.， Anal Biochem 2000 ；284 :11-18)，存在于樣品中的等位基因變體的量的影響，以及備擇等位基因(alternative allele)之間的比例的影響。綜合起來，這些因素常導(dǎo)致經(jīng)常出現(xiàn)假陽性結(jié)果，這使很多研究人員嘗試增大AS-PCR的可信性(Orou A，F(xiàn)echner B, Utermann G, Menzel HJ. ， Hum Mutat 1995 ；6 :163-169) (Imyanitov EN, Buslov KG, Suspitsin EN, Kuligina ES, Belogubova EV, Grigoriev MY 等人，Biotechniques 2002 ；33 :484-490) (McKinzie PB, Parsons BL. Detection of rare K_ras codon 12 mutations using allele-specific competitive blocker PCR. Mutat Res 2002 ；517 :209-220) (Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM.，Hum Mutat 2003 ；22 :79-85)。在一些情況下，通過使用基于SNP的含有鎖核酸(LNA) (Latorra, D.等人，Hum Mut2003,2 79-85 ；Nakiandwe，J 等人，Plant Method2007，3 :2)或修飾的堿基(Koizumi，M 等人Anal Biochem. 2005，340 =287-294)的PCR引物，已經(jīng)使AS-PCR的選擇性從檢測10個等位基因中的1個提高到檢測100，000個等位基因中的1個。然而，這些堿基“模擬物”或修飾增加了分析的總體成本，并且經(jīng)常需要深度的優(yōu)化。用于區(qū)分等位基因變體的另一種涉及探針雜交方法的技術(shù)是TaqMan 基因分型。然而，與AS-PCR —樣，使用該方法的選擇性受到局限，并且不適合于檢測混合樣品中的稀少(彡1，000個中的1個)等位基因或突變。

發(fā)明內(nèi)容
在一些實施方式中，本發(fā)明大體上涉及用于區(qū)分不同等位基因之間的序列差異的組合物、方法和試劑盒。更具體地，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了以高特異性定量包含豐富的(例如野生型)等位基因變體的樣品中的稀少(例如突變)等位基因變體， 例如SNP或核苷酸(NT)插入或刪除的組合物、方法和試劑盒。特別地，在一些實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測突變的高選擇性方法，其被稱作競爭性等位基因特異性TaqMan PCR(competitive allele-specific TaqMan PCR(“ cast-PCR“)。在一個方面，本發(fā)明提供了用于鑒定和/或定量核酸樣品中的等位基因變體的組合物。這些組合物中的一些可以包含(a)等位基因特異性引物；(b)等位基因特異性封閉探針(blocker probe) ； (c)檢測探針(detector probe)；和/或(d)基因座特異性引物。在組合物的一些實施方式中，等位基因特異性引物包含靶標(biāo)特異性部分和等位基因特異性核苷酸部分。在一些實施方式中，等位基因特異性引物還可以包含尾巴。在一些示例性實施方式中，所述尾巴位于等位基因特異性引物的5’末端。在其它實施方式中，等位基因特異性引物的尾巴具有重復(fù)的鳥苷和胞苷殘基(富含GC)。在一些實施方式中，整個等位基因特異性引物的熔解溫度(Tm)是大約50°C-66°C。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的濃度是大約20-900nM。在組合物的一些實施方式中，等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分位于3’末端。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的選擇涉及使用高度區(qū)分性的堿基(例如，用于檢測A/A，A/G，G/A，G/G，A/C或C/A等位基因)。 在一些實施方式中，例如，當(dāng)待檢測的等位基因包括A/G或C/T SNP時，A或G被用作等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果A或T是靶等位基因)，或者 C或T被用作等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果C或G是靶等位基因)。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量A/T SNP時，A被用作等位基因特異性引物的3’末端的區(qū)分性堿基。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量C/G SNP時，G被用作等位基因特異性引物的3’末端的區(qū)分性堿基。在組合物的一些實施方式中，等位基因特異性封閉探針在3’末端包含不可延伸的封閉部分。在一些示例性實施方式中，不可延伸的封閉部分是小溝結(jié)合劑(minor groove binder,MGB)。在一些實施方式中，靶等位基因的位置位于距離等位基因特異性封閉探針的不可延伸的封閉部分大約6-10個核苷酸處，例如大約6，大約7，大約8，大約9或大約10個核苷酸。在一些實施方式中，等位基因特異性封閉探針在5’末端包含MGB部分。在一些示例性實施方式中，等位基因特異性封閉探針在PCR過程中不被切割。在一些實施方式中，等位基因特異性封閉探針的Tm是大約60°C -66°C。在組合物的一些實施方式中，等位基因特異性封閉探針和/或等位基因特異性引物包含至少一個修飾的堿基。在一些實施方式中，修飾的堿基可以增大匹配的與錯配的靶序列之間的Tm差異，和/或降低錯配引發(fā)效率，從而不僅改善測定特異性而且改善選擇性。 此類修飾的堿基包括，例如，8-氮雜-7-脫氮雜-dA (ppA)，8-氮雜-7-脫氮雜_dG (ppG)，鎖核酸(LNA)或2' -0,4' -C-乙烯基核酸(ENA)堿基(圖4b)。在組合物的一些實施方式中，檢測探針是基于序列的或基因座特異性的檢測探針。在其它實施方式中，檢測探針是5’核酸酶探針。在一些示例性實施方式中，檢測探針可以包含MGB部分，報告子部分(例如FAM ，ΤΕΤ , JOE , VIC 或SYBR Green)，猝滅劑部分(例如 Black Hole Quencher 或 TAMRA )，和 / 或被動參照(passive reference) (例如R0X )。在一些示例性實施方式中，根據(jù)美國專利號6，727，356(其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)中描述的方法和原理設(shè)計檢測探針。在一些示例性實施方式中，檢測探針是 TaqMan 探針(Applied Biosystems, Foster City)。在組合物的一些實施方式中，組合物還可以包含聚合酶；三磷酸脫氧核糖核苷酸 (dNTP)；適合用于擴增的其它試劑和/或緩沖劑；和/或模板序列或核酸樣品。在一些實施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些其它實施方式中，聚合酶可以是熱穩(wěn)定性的， 例如Taq DNA聚合酶。在其它實施方式中，模板序列或核酸樣品可以是DNA，例如基因組 DNA(gDNA)或互補性DNA(cDNA)。在其它實施方式中，模板序列或核酸樣品可以是RNA，例如信使 RNA (mRNA)。在另一個方面，本公開物提供了用于擴增等位基因特異性序列的方法。這些方法中的一些可以包括下列一項或多項(a)使等位基因特異性引物與包含第一等位基因(等位基因-1)的第一核酸分子雜交；(b)使等位基因特異性封閉探針與包含第二等位基因 (等位基因_2~)的第二核酸分子雜交，其中等位基因-2對應(yīng)于與等位基因-1相同的基因座；(c)使檢測探針與第一核酸分子雜交；(d)使基因座特異性引物與等位基因特異性引物的延伸產(chǎn)物雜交；和(e)PCR擴增包含等位基因-1的第一核酸分子。在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測和/或定量包含其它等位基因的匯集的或混合的樣品中的等位基因變體的方法。這些方法中的一些可以包括下列一項或多項(a)在第一反應(yīng)混合物中，使第一等位基因特異性引物與包含第一等位基因(等位基因-ι)的第一核酸分子雜交，以及在第二反應(yīng)混合物中，使第二等位基因特異性引物與包含第二等位基因(等位基因-2)的第一核酸分子雜交，其中等位基因-2對應(yīng)于與等位基因-1相同的基因座；(b)在第一反應(yīng)混合物中，使第一等位基因特異性封閉探針與包含等位基因-2的第二核酸分子雜交，以及，在第二反應(yīng)混合物中，使第二等位基因特異性封閉探針與包含等位基因-1的第二核酸分子雜交；(c)在第一反應(yīng)混合物中，使第一檢測探針與第一核酸分子雜交，以及，在第二反應(yīng)混合物中，使第二檢測探針與第一核酸分子雜交；(d)在第一反應(yīng)混合物中，使第一基因座特異性引物與第一等位基因特異性引物的延伸產(chǎn)物雜交，以及， 在第二反應(yīng)混合物中，使第二基因座特異性引物與第二等位基因特異性引物的延伸產(chǎn)物雜交；和(e)PCR擴增第一核酸分子以形成第一組擴增子或擴增子的樣品，以及，PCR擴增第二核酸分子以形成第二組擴增子或擴增子的樣品；和(f)將第一組擴增子與第二組擴增子進行比較以定量包含等位基因-2的樣品中的等位基因-1，和/或包含等位基因-1的樣品中
10的等位基因_2。在方法的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物包含靶標(biāo)特異性部分和等位基因特異性核苷酸部分。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物還可以包含尾巴。在一些實施方式中，整個第一和/或第二等位基因特異性引物的Tm 是大約50°C _66°C。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的濃度是大約 20-900nM。在方法的一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分與第二等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分包含相同的序列。在其它實施方式中，第一等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分與第二等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分是相同的序列。在方法的一些實施方式中，尾巴位于第一和/或第二等位基因特異性引物的5’末端。在一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的5’尾巴和第二等位基因特異性引物的 5’尾巴包含相同的序列。在其它實施方式中，第一等位基因特異性引物的5’尾巴和第二等位基因特異性引物的5’尾巴是相同的序列。在其它實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的尾巴富含GC。在方法的一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分特異于SNP的第一等位基因(等位基因-1)，并且第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分特異于同一 SNP的第二等位基因(等位基因-2)。在方法的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分位于3’末端。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的選擇包括使用高度區(qū)分性的堿基(例如，用于檢測A/A，A/G，G/A，G/G，A/C或C/A等位基因)。 在一些實施方式中，例如，當(dāng)待檢測的等位基因包括A/G或C/T SNP時，A或G被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果A/T是靶等位基因)，或者C或T被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果C/G是靶等位基因)。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量A/TSNP 時，A被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’末端的區(qū)分性堿基。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量C/G SNP時，G被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’末端的區(qū)分性堿基。在方法的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在3’末端包含不可延伸的封閉部分。在一些示例性實施方式中，不可延伸的封閉部分是MGB。在一些實施方式中，靶等位基因的位置位于距離第一和/或第二等位基因特異性封閉探針的不可延伸的封閉部分大約6-10個核苷酸處，例如大約6，大約7，大約8，大約9或大約10個核苷酸處。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在5’末端包含MGB部分。 在其它實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在PCR擴增過程中不被切割。 在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針的Tm是大約60°C -66°C。在方法的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針和/或第一和/或第二等位基因特異性引物包含至少一個修飾的堿基。在一些實施方式中，修飾的堿基可以增大匹配的和錯配的靶序列之間的Tm差異，和/或降低錯配引發(fā)效率，從而不僅改善測定特異性而且改善選擇性。此類修飾的堿基包括，例如，8-氮雜-7-脫氮雜-dA (ppA)，
118-氮雜-7-脫氮雜-dG (ppG)，鎖核酸(LNA)或2 ‘ -0,4' -C-乙烯基核酸(ENA)堿基(圖 4b)。在方法的一些實施方式中，第一和/或第二檢測探針是相同的。在一些實施方式中，第一和/或第二檢測探針是不同的。在一些實施方式中，第一和/或第二檢測探針是基于序列的或基因座特異性的檢測探針。在其它實施方式中，第一和/或第二檢測探針是 5’核酸酶探針。在一些示例性實施方式中，第一和/或第二檢測探針包含MGB部分，報告子部分(例如FAMTM，TETTM，JOETM，VICTM或SYBR Green)，猝滅劑部分(例如 Black Hole Quencher 或 TAMRA )，和 / 或被動參照(passive reference)(例如 R0X )。在一些示例性實施方式中，根據(jù)美國專利號6，727，356(其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)中描述的方法和原理設(shè)計第一和/或第二檢測探針。在一些示例性實施方式中，檢測探針是 TaqMan 探針。在方法的一些實施方式中，第一基因座特異性引物和第二基因座特異性引物包含相同的序列。在一些實施方式中，第一基因座特異性引物和第二基因座特異性引物是相同的序列。在方法的一些實施方式中，第一和/或第二反應(yīng)混合物還可以包含聚合酶；dNTP ； 適合用于PCR擴增的其它試劑和/或緩沖劑；和/或模板序列或核酸樣品。在一些實施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些實施方式中，聚合酶可以是熱穩(wěn)定性的，例如Taq DNA聚合酶。在其它實施方式中，模板序列或核酸樣品可以是DNA，例如gDNA或cDNA。在其它實施方式中，模板序列或核酸樣品可以是RNA，例如mRNA。在方法的一些實施方式中，第一等位基因特異性封閉探針與第二等位基因特異性引物結(jié)合于相同的鏈或序列，同時第二等位基因特異性封閉探針與第一等位基因特異性引物結(jié)合于相同的鏈或序列。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針分別用于降低從第二等位基因和/或第一等位基因產(chǎn)生的背景信號的量。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針是不可延伸的并且優(yōu)選分別與第二等位基因或第一等位基因退火，從而封閉例如可延伸的第一等位基因特異性引物與第二等位基因的退火，和/或可延伸的第二等位基因特異性引物與第一等位基因的退火。在一些示例性實施方式中，第一等位基因是稀少的(例如少數(shù))或突變的等位基因。在其它示例性實施方式中，第二等位基因是豐富的(例如多數(shù))或野生型等位基因。在另一方面，本發(fā)明提供了用于定量包含第二等位基因變體的樣品中的第一等位基因變體的試劑盒，其包含(a)第一等位基因特異性引物；(b)第二等位基因特異性引物； (c)第一基因座特異性引物；(d)第二基因座特異性引物；(e)第一等位基因特異性封閉探針；(f)第二等位基因特異性封閉探針；和(g)第一基因座特異性檢測探針；和(h)第二基因座特異性檢測探針。在試劑盒的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物包含靶標(biāo)特異性部分和等位基因特異性核苷酸部分。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物還可以包含尾巴。在一些實施方式中，整個第一和/或第二等位基因特異性引物的 Tm是大約50°C _66°C。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的濃度是大約 20-900nM。在試劑盒的一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分與第二等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分包含相同的序列。在其它實施方式中，第一等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分與第二等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分是相同的序列。在試劑盒的一些實施方式中，尾巴位于第一和/或第二等位基因特異性引物的5’ 末端。在一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的5’尾巴和第二等位基因特異性引物的5’尾巴包含相同的序列。在其它實施方式中，第一等位基因特異性引物的5’尾巴和第二等位基因特異性引物的5’尾巴是相同的序列。在其它實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的尾巴富含GC。在試劑盒的一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分特異于SNP的第一等位基因(等位基因-1)，并且第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分特異于同一 SNP的第二等位基因(等位基因-2)。在公開的方法的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分位于3’ 末端。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的選擇包括使用高度區(qū)分性的堿基(例如，用于檢測A/A，A/G，G/A，G/G，A/C或C/A等位基因)(圖2)。在一些實施方式中，例如，當(dāng)待檢測的等位基因包括A/G或C/T SNP時，A 或G被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如， 如果A/T是靶等位基因)，或者C或T被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果C/G是靶等位基因)。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和 /或定量A/T SNP時，A被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’末端的區(qū)分性堿基。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量C/G SNP時，G被用作第一和/或第二等位基因特異性引物的3’末端的區(qū)分性堿基。在試劑盒的一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在3’末端包含不可延伸的封閉部分。在一些示例性實施方式中，不可延伸的封閉部分是MGB。在一些實施方式中，靶等位基因的位置位于距離第一和/或第二等位基因特異性封閉探針的不可延伸的封閉部分大約6-10個核苷酸處，例如大約6，大約7，大約8，大約9或大約10個核苷酸。在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在5’末端包含MGB部分。 在其它實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在PCR擴增過程中不被切割。 在一些實施方式中，第一和/或第二等位基因特異性封閉探針的Tm是大約60°C -66°C。在試劑盒的一些實施方式中，等位基因特異性封閉探針和/或第一和/或第二等位基因特異性引物包含至少一個修飾的堿基。在一些實施方式中，修飾的堿基可以增大匹配的與錯配的靶序列之間的Tm差異，和/或降低錯配引發(fā)效率，從而不僅改善測定特異性而且改善選擇性。此類修飾的堿基包括，例如，8-氮雜-7-脫氮雜-dA (ppA)，8-氮雜-7-脫氮雜-dG (ppG)，鎖核酸(LNA)或2 ‘ -0,4' -C-乙烯基核酸(ENA)堿基(圖4b)。在試劑盒的一些實施方式中，第一和/或第二檢測探針是相同的。在公開的試劑盒的一些實施方式中，第一和/或第二檢測探針是不同的。在公開的試劑盒的一些實施方式中，第一和/或第二檢測探針是基于序列的或基因座特異性的檢測探針。在其它實施方式中，第一和/或第二檢測探針是5’核酸酶探針。在一些示例性實施方式中，第一和 /或第二檢測探針包含MGB部分，報告子部分(例如FAM ，ΤΕΤ , JOE , VIC 或SYBR Green)，猝滅劑部分(例如 Black Hole Quencher 或 TAMRA )，和 / 或被動參照(passivereference)(例如R0X )。在一些示例性實施方式中，根據(jù)美國專利號6，727，356 (其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)中描述的方法和原理設(shè)計第一和/或第二檢測探針。在一些示例性實施方式中，檢測探針是TaqMan 探針。在試劑盒的一些實施方式中，第一基因座特異性引物和第二基因座特異性引物包含相同的序列。在一些實施方式中，第一基因座特異性引物和第二基因座特異性引物是相同的序列。在試劑盒的一些實施方式中，第一和/或第二反應(yīng)混合物還可以包含聚合酶； dNTP ；適合用于PCR擴增的其它試劑和/或緩沖劑；和/或模板序列或核酸樣品。在一些實施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些其它實施方式中，聚合酶可以是熱穩(wěn)定性的， 例如Taq DNA聚合酶。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒提供了高度的等位基因區(qū)分特異性和選擇性。在一些實施方式中，特異性和/或選擇性的定量測定包括比較第一組擴增子與第二組擴增子之間的Ct值。在一些實施方式中，選擇性的水平是可以檢出大約 1, 000, 000個拷貝的另一種等位基因中的單一拷貝的給定的等位基因。以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的多個實施方式，其通過使用下列一項或多項提供了等位基因變體的改善的檢測和區(qū)分(a)加尾的等位基因特異性引物；(b)低的等位基因特異性引物濃度；(c)設(shè)計為具有較低Tm值的等位基因特異性引物；(d)設(shè)計為靶向區(qū)分性堿基的等位基因特異性引物；(e)含有MGB的等位基因特異性封閉探針，其被設(shè)計為阻止從樣品中的備選的并且潛在更豐富的等位基因變體進行擴增；和(f)等位基因特異性封閉探針和 /或等位基因特異性引物，其被設(shè)計為包含修飾的堿基以增大匹配的與錯配的靶序列之間的 Δ Tm。雖然本文已經(jīng)討論了應(yīng)用數(shù)種上述改進的具體實施方式
，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是根據(jù)待測樣品的性質(zhì)，可以對上述改進進行多種組合以達到有利的結(jié)果。因此， 例如，在使用含有修飾的堿基的等位基因特異性引物以增大ΔΤπι的方法中，可以使用非 MGB封閉探針；此類引物也可以被設(shè)計為靶向區(qū)分性堿基；并且可以在低引物濃度使用引物。因此，基于本公開物的替代性實施方式可用于實現(xiàn)適宜水平的等位基因檢測。本公開物提供了下列優(yōu)點在具體情況下本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用所列舉的改進的任意組合。例如，本發(fā)明可以包括使用改進a、c、d和f ；改進b、c和e的方法或反應(yīng)混合物。應(yīng)該理解上述一般性描述和下文的具體描述僅是示例性和解釋性的，不是限制所要求保護的本發(fā)明。并入本說明書并構(gòu)成其一部分的附圖詮釋了本公開物的數(shù)個示例性實施方式，其與說明書一起用于解釋某些教導(dǎo)。


技術(shù)人員將理解以下描述的附圖僅是為了解釋的目的。附圖不是意在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。圖1顯示了 cast-PCR的說明性的實施方式的示意圖。在一些實施方式中， cast-PCR的成分包括下列一個基因座特異性TaqMan探針(LST)；兩個MGB封閉劑一個
14等位基因-1特異性MGB封閉劑(MGBl)和一個等位基因_2特異性MGB封閉劑(MGB》；3個 PCR引物一個基因座特異性PCR引物(LSP)；—個等位基因-1特異性引物(ASPl)和一個等位基因-2特異性引物(ASP2)。圖2顯示了 cast-PCR的說明性的實施方式的示意圖，其中使用等位基因特異性封閉探針，其包含高度區(qū)分性堿基以用于檢測稀少的等位基因變體。高度區(qū)分性堿基可以包括，例如，A/A，A/G，G/A，G/G，A/C，C/A。最小區(qū)分性堿基可以包括，例如，C/C, T/C, G/T，T/ G，C/T。在一些實施方式中，例如，為了檢測A-G或C-T SNP，A和G被用作區(qū)分性堿基(如果A//T是等位基因變體，例如突變等位基因)；或者C和T被用作區(qū)分性堿基(如果C//G 是等位基因，例如突變等位基因)。圖3顯示了 cast-PCR的說明性的實施方式的示意圖，其中使用等位基因特異性封閉探針，其在5’末端具有MGB部分。在一些實施方式中，探針的3’末端的封閉部分可以包括，例如NH2,生物素，MGB, PO4和PEG。圖4A顯示了 cast-PCR的說明性的實施方式的示意圖，其中使用MGB封閉探針或等位基因特異性引物中的修飾的堿基(G *代表ppG)。圖4B顯示了 MGB封閉探針或等位基因特異性引物的修飾的堿基的一些實例。圖5顯示了 cast-PCR的一個示例性實施方式的TaqMan樣靈敏性和動態(tài)范圍。圖6顯示了使用cast-PCR方法可以檢出的密碼子12和13中的KRAS突變的序列。 密碼子12和13中的KRAS突變與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌中對于西妥昔單抗或帕尼單抗的抗性相關(guān)(Di Nicolantonio F 等人，JClin Oncol. 2008 ；26 :5705-12)。圖7顯示了在一個示例性實施方式中，使用cast-PCR測定法檢測KRAS突變的特異性。圖8顯示了使用cast-PCR方法檢測IO6拷貝的野生型DNA中的單一拷貝的突變 DNA的一個示例性實施方式。圖9顯示了使用cast-PCR方法檢測摻入到野生型樣品中的突變樣品(KRAS-G12A) 的相對拷貝數(shù)。圖10顯示了使用cast-PCR的一個示例性實施方式在腫瘤樣品中檢測的多種不同的腫瘤標(biāo)志物(SNP)。圖IlA-D顯示了用于cast-PCR測定中的示例性等位基因特異性引物和探針的列表。
具體實施例方式I.緒論目標(biāo)等位基因的選擇性擴增經(jīng)常被一些因素復(fù)雜化，所述因素包括備選的等位基因上的錯配的等位基因特異性引物的錯誤引發(fā)和延伸。此類錯誤引發(fā)和延伸在檢測聚集了過量的另一等位基因變體的樣品中存在的稀少等位基因時尤其會產(chǎn)生問題。當(dāng)足夠過量時，其它等位基因變體的錯誤引發(fā)和延伸可以阻礙目標(biāo)等位基因的檢測。當(dāng)使用基于PCR 的方法時，含有備選的等位基因變體的樣品中的特定等位基因的區(qū)分依賴于目標(biāo)等位基因的選擇性擴增，同時防止該樣品中存在的其它等位基因的擴增或使其擴增最小化。已經(jīng)鑒定出了多個因素，其單獨或組合在一起促成等位基因特異性PCR的增強的
15區(qū)分能力。如本文所公開，提供錯配的與匹配的等位基因特異性引物之間的較大的△(；值的因素指示較大的區(qū)分等位基因變體的能力。人們發(fā)現(xiàn)此類因素改善使用本方法的等位基因變體的區(qū)分，包括，例如，使用下列一項或多項(a)加尾的等位基因特異性引物；(b)低的等位基因特異性引物濃度；(c)設(shè)計為具有較低Tm值的等位基因特異性引物；(d)設(shè)計為靶向區(qū)分性堿基的等位基因特異性引物；(e)等位基因特異性封閉探針，其被設(shè)計為阻止從樣品中的替代性的并且潛在更豐富的等位基因變體進行擴增；和(f)等位基因特異性封閉探針和/或等位基因特異性引物，其被設(shè)計為包含修飾的堿基以增大匹配的與錯配的靶序列之間的Δ Tm。上述因素，尤其是當(dāng)組合使用時，能夠影響等位基因特異性PCR的區(qū)分存在于樣品中的不同等位基因的能力。因此，本公開物大體上涉及新的擴增方法，其被稱作cast-PCR，該方法利用上述因素的組合以改善PCR過程中等位基因變體的區(qū)分(通過增大ACt值)。在一些實施方式中，本方法可以涉及高水平的選擇性，其中可以檢出至少 1，000-1，000，000,例如大約 1000-10，000，大約 10，000-100，000，或大約 100, 000-1, 000, 000,或其中的任意部分范圍的野生型分子背景中的1個突變分子。在一些實施方式中，涉及公開的方法的第一組擴增子與第二組擴增子之間的比較提供了下列倍數(shù)的特異性的改善1，000-1，000，000倍的差異，例如大約1000-10，000，大約 10，000-100，000，或大約100，000-1，000，000倍的差異，或其中的任意部分范圍。II.定義為了解釋本說明書的目的，適用下列定義，在所有適當(dāng)?shù)那闆r下，單數(shù)形式的術(shù)語也包括復(fù)數(shù)形式，反之亦然。如果出現(xiàn)下文給出的任意定義與任何其它文獻(包括通過引用方式并入本文的任何文獻)中使用的該詞語相矛盾的情況，為了解釋本說明書及其相關(guān)的權(quán)利要求的目的，一律以下文給出的定義為準(zhǔn)，除非明確指出了相反含義。如本文使用的術(shù)語“等位基因” 一般是指DNA區(qū)段例如同源染色體上的相同物理基因座上的備選DNA序列。等位基因可以指單一細胞或生物體內(nèi)的同源染色體上存在的相同物理基因座之間有差異的，或者多個細胞或生物體內(nèi)的相同物理基因座之間有差異的 DNA序列(“等位基因變體”)。在一些情況下，等位基因可以對應(yīng)于特定物理基因座上的單核苷酸差異。在其它實施方式中，等位基因可以對應(yīng)于核苷酸(單個或多個)插入或刪除。如本文使用的術(shù)語“等位基因特異性引物”是指與包含目標(biāo)等位基因的序列雜交并且當(dāng)用于PCR中時可以被延伸以完成第一鏈cDNA合成的寡核苷酸序列。等位基因特異性引物特異于給定的靶DNA或基因座的特定等位基因，并且可以被設(shè)計為檢測靶序列中的少至1個核苷酸的差異。等位基因特異性引物可以包含等位基因特異性核苷酸部分、靶標(biāo)特異性部分和/或尾巴。如本文使用的術(shù)語“等位基因特異性核苷酸部分”或“等位基因特異性靶核苷酸” 是指等位基因特異性引物中的這樣的核苷酸其可以在給定基因座上的一個等位基因(例如少數(shù)或突變等位基因)選擇性雜交并延伸，排除掉相同基因座上的其它等位基因(例如， 對應(yīng)的多數(shù)或野生型等位基因)。如本文使用的術(shù)語“靶標(biāo)特異性部分”是指等位基因特異性引物中的與靶多核苷酸序列雜交的區(qū)域。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分是在待測等位基因變體的5’的引發(fā)區(qū)互補于靶序列的引發(fā)區(qū)段。等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分可以包含等位基因特異性核苷酸部分。在其它情況下，等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分靠近3’等位基因特異性核苷酸部分。如本文使用的術(shù)語“尾巴”或“5’尾巴”是指引物的非3’末端。該區(qū)域通常(雖然無需)包含不互補于待分析的靶多核苷酸序列的序列。5’尾巴的長度可以是下列任意項大約2-30，2-5，4-6，5-8，6-12，7-15,10-20，15-25或20-30個核苷酸，或其中的任意范圍。如本文使用的術(shù)語“等位基因特異性封閉探針”(在本文中也稱作“封閉探針”、“封閉劑”)是指這樣的寡核苷酸序列其結(jié)合至包含位于與等位基因特異性引物所結(jié)合的鏈相同、相對或互補的鏈上的特定等位基因變體的DNA的鏈，并減少或阻止該特定等位基因變體的擴增。如本文更詳細地討論，等位基因特異性封閉探針一般包含修飾，例如在核糖環(huán)的 3’ -OH處，所述修飾阻止引物被聚合酶延伸。等位基因特異性封閉探針可以被設(shè)計為與等位基因特異性引物所退火的鏈相同或相對的鏈退火，并且可以以封閉基團(例如“不可延伸的封閉部分”)在其3’末端進行修飾。因此，封閉探針可以被設(shè)計為，例如，緊密結(jié)合至野生型等位基因(例如豐富的等位基因變體)，以抑制野生型等位基因的擴增，同時允許通過等位基因特異性引物的延伸在包含突變等位基因(例如稀少等位基因變體)的相同或相對鏈上發(fā)生擴增。在例示性的實施方式中，等位基因特異性封閉探針不包括標(biāo)記物，例如熒光、放射活性或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。如本文使用的術(shù)語“不可延伸的封閉部分” 一般是指寡核苷酸序列例如探針和 /或引物上的修飾，該修飾使其不能被聚合酶延伸，例如，當(dāng)在PCR反應(yīng)中與其互補序列雜交時。封閉部分的常見的實例包括寡核苷酸的核糖環(huán)3’ -OH的修飾，其阻止聚合酶向寡核苷酸序列的3’末端添加另外的堿基。此類3’ -OH修飾是本領(lǐng)域熟知的(見，例如， Josefsen，M等人，Molecular and Cellular Probes, 23 (2009) :201-223 ；McKinzie，P等人， Mutagenesis. 2006,21(6) :391-7 ；Parsons，B 等人，Methods MoI Biol. 2005，291 :235-45 ； Parsons, B 等人，Nucleic Acids Res. 1992,25 :20(10) :2493-6 ；和 Morlan，J 等人，PLoS One 2009,4(2) :e4584，其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。如本文使用的術(shù)語“MGB”、“MGB基團”、“MGB化合物”或“MBG部分”是指小溝結(jié)合劑。當(dāng)與寡核苷酸的3’末端綴合時，MGB基團能夠作為不可延伸的封閉部分發(fā)揮作用。MGB是結(jié)合于雙鏈DNA的小溝內(nèi)的分子。雖然不能提供所有已知的MGB化合物的一般性化學(xué)通式(因為此類化合物具有差異巨大的化學(xué)結(jié)構(gòu))，但是一般而言，能夠結(jié)合于 DNA的小溝內(nèi)的化合物具有月牙形的三維結(jié)構(gòu)。多數(shù)MGB部分對雙鏈DNA的B形式的富含 A-T (腺苷和胸苷)的區(qū)域具有強烈的優(yōu)選性。然而，顯示出對富含C-G(胞苷和鳥苷)的區(qū)域的優(yōu)選性的MGB化合物在理論上也是可能的。因此，包含衍生自具有針對C-G區(qū)域的優(yōu)選性的小溝結(jié)合劑分子的基團或部分的寡核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一些MGB能夠以IO3M4或更高的結(jié)合常數(shù)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝內(nèi)。可以通過完善建立的光譜學(xué)方法例如紫外(UV)和核磁共振(NMR)光譜并且也可以通過凝膠電泳來檢測這種類型的結(jié)合。在小溝結(jié)合劑分子結(jié)合之后，UV光譜的偏移和利用“核歐沃豪斯” (NOSEY) 效應(yīng)的NMR光譜是用于該目的的特別熟知的和有用的技術(shù)。凝膠電泳檢測MGB與雙鏈DNA 或其片段的結(jié)合，因為在發(fā)生此類結(jié)合之后，雙鏈DNA的遷移性會改變。在文獻中已經(jīng)描述了多種適宜的小溝結(jié)合劑。見，例如，Kutyavin等人的美國專禾U 號 5, 801, 155 ；ffemmer, D. E.，and Dervan P. B.，Current Opinion in Structural Biology,7 :355-361 (1997) ；Walker, W. L. , Kopka,J.L. and Goodsell, D. S. ,Biopolymers, 44 :323-334(1997) ；Zimmer, C. & ffahnert, U. Prog. Biophys. Molec. Bio. 47 :31-112 (1986) 以及 Reddy, B. S. P.，Dondhi，S. Μ.，and Lown, J. W.，Pharmacol. Therap. ,84 :1-111 (1999) (其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。根據(jù)本公開的優(yōu)選的MGB是DPI3。此類MGB 的合成方法和/或來源也是本領(lǐng)域熟知的(見，例如，美國專利號5，801，155 ；6, 492，346 ； 6，084，102 ；和6，727，356，其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。如本文使用的術(shù)語“MGB封閉探針”、“MGB封閉劑”或“MGB探針”是在小溝結(jié)合劑部分的3’和/或5’末端另外與其結(jié)合的寡核苷酸序列和/或探針。與MGB部分綴合的寡核苷酸與單鏈和雙鏈DNA靶標(biāo)形成非常穩(wěn)定的雙鏈體，因此允許在基于雜交的測定中使用較短的探針。與未經(jīng)修飾的DNA相比，MGB探針具有較高的熔解溫度(Tm)和增加的特異性， 尤其是當(dāng)錯配靠近雜交的雙鏈體的MGB區(qū)域的時候(見，例如，KutyaVin，I.V等人，Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28，No. 2 :655-661)。如本文使用的術(shù)語“修飾的堿基”一般是指與天然存在的核酸在結(jié)構(gòu)上有差異的核酸中的堿基或堿基的化學(xué)鍵合的任意修飾。此類修飾可以包括核酸的堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)或堿基的化學(xué)鍵合中的變化，或核酸的骨架結(jié)構(gòu)中的變化(見，例如，Latorra, D等人，Hum Mut 2003，2 :79-85. Nakiandwe，J 等人，plant Method 2007，3:2)。如本文使用的術(shù)語“檢測探針”是指指示擴增的多種信號傳導(dǎo)分子中的任意種。 例如，SYBR Green和其它DNA結(jié)合染料是檢測探針。一些檢測探針可以是基于序列的(在本文中也稱作“基因座特異性檢測探針)，例如5’核酸酶探針。多種檢測探針是本領(lǐng)域已知的，例如，本文中描述的TaqMan 探針(另外見美國專利號5，538，848)，多種莖環(huán)分子信標(biāo)(見，例如，美國專利號6，103，476和5，925，517以及Tyagi and Kramer, 1996, Nature Biotechnology 14 :303-308)，無莖的或線性信標(biāo)(見，例如，WO 99/21881)， PNA Molecular Beacons (見，例如，美國專利號 6，355, 421 和 6，593，091)，線性 PNA 信標(biāo)(見，例如，Kubista等人，2001，SPIE 4264 :53-58)，非-FRET探針(見，例如，美國專利號 6，150，097)，Sunrise /Amplifluor 探針(美國專利號 6，548，250)，莖環(huán)和雙
Scorpion (Solinas 等人，2001，Nucleic Acids Research 29 :E96 和美國專利號 6，589，743)，鼓起的環(huán)探針(美國專利號6，590，091)，假結(jié)探針(美國專利號6，589，250)， cyclicon (美國專利號 6，383，752)，MGB Eclipse 探針(Epoch Biosciences)，發(fā)夾探針 (美國專利號6，596，490)，肽核酸(PNA)點燃探針，自組裝納米顆粒探針和二茂鐵修飾的修飾，其描述于例如美國專利號6，485，901 ；Mhlanga等人，2001，Methods 25:463-471 ； Whitcombe φ A,1999, Nature Biotechnology. 17 :804-807 ；Isacsson φ A,2000, Molecular Cell Probes. 14 :321-328 ；Svanvik 等人，2000，Anal Biochem. 281:26-35 ； Wolffs 等人，2001，Biotechniques 766 :769-771 ；Tsourkas 等人，2002，Nucleic Acids Research. 30 :4208-4215 ；Riccelli 等人，2002，Nucleic Acids Research 30 :4088-4093 ； Zhang 等人，2002 Shanghai. 34 :329-332 ；Maxwell 等人，2002，J. Am. Chem. Soc. 124 9606-9612 ；Broude 等人,2002，Trends Biotechnol. 20 :249-56 ；Huang 等人,2002，Chem Res. Toxicol. 15 :118-126 ；和 Yu 等人，2001，J.Am. Chem. Socl4 :11155_11161。檢測探針可以包含報告分子染料，例如，6-羧基熒光素(6-FAM)或四氯熒光素(ΤΕΤ)。檢測探針還可以包含猝滅劑部分，例如四甲基若丹明(TAMRA)，Black Hole Quenchers (Biosearch)， Iowa Black(IDT)，QSY 猝滅劑(Molecular Probes)和 Dabsyl 和 Dabcel 磺酸鹽 / 羧酸鹽猝滅劑(Epoch)。檢測探針也可以包含兩個探針，其中，例如，在一個探針上具有氟石，在另一個探針上具有猝滅劑，這兩個探針在靶標(biāo)上的雜交共同猝滅信號，或者在靶標(biāo)上的雜交通過熒光的變化改變信號特征。檢測探針還可以包含具有SO3而非羧酸基團的熒光素染料的磺酸鹽衍生物，亞磷酰胺形式的熒光素，亞磷酰胺形式的CY5 (可以獲自例如Amersham Biosciences-GE Healthcare)0如本文使用的術(shù)語"基因座特異性引物"是指在PCR反應(yīng)中與源自第一引物(例如等位基因特異性引物)的延伸的產(chǎn)物雜交并且能夠?qū)崿F(xiàn)所述產(chǎn)物的第二鏈cDNA合成的寡核苷酸序列。因此，在一些實施方式中，等位基因特異性引物作為正向PCR引物，基因座特異性引物作為反向PCR引物，反之亦可。在一些優(yōu)選的實施方式中，基因座特異性引物以高于等位基因特異性引物的濃度存在。如本文使用的術(shù)語“稀少等位基因變體”是指相對于備選的等位基因變體，在樣品中以較低水平存在的靶多核苷酸。稀少等位基因變體也可以被稱作是“少數(shù)等位基因變體”和/或“突變等位基因變體”。例如，對于給定的SNP或基因，相對于另一個等位基因變體，稀少等位基因變體可以以小于1/10，1/100，1/1，000，1/10，000，1/100，000， 1/1，000，000，1/10，000，000，1/100，000，000 或 1/1，000，000，000 的頻率存在?；蛘撸?1，10，100，1，000 μ 1樣品或反應(yīng)體積中，稀少等位基因變體可以是例如小于2,3,4, 5,6, 7， 8,9,10，15，20，25，50，75，100，250，500，750，1，000，2，500，5，000，7，500，10，000，25，000， 50，000，75，000，100，000，250，000，500，000，750，000 或 1，000，000 個拷貝。如本文使用的術(shù)語“豐富的等位基因變體”可以指在樣品中以高于備選等位基因變體的水平存在的靶多核苷酸。豐富的等位基因變體也可以被稱作是“多數(shù)等位基因變體”和/或“野生型等位基因變體”。例如，對于給定的SNP或基因，相對于另一個等位基因變體，豐富的等位基因變體可以以大于10Χ, 100Χ, 1000Χ, 10，000Χ, 100，000Χ, 1，000，000Χ, 10，000，000Χ, 100，000，000Χ 或 1，000，000，000Χ 的頻率存在?；蛘?每 1，10，100，1，000 μ 1 樣品或反應(yīng)體積中，豐富的等位基因變體可以是例如大于2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20， 25，50，75，100，250，500，750，1，000，2，500，5，000，7，500，10，000，25，000，50，000，75，000， 100，000，250，000，500，000，750，000 或 1，000，000 個拷貝。如本文使用的術(shù)語“第一”和“第二”用于區(qū)分第一反應(yīng)(例如“第一”反應(yīng)；“第一”等位基因特異性引物)和第二反應(yīng)(例如“第二”反應(yīng)；“第二”等位基因特異性引物) 的成分。習(xí)慣上講，如本文所使用，第一反應(yīng)擴增第一(例如，稀少的)等位基因變體；第二反應(yīng)擴增第二(例如，豐富的)等位基因變體，反之亦可。如本文使用的“第一等位基因變體”和“第二等位基因變體”可以涉及來自相同生物體的給定基因座的等位基因。例如，包含野生型等位基因的人類樣品(例如細胞)中的情況可能是這樣，其中一些野生型等位基因已經(jīng)突變以形成少數(shù)或稀少等位基因。本教導(dǎo)中的第一和第二等位基因變體也可以指來自不同生物體的等位基因。例如，第一等位基因可以是經(jīng)遺傳修飾的生物體的等位基因，第二等位基因可以是野生型生物體的對應(yīng)的等位基因。本教導(dǎo)中的第一等位基因變體和第二等位基因變體可以包含于gDNA以及mRNA和 cDNA中，并且一般可以是由于例如SNP或核苷酸插入和/或刪除突變而顯示出序列變異性
19的任意靶核酸。如本文使用的術(shù)語“熱穩(wěn)定性的”或“熱穩(wěn)定性的聚合酶”是指這樣的酶其是熱穩(wěn)定性的或熱抗性的，并且催化脫氧核糖核苷酸聚合以形成互補于核酸鏈的引物延伸產(chǎn)物。 當(dāng)在PCR擴增中在升高的溫度經(jīng)歷足以使單鏈核酸去穩(wěn)定化或使雙鏈核酸變性的時間時， 本文中使用的熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶不會發(fā)生不可逆的失活。酶的不可逆的變性是指實質(zhì)上喪失酶的活性。優(yōu)選地，熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶在例如PCR擴增通常所需的條件下在大約90°C -100°C將不會不可逆地變性。如本文使用的術(shù)語“PCR擴增(PCR amplifying)，，或“PCR擴增”(PCR amplification) 一般是指循環(huán)的聚合酶介導(dǎo)的核酸的指數(shù)擴增，其使用與互補鏈雜交的弓I物，如在例如 Innis 等人，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)中所描述。已經(jīng)開發(fā)了能夠以包含熒光指示劑的成分進行熱循環(huán)反應(yīng)的裝置，所述熒光指示劑能夠發(fā)射指定波長的光束，讀取熒光染料的強度，并且顯示每個循環(huán)后熒光的強度。已經(jīng)描述了包含熱循環(huán)儀、光束發(fā)射器和熒光信號檢測器的裝置，例如，見美國專利號5，928，907 ；6, 015, 674 ；6, 174,670 ；和6，814，934，包括但不限于 ABI Prism 7700Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California) ,ABI GeneAmp 5700Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California)，ABI GeneAmp 730(^equence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California), ABI GeneAmp 7500Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California)，StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California)禾口 ABI GeneAmp 7900Sequence Detection System(Applied Biosystems,Foster City，California)0如本文使用的術(shù)語寡核苷酸的“Tm”或“熔解溫度”是指單鏈寡核苷酸的群體中的 50%的分子與它們的互補序列雜交并且群體中的50%的分子未與所述互補序列雜交時的溫度(以攝氏度表示)?？梢酝ㄟ^熔解曲線的方式通過經(jīng)驗確定引物或探針的Tm。在一些情況下，還可以使用本領(lǐng)域熟知的公式來計算(見，例如，Maniatis, T.等人，Molecular cloning :a laboratory manual/CoId Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. :1982)。如本文使用的術(shù)語“靈敏性”是指在給定的測定法中能夠被檢出的模板的最小的量(拷貝數(shù)或質(zhì)量)。如本文使用的術(shù)語“特異性”是指某測定法區(qū)分來自匹配模板和錯配模板的擴增的能力。特異性經(jīng)常表示為ACt = Ctlfs-Ctraet5特異性的改善或“特異性的改進”或“倍數(shù)差異”在本文中表示為。術(shù)語“選擇性”是指AS-PCR測定可用于測定混合物中的少數(shù)(通常是突變)等位基因而無來自多數(shù)(經(jīng)常是野生型)等位基因的干擾的程度。選擇性經(jīng)常表示為比例或百分率。例如，能夠在存在100個野生型模板的情況下檢出1個突變模板的測定被稱作具有1 100或的選擇性。如本文使用的 “測定的選擇性“也可以計算為1/2Δ"或使用(1/2δ"Χ100)以百分率表示。如本文使用的術(shù)語“Ct”或“Ct值”是指循環(huán)閾值，代表PCR擴增測定的循環(huán)數(shù)在該循環(huán)數(shù)時，來自指示擴增代數(shù)的報告分子的信號(例如熒光)首次變?yōu)樵诒尘八街峡蓹z出。在一些實施方式中，循環(huán)閾值或Ct是PCR擴增變?yōu)橹笖?shù)時的循環(huán)數(shù)。如本文使用的術(shù)語"德爾塔Ct"或"ACt"是指信號通過固定閾值時，兩個不同樣品或反應(yīng)之間的循環(huán)數(shù)差異。在一些實施方式中，Δ Ct是達到指數(shù)擴增時，兩個不同樣品或反應(yīng)之間的循環(huán)數(shù)差異。ACt可用于鑒定“針對相應(yīng)靶核酸序列的匹配的引物”與“針對相同的相應(yīng)靶核酸序列的錯配的引物”之間的特異性。在一些實施方式中，錯配的引物與匹配的引物之間的ACt的計算被用作等位基因特異性PCR的區(qū)分能力的一個度量。一般地，任何增大“使用與靶序列(例如包含目標(biāo)等位基因變體的序列)匹配的引物進行的擴增反應(yīng)的Ct值”與“使用錯配引物時的Ct值”之間的差異的因素都將導(dǎo)致更大的等位基因區(qū)分能力。根據(jù)多個實施方式，可以使用PCR曲線的衍生物來測定Ct值。例如，可以在PCR曲線上進行第一、第二或第η衍生物方法以測定Ct值。在多個實施方式中，衍生物的特征可用于測定Ct值。此類特征可以包括但不限于第二衍生物的正變形(positive inflection), 第二衍生物的負變形(negative inflection)，第二衍生物的零交叉，或第一衍生物的正變形。在多個實施方式中，可以使用閾值和基線法來測定Ct值。例如，可以使用衍生物方法建立PCR曲線的指數(shù)期上界(upper bound)，同時測定PCR曲線的基線以建立PCR曲線的指數(shù)期的下界(lower bound)。通過PCR曲線的上界和下界，可以建立閾值，從閾值可以確定Ct值。用于確定Ct值的其它方法是本領(lǐng)域已知的，例如但不限于，擬合點(fit point) 法的多種實施方式，和sigmoidal法的多種實施方式(見，例如，美國專利號6，303，305 ； 6，503，720 ；6, 783，934，7，228，237和美國申請?zhí)?004/0096819 ；其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。III.組合物、方法和試劑盒在一個方面，本發(fā)明提供了用于鑒定和/或定量核酸樣品中的等位基因變體的組合物。這些組合物中的一些可以包含(a)等位基因特異性引物；(b)等位基因特異性封閉探針；(c)檢測探針；和/或(d)基因座特異性引物。在組合物的一些實施方式中，組合物還可以包含聚合酶，dNTP，適合用于PCR擴增的試劑和/或緩沖劑；和/或模板序列或核酸樣品。在一些實施方式中，聚合酶可以是熱穩(wěn)定性的。在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含(i)第一等位基因特異性引物，其中所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；和(ii)第一等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑。在一些例示性實施方式中，組合物還可以包含基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域。在進一步的實施方式中，組合物還可以包括檢測探針。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于擴增等位基因特異性序列的方法。這些方法中的一些可以包括(a)使等位基因特異性引物與包含靶等位基因的第一核酸分子雜交；(b) 使等位基因特異性封閉探針與包含備選等位基因的第二核酸分子雜交，其中所述備選等位基因?qū)?yīng)于與靶等位基因相同的基因座；(c)使基因座特異性檢測探針與第一核酸分子雜交；(d)使基因座特異性引物與等位基因特異性引物的延伸產(chǎn)物雜交；和(e)PCR擴增靶等位基因。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測和/或定量混合樣品中的等位基因變體的方法。這些方法中的一些可以包括(a)在第一反應(yīng)混合物中，使第一等位基因特異性引物與包含第一等位基因(等位基因-ι)的第一核酸分子雜交，以及在第二反應(yīng)混合物中，使第二等位基因特異性引物與包含第二等位基因(等位基因-2)的第一核酸分子雜交，其中等位基因-2對應(yīng)于與等位基因-1相同的基因座；(b)在第一反應(yīng)混合物中，使第一等位基因特異性封閉探針與包含等位基因-2的第二核酸分子雜交，以及，在第二反應(yīng)混合物中， 使第二等位基因特異性封閉探針與包含等位基因-1的第二核酸分子雜交；(c)在第一反應(yīng)混合物中，使第一檢測探針與第一核酸分子雜交，以及，在第二反應(yīng)混合物中，使第二檢測探針與第一核酸分子雜交；(d)在第一反應(yīng)混合物中，使第一基因座特異性引物與第一等位基因特異性引物的延伸產(chǎn)物雜交，以及，在第二反應(yīng)混合物中，使第二基因座特異性引物與第二等位基因特異性引物的延伸產(chǎn)物雜交；和(e)PCR擴增第一核酸分子以形成第一組擴增子或擴增子的樣品，以及，PCR擴增第二核酸分子以形成第二組擴增子或擴增子的樣品；和(f)將第一組擴增子與第二組擴增子比較以定量包含等位基因-2的樣品中的等位基因-1，和/或包含等位基因-1的樣品中的等位基因_2。在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測和/或定量等位基因變體的方法。這些方法中的一些可以包括(a)PCR擴增第一反應(yīng)中的第一等位基因變體以形成第一擴增子，所述第一反應(yīng)包括(i)低濃度的第一等位基因特異性引物，(ii)第一基因座特異性引物，和 (iii)第一封閉探針；(b)PCR擴增第二反應(yīng)中的第二等位基因變體以形成第二擴增子，所述第二反應(yīng)包括(i)低濃度的第二等位基因特異性引物，(ii)第二基因座特異性引物，和 (iii)第二封閉探針；和(d)比較第一擴增子與第二擴增子以定量包含第二等位基因變體的樣品中的第一等位基因變體。在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測懷疑包含至少靶序列的第二等位基因變體的核酸樣品中的靶序列的第一等位基因變體的方法。該方面的方法包括通過組合下列形成第一反應(yīng)混合物(i)核酸樣品；(ii)第一等位基因特異性引物，其中第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；(iii)第一等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑；(iv)第一基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域；和(ν)第一檢測探針。接下來，使用第一基因座特異性引物和第一等位基因特異性引物在第一反應(yīng)混合物中進行擴增反應(yīng)，通常是PCR擴增反應(yīng)，以形成第一擴增子。然后，通過第一檢測探針與該擴增子結(jié)合后的可檢測性質(zhì)的變化來檢測第一擴增子，從而檢測核酸樣品中的靶基因的第一等位基因變體。在一些例示性的實施方式中，檢測探針是5’核酸酶探針。在一些例示性的實施方式中，可檢測性質(zhì)是熒光。在一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的5’靶區(qū)域的3’核苷酸部分是等位基因特異性核苷酸部分。在一些其它例示性的實施方式中，包括那些“第一等位基因特異性引物的5’靶區(qū)域的3’核苷酸部分是等位基因特異性核苷酸部分”的實施方式，等位基因特異性引物的封閉區(qū)域包括等位基因特異性核苷酸部分。此外，在例示性的實施方式中，第一等位基因特異性封閉探針包括小溝結(jié)合劑。此外，在一些例示性的實施方式中，等位基因特異性封閉探針不具有標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物，或猝滅劑。
在一些例示性的實施方式中，通過評價第一檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化來測定
第一等位基因變體的數(shù)量。在一些例示性的實施方式中，方法還包括通過組合下列形成第二反應(yīng)混合物(i) 核酸樣品；(ii)第二等位基因特異性引物，其中第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第二等位基因變體；(iii)第二等位基因特異性封閉探針， 其互補于包含第一等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第二等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑；(iv)第二基因座特異性引物，其互補于在第二等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域；和(ν)第二檢測探針。接下來，使用第二等位基因特異性引物和基因座特異性引物在第二反應(yīng)混合物中進行擴增反應(yīng)，以形成第二擴增子。然后通過檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化來檢測第二擴增子。在一些實施方式中，方法還包括將第一反應(yīng)混合物中的第一檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化與第二反應(yīng)混合物中的第二檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化進行比較。在另一個方面，本發(fā)明提供了包括下列的反應(yīng)混合物(i)核酸分子；(ii)等位基因特異性引物，其中等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；(iii)等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑；(iv)基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域；和(ν) 檢測探針。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于檢測給定SNP或基因中的第一等位基因變體，其以小于第二等位基因變體的1/10，1/100，1/1，000，1/10，000，1/100，000， 1/1，000，000，1/10，000，000，1/100，000，000 或 1/1，000，000，000 以及其中任意部分范圍的頻率存在。在其它實施方式中，該方法用于檢測第一等位基因變體，其以小于2，3，4， 5,6,7,8,9,10，15，20，25，50，75，100，250，500，750，1，000，2，500，5，000，7，500，10，000， 25，000，50，000，75，000，100，000，250，000，500，000，750，000，1，000，000 個拷貝 /1，10， 100，1，000 μ 1樣品或反應(yīng)體積或其中任意部分范圍的量存在。在一些實施方式中，第一等位基因變體是突變體。在一些實施方式中，第二等位基因是野生型。在一些實施方式中，本方法可以包括檢測至少1，000至1，000, 000，例如大約 1000至10，000，大約10，000至100，000，或大約100，000至1，000，000個或其中任意部分范圍的野生型分子的背景中的1個突變體分子。在一些實施方式中，方法可以提供至少與基于TaqMan 的測定法相當(dāng)?shù)母哽`敏性和效率。在一些實施方式中，涉及所公開的方法的第一擴增子與第二擴增子的比較提供了 1，000至1，000，000倍的倍數(shù)差異，例如大約1000至10，000倍，大約10，000至100，000 倍，或大約100，000至1，000，000倍倍數(shù)差異或其中任意部分范圍的特異性上的改進。在一些實施方式中，擴增子的大小是大約60-120個核苷酸的長度。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于定量包含備選的第二等位基因變體的樣品中的第一等位基因變體的試劑盒，其包含(a)第一等位基因特異性引物；(b)第二等位基因特異性引物；(c)第一基因座特異性引物；(d)第二基因座特異性引物；(e)第一等位基因特異性封閉探針；(f)第二等位基因特異性封閉探針；和(g)聚合酶。在公開的試劑盒的一些實施方式中，所述試劑盒還包含第一基因座特異性檢測探針和第二基因座特異性檢測探針。在另一方面，本發(fā)明提供了包括兩個或更多個容器的試劑盒，包含獨立分配于所述兩個或更多個容器中的一個中的下列成分(i)第一等位基因特異性引物，其中第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；和 (ii)第一等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑。在一些例示性的實施方式中，試劑盒還可以包括基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域。在其它實施方式中，試劑盒還可以包含檢測探針。在一些實施方式中，組合物、方法和/或試劑盒可用于在診斷中檢測循環(huán)的細胞。 在一個實施方式中，組合物、方法和/或試劑盒可用于檢測血液中的腫瘤細胞以進行早期癌癥診斷。在一些實施方式中，組合物、方法和/或試劑盒可用于癌癥或疾病相關(guān)的遺傳變異或體細胞突變檢測和驗證。在一些實施方式中，組合物、方法和/或試劑盒可用于對四、 三和二 -等位基因的SNP進行基因分型。在一些實施方式中，組合物、方法和/或試劑盒可用于從混合的DNA樣品中進行DNA分型，以進行QC和人類鑒定測定，就細胞污染物進行細胞系QC，等位基因的基因表達分析，病毒分型/稀少病原體檢測，從匯集的樣品中檢測突變，檢測血液中的循環(huán)的腫瘤細胞，和/或出生前診斷。在一些實施方式中，組合物、方法和/或試劑盒與多種儀器例如來自Applied Biosystems (Foster City, CA)的 SDS 儀器相容。等位基因特異性引物設(shè)計為具有低Tm的等位基因特異性引物(ASP)顯示出增強的等位基因變體的區(qū)分。在一些實施方式中，等位基因特異性引物是短的寡聚物，其長度是大約15-30，例如大約16-28，大約17-26，大約18-24，或大約20-22或其中任意范圍的核苷酸。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的Tm是大約50°C至70°C，例如大約52°C至68°C (例如53°C )， 大約至66°C，大約561至641，大約58°C至62 °C，或其中任意范圍。在其它實施方式中，等位基因特異性引物的Tm比擴增過程中使用的PCR循環(huán)條件的退火/延伸溫度高大約 3°C至 6°C。低的等位基因特異性引物濃度也可以改善選擇性。等位基因特異性引物濃度降低至900nM以下能夠增大匹配的與錯配的序列的ACt。在所公開的組合物的一些實施方式中，等位基因特異性引物的濃度是大約20nM至900nM，例如大約50nM至700nM，大約IOOnM 至500nM，大約200nM至300nM，大約400nM至500nM，或其中任意范圍。在一些例示性的實施方式中，等位基因特異性引物的濃度是大約200nM至400nM。在一些實施方式中，等位基因特異性引物可以包含特異于目標(biāo)靶等位基因的等位基因特異性核苷酸部分。等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于基因的一個等位基因，但不互補于該基因的另一個等位基因。換言之，等位基因特異性核苷酸部分結(jié)合基因的一個或多個可變核苷酸位置，所述位置是已知為對于基因的不同等位基因變體而言包括不同核苷酸的核苷酸位置。等位基因特異性核苷酸部分的長度至少是1個核苷酸。在例示性的實施方式中，等位基因特異性核苷酸部分的長度是1個核苷酸。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分位于等位基因特異性引物的 3’末端。在其它實施方式中，等位基因特異性核苷酸部分位于等位基因特異性引物的3’最末端的大約1-2，3-4，5-6，7-8，9-11，12-15或16-20個核苷酸處。被設(shè)計為靶向區(qū)分性堿基的等位基因特異性引物也可以改善等位基因變體的區(qū)分。在一些實施方式中，等位基因特異性核苷酸部分的核苷酸靶向高度區(qū)分性堿基(例如， 用于檢測A/A，A/G，G/A，G/G，A/C或C/A等位基因)。較低區(qū)分性的堿基，例如，可以包括檢測C/C，T/C，G/T，T/G，C/T等位基因。在一些實施方式中，例如，當(dāng)待測等位基因包括A/G 或C/T SNP時，A或G可以用作等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果A/T是靶等位基因)，或者，C或T可以用作等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分(例如，如果C/G是靶等位基因)。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量 A/T SNP時，A可以用作等位基因特異性引物的3’末端的核苷酸特異性部分(例如，等位基因特異性核苷酸部分)。在其它實施方式中，當(dāng)檢測和/或定量C/G SNP時，G可以用作等位基因特異性引物的3’末端的核苷酸特異性部分。在一些實施方式中，等位基因特異性引物可以包含特異于目標(biāo)多核苷酸序列(或基因座)的靶標(biāo)特異性部分。在一些實施方式中，靶標(biāo)特異性部分與目標(biāo)靶多核苷酸序列大約75-85 %，85-95 %，95-99 %或100 %互補。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分可以包含等位基因特異性核苷酸部分。在其它實施方式中中，靶標(biāo)特異性部分位于等位基因特異性核苷酸部分的5’。靶標(biāo)特異性部分的長度可以是大約4-30，大約 5-25，大約6-20，大約7-15，或大約8_10個核苷酸。在一些實施方式中，靶標(biāo)特異性部分的 Tm比用于PCR循環(huán)的退火/延伸溫度低大約5°C。在一些實施方式中，等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分的Tm是大約51°C至60 V，大約52°C至59 °C，大約53 V至58°C，大約討°〇至571，大約551至561，或大約50°C至大約60°C。在所公開的方法和試劑盒的一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分和第二等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分包含相同的序列。在其它實施方式中，第一等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分和第二等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分是相同的序列。在一些實施方式中，等位基因特異性引物包含尾巴。包含尾巴的等位基因特異性引物使引物的總體長度減小，從而降低Tm但不顯著影響測定的靈敏性。在一些例示性的實施方式中，尾巴位于等位基因特異性引物的5’末端。在一些實施方式中，尾巴位于等位基因特異性引物的靶標(biāo)特異性部分和/或等位基因特異性核苷酸部分的5’。在一些實施方式中，尾巴與目標(biāo)靶多核苷酸序列大約65-75 %，大約75-85 %， 大約85-95%，大約95-99%，或大約100%非互補。在一些實施方式中，尾巴的長度可以是大約2-40，例如大約4-30，大約5-25，大約6-20,大約7-15,或大約8-10個核酸。在一些實施方式中，尾巴富含GC。例如，在一些實施方式中，尾巴序列包含大約50% -100%，大約 60 % -100 %，大約 70 % -100 %，大約 80 % -100 %，大約 90 % -100 %，或大約 95 % -100 % G 和/或C核苷酸。等位基因特異性引物的尾巴的構(gòu)型可以是多種不同方式，包括但不限于這樣的構(gòu)型在引物延伸后，尾巴區(qū)域是可獲得的，以雜交至引物延伸產(chǎn)物中的互補性序列(如果存在)。因此，例如，等位基因特異性引物的尾巴可以雜交至由于基因座特異性引物的延伸而產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物中的互補性序列。在所公開的方法和試劑盒的一些實施方式中，第一等位基因特異性引物的尾巴和第二等位基因特異性引物的尾巴包含相同的序列。在其它實施方式中，第一等位基因特異性引物的5’尾巴和第二等位基因特異性引物的5’尾巴是相同的序列。等位基因特異件封閉探針等位基因特異性封閉探針(或ASB)(在本文中有時稱作"封閉探針")可以被設(shè)計為短的寡聚物，其是單鏈，長度是100個或更少的核苷酸，更優(yōu)選50個或更少的核苷酸， 再更優(yōu)選30個或更少的核苷酸，最優(yōu)選20個或更少的核苷酸，下限是大約5個核苷酸。在一些實施方式中，封閉探針的Tm是60°C至70°C，61 °C至69°C，62°C至68°C， 63°C至67°C，64°C至66°C，或大約60°C至大約63°C，或其中的任意范圍。在其它實施方式中，等位基因特異性封閉探針的Tm比擴增過程中使用的PCR循環(huán)條件的退火/延伸溫度高大約3°C至6°C。在一些實施方式中，封閉探針在PCR過程中不被切割。在一些實施方式中，封閉探針在它們的3’末端包含不可延伸的封閉部分。在一些實施方式中，封閉探針在它們的3’ 末端、5’末端和/或其中任意內(nèi)部位置處還可以包含其它部分(包括但不限于另外的不可延伸的封閉部分，猝滅劑部分，熒光部分等)。在一些實施方式中，等位基因的位置位于距離等位基因特異性封閉探針的不可延伸的封閉部分大約5-15，例如大約5-11，大約6-10， 大約7-9，大約7-12，或大約9-11，例如大約6，大約7，大約8，大約9，大約10，或大約11個核苷酸處(當(dāng)與它們的靶序列結(jié)合時)。在一些實施方式中，不可延伸的封閉部分可以是但不限于胺(NH2),生物素，PEG，DPI3或？04。在一些優(yōu)選的實施方式中，封閉部分是小溝結(jié)合劑(MGB)部分(本發(fā)明的寡核苷酸-MGB綴合物在本文中有時被稱作"MGB封閉探針" 或〃 MGB封閉劑〃)。如本文所公開，在等位基因特異性封閉探針中使用MGB部分能夠增加等位基因特異性PCR的特異性。該效應(yīng)的一種可能性是由于它們與單鏈或雙鏈核酸的互補序列的強親和性雜交和強烈結(jié)合，MGB能夠降低連接的寡核苷酸的Tm(見，例如，Kutyavin, I等人， Nucleic Acids Res.，2000，Vol. 28，No. 2 :655-661)。包含 MGB 部分的寡核苷酸具有嚴格的幾何學(xué)要求，因為寡核苷酸與MGB部分之間的接頭必須足夠靈活以允許MGB在DNA雙鏈形成后定位于小溝內(nèi)。因此，相對于常規(guī)DNA封閉探針，MGB封閉探針能夠提供匹配的與錯配的等位基因之間的更大的Tm差異。一般地，MGB部分是結(jié)合于雙鏈DNA的小溝內(nèi)的分子。雖然不能提供所有已知的 MGB化合物的一般性化學(xué)通式(因為此類化合物具有差異巨大的化學(xué)結(jié)構(gòu))，但是一般而言，能夠結(jié)合于DNA的小溝內(nèi)的化合物具有月牙形的三維結(jié)構(gòu)。多數(shù)MGB部分對雙鏈DNA的 B形式的富含A-T (腺苷和胸苷)的區(qū)域具有強烈的優(yōu)選性。然而，顯示出對富含C-G(胞苷和鳥苷)的區(qū)域的優(yōu)選性的MGB化合物在理論上也是可能的。因此，包含衍生自具有針對 C-G區(qū)域的優(yōu)選性的小溝結(jié)合劑分子的基團或部分的寡核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一些MGB能夠以IOl1或更高的結(jié)合常數(shù)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝內(nèi)?？梢酝ㄟ^完善建立的光譜學(xué)方法例如紫外(UV)和核磁共振(NMR)光譜并且也可以通過凝膠電泳來檢測這種類型的結(jié)合。在小溝結(jié)合劑分子結(jié)合之后，UV光譜的偏移和利用“核歐沃豪斯” (NOSEY) 效應(yīng)的NMR光譜法是用于該目的的特別熟知的和有用的技術(shù)。凝膠電泳檢測MGB與雙鏈 DNA或其片段的結(jié)合，因為在發(fā)生此類結(jié)合之后，雙鏈DNA的遷移性會改變。在文獻中已經(jīng)描述了多種適宜的小溝結(jié)合劑。見，例如，Kutyavin等人美國專利號 5,801, 155 ；ffemmer, D. Ε., and Dervan P. B. , Current Opinion in Structural Biology, 7 :355-361 (1997) ；Walker, W. L., Kopka, J. L. and Goodsell, D.S., Biopolymers,44 323-334(1997) ；Zimmer, C. & Wahnert, U.Prog. Biophys. Molec. Bio. 47 :31-112(1986)以及 Reddy, B. S. P.，Dondhi，S. Μ.，and Lown, J. W.，Pharmacol. Therap. ,84 :1-111 (1999)。 在一組實施方式中，MGB選自CC 1065類似物，lexitropsin，偏端霉素，紡錘菌素，貝尼爾， 多卡米星，噴他脒，4，6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2，l-c][l，4]苯二氮口。根據(jù)本公開物的優(yōu)選的MGB是DPI3 (見美國專利號6，727，356，其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。已經(jīng)描述了適合于將MGB通過接頭連接至寡核苷酸或探針的方法，見例如美國專利號 5，512，677 ；5，419，966 ；5，696，251 ；5，585，481 ；5，942，610 ；5，736，626 ；5，801，155 和 6，727，356(其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。例如，可以使用自動化寡核苷酸合成方法從具有可切割接頭的固體支持物合成MGB-寡核苷酸綴合物。在其它實例中，可以基本上根據(jù)Lukhtanov等人Bioconjugate Chern.，7 :564-567(1996)(其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)的程序從MGB修飾的固體支持物制備MGB探針。根據(jù)這些方法，可以將一個或多個MGB部分連接于寡核苷酸的5’末端、3’末端和/或任意內(nèi)部部分。MGB部分在MGB-寡核苷酸綴合物中的位置可以影響此類綴合物的區(qū)分力特性。雙鏈內(nèi)的非配對區(qū)域可能導(dǎo)致錯配堿基附近的小溝的形狀的變化。由于MGB最適合于在完美匹配的DNA雙鏈的小溝內(nèi)，所以導(dǎo)致小溝形狀變化的錯配將降低MGB與含有錯配的區(qū)域的結(jié)合強度。因此，MGB的使此類雜交體穩(wěn)定化的能力將被降低，從而增強MGB-寡核苷酸綴合物的將錯配與完美匹配的雙鏈區(qū)別開的能力。另一方面，如果錯配位于與MGB-寡核苷酸綴合物互補的區(qū)域之外，則預(yù)期相同長度的未綴合的以及MGB-綴合的寡核苷酸的區(qū)分能力大約是相同的。由于，寡核苷酸探針區(qū)分單一堿基對錯配的能力依賴于其長度，所以較短的寡核苷酸在區(qū)分錯配方面更加有效。在本文上下文中使用MGB-寡核苷酸綴合物的第一個優(yōu)點在于以下事實由于MGB綴合物的顯著的穩(wěn)定化效應(yīng)，可以使用相對于現(xiàn)有技術(shù)中所使用的那些短得多的寡核苷酸(即20-mer或更短)，其具有更大的區(qū)分能力。結(jié)果是，等位基因特異性封閉探針的較大的△ Tm能夠改進AS-PCR測定的特異性和選擇性。在5’末端具有MGB的封閉探針相對于僅在3’末端具有封閉部分(例如，MGB, PO4, NH2, PEG或生物素)的其它封閉探針具有另外的優(yōu)點。這至少是因為在5’末端具有 MGB(除了在3’末端具有阻止延伸的封閉部分之外)的封閉探針在PCR擴增過程中將不被切割。因此，在整個PCR過程中，探針濃度可以維持在恒定水平，這可以輔助維持封閉非特異性引發(fā)的有效性，從而增加cast-PCR測定法的特異性和選擇性(圖3)。在一些實施方式中，除了天然存在的堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶之外，等位基因特異性封閉探針可以包含一個或多個修飾的堿基。在一些實施方式中， 修飾的堿基可以增大匹配的與錯配的靶序列之間的Tm差異，和/或降低錯配引發(fā)效率，從而不僅改善測定的特異性，還改善其選擇性(圖4A)。
修飾的堿基被認為是通過添加或刪除一個或多個官能團、雜環(huán)結(jié)構(gòu)中的差異(即將碳取代為雜原子，反之亦可)和/或向堿基連接一個或多個接頭臂結(jié)構(gòu)而與天然存在的堿基相區(qū)別的那些堿基。此類修飾的堿基可以包括，例如，8-氮雜-7-脫氮雜-dA(ppA)， 8-氮雜-7-脫氮雜-dG (ppG)，鎖核酸(LNA)或2 ‘ -0,4' -C-乙烯基核酸(ENA)堿基(圖 4B)。修飾的堿基的其它實例包括但不限于下列一般類別堿基類似物7-脫氮雜嘌呤及其衍生物；吡唑并嘧啶及其衍生物(描述于PCT W090/14353 ；和美國申請?zhí)?9/0 , 630，其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)。這些堿基類似物，當(dāng)存在于寡核苷酸中時，加強雜交并改善錯配的區(qū)分。天然存在的堿基的所有互變異構(gòu)形式，修飾的堿基和堿基類似物都可包含于本發(fā)明的寡核苷酸引物和探針中。類似地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸綴合物的一個或多個核苷酸亞基中可以存在修飾的糖或糖類似物。糖的修飾包括但不限于向糖的2' ,3'和/或4'碳原子連接取代基， 糖的不同差向異構(gòu)體形式，糖苷鍵的α-或β-構(gòu)型中的差異，以及其它異頭變化。糖部分包括但不限于戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、核糖、脫氧核糖、葡萄糖、阿拉伯糖、戊呋喃糖、木糖、來蘇糖和環(huán)戊基。本發(fā)明的寡核苷酸綴合物中也可以存在修飾的核苷酸間鍵合。此類修飾的鍵合包括但不限于肽、磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、烷基磷酸酯、烷烴膦酸酯、硫代磷酸酯 (thiophosphate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、取代的氨基磷酸酯等。堿基、糖和/或核苷酸間鍵合的數(shù)種其它修飾(與它們在用作探針和/或引物的寡核苷酸中的用途相容)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。另外，在一些實施方式中，摻入到本發(fā)明的MGB封閉探針的寡核苷酸中的核苷酸單元可以具有通過連接臂共價結(jié)合于一個或多個堿基的交聯(lián)官能(烷基化試劑)。本發(fā)明的MGB封閉探針的一些實施方式的“糖”或糖苷部分可以包含脫氧核糖、核糖、2-氟核糖、2-0烷基或烯基核糖，其中烷基可以具有1-6個碳原子，烯基可以具有2-6個碳原子。在天然存在的核苷酸和本文描述的修飾和類似物中，脫氧核糖或核糖部分形成呋喃糖環(huán)。糖苷鍵是 構(gòu)型并且嘌呤堿基通過9-位連接于糖部分，嘧啶通過I-位連接，吡唑并嘧啶通過I-位。寡核苷酸的核苷酸單元通過“磷酸酯”骨架相互連接起來，如本領(lǐng)域熟知。除了“天然”磷酸二酯鍵之外，本發(fā)明的寡核苷酸-MGB綴合物(MGB封閉探針)的寡核苷酸可以包括硫代磷酸酯和甲基膦酸酯。在方法和試劑盒的一些實施方式中，第一等位基因特異性封閉探針與第一等位基因特異性引物結(jié)合于相同的鏈或序列，而第二等位基因特異性封閉探針與第一等位基因特異性引物結(jié)合于相對鏈和/或互補序列。檢測探針在一些實施方式中，檢測探針被設(shè)計為短的寡聚物，其為大約15-30個核苷酸，例如大約16，大約18，大約22，大約M，大約30或其中的任意數(shù)值。在一些實施方式中，檢測探針的Tm是大約60°C至70°C，大約61°C至69°C，大約62°C至68°C，大約63°C至67°C，或大約64°C至66 °C，或其中任意數(shù)值。在一些實施方式中，檢測探針是基因座特異性檢測探針(LST)。在其它實施方式中，檢測探針是5’核酸酶探針。在一些例示性的實施方式中，檢測探針可以包含MGB部分， 報告子部分(例如，F(xiàn)AM ，ΤΕΤ , JOE , VIC 或SYBR Green)，猝滅劑部分(例如，BlackHole Quencher 或TAMRA )，和/或被動參照(例如，R0X )。在一些例示性的實施方式中，根據(jù)美國專利號6，727，356(其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)描述的原理和方法設(shè)計檢測探針。在一些例示性的實施方式中，檢測探針是TaqMan 探針(Applied Biosystems, Foster City)。在例示性的實施方式中，可以根據(jù)美國專利號6，727，356 (其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文)描述的原理和方法設(shè)計基因座特異性檢測探針。例如，產(chǎn)生熒光的探針可以這樣制備在單鏈DNA的3’末端具有猝滅劑并且在5’末端具有熒光團。在此類實例中，TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性可以切割DNA鏈，從而將熒光團與猝滅劑分離并釋放熒光信號。在一些實施方式中，檢測探針在PCR擴增的引物延伸步驟中與模板鏈雜交(例如，在60°C -65°C )。在其它實施方式中，MGB共價連接于基因座特異性檢測探針的猝滅劑部分(例如通過接頭)。在所公開的方法和試劑盒的一些實施方式中，第一和第二檢測探針是相同的序列和/或包含相同的序列。基因座特異件引物在一些實施方式中，基因座特異性引物(LSP)被設(shè)計為短的寡聚物，其為大約 15-30個核苷酸，例如大約16，大約18，大約22，大約M，大約30或其中的任意數(shù)值。在一些實施方式中，基因座特異性引物的Tm是大約60°C至70°C，大約61 °C至69°C，大約62°C至 68 0C，大約63°C至67 V，或大約64°C至66 °C，或其中任意數(shù)值。在所公開的方法和試劑盒的一些其它實施方式中，第一基因座特異性檢測探針和 /或第二基因座特異性檢測探針包含相同的序列或者是相同的序列。另外的成分適合于實施本發(fā)明的聚合酶是本領(lǐng)域熟知的，并且可以從多個來源獲得。熱穩(wěn)定性的聚合酶可以獲自例如多種商業(yè)上可獲得的嗜熱細菌(例如，從美國典型微生物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville, Md 獲得)，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法(見，例如，美國專利號6，M5，53 ?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)技術(shù)，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的適合于特定物種的活性培養(yǎng)物生長的培養(yǎng)基和溫育條件使細菌細胞生長(見，例如，Brock, Τ. D.，and Freeze, H.，J. Bacteriol. 98(1) :289-297(1969)； Oshima，Τ·，and Imahori,K, Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1) : 102-112 (1974))。適合用作熱穩(wěn)定性聚合酶來源的有嗜熱細菌粞熱水生菌(Thermus aquaticus)、極端嗜熱菌(Thermus thermophilus)、Thermococcus litoralis、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus woosii 禾口 Pyrococcus屬的其它種、脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜酸熱硫化 Bflif (Sulfolobus acidocaldarius) ^^ !! .^ (Thermoplasma acidophilum) > Thermus flavus>il ^!i|ii (Thermus ruber) >Thermus brockianus、 fP可波羅棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana) > Ifi lif (Thermotoga maritima)禾口 ThermotogEi M 1 胃禾1f1，^X Ik. Methanobacterium thermoautotrophicum,以及這些物種的中的每一個的突變體。優(yōu)選的熱穩(wěn)定性的聚合酶可以包括但不限于Taq DNA聚合酶，Tne DNA聚合酶，Tma DNA聚合酶， 或其突變體、衍生物或片段。核酸的多種來源和/或制備方法所公開的組合物、方法和/或試劑盒中的核酸樣品的來源包括但不限于，人類細胞，例如循環(huán)的血液，口腔上皮細胞，培養(yǎng)的細胞和腫瘤細胞。另外，其它的哺乳動物組織，血液和培養(yǎng)的細胞也是模板核酸的合適的來源。此外，病毒、噬菌體、細菌、真菌和其它微生物可以作為用于分析的核酸的來源。DNA可以是基因組的或者可以克隆于質(zhì)粒、噬菌體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)或其它載體中?？梢詮南嚓P(guān)細胞直接分離RNA， 或者可以在體外從合適的RNA啟動子引發(fā)而制備，或者可以通過體外轉(zhuǎn)錄制備。本發(fā)明可用于檢測基因組DNA中的變異，可以是人類的、動物的或其它。其特別可用于遺傳性或獲得性疾病或病癥的分析。一個具體用途是用于檢測遺傳性疾病。在一些實施方式中，模板序列或核酸樣品可以是gDNA。在其它實施方式中，模板序列或核酸樣品可以是cDNA。在其它實施方式中，如在通過RT-PCR同時分析基因表達的情況下，模板序列或核酸樣品可以是RNA。DNA或RNA模板序列或核酸樣品可以提取自任意類型的組織，包括例如，福爾馬林固定的石蠟包埋的腫瘤樣品。以下實施例旨在解釋而非限制本發(fā)明。
實施例I. 一般測定設(shè)計用于下列實施例的cast-PCR測定的一般方案顯示于圖1。對于所分析的每個SNP， 將等位基因特異性引物設(shè)計為靶向第一等位基因(即等位基因-1)和第二等位基因(即等位基因-2)。用于分析等位基因-1的cast-PCR測定反應(yīng)混合物包括加尾的等位基因-1特異性引物(ASP1)，一個MGB等位基因-2封閉探針(MGB2)，一個共同的基因座特異性TaqMan 探針(LST)和一個共同的基因座特異性引物(LSP)。用于分析等位基因-2的cast-PCR測定反應(yīng)混合物包括加尾的等位基因-2特異性引物(ASP》，一個MGB等位基因-1封閉探針(MGBl)，一個共同的基因座特異性TaqMan探針(LST)和一個共同的基因座特異性引物 (LSP)。II.反應(yīng)條件:每個測定反應(yīng)混合物(共10 μ 1)包含IX TaqMan Genotyping Master Mixture (Applied Biosystems, Foster City, CA ；P/N 437135), 0. 5ng/ μ LDNA
1，000, 000個拷貝的質(zhì)粒DNA(如所標(biāo)示)，300nM(除非另有指明)加尾的或在一些情況下未加尾的等位基因特異性引物(用于檢測等位基因-1的ASP1，或用于檢測等位基因-2的 ASP2), 200nM TaqMan探針(LST)，900nM基因座特異性引物(LSP)，150nM等位基因特異性 MGB封閉探針(用于檢測等位基因-2的MGB1，或用于檢測等位基因-1的MGB2)。將反應(yīng)物在384孔平板中在95°C溫育10分鐘；然后5個循環(huán)的“在95°C溫育15秒”;然后在58°C溫育1分鐘；然后45個循環(huán)的“在95°C溫育15秒”;然后在60°C溫育1分鐘。所有的反應(yīng)按照一式兩份或更多個重復(fù)份在ABI PRISM 7900HT kquence Detection System中根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行。III.核酸樣品設(shè)計并從BlueHeron (Bothel 1，WA)訂購包含特定SNP序列的質(zhì)粒(關(guān)于以下實施例中所用的包含SNP的質(zhì)粒的列表，見表1)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用TaqMan RNase P Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA ；P/N 4316838)定量質(zhì)粒，并用作模板(見表 LRNase P對照)以驗證給定的測定法的靈敏性、線性動態(tài)范圍、特異性和選擇性?；蚪M DNA 購自 Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ ；NA17203, NA17129, NA17201)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用 TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA ；Ρ/Ν 4332856)驗證靴 SNP 的基因型。表1 質(zhì)粒SNP序列(以括號標(biāo)示出了靶等位基因
權(quán)利要求
1.用于檢測懷疑包含至少靶序列的第二等位基因變體的核酸樣品中的靶序列的第一等位基因變體的方法，包括a)通過組合1.核酸樣品； .第一等位基因特異性引物，其中所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；iii.第一等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑；iv.第一基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域；和v.第一檢測探針；形成第一反應(yīng)混合物；b)使用第一基因座特異性引物和第一等位基因特異性引物在第一反應(yīng)混合物中進行擴增反應(yīng)，以形成第一擴增子；和c)通過檢測第一檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化來檢測第一擴增子，從而檢測核酸樣品中的靶基因的第一等位基因變體。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括使用第一檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化來定量第一等位基因變體。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括d)通過組合i)核酸樣品； )第二等位基因特異性引物，其中第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第二等位基因變體；iii)第二等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第一等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于第二等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第二等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑；iv)第二基因座特異性引物，其互補于在第二等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域；和ν)第二檢測探針，形成第二反應(yīng)混合物；e)使用第二等位基因特異性引物和基因座特異性引物在第二反應(yīng)混合物中進行擴增反應(yīng)，以形成第二擴增子；和f)通過測定檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化來檢測第二擴增子，從而檢測核酸樣品中的靶基因的第二等位基因變體。
4.權(quán)利要求3的方法，還包括將第一反應(yīng)混合物中的第一檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化與第二反應(yīng)混合物中的第二檢測探針的可檢測性質(zhì)的變化進行比較。
5.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性引物包含尾巴。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述尾巴富含GC。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述尾巴長度是2-30個核苷酸。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述尾巴在所述第一和/或第二等位基因特異性引物的5’ 末端。
9.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性引物的Tm是 500C -55"C。
10.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性引物的濃度是 20-900nM。
11.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性引物設(shè)計為在 3’末端包含高度區(qū)分性堿基。
12.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性引物的所述等位基因特異性核苷酸部分位于所述第一和/或第二等位基因特異性引物的3’末端。
13.權(quán)利要求12的方法，其中，如果A/T是等位基因變體，則A或G被用作所述第一和 /或第二等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分；或者，如果C/G是等位基因變體，則C或T被用作所述第一和/或第二等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分。
14.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性引物和/或第一和/或第二等位基因特異性封閉探針包含至少一個修飾的堿基。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾的堿基是8-氮雜-7-脫氮雜-dN(ppN)堿基類似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾的堿基是鎖核酸(LNA)堿基。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾的堿基是增大匹配的與錯配的靶序列和/或核苷酸之間的Tm的任意修飾的堿基。
18.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在所述第一和/或第二等位基因特異性封閉探針的3’末端、5’末端和/或內(nèi)部位置處包含MGB 部分。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第一和/或第二等位基因特異性封閉探針在3’末端是不可延伸的。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述MGB部分在所述擴增反應(yīng)過程中不從所述第一和/ 或第二等位基因特異性封閉探針中被切下。
21.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二檢測探針是基因座特異性檢測探針。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述基因座特異性檢測探針是5’核酸酶探針。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品是基因組DNA(gDNA)。
24.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述第一和/或第二反應(yīng)混合物還包含聚合酶，dNTP, 和/或適合于PCR擴增的其它試劑或緩沖劑。
25.權(quán)利要求對的方法，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定性的。
26.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述擴增反應(yīng)是實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品源自腫瘤樣品。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品源自包含循環(huán)的腫瘤細胞的血液樣品。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述腫瘤樣品是乳腺癌或肺癌腫瘤樣品。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述腫瘤包含Ras、EGFR、Kit、pTEN、和/或p53中的突變。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述Ras突變是KRAS或和NRAS突變。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述KRAS突變在如圖6所示的密碼子12和/或密碼子 13中。
33.反應(yīng)混合物，其包含a)核酸分子；b)等位基因特異性引物，其中所述等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；c)等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域，其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于所述等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑；d)基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域；和e)檢測探針。
34.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性引物包含尾巴。
35.權(quán)利要求34的反應(yīng)混合物，其中所述尾巴富含GC。
36.權(quán)利要求34的反應(yīng)混合物，其中所述尾巴長度是2-30個核苷酸。
37.權(quán)利要求34的反應(yīng)混合物，其中所述尾巴在所述等位基因特異性引物的5’末端。
38.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性引物的Tm是50°C_55°C。
39.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性引物的濃度是20-900nM。
40.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性引物設(shè)計為在3’末端包含高度區(qū)分性堿基。
41.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性引物的所述等位基因特異性核苷酸部分位于所述等位基因特異性引物的3’末端。
42.權(quán)利要求41的反應(yīng)混合物，其中，如果A/T是等位基因變體，則A或G被用作所述等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分；或者，如果C/G是等位基因變體，則 C或T被用作所述等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分。
43.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性引物和/或第一和/或等位基因特異性封閉探針包含至少一個修飾的堿基。
44.權(quán)利要求43的反應(yīng)混合物，其中所述修飾的堿基是8-氮雜-7-脫氮雜-dN(ppN) 堿基類似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。
45.權(quán)利要求43的反應(yīng)混合物，其中所述修飾的堿基是鎖核酸(LNA)堿基。
46.權(quán)利要求43的反應(yīng)混合物，其中所述修飾的堿基是增大匹配的與錯配的靶序列和 /或核苷酸之間的Tm的任意修飾的堿基。
47.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性封閉探針在所述等位基因特異性封閉探針的3’末端、5’末端和/或內(nèi)部位置處包含MGB部分。
48.權(quán)利要求47的反應(yīng)混合物，其中所述等位基因特異性封閉探針在3’末端是不可延伸的。
49.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述檢測探針是基因座特異性檢測探針。
50.權(quán)利要求49的反應(yīng)混合物，其中所述基因座特異性檢測探針包含標(biāo)記物。
51.權(quán)利要求49的反應(yīng)混合物，其中所述基因座特異性檢測探針是5’核酸酶探針。
52.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述核酸分子是基因組DNA(gDNA)。
53.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物包含聚合酶，dNTP，和/或其它試劑或緩沖劑。
54.權(quán)利要求53的反應(yīng)混合物，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定性的。
55.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物用于實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
56.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述核酸分子源自腫瘤樣品。
57.權(quán)利要求33的反應(yīng)混合物，其中所述核酸分子源自包含循環(huán)的腫瘤細胞的血液樣
58.權(quán)利要求56的反應(yīng)混合物，其中所述腫瘤樣品是乳腺癌或肺癌腫瘤樣品。
59.權(quán)利要求56的反應(yīng)混合物，其中所述腫瘤包含Ras、EGFR、Kit、pTEN、和/或p53中的突變。
60.權(quán)利要求59的反應(yīng)混合物，其中所述Ras突變是KRAS或和NRAS突變。
61.權(quán)利要求60的反應(yīng)混合物，其中所述KRAS突變在如圖6所示的密碼子12和/或密碼子13中。
62.組合物，其包含a)第一等位基因特異性引物，其中所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；b)第一等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域， 其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑。
63.權(quán)利要求62的組合物，還包含基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域。
64.權(quán)利要求62的組合物，還包含檢測探針。
65.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性引物包含尾巴。
66.權(quán)利要求65的組合物，其中所述尾巴富含GC。
67.權(quán)利要求65的組合物，其中所述尾巴長度是2-30個核苷酸。
68.權(quán)利要求65的組合物，其中所述尾巴在所述等位基因特異性引物的5’末端。
69.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性引物的Tm是50°C-55°C。
70.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性引物的濃度是20-900nM。
71.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性引物設(shè)計為在3’末端包含高度區(qū)分性堿基。
72.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性引物的所述等位基因特異性核苷酸部分位于所述等位基因特異性引物的3’末端。
73.權(quán)利要求72的組合物，其中，如果A/T是等位基因變體，則A或G被用作所述等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分；或者，如果C/G是等位基因變體，則C或T被用作所述等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分。
74.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性引物和/或第一和/或等位基因特異性封閉探針包含至少一個修飾的堿基。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中所述修飾的堿基是8-氮雜-7-脫氮雜-dN(ppN)堿基類似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。
76.權(quán)利要求74的組合物，其中所述修飾的堿基是鎖核酸(LNA)堿基。
77.權(quán)利要求74的組合物，其中所述修飾的堿基是增大匹配的與錯配的靶序列和/或核苷酸之間的Tm的任意修飾的堿基。
78.權(quán)利要求62的組合物，其中所述等位基因特異性封閉探針在所述等位基因特異性封閉探針的3’末端、5’末端和/或內(nèi)部位置處包含MGB部分。
79.權(quán)利要求78的組合物，其中所述等位基因特異性封閉探針在3’末端是不可延伸的。
80.權(quán)利要求64的組合物，其中所述檢測探針是基因座特異性檢測探針。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中所述基因座特異性檢測探針包含標(biāo)記物。
82.權(quán)利要求64的組合物，其中所述基因座特異性檢測探針是5’核酸酶探針。
83.權(quán)利要求62組合物，其中所述組合物還包含核酸分子、聚合酶、dNTP和/或其它試劑或緩沖劑。
84.權(quán)利要求83的組合物，其中所述核酸分子是基因組DNA(gDNA)。
85.權(quán)利要求84的組合物，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定性的。
86.權(quán)利要求83的組合物，其中所述核酸分子源自腫瘤樣品。
87.權(quán)利要求83的組合物，其中所述核酸分子源自包含循環(huán)的腫瘤細胞的血液樣品。
88.權(quán)利要求86的組合物，其中所述腫瘤樣品是乳腺癌或肺癌腫瘤樣品。
89.權(quán)利要求86的組合物，其中所述腫瘤包含Ras、EGFR、Kit、pTEN、和/或p53中的突變。
90.權(quán)利要求89的組合物，其中所述Ras突變是KRAS或和NRAS突變。
91.權(quán)利要求90的組合物，其中所述KRAS突變在如圖6所示的密碼子12和/或密碼子13中。
92.包括兩個或更多個容器的試劑盒，所述容器包含獨立分配于兩個或更多個容器中的一個中的下列成分a)第一等位基因特異性引物，其中所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補于靶序列的第一等位基因變體；和b)第一等位基因特異性封閉探針，其互補于包含第二等位基因變體的靶序列的區(qū)域， 其中所述區(qū)域包含對應(yīng)于所述第一等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分的結(jié)合位置的位置，并且其中所述第一等位基因特異性封閉探針包含小溝結(jié)合劑。
93.權(quán)利要求92的試劑盒，還包含基因座特異性引物，其互補于在第一等位基因變體的3’并且在相對鏈上的靶序列的區(qū)域。
94.權(quán)利要求92的試劑盒，還包含檢測探針。
95.權(quán)利要求92的試劑盒，其中第一等位基因特異性封閉探針不包含標(biāo)記物。
96.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述等位基因特異性引物包含尾巴。
97.權(quán)利要求96的試劑盒，其中所述尾巴富含GC。
98.權(quán)利要求96的試劑盒，其中所述尾巴長度是2-30個核苷酸。
99.權(quán)利要求96的試劑盒，其中所述尾巴在所述等位基因特異性引物的5’末端。
100.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述等位基因特異性引物的Tm是50°C-55°C。
101.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述等位基因特異性引物的濃度是20-900nM。
102.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述等位基因特異性引物設(shè)計為在3’末端包含高度區(qū)分性堿基。
103.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述等位基因特異性引物的所述等位基因特異性核苷酸部分位于所述等位基因特異性引物的3’末端。
104.權(quán)利要求103的試劑盒，其中，如果A/T是等位基因變體，則A或G被用作所述等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分；或者，如果C/G是等位基因變體，則C 或T被用作所述等位基因特異性引物的3’等位基因特異性核苷酸部分。
105.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述第一等位基因特異性引物和/或第一等位基因特異性封閉探針包含至少一個修飾的堿基。
106.權(quán)利要求105的試劑盒，其中所述修飾的堿基是8-氮雜-7-脫氮雜-dN(ppN)堿基類似物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。
107.權(quán)利要求105的試劑盒，其中所述修飾的堿基是鎖核酸(LNA)堿基。
108.權(quán)利要求105的試劑盒，其中所述修飾的堿基是增大匹配的與錯配的靶序列和/ 或核苷酸之間的Tm的任意修飾的堿基。
109.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述等位基因特異性封閉探針在所述等位基因特異性封閉探針的3’末端、5’末端和/或內(nèi)部位置處包含MGB部分。
110.權(quán)利要求109的試劑盒，其中所述等位基因特異性封閉探針在3’末端是不可延伸的。
111.權(quán)利要求94的試劑盒，其中所述檢測探針是基因座特異性檢測探針。
112.權(quán)利要求111的試劑盒，其中所述基因座特異性檢測探針包含標(biāo)記物。
113.權(quán)利要求111的試劑盒，其中所述基因座特異性檢測探針是5’核酸酶探針。
114.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述試劑盒還包含聚合酶、dNTP和/或其它試劑或緩沖劑。
115.權(quán)利要求114的試劑盒，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定性的。
116.權(quán)利要求92-94的一項的試劑盒，其中所述試劑盒用于檢測Ras、EGFR、Kit、pTEN、 和/或p53中的突變。
117.權(quán)利要求117的試劑盒，其中所述Ras突變是KRAS或和NRAS突變。
118.權(quán)利要求118的試劑盒，其中所述KRAS突變在如圖6所示的密碼子12和/或密碼子13中。
119.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述方法具有至少1 1000，1 10，000， 1 100，000或1 1,000,000的檢測選擇性。
全文摘要
在一些實施方式中，本發(fā)明大體上涉及用于區(qū)分不同等位基因之間的序列差異的組合物、方法和試劑盒。更具體地，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了用于以高特異性和選擇性定量包含豐富的(例如野生型)等位基因變體的樣品中的稀少的(例如突變的)等位基因變體，例如SNP或核苷酸(NT)插入或刪除的組合物、方法和試劑盒。特別地，在一些實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測突變的高度選擇性的方法，其被稱作競爭性等位基因特異性TaqMan PCR(″cast-PCR″)。
文檔編號C12N15/11GK102301005SQ200980155775
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者C·陳, R·譚 申請人:生命技術(shù)公司