專利名稱：用于在植物中表達(dá)異源核苷酸序列的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及在植物中鑒定和使用調(diào)節(jié)元件。
背景技術(shù)：
植物中葉綠體的生物發(fā)生取決于位于葉綠體與細(xì)胞核中的兩個(gè)獨(dú)立的遺傳系統(tǒng) 的協(xié)調(diào)的活動(dòng)(參見 Cline 和 Henry (1996)，Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12，1-26)。大量的 組分葉綠體蛋白是由核基因編碼的并且是細(xì)胞質(zhì)合成的-作為包含稱為轉(zhuǎn)運(yùn)肽的N-端延 伸的前體形式。轉(zhuǎn)運(yùn)肽在特異性識(shí)別葉綠體表面并且介導(dǎo)前蛋白質(zhì)翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)跨過(guò)葉綠體 被膜并且因此進(jìn)入葉綠體內(nèi)的各種不同亞區(qū)室(例如，基質(zhì)、類囊體以及類囊體膜)的方面 起作用。所報(bào)告的在其N端具有自然編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的基因包括核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶(RuBisCo)的葉綠體小亞基(de Castro Silva Filho 等人(1996)Plant Mol. Biol. 30 769-780 ；Schnell, D. J.等人(1991) J. Biol. Chem. 266(5) :3335_3342) ；5-烯醇 丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (Archer 等人(1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22 (6) 789-810)；色氨酸合酶(Zhao, J.等人(1995) J. Biol. Chem. 270(11) :6081_6087)；質(zhì)體藍(lán) 素(Lawrence 等人(1997) J. Biol. Chem. 272(33) :20357_20363)；分支酸合酶(Schmidt 等 人(1993) J. Biol. Chem. 268(36) :27477_27457)；以及捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白(LHBP) (Lamppa等人(1988) J. Biol. Chem. 263 14996-14999)，雖然并不是所有這些序列在高等植 物中在葉綠體靶向蛋白的異源表達(dá)中是有用的。發(fā)明概述在此提供了用于植物中多肽的葉綠體靶向的組合物和方法。組合物包含表達(dá)盒， 所述表達(dá)盒包含可操作地連接到感興趣的核苷酸序列上的對(duì)從藻類生物衍生的葉綠體靶 向肽(或葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，“CTP”)序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列。這些表達(dá)構(gòu)建體對(duì)于單子葉 植物或雙子葉植物中感興趣的核苷酸序列的表達(dá)以及正確的靶向是有用的。本發(fā)明進(jìn)一步 提供了包含表達(dá)盒的載體、以及具有已穩(wěn)定地?fù)饺牖蛩矔r(shí)表達(dá)在其基因組中的上述表達(dá)盒 的植物和植物細(xì)胞。另外，組合物包括此類植物的轉(zhuǎn)基因種子。還提供了用于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的方法，以及鑒定用于植物的 藻類CTP序列的方法。


圖1表示TagGFP在煙草原生質(zhì)體中的表達(dá)。圖2表示在玉米細(xì)胞中衣藻(Chlamydomonas)EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的表達(dá)以及加 工。泳道1 非轉(zhuǎn)基因玉米系Hi-II ；泳道2-6 用衣藻EPSPSCTP/GRG23(ace3) (R173K)構(gòu) 建體轉(zhuǎn)化的各個(gè)T。轉(zhuǎn)植項(xiàng)；泳道7 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物；泳道8 純化的GRG23(ace3) (R173K)蛋白(4ng)。圖3表示玉米中表達(dá)的經(jīng)加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3) (R173K)蛋白的分 子量的計(jì)算。使用對(duì)數(shù)分子量對(duì)來(lái)自圖2的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品的遷移距離的圖的線性回歸來(lái)計(jì)算GRG23(ace3) (R173K)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品以及植物提取物中檢測(cè)到的經(jīng)加工的衣藻 EPSPS-GRG-23 (ace3) (R173K)的表觀分子量。詳細(xì)說(shuō)明在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物中，將外源蛋白導(dǎo)向至特定的亞細(xì)胞位置(例如，葉綠體、液 泡、線粒體或ER)通常是有用的。以前的工作人員已經(jīng)將來(lái)自不同植物基因的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽 的DNA序列融合到感興趣的基因上。當(dāng)翻譯該基因時(shí)，得到的蛋白質(zhì)具有融合到感興趣的 蛋白質(zhì)的氨基末端上的植物轉(zhuǎn)運(yùn)肽，并且因此以不同的效率將該蛋白 質(zhì)導(dǎo)向至所希望的亞 細(xì)胞的區(qū)室。因此，本發(fā)明是針對(duì)用于在高等植物或植物細(xì)胞中多肽的葉綠體靶向的組合物以 及方法。本發(fā)明的組合物包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至感興趣的核苷酸序 列上的對(duì)從藻類生物衍生的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)進(jìn)行編碼的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案 中，該CTP是從衣藻衍生的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該CTP包含SEQ ID N0:3、5或7中所列 出的氨基酸序列或由SEQ ID NO :1、2、4或6所編碼的氨基酸序列，及其變體、片段以及衍生 物。此外，提供了轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞和種子。當(dāng)在DNA構(gòu)建體中進(jìn)行組裝從而將編碼CTP的序列可操作地連接到感興趣的核苷 酸序列上時(shí)，本發(fā)明的編碼CTP的序列有助于將感興趣的肽共翻譯地或翻譯后地轉(zhuǎn)運(yùn)到用 該DNA構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的葉綠體中。在植物中用于表達(dá)核苷酸序列的方法包括 將表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中(該表達(dá)盒包含可操作地連接到感興趣的核苷酸序列上的本發(fā) 明的編碼CTP的核苷酸序列)并且從該植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。在這里使用冠詞“一個(gè)”以及“一種”是指一個(gè)或一個(gè)以上(即至少一個(gè))的該冠 詞的語(yǔ)法對(duì)象。例如，“一個(gè)元件”是指一個(gè)或多個(gè)元件。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)以 及RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物。所述核酸分 子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選地是雙鏈的DNA。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽葉綠體是在進(jìn)行光合作用的植物細(xì)胞以及真核藻類中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器。葉綠體是由 三個(gè)膜組成的復(fù)雜的細(xì)胞器，即內(nèi)被膜、外被膜、以及類囊體膜。這些膜一起封閉了三個(gè)水 性區(qū)室稱為中間部、基質(zhì)、以及類囊體腔。雖然葉綠體包含其自己的環(huán)形基因組，許多組分 葉綠體蛋白是由核基因編碼的并且是細(xì)胞質(zhì)合成的，作為包含稱為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)的 N-端延伸的前體形式。該CTP在特異性識(shí)別葉綠體表面并且介導(dǎo)前蛋白質(zhì)翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)跨過(guò) 葉綠體被膜并且進(jìn)入葉綠體內(nèi)的多種不同亞區(qū)室中(例如，基質(zhì)、類囊體以及類囊體膜)的 方面起作用。已經(jīng)在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽中鑒定出了至少兩個(gè)獨(dú)特的功能域基質(zhì)靶向結(jié)構(gòu)域 (stromal targeting domain ；STD)以及內(nèi)腔革巴向結(jié)構(gòu)域(lumen targeting domain ；LTD)。 STD控制進(jìn)入普通的導(dǎo)入途徑并且對(duì)于將過(guò)客蛋白(passenger protein)導(dǎo)入到基質(zhì)中不 但是必要的而且是充分的。基質(zhì)蛋白前體具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽僅包含STD，然而類囊體 內(nèi)腔蛋白前體具有STD和LTD兩者。STD長(zhǎng)度范圍從約30個(gè)殘基至120個(gè)殘基，并且富含羥基化的殘基并且缺少酸性 殘基。它們傾向于共享幾種組成性基序缺少Gly、Pro以及帶電荷的殘基的10至15個(gè)殘基的氨基末端；富含Ser、Thr, Lys以及Arg的可變的中間區(qū)；以及具有用于蛋白酶解加工 的寬松地保守的序列(Ile/Val-X-Ala/Cys-Ala ;SEQ ID NO 17)的鄰近羧基的區(qū)域。然而， 既不存在廣泛的序列保守的嵌段，也沒(méi)有任何保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)基序。理論分析表明STD主 要地采用了無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象。所報(bào)告的在其N端具有自然編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的基因包括核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶的葉綠體小亞基(RuBisCo) (de Castro Silva Filho 等人(1996)Plant Mol. Biol. 30 769-780 ；Schnell, D. J.等人(1991) J. Biol. Chem. 266(5) :3335_3342) ；5-烯醇 丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (Archer 等人(1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22 (6) 789-810)；色氨酸合酶(Zhao, J.等人(1995) J. Biol. Chem. 270(11) :6081_6087)；質(zhì)體藍(lán) 素(Lawrence 等人(1997) J. Biol. Chem. 272(33) :20357_20363)；分支酸合酶(Schmidt 等 人(1993) J. Biol. Chem. 268(36) :27477_27457)；以及捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白(LHBP) (Lamppa 等人(1988) J. Biol. Chem. 263 14996-14999)。雖然已經(jīng)描述了一些 CTP，僅有幾 個(gè)已經(jīng)被成功地用于試圖在高等植物中將嵌合分子靶向到葉綠體中。本發(fā)明披露了從藻類物種特別是衣藻衍生的CTP在高等植物中的用途。為了本發(fā) 明的目的，“高等植物”被認(rèn)為是有胚植物(Embryophytae)亞界的成員。在一個(gè)實(shí)施方案 中，在此處披露的方法以及組合物中有用的CTP是從衣藻中衍生的。在另一實(shí)施方案中，該 CTP被列于SEQ ID NO :3、5或7中或由SEQ ID NO :1、2、4或6所編碼，包括及其變體、片段 以及衍生物。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解如何鑒別除了在此披露的那些肽之外的 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。例如，許多CTP(或包含CTP的蛋白序列)被列于GENBANK 中。 在此披露的CTP對(duì)于將多肽靶向到植物細(xì)胞的葉綠體中是有用的。在一個(gè)實(shí)施方 案中，與從例如高等植物生物中衍生的CTP相比，在此披露的CTP提供了改進(jìn)的轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng) 與參照CTP相比較時(shí)，在此披露的CTP可以導(dǎo)致多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中至少約20%、至少約 30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %、至少 約100%或更多或至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍或更多的提高。能夠以得以轉(zhuǎn)移進(jìn) 入葉綠體中的多肽的量，得以轉(zhuǎn)移進(jìn)入葉綠體中的活性多肽的量或這兩者的方式測(cè)量提高 值。也能夠以用感興趣的葉綠體靶向的蛋白轉(zhuǎn)化的生物的表型方面的提高量的方式測(cè)量提 高。例如，當(dāng)使用本發(fā)明的CTP來(lái)將除草劑抗性蛋白靶向到植物的葉綠體中時(shí)，能夠以除草 劑抗性方面提高的方式測(cè)量活性的提高。表達(dá)盒可以將本發(fā)明的編碼CTP的序列提供于表達(dá)盒中，該表達(dá)盒允許它來(lái)驅(qū)動(dòng)由感興 趣的核苷酸序列所編碼的多肽表達(dá)并定位于植物細(xì)胞的葉綠體中?！氨磉_(dá)盒”是指DNA構(gòu)建 體，該DNA構(gòu)建體能夠?qū)е碌鞍自诩?xì)胞中從可讀框進(jìn)行表達(dá)。該盒在轉(zhuǎn)錄的5' -3'方向 包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)優(yōu)選地包含適合用于在感興趣的植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng) 子，其可操作地連接到本發(fā)明的編碼CTP的序列上，它被進(jìn)一步可操作地連接到感興趣的 核苷酸序列上；以及在植物中有功能的翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(即，終止區(qū))?？梢酝ㄟ^(guò)如在此 其他地方所討論的對(duì)一個(gè)或多個(gè)“接頭”氨基酸進(jìn)行編碼的核苷酸序列將編碼CTP的核苷 酸序列與感興趣的核苷酸序列彼此分離。該盒可以另外包含至少一個(gè)另外的有待共轉(zhuǎn)化入生物體內(nèi)的基因，例如選擇性標(biāo) 記基因。作為替代方案，可以將一個(gè)或多個(gè)另外的基因提供于多個(gè)表達(dá)盒上。將多個(gè)限制性位點(diǎn)提供于這類表達(dá)盒以用于將感興趣的核苷酸序列插入在這些調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。該表達(dá)盒可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)3'和/或5'非翻譯區(qū)?！?'非翻譯區(qū)”是 指位于編碼序列的下游的核苷酸序列。聚腺苷酸化信號(hào)序列以及對(duì)能夠影響聚腺苷酸束加 入到該mRNA前體的3'端上的調(diào)節(jié)信號(hào)進(jìn)行編碼的其他序列是3'非翻譯區(qū)?！?'非翻譯 區(qū)”是指位于編碼序列的上游的核苷酸序列。其它上游或下游的非翻譯元件包括增強(qiáng)子。 增強(qiáng)子是發(fā)揮作用以增加啟動(dòng)子區(qū)域的表達(dá)的核苷酸序列。增強(qiáng)子在本領(lǐng)域中是熟知的并 且包括但不限于SV40增強(qiáng)子區(qū)以及35S增強(qiáng)子元件。終止區(qū)可以是與本發(fā)明的編碼CTP的核苷酸序列固有的，可以是與感興趣的 核苷酸序列固有的，或可以是從另一種來(lái)源衍生的。方便的終止區(qū)可以從根癌農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)的Ti質(zhì)粒得到，例如章魚堿合酶終止區(qū)和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。也參見 Guerineau 等人(1991)Mol. Gen. Genet. 262 :141_144 ；Proudfoot (1991) Cell 64 :671_674 ； Sanfacon等人(1991)Genes Dev. 5 :141_149 ；Mogen等人(1990)Plant Cell 2 :1261_1272 ； Munroe 等人(1990)Gene 91 :151_158 ;Ballas 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17 7891-7903 ；以及 Joshi 等人(1987)Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639。在此描述的表達(dá)盒可以進(jìn)一步包含除了 CTP以及本領(lǐng)域已知的另外的CTP以外的 一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)元件?！罢{(diào)節(jié)元件”或“調(diào)節(jié)區(qū)”是指在基因的上游或下游處所發(fā)現(xiàn)的核酸 的一部分，它可以包含DNA或RNA，或DNA和RNA兩者以及在基因表達(dá)中所涉及的物質(zhì)。調(diào) 節(jié)元件可以能夠介導(dǎo)器官特異性或控制發(fā)展的或暫時(shí)的基因活化并且包括啟動(dòng)子元件、核 心啟動(dòng)子元件、應(yīng)答于外部刺激可誘導(dǎo)的元件、被組成型地激活的元件、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺 苷酸化信號(hào)、以及減少或增加啟動(dòng)子活性的元件(對(duì)應(yīng)地例如負(fù)調(diào)節(jié)元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。 “順式作用”是指物理地與轉(zhuǎn)錄序列鄰接的序列。順式作用序列一般地與蛋白或其他分子相 互作用以實(shí)現(xiàn)(開/關(guān)、調(diào)節(jié)、調(diào)制等)轉(zhuǎn)錄?！稗D(zhuǎn)錄增強(qiáng)子”是指核酸序列，當(dāng)置于啟動(dòng)子 附近并且存在于能夠支持轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄介質(zhì)中時(shí)，與在缺少該增強(qiáng)子下該啟動(dòng)子得到的結(jié)果 相比該核酸序列提供增加的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子可以在基因的上游、之中或下游，甚至距離該 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)遠(yuǎn)達(dá)50千堿基處起作用。增強(qiáng)子還可以獨(dú)立于它們的方向起作用?！稗D(zhuǎn)錄終 止子”是指包括對(duì)減少或消除轉(zhuǎn)錄必需的核苷酸堿基對(duì)序列的DNA序列?！熬巯佘账峄?號(hào)”是指控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。 本發(fā)明的一個(gè)方面，對(duì)給定的多肽設(shè)計(jì)了合成的DNA序列，該多肽例如在此披露 的方法中有用的靶向葉綠體的多肽。在細(xì)胞中該合成的DNA序列的可讀框的表達(dá)導(dǎo)致該多 肽的生成。合成的DNA序列對(duì)于簡(jiǎn)單地去除不想要的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)、對(duì)于有 利于DNA克隆策略、對(duì)于改變或去除任何潛在的密碼子偏愛、對(duì)于改變或改進(jìn)GC含量、對(duì)于 去除或改變可替代的閱讀框、和/或?qū)τ诟淖兓蛉コ齼?nèi)含子/外顯子剪接識(shí)別位點(diǎn)、聚腺苷 酸化位點(diǎn)、SD序列、不想要的啟動(dòng)子元件以及在天然DNA序列中可能存在的序列可能是有 用的。還可能的是可以使用合成的DNA序列來(lái)將其他改進(jìn)引入DNA序列中，例如引入內(nèi)含 子序列、生成作為與細(xì)胞器靶向序列(例如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、質(zhì)外體/液泡靶向肽或?qū)е律?成的肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留的肽序列)的蛋白融合物表達(dá)的DNA序列。合成基因還可以使用 宿主細(xì)胞優(yōu)選的用于提高表達(dá)的密碼子來(lái)合成或可以使用密碼子在宿主優(yōu)選的密碼子使 用頻率下合成。參見，例如Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol. 92 :1_11 ；美國(guó)專利 號(hào) 6，320，100 ；6, 075, 185 ；5，380,831 ；以及 5，436，391，美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)?20040005600 以及20010003849，以及 Murray 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17 :477_498，通過(guò)引用并入本
文作為參考。還可以將有待靶向到葉綠體的感興趣的核酸進(jìn)行優(yōu)化用于在葉綠體中表達(dá)從而 說(shuō)明了植物細(xì)胞核與細(xì)胞器之間密碼子使用方面的差異。以這種方式，可以使用葉綠體優(yōu) 選的密碼子來(lái)合成感興趣的核酸。參見，例如美國(guó)專利號(hào)5，380，831，將其通過(guò)引用并入本 文作為參考。變體以及片段本發(fā)明還包括所披露的CTP序列的片段的核酸分子?！捌巍笔侵冈揅TP序列的 一部分。核苷酸序列的片段可以是生物學(xué)活性的并且因此能夠有助于將感興趣的多肽轉(zhuǎn)運(yùn) 到植物的葉綠體中，或它可以是能夠使用以下披露的方法被用作雜交探針或PCR引物的片 段。確定是否這類片段具有CTP活性的測(cè)定法在本領(lǐng)域中是熟知的。是在此披露的編碼CTP的核苷酸序列的片段的核酸分子可以包含至少約90、100、 125、150、175、200、225、250、275、300個(gè)鄰接的核苷酸，或取決于想要的用途高達(dá)在此披露 的全長(zhǎng)CTP序列中的核苷酸數(shù)(例如對(duì)于SEQ ID NO :1為306個(gè)核苷酸)?！班徑拥摹焙塑?酸是指彼此緊接的核酸殘基。本發(fā)明的編碼CTP的序列的生物活性片段將編碼保留了活性 的CTP?！氨Ａ袅?CTP活性”是指該片段將指導(dǎo)至少約30%、至少約50%、至少約70%或至 少約80%的由感興趣的核苷酸序列編碼的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入葉綠體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在 此披露的編碼CTP的核苷酸序列的片段包含SEQ ID NO :1、2、4或6的一個(gè)或多個(gè)缺失，包 括高達(dá)約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約12、約15、約18、約21、約24、約 27、約30或更多個(gè)缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此披露的編碼CTP的核苷酸序列的片段 可以編碼包含SEQ ID NO :3、5或7的一個(gè)或多個(gè)缺失的氨基酸，包括高達(dá)約2、約3、約4、 約5、約6、約7、約8、約9、約10或更多個(gè)氨基酸缺失。可以通過(guò)分離本發(fā)明的CTP序列之一中的一部分并且對(duì)該CTP的該部分的活性進(jìn) 行評(píng)估來(lái)制備CTP的生物學(xué)活性部分。用于測(cè)量CTP活性的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。對(duì) 于適合的方法的實(shí)例參見名稱為“CTP活性的評(píng)估”的章節(jié)。還包括在此披露的編碼CTP的核苷酸序列或CTP氨基酸序列的變體?！白凅w”是指 十分相同的序列，或與天然葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽相差至少一個(gè)氨基酸的序列。本發(fā)明所包括的編 碼CTP的序列是與SEQ ID NO :1、2、4或6的核苷酸序列十分相同的。在此包括的CTP序列 是與SEQ ID NO :3、5或7的氨基酸序列十分相同的。“十分相同的”是指使用如在此描述的 比對(duì)程序與參照序列相比較，核苷酸序列具有至少約70 %或75 %、約80 %或85 %序列同一 性，約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此披露的變體包括SEQ ID NO :1、2、4或6的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或SEQ ID NO :3、5或7的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的核苷酸或氨基酸的替代、缺失、截短以及 插入，包括高達(dá)約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30或 更多個(gè)氨基酸替代、缺失或插入。通過(guò)使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)(例如以下描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交 技術(shù))可以鑒定天然存在的變體。變體核苷酸序列還包括合成地衍生的核苷酸序列，該合 成地衍生的核苷酸序列是例如通過(guò)使用位點(diǎn)定向誘變生成的，但它仍然具有如在此定義的 CTP活性。
本發(fā)明所包括的變體是生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)具有天然序列的所希望的生物 學(xué)活性，即保留了 CTP活性(即有助于所表達(dá)的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中)?！氨Ａ袅?CTP活性” 是指該變體將指導(dǎo)至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%的由感興趣的核苷 酸序列編碼的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中。用于測(cè)量CTP活性的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。對(duì)于 適合的方法的實(shí)例參見名稱為“CTP活性的評(píng)估”的章節(jié)。普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是可以將對(duì)CTP的改變通過(guò)突變引入到本發(fā)明 的編碼CTP的核苷酸序列中而不改變CTP的驅(qū)動(dòng)將多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的葉綠體中的能 力。因此，可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、添加或缺失至在此披露的相應(yīng)的核苷酸序 列中而生成分離的核酸分子的變體?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變以及PCR介導(dǎo)的誘 變)引入突變。本發(fā)明也包括這類變體核苷酸序列。作為替代方案，可以通過(guò)將突變隨機(jī)地沿該CTP序列的全部或部分進(jìn)行引入而制 備變體核苷酸序列(例如通過(guò)飽和誘變)，并且可以篩選得到的突變體的驅(qū)動(dòng)將可操作連 接的多肽序列轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的葉綠體中的能力?！翱刹僮鞯剡B接的”是指在調(diào)節(jié)元件(例如CTP)與第二序列之間的功能性連接， 其中該CTP序列指導(dǎo)將感興趣的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的葉綠體中?？傮w上，但并非總是如 此，可操作地連接是指被連接的核酸序列是鄰接的，并且根據(jù)需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)，從 而是鄰接的并且在同一個(gè)閱讀框內(nèi)。為了確定兩個(gè)核苷酸的同一性百分?jǐn)?shù)，為了最佳比較的目的將這些序列進(jìn)行比 對(duì)。兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是由這些序列所共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即同一 性百分?jǐn)?shù)=相同位置的數(shù)量/位置的總數(shù)量(例如，重疊位置)χ100)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 這兩個(gè)序列是具有相同長(zhǎng)度的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該比較是在參比序列的整體上進(jìn)行 的(例如，SEQ ID N0:l、2、4或6)?？梢允褂门c以下描述的那些類似的技術(shù)(允許或不允 許缺口)確定兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。在計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)時(shí)，一般計(jì)數(shù)精確的配 對(duì)?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)的確定。用于比較兩個(gè)序 列的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264 提出的，在 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中進(jìn) 行修改的算法。將這類算法結(jié)合到Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 403的BLASTN程 序中。使用BLASTN程序，得分=100，詞長(zhǎng)=12可以進(jìn)行BLAST核苷酸檢索從而得到與本 發(fā)明的序列同源的核苷酸序列。出于比較的目的為了得到有缺口的比對(duì)，可以如Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所述使用Gapped BLAST。作為替代方案，可以 使用PSI-Blast來(lái)進(jìn)行檢測(cè)分子間遠(yuǎn)近關(guān)系的重復(fù)檢索。參見以上Altschul等人(1997)。 當(dāng)使用BLAST、Gapped BLAST、以及PSI-Blast程序時(shí)，還可以使用這些對(duì)應(yīng)的程序(例如， BLASTN)的默認(rèn)的參數(shù)。參見，www. ncbi. nlm. nih. gov。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè) 非限制性實(shí)例是ClustalW算法(Higgins 等人(1994) Nucleic Acids Res. 22 4673-4680)。 Clustalff比較了序列并且與該DNA序列的整體進(jìn)行比對(duì)，并且因此可以提供關(guān)于該整體核 苷酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。將該ClustalW算法用于幾個(gè)可以商購(gòu)的DNA分析軟件包 中，例如載體NTi程序套件的ALIGNX模塊(Informax公司)。對(duì)于分析ClustalW比對(duì)有 用的軟件程序的非限制性的實(shí)例是GeneDoc 。Genedoc (Karl Nicholas)允許對(duì)多個(gè)基因之間DNA相似性以及同一性進(jìn)行評(píng)估。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)優(yōu)選的非限制 性實(shí)例是Myers和Miller (1988) CABIOS 4 :11_17的算法。將這類算法結(jié)合到ALIGN程序 (版本2.0)中，該程序是GCG序列比對(duì)軟件包(可以從美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥市9865 斯克蘭頓路 Accelrys 公司(Accelrys, Inc. , 9865Scranton Rd. , San Diego, California, USA)得到)的一部分。除非另行說(shuō)明，GAP版本 10(它使用 Needleman 和 Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48 (3) :443-453的算法)將被用于使用以下參數(shù)來(lái)確定序列同一性或相似性對(duì)于核 苷酸序列的％同一性和％相似性使用50的缺口權(quán)重和3的長(zhǎng)度權(quán)重，以及nwsgapdna. cmp 計(jì)分矩陣；對(duì)于氨基酸序列的％同一性或％相似性使用8的缺口權(quán)重以及2的長(zhǎng)度權(quán)重，以 及BL0SUM62計(jì)分程序。還可以使用等效的程序。“等效的程序”是指任何序列比較程序， 該程序?qū)τ谌魏蝺蓚€(gè)所討論的序列產(chǎn)生比對(duì)，當(dāng)與GAP版本10所產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)的比對(duì)相比較 時(shí)，該比對(duì)具有相同的核苷酸殘基配對(duì)以及相同的序列同一性百分?jǐn)?shù)。使用多種方法(例如，PCR、雜交等)可以鑒定來(lái)自其他生物、具體地其他藻類生物 的相應(yīng)的序列，例如具有與本發(fā)明的序列基本上同一性的序列。參見例如Sambrook J.和 Russell, D. W. (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) \)JsR Innis ^A (1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Academic Press，NY)。本發(fā)明包括通過(guò)它們與在此 列出的CTP序列的同一性所鑒定的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以基于鑒定已知包含CTP的序列來(lái)鑒定CTP。例如，可 以基于與在此披露的或本領(lǐng)域已知的靶向葉綠體的蛋白(例如乙酰乳酸合酶(AHAS)、小 亞基(SSU)、以及EPSPS)的相似性來(lái)鑒定靶向葉綠體的序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方 法來(lái)鑒定來(lái)自這些靶向蛋白的CTP序列。參見例如Emanuelsson和von Heijne (2001) Biochimica et Biophysica Acta 1541 :114_119 ;Nielson 等人(1997)Protein Eng. 10 1-6 ；以及，Nielson 和 Krogh(1998) Intell. Syst. Mol. Biol. 6 :122_130，將它們每一個(gè)通 過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。還可以得到多種計(jì)算機(jī)程序用于鑒定。參見， 例如ChloroP(它可以在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)地址www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/處找到)； Predotar(它可以在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)地址 www. inra. fr/Internet/Produits/Predotar/ 處找 到)；以及SignalP (它可以在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)地址www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/處找 到)。可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)中以擴(kuò)增相應(yīng)的來(lái)自感興趣的生物的cDNA 或基因組DNA的DNA序列。用于設(shè)計(jì)PCR引物以及PCR克隆的方法在本領(lǐng)域中是普遍已知 的并且披露于 Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)中。也參見 Innis 等 人編著(1990) PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York) ；Innis 禾口 Gelfand 編著(1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)； 以及 Innis 禾口 Gelfand 編著(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)。己 知的PCR方法包括但不限于使用配對(duì)引物、嵌套引物、單個(gè)的特異性引物、簡(jiǎn)并的引物、基 因特異性引物、載體特異性引物、以及部分錯(cuò)配的引物的方法。在雜交方法中，可以使用已知核苷酸序列的全部或部分來(lái)篩選cDNA或基因 組文庫(kù)。用于構(gòu)建這類cDNA或基因組文庫(kù)的方法在本領(lǐng)域中是普遍已知的并且在以上的 Sambrook和Russell，2001中進(jìn)行了披露。這些雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片 段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可檢出的基團(tuán)例如32P或任何其他可檢出的標(biāo)志 物例如其他的放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子進(jìn)行標(biāo)記?？梢曰谝阎脑诖伺?露的編碼CTP的序列或引物通過(guò)將合成的寡核苷酸標(biāo)記到已知的葉綠體靶向蛋白上來(lái)制 造用于雜交的探針?？梢粤硗獾厥褂没诤塑账嵝蛄兄斜Ｊ氐暮塑账崴O(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并的引 物。該探針一般地包含核苷酸序列的區(qū)域(該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交到本發(fā)明的 編碼CTP的序列的至少約12、至少約20、至少約25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125、 150、175、200、250、300、350或400個(gè)連續(xù)核苷酸上)、編碼葉綠體靶向蛋白的核苷酸序列或 其片段或變體。用于雜交的探針的制備在本領(lǐng)域中是普遍已知的并且在以上Sambrook和 Russell, 2001中進(jìn)行了披露，將其通過(guò)引用并入本文作為參考。 例如，可以將在此披露的編碼CTP的全長(zhǎng)序列(或?qū)τ谌~綠體靶向蛋白的編碼序 列)或其一個(gè)或多個(gè)部分用作能夠特異性地與相應(yīng)的CTP樣序列雜交的探針。為了實(shí)現(xiàn)在 多種條件下的特異性雜交，這類探針包括序列，所述序列是獨(dú)特的并且是至少約10個(gè)核苷 酸長(zhǎng)度或至少約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。可以通過(guò)PCR使用這類探針來(lái)擴(kuò)增相應(yīng)的來(lái)自所選擇的 生物的編碼CTP的序列?？梢允褂眠@種技術(shù)來(lái)從所希望的生物中分離另外的編碼序列，或 作為用于確定生物中存在編碼序列的診斷測(cè)定法。雜交技術(shù)包括雜交篩選鋪板的(plated) DNA文庫(kù)(或者是菌斑或者是集落；參見例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning A Laboratory Man ual (第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。在嚴(yán)格條件下可以進(jìn)行這類序列的雜交。“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格的雜交條件”是指 這些條件，在這些條件下與其他序列相比探針將與其目標(biāo)序列雜交達(dá)到可檢出的更大的程 度(例如，比背景高至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的環(huán)境中是不同的。 通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與該探針100 %互補(bǔ)的目標(biāo)序列(同源探 測(cè))。作為替代方案，可以對(duì)嚴(yán)格條件進(jìn)行調(diào)節(jié)以允許一些錯(cuò)配存在于序列中，從而檢測(cè)到 更低程度的相似性(異源探測(cè))。總體上，探針是小于約1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的，或小于500 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的。一般地，嚴(yán)格條件應(yīng)該是下面的那些，其中在pH 7. O至8. 3下鹽濃度是小于約 1. 5M Na離子，一般地約0. 01至1. OM Na離子濃度(或其他鹽類)并且對(duì)于短的探針(例 如10至50個(gè)核苷酸)溫度是至少約30°C并且對(duì)于長(zhǎng)的探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)是 至少約60°C。通過(guò)加入去穩(wěn)定試劑(例如，甲酰胺)也可以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。示例性的低嚴(yán) 格條件包括在37°C用30%至35%甲酰胺、IM NaCl、1 % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖液進(jìn) 行雜交，并且在50°C至55°C用IX至2X SSC (20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)進(jìn) 行洗滌。示例性的中等的嚴(yán)格條件包括在37°C在40%至45%甲酰胺、1.0M NaClU% SDS 中進(jìn)行雜交并且在55°C至60°C在0. 5X至IX SSC中進(jìn)行洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括 在37°C在50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中進(jìn)行雜交，并且在60°C至65°C在0. IX SSC中進(jìn) 行洗滌。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. 至約的SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間通常是小 于約24小時(shí)，通常是約4至約12小時(shí)。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. 至約的 SDS。
特異性一般地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵的因素是離子強(qiáng)度以及最終洗滌液的溫 度。對(duì)于 DNA-DNA 雜交，該 Tm 可以近似地是 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 267-284 =Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L 的方程式；其中 M 是一價(jià)陽(yáng)離子的體積摩爾濃度，% GC是DNA中鳥嘌呤核苷酸與胞嘧啶核苷酸的百分比，% form是該雜交溶液中甲酰胺的百分?jǐn)?shù)，并且L是堿基對(duì)雜交的長(zhǎng)度。Tm是溫度(在定義 的離子強(qiáng)度以及PH下)，在該溫度下50%的互補(bǔ)目標(biāo)序列雜交到完全配對(duì)的探針上。對(duì) 于每的錯(cuò)配Tm降低約1°C ；因此，可以對(duì)Tm、雜交條件和/或洗滌條件進(jìn)行調(diào)節(jié)從而雜 交到所希望的同一性的序列上。例如，如果尋找具有>90%同一性的序列，Tm可以被降低 10°C。總體上，選擇的嚴(yán)格條件是在定義的離子強(qiáng)度以及pH下比特定序列和其互補(bǔ)序列的 熱熔點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而，嚴(yán)格的嚴(yán)格條件下可以在比熱熔點(diǎn)(Tm)低1、2、3或4°C進(jìn)行 雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以在比熱熔點(diǎn)(Tm)低6、7、8、9或10°C進(jìn)行雜交和/或洗 滌；低嚴(yán)格條件可以在比熱熔點(diǎn)(Tffl)低11、12、13、14、15或20°C進(jìn)行雜交和/或洗滌。使 用該方程式、雜交以及洗滌組合物、以及所希望的Tm，普通的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是在雜交 和/或洗滌液的嚴(yán)格性方面的變化是被內(nèi)在的描述的。如果所希望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm低 于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，可以增加SSC濃度，從而可以使用更高的溫度。 對(duì)于核酸雜交的廣泛的指導(dǎo)見 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York) ； UR Ausubel ^AIS^ (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York)中。參見 Sambrook^A (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。本發(fā)明包括多種分離的序列，這些序列具有CTP活性并且在嚴(yán)格條件下與在此披 露的CTP序列雜交，或其片段。使用方法本發(fā)明的方法涉及在高等植物以及植物細(xì)胞中在本發(fā)明的CTP序列的控制下正 確表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)、以及加工葉綠體靶向的序列。為了本發(fā)明的目的，“經(jīng)加工的”葉綠體靶向的 蛋白是其中已經(jīng)去除CTP的蛋白。在將葉綠體靶向的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的葉綠體中時(shí)， 通過(guò)在CTP與成熟蛋白之間的特定“切割位點(diǎn)”進(jìn)行切割將CTP從靶向蛋白中去除。能夠 以實(shí)驗(yàn)確定該切割位點(diǎn)，或可以基于序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(例如，通過(guò)將未加工的蛋白與其 中切割位點(diǎn)是已知的葉綠體靶向的蛋白進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)分析序列中特征性CTP結(jié)構(gòu)域的存 在等)或通過(guò)使用一種或多種如在此其他地方所討論的用于切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)的算法(例如 SignalP)0 這些轉(zhuǎn)基因植物可以具有表型上的改變，包括但不限于改變的病原體或昆蟲防御 機(jī)制、對(duì)一種或多種除草劑增加的抗性、對(duì)耐受脅迫環(huán)境條件增加的能力、對(duì)于生產(chǎn)淀粉改 進(jìn)的能力、改進(jìn)水平的淀粉生產(chǎn)、改進(jìn)的油含量和/或組分、對(duì)于利用、分配和/或存儲(chǔ)氮的 改進(jìn)的能力等。這些結(jié)果可以通過(guò)將感興趣的多肽表達(dá)并且靶向到植物中的葉綠體中來(lái)實(shí) 現(xiàn)，其中該感興趣的多肽在葉綠體中發(fā)揮作用。本發(fā)明的CTP序列對(duì)于在高等植物中靶向 天然序列和異源(非天然)序列是有用的。為了本發(fā)明的目的，“高等植物”被認(rèn)為是有胚 植物亞界的成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，該植物是單子葉植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該植物是雙子葉植物。通常，將編碼本發(fā)明的CTP的核苷酸序列提供于具有感興趣的核苷酸序列的表達(dá) 盒中用于在感興趣的植物中進(jìn)行表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的編碼CTP的序列對(duì)于 提高天然序列在植物中的轉(zhuǎn)運(yùn)是有用的。在其他實(shí)施方案中，這些編碼CTP的序列對(duì)于表 達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)由異源核苷酸序列所編碼的多肽是有用的?！爱愒春塑账嵝蛄小笔侵高@樣的序列， 該序列沒(méi)有天然地可操作地與本發(fā)明的編碼CTP的序列連接，包括天然存在的DNA序列的 非天然存在的多個(gè)拷貝。當(dāng)該核苷酸序列對(duì)于編碼CTP的序列是異源的時(shí)，它對(duì)于植物宿 主可以是同源的或“天然的”或異源的或“外來(lái)的”。在一些情況下，經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物可以具有 表型上的改變。“異源的”通常是指核酸序列，這些核酸序列對(duì)于它們存在于其中的細(xì)胞或 天然基因組的部分不是內(nèi)源的，并且已經(jīng)通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔、微彈轟擊等被加 入到該細(xì)胞中。 可以將感興趣的任何核苷酸序列與本發(fā)明的編碼CTP的序列一起使用，只要由感 興趣的核苷酸序列編碼的多肽(即“感興趣的多肽”)在葉綠體中發(fā)揮作用。這類核苷酸 序列包括但不限于除草劑抗性編碼序列、殺蟲編碼序列、殺線蟲的編碼序列、抗微生物的編 碼序列、抗真菌的編碼序列、抗病毒的編碼序列、非生物和生物的脅迫抗性編碼序列或修飾 植物性狀例如產(chǎn)量、谷物品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物含量、淀粉質(zhì)與量、氮固定和/或利用、以及油含量和 /或組成的序列。對(duì)于本發(fā)明感興趣的更特定的基因包括但不限于提高作物產(chǎn)量的基因、 提高作物希求的基因、編碼提供對(duì)非生物脅迫(例如，干旱、溫度、鹽度、有毒金屬或痕量元 素)抗性的蛋白的基因，或提供對(duì)毒素(例如殺蟲劑或除草劑)或?qū)ι镄悦{迫(例如被 真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲、以及線蟲攻擊以及與這些生物相關(guān)的疾病的發(fā)展)抗性的那些基 因。應(yīng)當(dāng)理解的是可以將任何感興趣的基因可操作地連接到本發(fā)明的編碼CTP的序列上并 且在植物中進(jìn)行表達(dá)，只要由該基因所編碼的多肽在葉綠體中發(fā)揮作用。這些感興趣的核苷酸序列可以編碼參與提供疾病抗性或害蟲抗性的多種蛋白。 “疾病抗性”或“害蟲抗性”是指植物避免了有害的癥狀，這些癥狀是植物_病原體相互作 用的結(jié)果。疾病抗性基因以及昆蟲抗性基因(例如用于抗細(xì)菌保護(hù)的溶菌酶或天蠶素)或 多種蛋白(例如用于抗真菌保護(hù)的防御素、葡聚糖酶或甲殼酶)或用于控制線蟲或昆蟲的 蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素、蛋白酶抑制劑、膠原酶、凝集素或糖苷酶都是有用的基因產(chǎn)品的實(shí) 例。例如可以在www. nbiap. vt. edu/cfdocs/fieldtests2. cfm處找到感興趣的基因的實(shí) 例。“害蟲”包括但不限于昆蟲、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、螨、蜱等。昆蟲害蟲包括選自 以下目的昆蟲鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目 (L印idoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目 (Orthroptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目 (Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特別是鞘翅目、鱗翅目以及 雙翅目。病毒包括但不限于煙草花葉病毒或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒、壞死病毒、玉米矮花 葉病毒等。線蟲包括但不限于寄生性線蟲例如根結(jié)線蟲、孢囊線蟲、以及腐線蟲，包括胞囊 類線蟲(Heterodera spp)、根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp)、以及球形胞囊線蟲(Globodera spp)；特別是孢囊線蟲的成員，包括但不限于大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)；甜菜 胞囊線蟲(Heterodera schachtii)；禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)；以及馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯包囊線蟲(Globoderapailida)。腐線蟲包括但 不限于短體線蟲(Pratylenchus spp.)。真菌性害蟲包括引起葉銹病、黃銹病、條銹病以及 莖銹病的那些?！俺輨┛剐缘鞍住被驈摹熬幋a除草劑抗性的核酸分子”表達(dá)得到的蛋白包括以下 這些蛋白，與沒(méi)有表達(dá)該蛋白的細(xì)胞相比這些蛋白提供給細(xì)胞耐受更高濃度的除草劑的能 力，或與不表達(dá)該蛋白的細(xì)胞相比，提供耐受某一濃度的除草劑持續(xù)更長(zhǎng)一段時(shí)間的能力。 可以通過(guò)編碼對(duì)抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的除草劑特別是磺酰脲類除草劑具有抗性的基 因、編碼對(duì)抑制谷氨酰胺合酶的除草劑例如草胺膦(Phosphinothricin)或basta具有抗性 的基因(例如，bar基因)、對(duì)草甘膦(glyphosate)具有抗性的基因(例如EPSP合酶基因 和GAT基因) 或本領(lǐng)域中已知的其他這類基因?qū)⒊輨┛剐孕誀钜胫参镏?。提高作物產(chǎn)量的基因包括矮化基因，例如Rhtl和Rht2(Peng等人(1999)Nature 400 256-261)，以及增加植物生長(zhǎng)的基因，例如銨誘導(dǎo)的谷氨酸脫氫酶。提高作物希求的基 因包括例如允許植物具有減少的飽和脂肪含量的那些基因、提高植物的營(yíng)養(yǎng)值的那些基因 以及增加谷物蛋白的那些基因。提高鹽耐受性的基因是增加或允許植物在比植物的天然環(huán) 境更高的鹽度的環(huán)境中生長(zhǎng)的那些基因，其中已經(jīng)將一個(gè)或多個(gè)鹽耐受性基因引入到該植 物中。植物轉(zhuǎn)化載體一般地將植物表達(dá)盒插入到“植物轉(zhuǎn)化載體”中?！稗D(zhuǎn)化載體”是指DNA分子，該 DNA分子對(duì)于有效地轉(zhuǎn)化細(xì)胞是必要的。這類分子可以由一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒構(gòu)成，并且可 以被組織成一個(gè)以上的“載體” DNA分子。例如，二元載體是植物轉(zhuǎn)化載體，該載體利用兩 個(gè)非鄰近的DNA載體來(lái)編碼用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的所有必要的順式作用和反式作用功能團(tuán) (Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451)。“載體，，是指設(shè)計(jì) 的用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體”是指載體，該載體具有在外來(lái) 細(xì)胞中摻入、整合以及表達(dá)異源DNA序列或片段的能力?！耙搿笔侵敢赃@樣方式將該核苷 酸構(gòu)建體提供于有待轉(zhuǎn)化的生物中，即該構(gòu)建體得以進(jìn)入該生物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。該植物轉(zhuǎn)化載體可以包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需要的DNA載體。例 如，使用包括一個(gè)以上鄰近的DNA片段的植物轉(zhuǎn)化載體在本領(lǐng)域中是普通的實(shí)踐。在本領(lǐng) 域中這些載體通常被稱為‘二元載體’。二元載體以及具有輔助質(zhì)粒的載體被最通常地用于 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中對(duì)于實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化所需要的DNA片段的大小以及復(fù)雜度是相當(dāng)大 的，并且將多種功能團(tuán)分到分離的DNA分子上是有利的。二元載體一般地包含質(zhì)粒載體，該 質(zhì)粒載體包含對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列(例如，左邊界和右邊界)、被設(shè)計(jì)能 夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇性標(biāo)志物、以及“感興趣的基因”(設(shè)計(jì)的能夠在植物細(xì)胞中表 達(dá)的基因，對(duì)于該植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物是所希望的)。在該質(zhì)粒載體上還存在的是對(duì) 于細(xì)菌復(fù)制所需要的序列。將這些順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中并且在其中表達(dá)的方式進(jìn)行 排放。例如，將該選擇性標(biāo)志基因以及感興趣的基因置于左邊界與右邊界之間。通常第二質(zhì) 粒載體包含反式作用因子，這些反式作用因子介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。該 質(zhì)粒通常包含有毒力的功能團(tuán)(Vir基因)，如本領(lǐng)域中所理解的這些有毒力的功能團(tuán)允許 由農(nóng)桿菌屬感染植物細(xì)胞，并且通過(guò)在邊界序列處進(jìn)行切割轉(zhuǎn)移DNA以及vir介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science，5 :446_451)。幾種類型的 農(nóng)桿菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物轉(zhuǎn)化。該第二質(zhì)粒 載體對(duì)于通過(guò)其他方法(例如微彈轟擊、微注射、電穿孔、聚乙二醇等)轉(zhuǎn)化植物不是必要 的。植物 轉(zhuǎn)化本發(fā)明的方法涉及將核苷酸構(gòu)建體引入植物中?！耙搿笔侵敢赃@樣方式將該核 苷酸構(gòu)建體提供于該植物中，即該構(gòu)建體得以進(jìn)入該植物的細(xì)胞的內(nèi)部。本發(fā)明的方法不 要求使用用于將核苷酸構(gòu)建體引入植物中的特定的方法，只要該核苷酸構(gòu)建體得以進(jìn)入該 植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。用于將核苷酸構(gòu)建體引入植物中的方法是本領(lǐng)域中已知 的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法、以及病毒介導(dǎo)的方法?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中已知的幾種技術(shù)中的一種技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?！爸参铩笔?指整個(gè)植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚以及其后代。植物 細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì) 胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)。“轉(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化的植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或細(xì)胞或組 織是指具有摻入或整合到植物細(xì)胞中的外源核酸序列或DNA片段的植物?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”是指 被引入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合到該植物的基因組中并且能夠由其后代繼承。一般而言，植物轉(zhuǎn)化方法涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移到目標(biāo)植物細(xì)胞中(例如，未成熟的 或成熟的胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)，隨后使用最大閾值水平的適當(dāng) 選擇(取決于選擇性標(biāo)記基因)來(lái)從一組未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞物質(zhì)中回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。一般 地將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基上并且進(jìn)行常規(guī)地培養(yǎng)。隨后，在置于補(bǔ)充有最 大閾值水平的選擇試劑的再生培養(yǎng)基上之后這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被分化成嫩枝。然后將這些 嫩枝轉(zhuǎn)移到選擇性的生根培養(yǎng)基中用于回收生根的嫩枝或小植株。然后將轉(zhuǎn)基因的小植 株生長(zhǎng)成成熟的植物并且生產(chǎn)能育的種子(例如Hiei等人(1994) The Plant Journal 6 271-282 ；Ishida等人(1996)Nature Biotechnologyl4 745-750)。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的 技術(shù)以及方法的一般性描述見 Ayres 和 Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13 219-239 以及 Bommineni 和 Jauhar (1997)Maydica 42 107-120 中。因?yàn)樵撧D(zhuǎn)化的物質(zhì) 包含許多細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞兩者都存在于受試的目標(biāo)愈傷組織或組織或細(xì)胞群 的任何部分中。殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并且允許轉(zhuǎn)化的細(xì)胞繁殖的能力導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng) 物。通常地，去除未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力是對(duì)于快速回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞并且成功地生產(chǎn)轉(zhuǎn) 基因植物的限制?？梢允褂梅肿拥囊约吧姆椒▉?lái)證實(shí)整合的感興趣的異源基因存在于 轉(zhuǎn)基因植物的基因組中?？梢酝ㄟ^(guò)幾種方法中的一種方法來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，包括但不限于通過(guò)農(nóng) 桿菌將異源的DNA引入植物細(xì)胞中(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)，用粘合到粒子上的異源的外 來(lái)DNA轟擊植物細(xì)胞，以及多種其他的非粒子直接介導(dǎo)的方法(例如Hiei等人(1994) The Plant Journal 6 271-282 ；Ishida ^A (1996) Nature Biotechnology 14 745-750 ； Ayres 禾口 Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13 :219_239 ；Bommineni 禾口 Jauhar (1997)Maydica42 :107-120)來(lái)轉(zhuǎn)移 DNA。用于轉(zhuǎn)化葉綠體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Svab等人(1990) Proc. Natl. A cad. Sci. USA 87 8526-8530 ；Svab 禾口 Mal iga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917 ；Svab和Maliga (1993) EMBO J. 12 :601_606。該方法依賴于粒子槍遞送包含選擇 性標(biāo)志物的DNA并且通過(guò)同源重組將該DNA靶向到質(zhì)體基因組中。另外，通過(guò)組織偏好 地表達(dá)核編碼的并且質(zhì)體導(dǎo)向的RNA聚合酶通過(guò)反式激活沉默的質(zhì)體來(lái)源的轉(zhuǎn)基因可以 實(shí)現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化。這類系統(tǒng)已經(jīng)報(bào)告于McBride等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 7301-7305 中?？梢愿鶕?jù)常規(guī)方法將已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)成植物。參見例如McCormick等人 (1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以將這些植物進(jìn)行生長(zhǎng)，并且用同一轉(zhuǎn)化的 品系進(jìn)行授粉亦或用不同的品系進(jìn)行授粉，并且對(duì)得到的具有組成型表達(dá)所希望的表型特 征的雜交體進(jìn)行鑒定?？梢陨L(zhǎng)兩個(gè)或更多個(gè)世代來(lái)確保所希望 的表型特征的表達(dá)是被穩(wěn) 定地保持和遺傳的，并且然后收獲種子以確保所希望的表型特征的表達(dá)已經(jīng)被實(shí)現(xiàn)。以這 種方式，本發(fā)明提供了具有本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體(例如穩(wěn)定地?fù)饺肫浠蚪M中的本發(fā)明 的表達(dá)盒)的轉(zhuǎn)化種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)。植物本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何高等植物物種，包括但不限于單子葉植物以及雙子葉植 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此包括的CTP在單子葉植物和雙子葉植物兩者中都是有活性的。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該CTP僅在單子葉植物或僅在雙子葉植物中是有活性的。感興趣的 植物的實(shí)例包括但不局限于玉黍蜀(玉米)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡 椒、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、以及油菜籽油菜、蕓薹屬、苜猜、黑麥、 粟、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無(wú)花果、番石榴、 芒果、橄欖、番木瓜、腰果樹、澳洲堅(jiān)果樹、扁桃、燕麥、蔬菜、觀賞植物、以及松類。蔬菜包括但不局限于番茄、萵苣、青豆(green bean)、利馬豆、豌豆、以及甜瓜屬 (Curcumis)的成員如黃瓜、香瓜、以及甜瓜。觀賞植物包括但不局限于杜鵑花、八仙花、木 槿、玫瑰、郁金香、水仙花、喇叭花、康乃馨、猩猩木、以及菊花。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是作物 植物(例如玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜 菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜籽油菜等)。本發(fā)明特別適合用于單子葉植物科的任何成員，包括但不局限于玉米、稻、大麥、 燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、山藥、蔥頭、香蕉、椰子、以及棗椰樹。植物轉(zhuǎn)化的評(píng)估將異源的外來(lái)的DNA引入到植物細(xì)胞中之后，通過(guò)各種方法(例如與該整合的DNA 相關(guān)的核酸或蛋白以及代謝產(chǎn)物的分析)證實(shí)了植物基因組中異源DNA的轉(zhuǎn)化或整合。PCR分析是在移植到土壤中之前在早期階段用于篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或嫩枝檢 測(cè)整合的 DNA 的存在的快速的方法(Sambrook 和 Russell, 2001. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。 使用對(duì)感興趣的基因或農(nóng)桿菌載體背景等特異性的寡核苷酸引物實(shí)現(xiàn)PCR?？梢酝ㄟ^(guò)基因組DNA的DNA印跡分析來(lái)證實(shí)植物轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell， 2001，上述)?？傮w上，從該轉(zhuǎn)化體中提取總DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦高M(jìn)行消化，在瓊脂糖凝 膠中進(jìn)行分級(jí)并且轉(zhuǎn)到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用例如放射性標(biāo)記的32P目標(biāo)DNA片段 來(lái)探測(cè)該膜或“印跡”以證實(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)所引入到植物基因組中的DNA的整合(Sambrook 和 Russell，2001，上述)。
在RNA印跡分析中，從轉(zhuǎn)化體的特定組織中分離出RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中進(jìn)行 分級(jí)，根據(jù)本領(lǐng)域中常規(guī)地使用的標(biāo)準(zhǔn)步驟印跡到尼龍過(guò)濾器上(Sambrook和Russell， 2001，上述)。然后通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法通過(guò)將該過(guò)濾器與從異源基因衍生的放射性 探針進(jìn)行雜交來(lái)測(cè)試由可操作地連接到編碼CTP的序列上的異源基因所編碼的RNA的表達(dá) (Sambrook 和 Russell,2001,上述)。CTP活性的 評(píng)估用于確定本發(fā)明的CTP序列將感興趣的蛋白靶向到葉綠體中的有效性的測(cè)定法 已知的。參見，例如Mishkind等人(1985) J of Cell BiollOO :226_234，將它通過(guò)引用以 全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。將報(bào)告基因(例如葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移 酶(CAT)或綠色熒光蛋白(GFP))可操作地連接到該CTP序列上。將該融合物置于適合的 啟動(dòng)子的控制的后面，連接到轉(zhuǎn)化載體中，并且轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中。在表達(dá)和定位于 葉綠體中足夠的時(shí)間期間之后，對(duì)葉綠體組分進(jìn)行提取并且進(jìn)行報(bào)告基因活性測(cè)定?？梢?將該分離的序列的靶向以及遞送報(bào)告基因蛋白到葉綠體中的能力與其他已知的CTP序列 進(jìn)行比較。參見 de Castro Silva Filho 等人(1996)Plant Mol. Biol. 30 :769_780。通過(guò) 將蛋白酶加入到該分離的葉綠體部分中還可以體外證實(shí)蛋白導(dǎo)入。被成功地導(dǎo)入葉綠體中 的蛋白是對(duì)外部加入的蛋白酶耐受的，然而，胞質(zhì)溶膠中保留的蛋白是對(duì)消化敏感的。通過(guò) 使用標(biāo)準(zhǔn)的分子技術(shù)來(lái)檢測(cè)葉綠體中功能性蛋白的存在，或通過(guò)對(duì)從葉綠體靶向的蛋白的 表達(dá)所得到的表型進(jìn)行評(píng)估，也可以證實(shí)蛋白導(dǎo)入。以下實(shí)施例是通過(guò)說(shuō)明的方式但不是通過(guò)限制的方式來(lái)提供的。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1衣藻AHAS CTP。通過(guò)將全長(zhǎng)的衣藻AHAS ( "ChIamyAHAS")肽(GENBANK 登錄號(hào) AF022816 ；SEQ ID NO 8)與來(lái)自植物、細(xì)菌、酵母以及真菌的幾種AHAS肽進(jìn)行比較鑒定出衣藻AHAS CTP (SEQ ID NO :3)。該比對(duì)顯示ChlamyAHAS CTP顯示了與植物CTP非常小的序列保守性，然而，成 熟蛋白顯示了多個(gè)保守的元件。因此，通過(guò)將多個(gè)AHAS蛋白與該ChlamyAHAS蛋白進(jìn)行比 較，可以推斷出衣藻AHAS蛋白的氨基酸1-99包含該CTP。對(duì)于該CTP在導(dǎo)入到衣藻葉綠體 中時(shí)所預(yù)測(cè)的加工位點(diǎn)是SEQ ID NO 8的近似地氨基酸92處。實(shí)施例2衣藻RuBisCo小亞基(SSU) CTP。通過(guò)將全長(zhǎng)的衣藻SSU (“ ChIamySSU”)肽(GENBANK 登錄號(hào) CAA28160 ； SEQ ID NO 9)與幾種植物RuBisCo小亞基肽進(jìn)行比較鑒定出衣藻SSU CTP(SEQ ID NO :5)。該比對(duì)顯 示ChlamySSU CTP顯示了與植物CTP非常小的序列保守性，然而，成熟蛋白顯示了多個(gè)保守 的元件。因此，通過(guò)將幾種植物RuBisCo蛋白的已知的加工位點(diǎn)與該ChlamySSU蛋白進(jìn)行 比較，可以推斷出該衣藻SSU蛋白(SEQ ID NO 9)的氨基酸1_45包含該CTP。已經(jīng)經(jīng)驗(yàn)地確定衣藻RuBisCO小亞基前體(“ChlamySSU”)的切割位點(diǎn)為SEQ ID NO :9 的殘基 44 與 45 之間(Schmidt 等人 1979，Journal of Cell Biology 83 :615_662)。實(shí)施例3衣藻EPSPS CTP通過(guò)將全長(zhǎng)的衣藻EPSPS 肽(GENBANK 登錄號(hào) XP_001702942 ；SEQID NO 10)與 幾種植物以及細(xì)菌的EPSPS進(jìn)行比較鑒定出衣藻EPSPSCTP(SEQ ID NO :7)。該比對(duì)顯示 ChlamyEPSPS CTP顯示了與植物CTP非常小的序列保守性，然而，成熟蛋白顯示了多個(gè)保守的元件。因此，通過(guò)將幾種EPSPS蛋白與該ChlamyEPSPS蛋白進(jìn)行比較，可以推斷出該衣藻 EPSPS蛋白(SEQ ID NO=IO)的氨基酸1_75包含該CTP。對(duì)于該CTP在導(dǎo)入到衣藻葉綠體 中時(shí)所預(yù)測(cè)的加工位點(diǎn)是SEQ ID NO: 10的近似地氨基酸61處。表1.衣藻 CTP
用于CTP的 *自SEQ ID NO:前體蛋白的殘基
ChlamyAHAS__8__1-99__92_
氛基酸44或
chlam^su9__“5■酸 45
ChlamyEPSPS101-7561實(shí)施例4使用用于蛋白靶向的衣藻CTP的DNA構(gòu)建體利用該衣藻CTP (包括衣藻AHAS CTP、衣藻SSU CTP或衣藻EPSPSCTP)來(lái)生成用 于將蛋白靶向葉綠體的多個(gè)構(gòu)建體的DNA元件可以涉及包含多個(gè)方便的限制性內(nèi)切核酸 酶識(shí)別位點(diǎn)(例如，Bam HI限制性位點(diǎn))以及該葉綠體CTP與蛋白之間的小肽接頭(例如 Gly-Ser-Gly三肽CTP ；SEQ ID NO 18)。此外，能夠?qū)⑦@類DNA元件以方式進(jìn)行設(shè)計(jì)以及合 成地制造，即該DNA序列與初始DNA是不同的，但是編碼相同的肽。作為替代方案，人們可以設(shè)計(jì)多種DNA構(gòu)建體從而不需要限制性酶切位點(diǎn)，并且 通過(guò)全合成該結(jié)合編碼區(qū)或通過(guò)基于PCR的策略(包括“sewing PCR”等)可以實(shí)現(xiàn)CTP/ 蛋白融合物。人們還能夠以一種方式設(shè)計(jì)CTP/蛋白融合物，其中兩個(gè)蛋白之一中的一些氨基 酸被截短了。例如，人們能夠從細(xì)菌表達(dá)的蛋白的N端去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，但仍然實(shí)現(xiàn) 與衣藻CTP的功能性融合。設(shè)計(jì)了盒子，該盒子包含合成地設(shè)計(jì)的對(duì)衣藻AHAS CTP進(jìn)行編碼的DNA序列，該 序列摻入了 BamHI限制性位點(diǎn)和Gly-Ser-Gly接頭。這些DNA構(gòu)建體包含(從5’至3’) (I)Pst I克隆位點(diǎn)，(2)提供用于有效翻譯的“Kozak”環(huán)境的堿基ACC，(3)對(duì)氨基末端蛋 氨酸至ChlamyAHAS的已知轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行編碼的基因部分，并且包括對(duì)C端至切割位 點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行編碼的小的DNA區(qū)域，(4)對(duì)具有植入的BamH I克隆位點(diǎn)的Gly-Ser-Gly 殘基進(jìn)行編碼的DNA堿基，以及(5)感興趣的基因的編碼區(qū)。設(shè)計(jì)了盒子，該盒子包含合成地設(shè)計(jì)的對(duì)衣藻SSU CTP進(jìn)行編碼的DNA序列，該序 列摻入了 BamHI限制性位點(diǎn)和Gly-Ser-Gly接頭。這些DNA構(gòu)建體包含(從5’至3’)(1) Pst I克隆位點(diǎn)，(2)提供用于有效翻譯的“Kozak”環(huán)境的堿基ACC，(3)對(duì)氨基末端蛋氨酸 至ChlamySSU的已知轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行編碼的基因部分，并且包括對(duì)C端至切割位點(diǎn)的 氨基酸進(jìn)行編碼的小的DNA區(qū)域，(4)對(duì)具有植入的BamH I克隆位點(diǎn)的Gly-Ser-Gly殘基 進(jìn)行編碼的DNA堿基，以及(5)感興趣的基因的編碼區(qū)。設(shè)計(jì)了盒子，該盒子包含合成地設(shè)計(jì)的對(duì)衣藻EPSPS CTP進(jìn)行編碼的DNA序列，該 序列摻入了 BamHI限制性位點(diǎn)和Gly-Ser-Gly接頭。這些DNA構(gòu)建體包含(從5’至3’(I)PstI克隆位點(diǎn)，(2)提供用于有效翻譯的“Kozak”環(huán)境的堿基ACC，(3)對(duì)氨基末端蛋氨 酸至ChlamyEPSPS的已知轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行編碼的基因部分，并且包括對(duì)C端至切割位 點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行編碼的小的DNA區(qū)域，(4)對(duì)具有植入的BamH I克隆位點(diǎn)的Gly-Ser-Gly 殘基進(jìn)行編碼的DNA堿基，以及(5)感興趣的基因的編碼區(qū)。 實(shí)施例5將來(lái)自非棺物物種的轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合到異源蛋白上，并目.在單子葉棺物中IH 確地定位并目.切割在單子葉棺物中衣藻AHAS CTP起作用。設(shè)計(jì)了多種DNA構(gòu)建體從而使得到的蛋白在N端編碼該衣藻AHAS轉(zhuǎn)運(yùn)肽 (“ChlamyAHAS”)，隨后將蛋白融合到對(duì)細(xì)胞提供除草劑抗性的基因上(GRG-1 ；美國(guó)專利號(hào) 7，405，347)。對(duì)于ChlamyAHAS前體，通過(guò)將蛋白序列與來(lái)自細(xì)菌、真菌以及酵母的ALS蛋 白進(jìn)行比對(duì)推斷出這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)。這些DNA構(gòu)建體包含(從5’至3’)(I)Pst I克隆位點(diǎn)，(2)提供用于有效翻譯 的“Kozak”環(huán)境的堿基ACC，(3)對(duì)氨基末端蛋氨酸至ChlamyAHAS CTP的已知轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割 位點(diǎn)進(jìn)行編碼的基因部分，并且包括對(duì)C端至切割位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行編碼的小的DNA區(qū)域， (4)對(duì)具有植入的BamH I克隆位點(diǎn)的Gly-Ser-Gly殘基進(jìn)行編碼的DNA堿基，以及(5)感 興趣的基因(在這個(gè)情況下是GRG-1)的編碼區(qū)。這些DNA分子是合成制造的(Menlo Park, CA的DNA 2. 0)。提供了包含該構(gòu)建體 的區(qū)域的DNA序列，為SEQ ID NO 11，并且提供了生成的氨基酸序列，為SEQ ID N0:12。制造了對(duì)照構(gòu)建體(pAG250)，該構(gòu)建體包含從TrpPr05啟動(dòng)子表達(dá)的GRG-1，其中 該GRG-I蛋白不具有葉綠體CTP。將這種無(wú)CTP/GRG-1構(gòu)建體設(shè)計(jì)到用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米胚的轉(zhuǎn)化的載體中，并 且生成包含這種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植物。通過(guò)PCR分析這些Ttl轉(zhuǎn)化的植物以確定該構(gòu) 建體存在于這些玉米系中，并且然后將這些Ttl植物與非轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行異型雜交從而生成半 合子的T1子代。得到的T1轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)大量的GRG-I蛋白。但是，用PAG250轉(zhuǎn)化的以 及非定位地表達(dá)GRG-I的植物是對(duì)草甘膦不耐受的。將藻類CTP ChlamyAHAS/GRG-1構(gòu)建體設(shè)計(jì)到用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米胚的轉(zhuǎn)化的 載體中，并且生成包含這種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植物。通過(guò)PCR分析這些Ttl轉(zhuǎn)化的植物以確定該構(gòu)建體存在于這些玉米系中，并且然后 將這些Ttl植物與非轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行異型雜交從而生成半合子的T1子代。得到的T1轉(zhuǎn)基因植 物對(duì)于噴射施用的草甘膦是耐受的(與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照進(jìn)行比較)。來(lái)自轉(zhuǎn)基因玉米植物的葉組織的蛋白質(zhì)印跡顯示這些植物表達(dá)GRG-I蛋白。此 夕卜，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡鑒定的蛋白的大小與將該蛋白導(dǎo)入葉綠體中，并且在或鄰近切割位點(diǎn) 處對(duì)ChlamyAHAS/GRG-Ι蛋白進(jìn)行加工的情況一致。因此，該ChlamyAHAS CTP足以將GRG-I靶向到玉米葉綠體，并且導(dǎo)致表型(除草 劑抗性)，在缺少靶向到該葉綠體時(shí)該表型不被GRG-I所提供。^MM 6
確地定位和切割在單子葉棺物中衣藻SSU CTP起作用為了測(cè)試是否藻類的葉綠體CTP可以在單子葉植物中起作用，生成了多個(gè)轉(zhuǎn)基因 單子葉植物并且通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)藻類CTP的表達(dá)以及切割進(jìn)行評(píng)估。設(shè)計(jì)了多個(gè)DNA構(gòu)建體從而使得到的蛋白在N端編碼藻類的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，融合到對(duì)細(xì)胞提供除草劑抗性的蛋白上(在這個(gè)情況下是GRG-8蛋白；美國(guó)專利
發(fā)明者P·E·漢默, T·K·辛森, V·貝林松 申請(qǐng)人:阿森尼克斯公司