專利名稱：一種mica基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)試劑盒，特別涉及一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
MHC-I 類鏈相關(guān)基因(MHC class I chain-related gene，MIC)，位于人 6 號(hào)染色體主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)基因區(qū)域中，長度為2Mb，所編碼蛋白質(zhì)分子是NK細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化性受體 NKG2D所識(shí)別的重要配體。目前已發(fā)現(xiàn)有7個(gè)MIC基因位點(diǎn)，僅MICA、MICB為功能基因，分別位于著絲粒461Λ和1401Λ位置處，靠近HLA-B位點(diǎn)三者高度連鎖不平衡。MICA基因具有廣泛的多態(tài)性，存在多個(gè)基因型。根據(jù)編碼MICB分子胞外區(qū)的外顯子2 5基因序列的差異，發(fā)現(xiàn)了 70多個(gè)MICB等位基因。MICA基因編碼蛋白MICA分子作為NKG2D配體參與多種感染免疫的過程，大量研究表明MICA基因多態(tài)性與多種疾病的易感相關(guān)，同時(shí)也是導(dǎo)致移植排斥的重要因素。另一方面HLA分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如HLA多態(tài)性的研究、HLA的生物學(xué)功能、器官和骨髓移植前供受者組織相容性配型、HLA與某些疾病的關(guān)聯(lián)、親子鑒定以及人類遺傳學(xué)等方面。HLA分型技術(shù)主要由血清學(xué)分型技術(shù)、細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)、基因分型技術(shù)等。個(gè)體的HLA遺傳學(xué)差異的本質(zhì)在于編碼其抗原產(chǎn)物的基因上，所以分析個(gè)體HLA的基因型無疑是對(duì)HLA型別分析的最準(zhǔn)確的方法，其準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于血清學(xué)與細(xì)胞血分型。目前以DNA為基礎(chǔ)的HLA基因分型技術(shù)日趨成熟，并逐漸取代血清學(xué)方法和細(xì)胞血分型技術(shù)。 基因分型方法具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)需要的血樣少，標(biāo)本可長期保存，相應(yīng)的分型試劑可大量制備，來源不受限制。特別重要的是基因分型精確可靠，重復(fù)性好，其分型錯(cuò)誤率遠(yuǎn)低于血清學(xué)方法，基因分型技術(shù)已在實(shí)際工作中得到了廣泛的應(yīng)用。目前國際上標(biāo)準(zhǔn)的HLA分型技術(shù)有PCR-SSP(序列特異引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))， PCR-SSO (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)寡核苷酸探針雜交)和PCR-SBT (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序分型)。其中PCR-SSP技術(shù)敏感性高、特異性強(qiáng)且操作簡便，常用于對(duì)HLA進(jìn)行初步分型，應(yīng)用十分廣泛。PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) ik 禾爾 PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性標(biāo)記的探針與PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段產(chǎn)物雜交，根據(jù)陽性斑點(diǎn)判斷個(gè)體基因型。由于MICB等位基因非常多，就需要很多的探針對(duì)每個(gè)DNA樣品進(jìn)行多次雜交(甚至十幾次)才能完成定型分析操作也十分繁瑣，于是在此基礎(chǔ)上又發(fā)展起來一種反向雜交法(reverse hybridization) 0將各種不同的探針固定于同一張膜上，再將PCR產(chǎn)物標(biāo)記，以PCR產(chǎn)物(待檢測(cè)基因DNA)反過來與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個(gè)等位基因的分析。此方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，但不同探針的雜交條件必須嚴(yán)格統(tǒng)一(如溫度、離子濃度)，容易出現(xiàn)誤差；不能檢測(cè)新的等位基因，試劑盒需不斷升級(jí)；對(duì)某些雜合子分辨率也不好。很多基因型含有相同的多態(tài)
3性，而僅僅由于排列方式的不同，因此分辨率不及SSP和SBT。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書面原始記錄長期保存(三種效果比較)。PCR-SBT 以PCR擴(kuò)增所要分析的基因片段，然后對(duì)DNA序列進(jìn)行分析，可直接得到基因型。分辨率高，可大規(guī)模進(jìn)行，精確度高，能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因。因此，應(yīng)用SBT技術(shù)進(jìn)行高分辨率基因分型是目前國際上公認(rèn)的基因分型金標(biāo)準(zhǔn)。但此方法成本高昂，不適合大規(guī)模普及，一般用于在移植前進(jìn)一步對(duì)供體與受體進(jìn)行精確分型。PCR-SSP =PCR-SSP方法用預(yù)先設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物(sequence specific primer, SSP)，借助PCR技術(shù)獲得MICB型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過電泳直接分析帶型決定MICB型別，從而大大簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。優(yōu)點(diǎn)是簡單易行，分辨率可從低到高，成本低。在實(shí)際工作中得到了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前MICA基因的分型尚無廣泛普及，且無相關(guān)的商品試劑。
實(shí)用新型內(nèi)容為了解決現(xiàn)有MICA基因的分型尚無相關(guān)的商品試劑的技術(shù)問題，本實(shí)用新型提供一種采用PCR-SSP技術(shù)對(duì)MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案是，一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，包括包裝盒體、襯墊、裝有PCR反應(yīng)液的試管、裝有陽性對(duì)照DNA樣品的陽性對(duì)照管和裝有陰性對(duì)照DNA樣品的陰性對(duì)照管，所述的襯墊設(shè)置于包裝盒內(nèi)，襯墊上設(shè)有容器孔，所述的試管、陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管放置于容器孔內(nèi)。所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，還包括包被有檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)引物的孔板，所述的孔板設(shè)置于包裝盒體內(nèi)的底部并處于襯墊下。所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，所述的孔板的孔壁上設(shè)有濃度為O.Olnmol/μ 1的上游引物、下游引物、內(nèi)對(duì)照上游引物和內(nèi)對(duì)照下游引物各1 μ 1。所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，所述的上游引物、下游引物、內(nèi)對(duì)照上游引物和內(nèi)對(duì)照下游引物通過凍干技術(shù)凍干于孔壁上。所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，所述的孔板上設(shè)有膠布封口膜。所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，所述的孔板為96孔板。本實(shí)用新型的技術(shù)效果在于，本實(shí)用新型運(yùn)用PCR-SSP技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)MICA基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)分型的目的，本實(shí)用新型試劑盒將引物包被在96孔板上，并檢測(cè)相關(guān)試劑整合在一起，使用更方便且成本更低，對(duì)MICA基因的結(jié)果分析也更便捷，用于對(duì)MICA基因的初步分型研究。
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說明。
圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實(shí)用新型的孔板結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為MICA分型格局表，■示陽性，？示可疑；1 67為67個(gè)引物對(duì)序列號(hào)；其中1為包裝盒體，2為襯墊，3為試管，4為孔板，5為陽性對(duì)照管，6為陰性對(duì)照管，7為上游引物，8為下游引物，9為內(nèi)對(duì)照上游引物，10為內(nèi)對(duì)照下游引物，11為膠布封口膜。
具體實(shí)施方式
參見圖1、圖2，本實(shí)用新型包括包裝盒體1、襯墊2、裝有PCR反應(yīng)液的試管3、裝有陽性對(duì)照DNA樣品的陽性對(duì)照管5、裝有陰性對(duì)照DNA樣品的陰性對(duì)照管6和孔板4，襯墊2設(shè)置于包裝盒內(nèi)，襯墊2上設(shè)有容器孔，試管3、陽性對(duì)照管5和陰性對(duì)照管6放置于容器孔內(nèi)。包被有檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)引物的孔板4設(shè)置于包裝盒體1內(nèi)的底部并處于襯墊2下。 孔板4的孔壁上設(shè)有濃度為0. Olnmol/μ 1的上游引物7、下游引物8、內(nèi)對(duì)照上游引物9和內(nèi)對(duì)照下游引物10。上游引物7、下游引物8、內(nèi)對(duì)照上游引物9和內(nèi)對(duì)照下游引物10通過凍干技術(shù)凍干于孔壁上。孔板4上設(shè)有膠布封口膜11?？装?為96孔板。參見表1、表2，內(nèi)對(duì)照引物濃度0. Olnmol/μ 1其中上游引物序列為 5，-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3，，下游引物序列為 5，-GAGAAAGGCCTGGAG GATTC-3，，擴(kuò)增片段大小為834bp。表1 :MICA與MICB各孔引物組合表
權(quán)利要求1.一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體(1)、襯墊O)、 裝有PCR反應(yīng)液的試管(3)、裝有陽性對(duì)照DNA樣品的陽性對(duì)照管(5)和裝有陰性對(duì)照DNA 樣品的陰性對(duì)照管(6)，所述的襯墊( 設(shè)置于包裝盒內(nèi)，襯墊( 上設(shè)有容器孔，所述的試管(3)、陽性對(duì)照管(5)和陰性對(duì)照管(6)放置于容器孔內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括包被有檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)引物的孔板，所述的孔板(4)設(shè)置于包裝盒體(1)內(nèi)的底部并處于襯墊⑵下。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的孔板⑷的孔壁上設(shè)有濃度為0. Olnmol/μ 1的上游引物(7)、下游引物(8)、內(nèi)對(duì)照上游引物(9)和內(nèi)對(duì)照下游引物(10)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的上游引物(7)、下游引物(8)、內(nèi)對(duì)照上游引物(9)和內(nèi)對(duì)照下游引物(10)通過凍干技術(shù)凍干于孔壁上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的孔板(4)上設(shè)有膠布封口膜(11)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的孔板⑷為96孔板。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種MICA基因位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)試劑盒，包括包裝盒體、襯墊、裝有PCR反應(yīng)液的試管、裝有陽性對(duì)照DNA樣品的陽性對(duì)照管、裝有陰性對(duì)照DNA樣品的陰性對(duì)照管和孔板，襯墊設(shè)置于包裝盒內(nèi)，襯墊上設(shè)有容器孔，試管、陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管放置于容器孔內(nèi)。包被有檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)引物的孔板設(shè)置于包裝盒體內(nèi)的底部并處于襯墊下。本實(shí)用新型的技術(shù)效果在于，本實(shí)用新型運(yùn)用PCR-SSP技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)MICA基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)分型的目的，本實(shí)用新型試劑盒將引物包被在96孔板上，并檢測(cè)相關(guān)試劑整合在一起，使用更方便且成本更低，對(duì)MICA基因的結(jié)果分析也更便捷，用于對(duì)MICA基因的初步分型研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202279827SQ2011202888
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者余平, 杜昆, 林琳, 羅奇志, 霍治, 龔拯 申請(qǐng)人:中南大學(xué)