專利名稱：利用粘細(xì)菌生產(chǎn)omega-3脂肪酸的制作方法
利用粘細(xì)菌生產(chǎn)omega-3脂肪酸本發(fā)明提供用于生產(chǎn)omega-3多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法，該方法通過培養(yǎng)適合于該方法的特定的粘細(xì)菌菌株來生產(chǎn)omega-3多不飽和脂肪酸。另外，本發(fā)明提供用于鑒定這種生產(chǎn)omega-3的粘細(xì)菌的方法，該方法通過結(jié)合使用基于16S rDNA序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)生分析和基于氣相色譜與質(zhì)譜連用的物理化學(xué)數(shù)據(jù)以發(fā)現(xiàn)omega-3多不飽和脂肪酸其它的生產(chǎn)菌。
背景技術(shù)：
長鏈不飽和脂肪酸(PUFA)，包括那些omega-3家族[也被稱為 ω-3(〃 omega-3")脂肪酸]的脂肪酸是在性質(zhì)上令人關(guān)注的脂肪酸。它們是在降低膜的剛性中發(fā)揮作用的磷脂的重要組分。二十碳五烯酸(EPA)是人腦磷脂的主要組分并且是前列腺素和脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑(resolvins)的前體。另一個(gè)重要的omega-3家族的PUFA是二十二碳六烯酸(DHA)。嬰兒發(fā)育過程中的認(rèn)知改善和行動(dòng)功能可能與高水平的該化合物有關(guān)。就0mega-3PUFA(尤其是DHA和EPA)而言，其對(duì)于健康有益的效果有例如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病的預(yù)防、免疫功能的改善、眼部和大腦的健康[近期的研究總結(jié)
Teale MC(ed. ) (2006)0MEGA-3fatty acid research. Nova Science Publishers. New York,以及其中的參考文獻(xiàn)]。由于這些有益性質(zhì)，omega-3PUFA被廣泛地用作健康添加劑和飲食添加劑中的營養(yǎng)脂質(zhì)，以及用作多種食品中的功能成分。近年來，0mega-3PUFA 占據(jù)食品和飲料工業(yè)領(lǐng)域中的最大和增長最強(qiáng)勁的市場(chǎng)部門，并且在過去的數(shù)年中對(duì)其的需求充分增加。近年來，魚油是最豐富以及被廣泛使用的天然omega-3脂肪酸資源，但這種資源遭受到過渡捕撈、缺乏含充足DHA/EPA含量的高品質(zhì)油的供給、以及質(zhì)量問題(味道、成分挑戰(zhàn)等)的考驗(yàn)。已經(jīng)建立或正在開發(fā)涉及以藻類和卵菌(oomycetes)作為生產(chǎn)生物的備選方法[分別參考 Hinzpeter I 等人 Q006) Grasas y Aceites 57 :336_342，以及 Ward OP, Singh A (2005). ProcessBiochemistry 40 :3627-3652 的綜述]。由于對(duì)高品質(zhì)魚油供給的限制逐年遞增，人們已經(jīng)嘗試尋找備選的、可持續(xù)的生物資源。在過去的20多年中， 已經(jīng)開發(fā)出多種類型的海藻，并且一些基于藻類生物質(zhì)的產(chǎn)品已同時(shí)進(jìn)入了市場(chǎng)。也出現(xiàn)過有關(guān)一些屬于原生藻菌界(stramenopiles)(—種類藻類真核生物，以前也稱為"黃藻 (Chromophyta)“)的卵菌生產(chǎn)上述化合物(例如，Achyla屬和腐霉屬(Pythium) ； [Aki T 等人(1998) J Ferm Bioengin 86 :504-507 ；Cheng MH等人(1999) Bioresour Technol 67 101-110 ；Athalye SK 等人 Q009) JAgric FoodChem 57:2739-2744])的報(bào)道。在其它的原生藻菌(例如，裂殖壺菌屬Gchizochytrium)和破囊壺菌屬(Thraustochytrium)；如 US 7022512 和 W02007/068997 所述)以及在甲藻前溝藻(dinoflagellate Amphidinium) (US2006/0099694)中，DHA可能會(huì)占據(jù)細(xì)胞脂肪酸含量的最多48%，這是目前已知的在真核生物中的最高含量。但是，即使在數(shù)年的發(fā)展之后，以工業(yè)水平來培養(yǎng)這些生物仍然面臨挑戰(zhàn)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的omega-3PUFA的其它備選生物來源是原核真細(xì)菌[Nichols D 等人(1999)，Curr Opin Biotechnol 10 :240-246 ；Metz JG 等人 0001)，Science 293 290-293 ；Gentile G 等人 Q003)J Appl Microbiol 95:1124-1133]。但是，對(duì)這些生物用于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)PUFA的商業(yè)開發(fā)遇到了阻礙，這是由于這些嗜冷微生物緩慢生長的特性，以及它們固有的低收率和低生產(chǎn)性。在粘細(xì)菌中，首先在海洋菌屬(marine genera)Plesiocystis和Enhygromyxa中發(fā)現(xiàn)了具有20個(gè)碳原子和4個(gè)雙鍵的未辨別的 PUFA[Iizuka T 等人 U003nntJ Syst Evol Microbiol 53 :189-195 ；Iizuka Τ.等人0003)，Syst Appl Microbiol26 =189-196] 近年來，在作為新粘細(xì)菌家族代表的 Phaselicystis flava 中發(fā)現(xiàn)了 ARA(omega_6PUFA) [Garcia RO 等人 Q009)，Int J Syst Evol Microbiol50(PT12) :1524-1530]。還完全沒有關(guān)于在粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)omega-3PUFA例如DHA和EPA的報(bào)道，以及到目前為止，已報(bào)道的方法的產(chǎn)率、PUFA量以及特別是有關(guān)重要的omega-3PUFA的產(chǎn)率和量仍然不能充分滿足要求。粘細(xì)菌的分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)牛學(xué)粘細(xì)菌被認(rèn)為是粘球菌目(Myxococcales)(在變形菌門的δ亞綱中)的生物的單系群。目前，已經(jīng)識(shí)別了粘細(xì)菌中的三個(gè)亞目(孢囊桿菌亞目(Cystobacterineae)、侏囊菌亞目(Nannocystineae)、以及堆囊菌亞目(Sorangiineae)) [Reichenbach H (2005) Order VIII. Myxococcales Tchan, Pochon and Prevot 1948,398AL. In Brenner DJ 等(eds.) Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology,2nd edn,vol. 2,part C,pp. 1059-1072, New York :Springer]。這些亞目被分為六個(gè)科，即孢囊桿菌科(Cystobacteraceae)、 粘球菌禾斗(Myxococcaceae)、侏囊菌禾斗(Nannocystaceae)、KofIeriaceae> 多囊菌禾斗 (Polyangiaceae) IMM PhBselicystidBceBe0粘球菌科由粘球菌屬(Myxococcus)、珊瑚球菌屬(Corallococcus)以及 Pyxidicoccus構(gòu)成。已知與其相關(guān)的孢囊桿菌科有五個(gè)屬(孢囊桿菌屬(CystcAacter)、 原囊菌屬(Archangium)、Hyalangium、蜂窩囊菌屬(Melittangium)禾口標(biāo)記菌屬 (Stigmatella))。侏囊菌亞目的侏囊菌科由侏囊菌屬(Narmocystis)和海洋菌屬 (Enhygromyxa禾口Plesiocystis)構(gòu)成。與其相關(guān)的Kofleriaceae 由陸生菌屬(terrestrial genus)Kofleria和海洋菌屬Heliangium構(gòu)成。多囊菌科包括Jahnella、軟骨霉?fàn)罹鷮?(Chondromyces)、多囊菌屬(Polyangium)、Byssovorax、以及堆囊菌屬(Sorangium)0 至Ij 目前為止，在整個(gè)目中后兩者是唯一已知的纖維素降解菌屬；其它分類單元中的大部分菌均難以分離和培養(yǎng)。近期發(fā)現(xiàn)的Wiaselicystis是近來確立的Wiaselicystidaceae科中的唯——個(gè)菌屬[GarciaRO 等人(2009) Int J Syst Evol Microbiol 59 :1524-1530]。目前， 有20個(gè)菌屬可識(shí)別并且已被正確地記錄在粘細(xì)菌中以覆蓋所有已知的土壤和海洋分離菌株。16S rDNA在細(xì)菌分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)中的通常重要性16S rDNA已經(jīng)被廣泛和普遍地用于細(xì)菌的系統(tǒng)學(xué)中，以指定分類單元的遺傳分組，這是因?yàn)樵摶蛟诟骶N之間高度保守[Weisburg WG等人(1991) J Bacteriol 173 697-703]。在粘細(xì)菌中，16S rDNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征為遺傳分類提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[Spr0erC 等人(1999)，Int J SystBacteriol 49 (PT 3) :1255-1262] 發(fā)現(xiàn)那些由形態(tài)學(xué)分類為相同屬的粘細(xì)菌菌株在它們的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上也緊密地聚集。該方法還提供了其種屬成員之間遺傳的親緣關(guān)系的圖譜，該遺傳的情緣關(guān)系會(huì)以表性特征的程度體現(xiàn)[Vellicer GJ，Hillesland K(2008) In Myxobacteria =MultiCellularity andDifferentiation (ffhitworth DE, ed.), pp. 17-40, Washington, DC :ASM Press]。脂肪酸It式(fattv acid profile)作為細(xì)菌化學(xué)分類學(xué)指標(biāo)的重要十牛系統(tǒng)發(fā)生學(xué)與粘細(xì)菌的形態(tài)和生理特征相關(guān)。最為重要的是，由細(xì)胞的脂肪酸含量的GC-MS分析推出的脂肪酸模式被通常用于并被認(rèn)為是可以接受的粘細(xì)菌、以及其它多種細(xì)菌生物種類的分類學(xué)分離，這是因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)脂肪酸模式是一個(gè)恒定的特征，至少在應(yīng)用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的方法學(xué)時(shí)，其是恒定的特征。這項(xiàng)技術(shù)的首次應(yīng)用早在1989年之前 [Tornabenet G (1985) Methods in Microbiology 18，209-234]。因此，這禾中基于 GC-MS (或 GC-)的脂肪酸模式已經(jīng)被廣泛地用于細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分類學(xué)中。然而，還從未進(jìn)行過將對(duì)特別經(jīng)濟(jì)重要的脂肪酸的搜索與研究以評(píng)價(jià)各自的脂肪酸生產(chǎn)者的分類和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)位置的其它手段相結(jié)合的系統(tǒng)研究。PCR細(xì)去·Φ縣會(huì)充Φ_胃難棚娜她匕物雜_細(xì)牛對(duì)于現(xiàn)存的細(xì)菌菌種的整體多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于已知的、被很好表征的、可培養(yǎng)菌種的數(shù)量的討論已經(jīng)進(jìn)行了很久(并同時(shí)利用針對(duì)環(huán)境樣品中的真細(xì)菌進(jìn)行原位鑒定的分子生物學(xué)方法得以證實(shí))[Amann Rl 等人(1995) Microbiol Rev 59 :143-169 ；Torsvik V等人(1990)Appl Environ Microbiol56 :782-787]。根據(jù)目前的評(píng)估，多大90%的現(xiàn)存的細(xì)菌仍然未被發(fā)現(xiàn)。利用例如對(duì)來自土壤和其它環(huán)境樣品的16S rDNA進(jìn)行直接測(cè)序的方法日益顯示大量DNA序列無法和任何已知的、可培養(yǎng)的細(xì)菌菌種相關(guān)聯(lián)。但是，它們系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上的親緣性可以通過它們的16S rDNA與那些相關(guān)菌株的同源比對(duì)來顯示。目前還處于發(fā)展中的宏基因組技術(shù)(metagenomic technique)，將來可能會(huì)最終促進(jìn)直接利用這些 “未能培養(yǎng)(unculturable)”生物的基因和酶。目前，在大多數(shù)情況下，仍然需要針對(duì)迄今尚未開發(fā)的細(xì)菌生物尋找合適的培養(yǎng)條件并且在它們的純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行開發(fā)。 作為對(duì)所有未開發(fā)的細(xì)菌的定性研究，以及針對(duì)它們的生物技術(shù)開發(fā)的前提，特別需要建立分離技術(shù)。分離技術(shù)對(duì)于特別是涉及發(fā)現(xiàn)新粘細(xì)菌分類單元，以及對(duì)于發(fā)現(xiàn)在生物技術(shù)方面具有巨大潛力的真細(xì)菌的多種其它種類和其它微生物種類也是非常重要的。利用特異的16S rDNA引物通過PCR可以特定地搜索粘細(xì)菌群。之前針對(duì)土壤生態(tài)位(soil niche)的研究顯示利用該方法可以檢測(cè)出至少30種另外未知的粘細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)類別。不但可以將它們彼此區(qū)分，而且它們的16S rDNA基因也與那些在GenBank和其它公眾領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫中已有的粘細(xì)菌的16S rDNA基因序列不同。這些結(jié)果說明存在需要對(duì)它們進(jìn)行培養(yǎng)和開發(fā)的大量未被發(fā)現(xiàn)的多種土壤粘細(xì)菌[Zhi-Hong W.等人O005)Env. Microbiol7(10) :1602-1610]。特別強(qiáng)化粘細(xì)菌的微牛物發(fā)酵通常在浸沒需氧條件(submerged aerobic condition)下的含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵粘細(xì)菌菌株。在學(xué)術(shù)領(lǐng)域，已經(jīng)廣泛了解能夠在中試和工廠規(guī)模大規(guī)模發(fā)酵這類生物的多個(gè)實(shí)例，例如涉及近年來被批準(zhǔn)作為抗癌藥物的埃坡霉素(印othilones)的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。在對(duì)它們的生長和營養(yǎng)條件進(jìn)行徹底的評(píng)估之后，這類生物通常可以在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下良好生長，并且能夠直接按比例放大它們的生產(chǎn)。通常，在含有碳源和蛋白質(zhì)材料的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物。優(yōu)選的碳源包括葡萄糖、紅糖(brown sugar)、蔗糖、甘油、淀粉、玉米淀粉、乳糖、糊精、糖蜜等。優(yōu)選的氮源包括棉籽粉、玉米漿、酵母、具有乳固體(milk solid)的自溶的面包酵母(brewer’ yeast)、大豆粕、棉籽粕、玉米粉、乳固體、酪蛋白的胰腺消化物、酒糟固體(distillers' solid)、動(dòng)物蛋白胨液體、肉和骨頭碎片(bone scrap) 等。可以方便地使用這些碳源和氮源的組合。沒有向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入痕量金屬，例如鋅、 鎂、錳、鈷、鐵等的必要，這是因?yàn)槭褂米詠硭臀醇兓某煞謥碜鳛榕囵B(yǎng)基的組分?？梢栽谂c微生物良好生長相關(guān)的約18°C 32°C，以及優(yōu)選在約的任何溫度誘導(dǎo)用于生產(chǎn)培養(yǎng)物的大規(guī)模發(fā)酵。通常，在發(fā)酵約2 8天，優(yōu)選發(fā)酵約4 5天時(shí)，可以獲得最佳化合物的生產(chǎn)。生產(chǎn)可以在搖瓶中進(jìn)行，也可以在固體培養(yǎng)基和攪拌的發(fā)酵罐中進(jìn)行。當(dāng)生長在搖瓶或較大容器以及槽中進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選使用營養(yǎng)體型(vegetative form)的，而不是用于接種的微生物的孢子形式。這樣可以避免在PUFA化合物生產(chǎn)方面顯著的遲滯，以及對(duì)所使用的儀器的維護(hù)不足。相應(yīng)地，期望通過用來自土壤或斜面培養(yǎng)物的部分樣品來接種含水營養(yǎng)培養(yǎng)基，從而在含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中生產(chǎn)營養(yǎng)型接種物。在隨后得到了初期的、活性的營養(yǎng)型接種物時(shí)，將其無菌轉(zhuǎn)移到其它搖瓶或用于微生物發(fā)酵的適合的裝置中。用于生產(chǎn)營養(yǎng)性接種物的培養(yǎng)基可以與用于生產(chǎn)化合物的培養(yǎng)物相同，也可以不同于用于生產(chǎn)化合物的培養(yǎng)物，只要能夠獲得充分生長的微生物即可。通常來說利用下述過程接種粘細(xì)菌菌株并在攪拌的容器中，以深層需氧發(fā)酵的形式發(fā)酵，以及生產(chǎn)化合物。生產(chǎn)不受所使用的容器、發(fā)酵罐和啟動(dòng)程序的制約。也可以通過搖瓶培養(yǎng)或者通過其它特別設(shè)計(jì)的容器(例如氣升式發(fā)酵罐或Biowave發(fā)酵罐)來得到該化合物。針對(duì)大容量的發(fā)酵，優(yōu)選使用營養(yǎng)型接種物。通過下述方法來制備營養(yǎng)型接種物通過接種少量的孢子形式的培養(yǎng)物或者生物的凍干顆粒(lyophilised pellet)。然后將營養(yǎng)型接種物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵容器中，然后在合適的溫育時(shí)間之后，在其中以最適收率生產(chǎn)化合物。正如傳統(tǒng)的需要深層培養(yǎng)過程，無菌空氣分散在培養(yǎng)基中。為了使生物充分生長， 所使用的空氣的體積在約0. 25 約0. 5vvm的范圍內(nèi)。在101的容器中攪拌的最適速率為約0. 3vvm，這是由傳統(tǒng)的攪拌葉輪以約240rpm的速度轉(zhuǎn)動(dòng)所提供的。如果起泡成為問題， 則根據(jù)需要可以向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入少量(即lml/1)的消泡劑(例如硅樹脂)。針對(duì)微需氧生物，優(yōu)選進(jìn)一步減少通氣從而支持生物質(zhì)的產(chǎn)生。通常以分批方式來進(jìn)行發(fā)酵，但是為了獲得更好的生長和提高的產(chǎn)物收率，可以利用補(bǔ)料分批發(fā)酵來進(jìn)行，該補(bǔ)料分批發(fā)酵是通過在原始培養(yǎng)基中缺少營養(yǎng)源時(shí)向生長的培養(yǎng)物中提供所需的營養(yǎng)物源的方式來進(jìn)行的。所需的產(chǎn)物通常大部分存在于已發(fā)酵的粘細(xì)菌菌株的生物質(zhì)中，但是在它們過量生產(chǎn)的情況下，產(chǎn)物也可以位于發(fā)酵液的培養(yǎng)物過濾液中?？梢酝ㄟ^過濾或壓濾的方式來分離培養(yǎng)液?？梢岳枚喾N方法從發(fā)酵液中分離和純化PUFA化合物，例如利用如下方法 色譜吸附過程，然后利用合適的溶劑進(jìn)行洗脫、柱色譜法、分配層析、利用超臨界流體提取、 以及上述這些方法的組合。

發(fā)明內(nèi)容
在鑒定和識(shí)別迄今未知的堆囊菌亞目粘細(xì)菌菌株的過程中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)所有被分類在迄今未知的、新發(fā)現(xiàn)的屬(在此將該屬命名為Aetherobacter)中的所有菌株均可以生產(chǎn)大量的不飽和脂肪酸(PUFA)，特別是omega-3多不飽和脂肪酸，例如EPA和DHA。發(fā)現(xiàn)有三株EPA和DHA的過量生產(chǎn)者，將它們屬于Aetherobacter fasciculatus新種未出版 (sp. nov. ined)(以菌株 DSM21835 表示)，Aetherobacter rufus 新種未出版(以菌株 DSM 23122來表示)，以及Aetherobacter sp. DSM 23098。本發(fā)明還涉及令人驚奇的新發(fā)現(xiàn)屬于粘細(xì)菌分類(特別是Enhygromyxa和堆囊菌屬的菌株)的某些其它菌株也可以生產(chǎn)較低含量的DHA和EPA。同時(shí)，在公共數(shù)據(jù)庫中基于公開的DNA序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上相關(guān)的細(xì)菌的篩選顯示一些“未能培養(yǎng)的”細(xì)菌作為新得到的omega-3PUFA過量生產(chǎn)菌株的最靠近的親緣菌株也被推測(cè)為粘細(xì)菌。認(rèn)為針對(duì)生物多樣性的這種細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分類還尚未被廣泛地進(jìn)行，因此極有可能在不遠(yuǎn)的將來發(fā)現(xiàn)可以大量生產(chǎn)DHA和/或EPA的另外新的、以及迄今為止尚未研究的分類單元以及菌株。利用相似的篩選方法可以促進(jìn)上述過程，所述篩選方法是在發(fā)現(xiàn)本發(fā)明主題的PUFA-生產(chǎn)菌株的過程中使用的篩選方法。該方法不僅涉及新的、尚未出版的Aetherobacter的另外的新菌株，還涉及其它目和粘細(xì)菌科的新菌株。


圖 1 “Aetherobacter fasciculatus，，DSM 21835 的生長階段(a_d)， "Aetherobacter rufus"DSM 23122 的生長階段(e_h)，以及“Aetherobacter sp. "DSM 23098的生長階段(i-Ι)。深色區(qū)域營養(yǎng)細(xì)胞(a，e, i)。標(biāo)尺10 μ m。νΥΛ瓊脂上的群游菌落(swarming colony)顯示酵母細(xì)胞的傳統(tǒng)的透明圈(b，f，j)。標(biāo)尺15mm。VY/2瓊脂上的子實(shí)體(fruiting body)的立體解剖照片(c，g，k)。標(biāo)尺300 μ m。來自粉碎的小孢子囊(sporangioles)的略微折光的粘孢子(d，h，1)。標(biāo)尺10 μ m。圖2 從5天培養(yǎng)物的三份樣品中提取的Aetherobacter fasciculatus DSM21835 的細(xì)胞脂肪酸的GC-MS色譜圖。圖3:DHA片段圖譜，上圖Aetherobacterfasciculatus DSM 21835 的典型培養(yǎng)物樣品下圖購買的參比DHA甲基酯。圖4:EPA片段圖譜，上圖Aetherobacterfasciculatus DSM 21835 的典型培養(yǎng)物樣品下圖購買的參比EPA甲基酯。圖5 基于粘細(xì)菌16S rDNA基因序列的鄰接法進(jìn)化樹(Neighbor-joining tree)， 并示出EPA和DHA生產(chǎn)菌株(黑體)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)位置。在分支點(diǎn)上的數(shù)字表示自展支持度水平(the level of bootstrap support)，基于1000個(gè)再取樣。僅示出大于60的值。標(biāo)尺，每個(gè)核苷酸位置0.05置換(substitution)。符號(hào)* 在該進(jìn)化樹中的纖維堆囊菌(Sorangium Cellulosum)模式株代表在堆囊菌屬中唯一能夠生產(chǎn)omega-3脂肪酸的菌株。纖維堆囊菌的其它菌株，例如由SBSo021和SBSo024(它們的DNA序列未包括在該進(jìn)化樹中)所表示的菌株，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們可以生產(chǎn)EPA，但是該模式株本身缺失omega-3PUFA生產(chǎn)。圖 6 =NCBI-BLASTn 產(chǎn)生的鄰接法進(jìn)化樹，其顯示 Aetherobacter fasciculatusDSM 21835(箭頭)的16S rDNA序列與2009年11月29日時(shí)GenBank中提供的最為同源的 50個(gè)典型序列的親緣關(guān)系。發(fā)明詳述本發(fā)明的粘細(xì)菌菌株應(yīng)當(dāng)被分類在新的屬AthercAacter中，并且為新的菌種 A. fasciculatus、A. rufus以及尚未命名的Aetherobacter菌株。這些所有的菌株均從最初在1962年于印度尼西亞收集的土壤和植物碎片樣品中分離。該樣品被保藏在仏肚！· fur Biodokumentation, Landsweiler-Reden，德國。為了分離粘細(xì)菌，使用活的大腸桿菌(Escherichia coli 作為誘館(bait)，按照之前描述的方法[Reichenbach H&Dworkin M(1992)The Myxobacteria, In The Prokaryotes，第二版，pp. 3416-3487 (Balows A 等人編)NewYork =Springer]處理土壤/植物碎片樣品。于2007年11月從含有根部碎片和其它腐爛植物材料的土壤樣品中分離出 Aetherobacter fasciculatus DSM 21835。于 2007 年 12 月分離出菌株 A. rufusDSM 23122 以及于 2009 年 2 月分離出 Aetherobacter sp. DSM 23098。上述粘細(xì)菌菌株屬于粘球菌目的堆囊菌亞目，為新編訂的屬Aetherobacter的代表菌株，由此提出作為新編訂的菌種(A. fasciculatus、A. rufus、Aetherobacter sp.)，所述菌株是需氧的 兼性需氧的，并且為化學(xué)異養(yǎng)的，具有的16S rDNA序列如SEQ ID N0 1 所示(DSM 218；35)，如 SEQ ID NO 2 所示(DSM 23122)以及如 SEQ ID NO 4 所示(DSM 23098)，與菌株 Byssovorax (同物異名 Byssophaga) cruenta DSM 14553T (GenBank 登錄號(hào) AJ833647，SEQ ID NO 3)具有約96%的同一性和/或具有的omega_3PUFA含量為總細(xì)胞脂肪酸含量的至少10%，優(yōu)選至少15重量％。下文將對(duì)提出的分類單元進(jìn)行詳述。本發(fā)明菌株的學(xué)名尚未公開?，F(xiàn)有技術(shù)中無已知屬于屬Aetherobacter的其它菌株。在本發(fā)明中首次對(duì)該屬進(jìn)行了描述。其系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系概述如下所述。更具體來說， 在實(shí)施例中對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了概述。粘球菌目包括下述列舉的亞目，其依次包括下述列舉的科、列舉的屬以及列舉的種。亞目(suborder)科(family)屬(genus)
孢嚢桿菌亞目
孢嚢桿菌科
原嚢菌屬孢嚢桿菌屬 Hyalangium 蜂窩嚢菌屬才示孓己菌屬
粘球菌科
Anaeromyxobacter 珊瑚球菌屬粘球菌屬 Pyxidiococcus
種(species)(例子)
侏嚢菌亞目
Haliangiaceae(Kofleriaceaea) Haliangium
侏嚢菌科
侏嚢菌屬 Plesiocystis Enhygromyxa
Enhygromyxa salina
堆嚢菌亞目
Phaselicystidaceae
Phaselicystis
多嚢菌科
多嚢菌屬 Jahnella 軟骨霉?fàn)罹鷮?br> Byssovorax Byssovorax cruenta
Aetherobacter Aetherobacterfasciculatus (DSM 21835)Aetherobacter rufus (DSM 23122) Aetherobacter sp. (DSM 23098)
堆嚢菌屬
纖維堆嚢菌系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系是通過比較現(xiàn)存活的可培養(yǎng)的代表性的屬和菌株的16S rDNA序列數(shù)據(jù)而獲得的，如圖10所示。三株新菌株在形態(tài)上有一定程度的相似。關(guān)于營養(yǎng)細(xì)胞以及子實(shí)體， Aetherobacter fasciculatus DSM 21835 與 Aetherobacter sp. DSM 23098 生長階段的夕卜觀基本相同。AethercAacter rufus DSM 23122不同，在于其具有紅色的子實(shí)體以及更小的小孢子囊。另外，DSM 23122產(chǎn)生發(fā)白的群游(swarm)，其與AethercAacter剩余的兩株菌株的發(fā)黃桔色不同。生理學(xué)檢測(cè)也顯示新菌株和種之間的區(qū)別。明顯地，三株新菌株優(yōu)選不同的糖和氮源以用于生長。分離菌株的抗生素抗性不同，例如DSM 21835和DSM 23098對(duì)于潮霉素B 有抗性，而DSM 23122對(duì)于該化合物敏感。對(duì)于氨芐青霉素和新霉素的抗性使得可以從菌株 DSM 23098 中區(qū)分出 A. fasciculatus DSM 23098 和 A. rufus DSM 23122。此外，與 DSM 23122相比，DSM 21835和DSM 23098似乎顯示出更廣范圍的抗生素抗性。在系統(tǒng)發(fā)生樹中，來自三株新菌株的16S rDNA序列聚集在一起，由100%自展值 (bootstrap value)支持。Aetherobacter fasciculatus DSM 21835 不僅形態(tài)上與 A. sp. DSM 23098相似，而且16S rDNA序列也顯示它們具有高度的同源性(99. 4%同一性)。發(fā)現(xiàn) A. rufus DSM 23122 與 DSM 218；35 具有 98. 9%的同一性，與 DSM 23098 具有 99. 2%的同一性。上述關(guān)系在系統(tǒng)發(fā)生樹中非常明顯，其中，與DSM 23122相比，DSM 21835的序列與DSM 23098聚集在一起(圖10)。對(duì)新屬和種的描述1. Aetherobacter R. 0· Garcia& R.Miiller.新屬未出版(Ren, nov. ined.)語源:Aetherobacter [Ae. the. ro. bac ‘ ter.希臘語(Gr.)陽性名詞(masc. n.) Aether希臘光之神(Greek God of Light)(是指清澈透明的群游)；希臘語陰性名詞 (fem. n. )bacter來自希臘語中性名詞(neut. . n. )bakterium小棒，桿；現(xiàn)代拉丁語(M. L.) 陽性名詞Aetherobacter清澈群聚的棒]營養(yǎng)細(xì)胞長度適當(dāng)并且為具有平端(blunt end)的細(xì)長圓柱棒狀；通過在表面上以及在瓊脂下滑動(dòng)來運(yùn)動(dòng)。群游，類似于膜狀 透明清澈的菌落。剛果紅-陰性，其邊緣為彼此粘附遷移的細(xì)胞，穿透到大部分固體培養(yǎng)基下；瓊脂稍有凹陷。粘孢子具有平端的折光的細(xì)長棒，比營養(yǎng)細(xì)胞短，并封裝在孢子囊壁(sporangial wall)中。子實(shí)體作為微小的卵形體小孢子囊，通常較為致密或是聚集的。酵母被完全降解。強(qiáng)溶菌性。具有omega-3多不飽和脂肪酸作為細(xì)胞FA的主要成分。G+C百分比，68. 0-70 %。新屬AthercAacter與最為類似的、已接受的粘細(xì)菌屬Byssovorax在很多方面明顯不同。在形態(tài)上，Byss0v0rax在瓊脂培養(yǎng)基上顯示為深紅色類偽原質(zhì)團(tuán)群游和子實(shí)體。遷移細(xì)胞的獨(dú)立群體被認(rèn)為是該屬的典型特征。小孢子囊較大(60-180μπι寬)，并且也顯示為深紅色的顏色。相反，由下面將要詳細(xì)描述的菌株所代表的新屬AethercAacter的種會(huì)產(chǎn)生群游的形式，該群游可以深深地穿透瓊脂。Aetherobacter spp.的穴居細(xì)胞 (burrowing cell)形成的群游顯示出放射狀(環(huán)狀)外觀。另外，群游細(xì)胞(swarming cell)顯示出白色 淺桔色的顏色。在酵母瓊脂(VY/2)上，在所有這些新菌株中，菌落的中間通常為清澈的。單個(gè)小孢子囊較小(< 20 μ m)，并且排列成緊密填充的聚集體或束狀，并通常位于瓊脂中。Aetherobacter spp.與Byssovorax另一個(gè)顯著的區(qū)別在于該新屬的成員無法降解纖維素。兩種屬在它們的脂肪酸模式上也有明顯不同。Byss0v0rax含有較高含量的 iso-15:0和直鏈脂肪酸，而且不含有DHA和EPA。16S rDNA的96 %相似性的遺傳學(xué)特征也用于近期建立的粘細(xì)菌屬 Enhygromyxa[Iizuka Τ.等人(2003)Syst Appl Microbiol 26:189-196]以及 Byssovorax [Reichenbach 等 Α 2006. Int J Syst Evol Microbiol. 56 (PT 10) 2357-2363]?；谏鲜鰯?shù)據(jù)，新Aetherobacter菌株顯示與已知的屬Byssovorax (即粘細(xì)菌的屬)明顯不同，根據(jù)它們16S rDNA的同源比對(duì)推斷該屬Byssovorax與新Aetherobacter 菌株最為相關(guān)。綜合考慮在形態(tài)學(xué)、生理化學(xué)、16S rDNA基因拓?fù)鋵W(xué)、以及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析方面的這些不同，顯示這些不同是一致的從而證明新屬的創(chuàng)建是正確的。2. Aetherobacter fasciculatus 0. Garcia&R. Miiller jf禾中ip-iJI :fasciculatus [fasc. i. cu' la. iiT^i吾陰t生名i司(L masc. η.) fasciculum 小束或串(是指小孢子囊的排列)]。具有該屬的全部特征。營養(yǎng)細(xì)胞寬棒狀，大小為1. 2-1. 3X2. 9-5. 7 μ m，以及為深色相(phase dark)。群游為桔色微小的，其顯示出酵母細(xì)胞誘餌的完整透明圈，在瓊脂的表面上具有淺的凹陷，并且該群游通常深深地穿透該培養(yǎng)基從而形成彼此粘附的類似于絲膜 (coherent curtain-like)的結(jié)構(gòu)。子實(shí)體的顏色為黃色 桔色，通常在瓊脂下被發(fā)現(xiàn)，由 5-20微小小孢子囊(10.4X11.4ym)緊密地排列成串作為孢子堆(30X50 μ m)0粘孢子折光、短粗棒狀，具有圓形末端，與營養(yǎng)細(xì)胞類似，但比營養(yǎng)細(xì)胞短(1. 0-1. 2 X 3. 2-4. O μ m)； 封裝在孢子囊壁中。營養(yǎng)型，溶菌的，酵母降解者。不降解纖維素和殼多糖。在蔗糖、果糖、D-甘露糖和L-阿拉伯糖中生長良好。對(duì)光譜的抗生素具有抗性艮他霉素、阿泊拉霉素、妥布拉霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、新霉素和潮霉素B。對(duì)下述抗生素敏感卡那霉素、 壯觀霉素、四環(huán)素、土霉素、羧芐青霉素以及利福平(rifampicin)。主要的細(xì)胞脂肪酸成分為二十二碳六烯酸，DHA) iso-C15:0, C20:5. ( 二十碳五烯酸，EPA)。G+C的摩爾百分比為 68. 9。模式株根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2008年8月27日將Aetherobacter fasciculatus 保藏在DMSZ，德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Inhoffenstr. 7B, 38124Braunschweig,德國， 保藏號(hào)為DSM 21835。A. fasciculatus DSM 218 具有的 rDNA 序列與 Byssovorax(同物異名 Byssophaga) cruenta DSM 14553τ 的 16S rDNA 序列 96%相同。其 omega_3PUFA 含量至少為總細(xì)胞脂肪酸含量的10%，優(yōu)選至少為15重量％。根據(jù)顯示出下述特征確認(rèn)A. fasciculatus DSM 21835為粘細(xì)菌綱、粘球菌目的成員，所述特征革蘭氏陰性菌的群游、細(xì)長棒形營養(yǎng)細(xì)胞、子實(shí)體的形成、以及溶菌活性。該菌株為需氧 兼性需氧，化學(xué)異養(yǎng)，以及還顯示出對(duì)于多種抗生素具有抗性。主要脂肪酸為C22:6( 二十二碳六烯酸)，is0-C15:Q，anti-iS0 C17:Q 以及 C2Q:5 (二十碳五烯酸)。基因組DNA的G+C含量為68. 9摩爾％。其16S rDNA序列顯示出與纖維素降解菌Byssovorax cruenta 96%的同一性，以及與纖維堆囊菌95%的同一性。這些清楚地顯示該菌株屬于粘球菌目的堆囊菌亞目。另外，形態(tài)上的生長階段以及新脂肪酸模式上的唯一性清楚地表明DSM 21835屬于新的分類單元，其應(yīng)當(dāng)被分類為屬于新屬AethercAacter 以及新禾中A. fasciculatus。3. Aetherobacter rufus R. (λ Garcia& R.Miiller·新種未出版語源:rufus(ru. fus.拉丁語陰性形容詞(L. masc. adj. ) rufus 紅色)。具有該屬的全部特征。營養(yǎng)細(xì)胞寬棒狀，大小為1.0-1. 2X3. 0-6. Ομπι，最長 15 μ m，深色相。在酵母瓊脂中，群游粘附在培養(yǎng)基中移動(dòng)從而形成具有白色邊緣的環(huán)或圓形結(jié)構(gòu)。菌落(在VY/2瓊脂上)顯示為清澈和透明的，這是酵母完全降解的結(jié)果。在瓊脂的表面上，它們通常產(chǎn)生為具有朝向菌落邊緣的細(xì)胞聚集體的凸起的薄片或膜，顯示出淺的瓊脂凹陷。子實(shí)體顯示出紅色 朱紅色顏色，以單個(gè)凸起(120Χ140μπι)的形式出現(xiàn)，或者以非常長的輥(340Χ400μπι-1900Χ^00μπι)的形式出現(xiàn)，肉眼可見，最初由細(xì)胞聚集體的白色隆起發(fā)展而成。由微小的小孢子囊(6-12μπι)構(gòu)成，形成孢子堆 (14Χ15μπι-16Χ^μπι)。粘孢子折光、短粗和短棒狀(1. 0-2. O μ m)，具有圓形末端與營養(yǎng)細(xì)胞類似；封裝在孢子囊壁中。營養(yǎng)型，溶菌的。不降解纖維素和殼多糖。在下述所有檢測(cè)過的糖中均同樣良好生長L-阿拉伯糖、果糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、糖蜜、山梨糖醇、木糖、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖以及可溶淀粉。對(duì)于氨芐青霉素、新霉素和艮他霉素具有抗性。對(duì)于下述抗生素敏感阿泊拉霉素、妥布拉霉素、卡那霉素、壯觀霉素、潮霉素 B、氨芐青霉素、四環(huán)素、土霉素、鏈霉素、羧芐青霉素以及利福平，主要的細(xì)胞脂肪酸成分為 iso-C15:。、C22:6 (DHA)、C15:。、C16:。。也產(chǎn)生 C2。:5. (EPA)。G+C 的摩爾百分比為 68. O。模式株于2009年11月25日將Aetherobacter rufus保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Braunsctiweig，德國，保藏號(hào)為DSM23122。發(fā)現(xiàn)A. rufus菌株DSM 23122也產(chǎn)生EPA和DHA。在形態(tài)上，該菌株與 A. fasciculatus菌株DSM 21835具有許多相似之處。但是，這兩個(gè)種在一些生理學(xué)特征上存在不同，例如抗生素敏感性、碳需求、PH耐受性以及在16S rDNA序列方面。在omega-3脂肪酸的分析中，A. rufus DSM 23122也產(chǎn)生DHA和EPA兩者。4. Aetherobacter sp. DSM 23098還發(fā)現(xiàn)Aetherobacter sp. DSM 23098也與上述提到的菌株相關(guān)，并且在其細(xì)胞生物質(zhì)中含有大量omega 3-PUFA。因此，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2009年11月12日該菌株也保藏在DMSZ，保藏號(hào)為DSM 23098。在本申請(qǐng)的的公開內(nèi)容中，通常的表述優(yōu)選具有下述或上述體積的含義，在每一個(gè)實(shí)施方式中，超過一個(gè)或全部更多的通常表述可彼此獨(dú)立，可被更具體的定義所代替，從而分別形成本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。優(yōu)選，下述縮寫用于說明本發(fā)明的意圖
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)omega-3多不飽和脂肪酸的方法，該方法包括培養(yǎng)能夠生產(chǎn)一種或多種 omega-3多不飽和脂肪酸的粘細(xì)菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株屬于粘球菌目(Myxococcales) 的堆囊菌亞目(Sorangiineae)。
3.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株具有的16SrDNA序 ^lJ% Byssovorax (Byssophaga) cruenta DSM 14553τ 具*至少 84% 的同一'I"生。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株屬于堆囊菌亞目的多囊菌科 (Polyangiaceae)0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株具有的16SrDNA序列與 Byssovorax (Byssophaga) cruenta DSM 14553τ 具*至少的同一'I"生。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株具有的omega-3多不飽和脂肪酸的含量為總細(xì)胞脂肪酸含量的至少10%，優(yōu)選至少15重量％。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株屬于粘球菌目的堆囊菌亞目并且是在此提出的新屬(AethercAacter)和新種(fasciculatus)的代表，該菌株是需氧的 兼性需氧的，并且為化學(xué)異養(yǎng)的，其具有的16S rDNA序列與SEQ ID NO :3所示的菌株 Byssovorax(Byssophaga) cruenta DSM 14553τ 具有約 96% 的同一性和 / 或具有的 omega-3多不飽和脂肪酸含量為總細(xì)胞脂肪酸含量的至少10%，優(yōu)選至少15重量％。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株具有的16SrDNA序列與SEQ ID NO 1所示的16S rDNA具有至少97 %的同一性，優(yōu)選具有至少99%的同一性，最優(yōu)選所述粘細(xì)菌菌株具有的SEQ ID NO 1所示的16SrDNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株是菌株 Aetherobacterfasciculatus DSM 21835。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株具有的16SrDNA序列與SEQID NO 2所示的16S rDNA具有至少97 %的同一性，優(yōu)選具有至少99%的同一性，最優(yōu)選所述粘細(xì)菌菌株具有的SEQ ID NO 2所示的16S rDNA序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株是菌株Aetherobacterrufus DSM 23122。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述粘細(xì)菌菌株具有的16SrDNA序列與SEQID NO :4所示的16S rDNA具有至少97%的同一性，優(yōu)選具有至少99%的同一性，最優(yōu)選所述粘細(xì)菌菌株具有的SEQ ID N0:4所示的16S rDNA序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，將所述粘細(xì)菌菌株分類為AethercAacter sp.菌株 DSM 23098。
14.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述omega-3多不飽和脂肪酸選自二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)以及它們的混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括⑴從培養(yǎng)物中分離所述一種或多種omega-3多不飽和脂肪酸；和/或(ii)純化所述一種或多種omega-3多不飽和脂肪酸；和/或(iii)分離單獨(dú)的omega-3不飽和脂肪酸。
16.粘細(xì)菌菌株，其是根據(jù)權(quán)利要求1 14所定義的能夠生產(chǎn)omega-3多不飽和脂肪酸的粘細(xì)菌菌株。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的粘細(xì)菌菌株，其是AetherobacterfasciculatusDSM 21835、Aetherobacter rufus DSM 23122 或Aetherobacter sp. DSM 23098。
18.omega-3多不飽和脂肪酸混合物，其是通過權(quán)利要求1 15中任一項(xiàng)所述的方法獲得的。
19.權(quán)利要求18所述的omega-3多不飽和脂肪酸，其含有至少10%、優(yōu)選至少15重量％的EPA和DHA。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)特定的粘細(xì)菌菌株來生產(chǎn)omega-3多不飽和脂肪酸的方法以及適用于該方法的粘細(xì)菌菌株。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102325892SQ200980155819
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日
發(fā)明者亞歷山大.布拉克曼, 厄恩斯特.羅默, 多米尼克.皮斯托里厄斯, 羅爾夫.馬勒, 羅納德.O.加西亞, 馬克.斯塔德勒 申請(qǐng)人:贏泰醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司