專利名稱：：植物谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶基因以及攜帶該基因的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法植物谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶基因以及攜帶該基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)基于聯(lián)邦資助的研究或項(xiàng)目而進(jìn)行的發(fā)明的權(quán)利的聲明本發(fā)明是在政府的支持下，根據(jù)由美國(guó)能源部授予加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)的合同NO.W-7405-ENG-36以及美國(guó)能源部授予LosAlamosNationalSecurity，LLC的合同NO.DE-AC52-06NA25396而進(jìn)行的。政府對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)利。相關(guān)專利申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2008年8月四日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO.61/190，581的權(quán)利要求。
背景技術(shù)：
：隨著全世界人口的增加以及可供利用的農(nóng)場(chǎng)不斷受到破壞或以其它方式受損，對(duì)更有效和可持續(xù)性的農(nóng)業(yè)體系的需求已經(jīng)成為人種的首要關(guān)注點(diǎn)。提高農(nóng)作物產(chǎn)率、蛋白含量和植物生長(zhǎng)速率代表了開發(fā)能夠更有效地應(yīng)對(duì)所面臨的挑戰(zhàn)的農(nóng)業(yè)體系的主要目標(biāo)。近年來，隨著許多發(fā)育良好的農(nóng)作物已經(jīng)趨于瓶頸，經(jīng)改善的農(nóng)作物生產(chǎn)技術(shù)的重要性得到提高。許多農(nóng)業(yè)活動(dòng)都是時(shí)間敏感的，并且成本和回收取決于農(nóng)作物的快速周轉(zhuǎn)以及投入市場(chǎng)的時(shí)間。因此，植物快速生長(zhǎng)是許多農(nóng)業(yè)商業(yè)的經(jīng)濟(jì)重要的目標(biāo)，所述農(nóng)業(yè)商業(yè)涉及高價(jià)值的農(nóng)作物，如谷物、蔬菜、漿果和其它水果?；蚬こ淘陂_發(fā)可持續(xù)農(nóng)業(yè)技術(shù)中已經(jīng)并且繼續(xù)起到重要的作用，但是仍有爭(zhēng)議。近年來，已經(jīng)開發(fā)了大量的基因修飾的植物和相關(guān)技術(shù)，其中許多技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用(資料:GeneticallyModifiedCropsintheUnitedStates，PewInitiativeonFoodandBiotechnology，2004年8月，(pewagbiotech.org/resources/factsheets)0所采用的轉(zhuǎn)基因植物品種目前非常巨大，并且繼續(xù)增加，其中2006年有25000萬(wàn)英畝土地種植有轉(zhuǎn)基因植物。雖然轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的認(rèn)可度可能逐步增加(特別是在美國(guó)、加拿大和澳大利亞)，但是世界上的很多地區(qū)在農(nóng)業(yè)中采用基因修飾的植物仍然緩慢(特別是歐洲)。因此，為了致力于可靠并且可持續(xù)性的農(nóng)業(yè)的目標(biāo)，強(qiáng)烈期望開發(fā)這樣的轉(zhuǎn)基因植物，其不會(huì)將毒素和/或可能有害的物質(zhì)引入到植物和/或環(huán)境中。還強(qiáng)烈期望最大程度地降低實(shí)現(xiàn)諸如改善滅草劑耐抗性、害蟲和疾病耐抗性以及農(nóng)作物的總產(chǎn)率等目標(biāo)的成本。因此仍然需要能夠?qū)崿F(xiàn)這些目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因植物。已經(jīng)通過對(duì)各種植物調(diào)節(jié)體系的大量研究而致力于植物快速生長(zhǎng)的目標(biāo)，其中許多植物調(diào)節(jié)體系仍然未被徹底理解。特別是，使得碳代謝和氮代謝的植物調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。據(jù)估計(jì)這些調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)展具有實(shí)質(zhì)性影響。在光合有機(jī)體中，碳和氮的代謝必須以協(xié)調(diào)的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，以確保植物源和能量的充分利用。目前對(duì)碳和氮機(jī)制的理解包括作為較大體系的子體系的某些步驟和代謝途徑的詳細(xì)情況。在光合成有機(jī)體中，碳代謝以(X)2固定開始，然后通過被稱為C-3和C-4代謝的兩個(gè)主要過程繼續(xù)進(jìn)行。在具有C-3代謝的植物中，核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisC0)催化(X)2與二磷酸核酮糖的組合，以產(chǎn)生3-磷酸甘油酸酯，該3-磷酸甘油酸酯為植物利用其來合成含碳化合物的三碳化合物(C-3)。在具有C-4代謝的植物中，CO2在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)中與磷酸烯醇丙酮酸結(jié)合，以形成含有4碳(C-4)的酸。酸被轉(zhuǎn)移至維管束鞘細(xì)胞，在那里酸發(fā)生脫羧反應(yīng)，以釋放CO2，然后CO2在由C-3植物所采用的相同反應(yīng)中與核酮糖雙磷酸酯結(jié)合。許多研究發(fā)現(xiàn)各種代謝物對(duì)于植物調(diào)節(jié)氮代謝是重要的。這些化合物包括有機(jī)酸-蘋果酸酯以及氨基酸-谷氨酸和谷氨酰胺。氮借助于酶-谷氨酰胺合成酶(GQ的作用由光合成有機(jī)體分泌，所述谷氨酰胺合成酶催化氨與谷氨酸的組合，以形成谷氨酰胺。GS在通過在ATP依賴反應(yīng)中催化氨添加至谷氨酸上以形成谷氨酰胺，從而在植物分泌氮時(shí)起到重要作用(Miflin禾口Habash,2002,JournalofExperimentalBotany,Vol.53,No.370,第979-987頁(yè))。GS還由于光呼吸作用與蛋白和氮輸送化合物的分解而重新分泌所釋放的氨。GS酶可被分為兩種常規(guī)類別，一種代表細(xì)胞質(zhì)形式(GSl)，并且另一種代表質(zhì)體(即葉綠素)形式(GS2)。以前的報(bào)導(dǎo)已經(jīng)證明，GSl的表達(dá)水平增加使得GS活性和植物生長(zhǎng)的水平增加，但是報(bào)導(dǎo)并不一致。例如，F(xiàn)uentes等報(bào)導(dǎo)，CaMVS35啟動(dòng)子促使紫花苜蓿GSl(細(xì)胞質(zhì)形式)在煙草中過度表達(dá)，從而使得葉子組織中的GS表達(dá)水平和GS活性增加，在氮貧乏條件下的生長(zhǎng)增強(qiáng)，但是卻對(duì)在最優(yōu)氮肥條件下的生長(zhǎng)沒有效果(Fuentes等，2001，J.Exp.Botany52:1071-8)。Temple等報(bào)導(dǎo)，過度表達(dá)全長(zhǎng)紫花苜蓿GSl編碼序列的轉(zhuǎn)基因煙草植物含有水平顯著升高的GS轉(zhuǎn)錄體，以及組裝成活性酶的GS多肽，但是卻沒有報(bào)導(dǎo)其對(duì)生長(zhǎng)的效果(Temple等，1993，MolecularandGeneralGenetics236:315-325)。Corruzi等已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在CaMVS35啟動(dòng)子的控制下過度表達(dá)豌豆細(xì)胞溶質(zhì)GSl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因煙草顯示出增加的GS活性、增加的細(xì)胞溶質(zhì)GS蛋白和改善的生長(zhǎng)特性(美國(guó)專利N0.6，107，547)。Unkefer等最近報(bào)導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在葉子組織中過度表達(dá)紫花苜蓿GSl的轉(zhuǎn)基因煙草植物在其葉子部分產(chǎn)生增多的2-羥基-5-氧脯氨酸水平，發(fā)現(xiàn)與野生型煙草植物相比，這會(huì)使得生長(zhǎng)速率顯著增加，其中所述轉(zhuǎn)基因煙草植物通過自體受精進(jìn)行基因分離，然后篩選其增強(qiáng)的葉至根的GS活性，從而使得GSl轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)增多(參見美國(guó)專利No.6，555，500,6,593，275和6，831，040)。Unkefer等還記載了采用2-羥基-5-氧脯氨酸(也稱為2_氧戊二酸酰胺)來改善植物生長(zhǎng)(美國(guó)專利No.6，555，500,6.593，275,6,831，040)。特別是，Unkefer等公開了2-羥基-5-氧脯氨酸在葉子組織中的濃度增加(相對(duì)于根組織而言)引發(fā)一系列事件，其使得植物生長(zhǎng)特性增強(qiáng)。Unkefer等記載了這樣的方法，通過該方法可以使得2-羥基-5-氧脯氨酸的葉子內(nèi)濃度增多，以便促使植物生長(zhǎng)特性增強(qiáng)，具體而言，這是通過將2-羥基-5-氧脯氨酸的溶液直接施加到植物的葉子部分、并且在葉子組織內(nèi)優(yōu)先過度表達(dá)谷氨酰胺合成酶而實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)在動(dòng)物肝臟和腎臟組織中確認(rèn)了多種轉(zhuǎn)氨酶和水解酶，已知這些酶在動(dòng)物內(nèi)參與2-羥基-5-氧脯氨酸的合成(Cooper和Meister，1977，CRCCriticalReviewsinBiochemistry，第281-303頁(yè)；Meister，1952，J.Biochem.197:304)。在植物中，2-羥基-5-氧脯氨酸的生物化學(xué)合成是已知的，但是尚未充分表征。此外，2-羥基-5-氧脯氨酸在植物內(nèi)的功能及其池大小(組織濃度)是未知的。最后，本領(lǐng)域?qū)τ诰烤乖谥参飪?nèi)可能存在何種轉(zhuǎn)氨酶或水解酶并且/或者何種轉(zhuǎn)氨酶或水解酶對(duì)催化2-羥基-5-氧脯氨酸的合成具有活性沒有具體的指導(dǎo)，并且尚未報(bào)導(dǎo)、分離或表征這樣的轉(zhuǎn)氨酶。5發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物以及產(chǎn)生生長(zhǎng)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出提高的生長(zhǎng)速率、種子和果實(shí)產(chǎn)率和總生物量產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了被修飾為過度表達(dá)谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的轉(zhuǎn)基因植物。通常，這些植物的生長(zhǎng)超過其野生型相應(yīng)部分約50%。申請(qǐng)人:已經(jīng)確認(rèn)酶谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)作為植物內(nèi)2-羥基-5-氧脯氨酸(2-氧戊二酸酰胺)合成的催化劑。2-氧戊二酸酰胺為強(qiáng)有效的信號(hào)代謝物，其調(diào)節(jié)參與光合機(jī)構(gòu)、碳固定和氮代謝的大量基因的功能。通過優(yōu)先增加信號(hào)代謝物2-氧戊二酸酰胺的濃度(即在葉子組織內(nèi))，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物能夠在較短的時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生較高的總產(chǎn)率，因此可以提供在寬泛的農(nóng)作物中都具有增加的生產(chǎn)率的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。重要的是，與迄今已經(jīng)記載的許多植物不同，本發(fā)明利用了編碼天然植物酶的天然植物基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性基本上是通過向植物中引入附加的GPT容量而實(shí)現(xiàn)的。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物不會(huì)表達(dá)任何毒性物質(zhì)、生長(zhǎng)激素、病毒或細(xì)菌基因產(chǎn)物，因此不會(huì)產(chǎn)生目前妨礙轉(zhuǎn)基因植物在世界的某些地區(qū)應(yīng)用的問題。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含GPT轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述GPT轉(zhuǎn)基因可操作地連接植物啟動(dòng)子。在具體的實(shí)施方案中，所述GPT轉(zhuǎn)基因編碼具有選自由以下序列組成的組中的氨基酸序列的多肽，并且具有GPT活性，其中所述序列為(a)SEQIDNO2,SEQIDNO:9,SEQIDNO:15,SEQIDNO:19,SEQIDNO:21、SEQIDNO24,SEQIDNO:30,SEQIDN0:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO36；以及(b)與SEQIDNO:2、SEQIDNO:9、SEQIDNO:15,SEQIDNO:19,SEQIDNO21、SEQIDNO24、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36中的任一者具有至少75%—致性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因引入植物的基因組中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以為單子葉或雙子葉植物。本發(fā)明還提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的任意代次的后代，其中所述后代包含GPT轉(zhuǎn)基因；以及本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的任意代次的種子，其中所述種子包含GPT轉(zhuǎn)基因。與相似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以顯示出一種或多種增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性，其包括(但不限于)提高的生長(zhǎng)速率、生物量產(chǎn)率、種子產(chǎn)率、花朵或花苞產(chǎn)率、果實(shí)或莢果產(chǎn)率、較大的葉子，并且還可以顯示出提高的GPT活性水平和/或提高的2-氧戊二酸酰胺水平。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物顯示出提高的氮利用效率。本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物及其種子的方法，包括生產(chǎn)以下植物的方法，其中相對(duì)于類似野生型或未轉(zhuǎn)化的植物而言，所述具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)性能、提高的氮利用效率以及對(duì)在鹽或鹽水條件下的發(fā)芽或生長(zhǎng)耐受性增加。附圖簡(jiǎn)要說明圖1.氮同化作用和2-氧戊二酸酰胺生物合成代謝途徑的示意圖。圖2示出過度表達(dá)GPT的轉(zhuǎn)基因煙草植物與野生型煙草植物的比較結(jié)果的照片。從右側(cè)至左側(cè)分別為野生型植物、紫花苜蓿GSl轉(zhuǎn)基因、擬南芥GPT轉(zhuǎn)基因。參見以下的實(shí)施例3。圖3示出過度表達(dá)GPT的轉(zhuǎn)基因小湯姆番茄植物與野生型番茄植物的比較結(jié)果的照片。(A)野生型植物；(B)擬南芥GPT轉(zhuǎn)基因。參見以下的實(shí)施例4。圖4示出野生型煙草植物(上部葉子)與GPT轉(zhuǎn)基因煙草植物(底部葉子)之間的葉子尺寸的比較結(jié)果的照片。發(fā)明詳述定義除非另外限定，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)、符號(hào)和其它科學(xué)術(shù)語(yǔ)都旨在具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的含義。在一些情況下，為了清楚和/或準(zhǔn)備引用的目的，在本文中對(duì)具有通常理解的含義的術(shù)語(yǔ)進(jìn)行了定義，并且在本文中引入這些定義不應(yīng)被解釋為表示與本領(lǐng)域通常理解的含義具有實(shí)質(zhì)性區(qū)別。本文所描述或引用的技術(shù)和過程一般容易理解，并且通常由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員采用常規(guī)的方法進(jìn)行使用，例如，在以下文獻(xiàn)中所述的廣泛利用的分子克隆方法，所述文獻(xiàn)為=Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual第三片反(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.；CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausbel等，eds.,JohnWiley&Sons公β],2001；TransgenicPlants:MethodsandProtocols(LeandroPena,ed.，HumanaPress,一2004)；禾口AgrobacteriumProtocols(Wan,ed.,HumanaPress，^!二版，2006)。除非指定，否則適當(dāng)時(shí)，涉及利用市售可得的試劑盒和試劑的過程通常根據(jù)制造商限定的規(guī)程和/或參數(shù)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指單股形式或雙股形式的脫氧核苷酸或核糖核酸及其聚合物(“多核苷酸”)。除非具體限定，否則術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述天然核苷酸具有與參引核酸類似的結(jié)合特性，并且以類似于天然存在的核苷酸的方式代謝。除非另外指定，否則特定的核算序列還隱含包括其保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列以及所明確指定的序列。具體而言，可以通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)所選(或全部)密碼子的第三位置被混合堿和/或脫氧肌苷殘基置換的序列實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子置換(Batzer等，1991，NucleicRes.19:5081；Ohtsuka等，1985J.Biol.Chem.2602605-2608；禾口Cassol等，1992；Rossolini等，1994，MoI.Cell.Probes8:91-98)。術(shù)語(yǔ)核酸可以與基因、基因編碼的cDNA和mRNA交換使用。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指用于指導(dǎo)可操作連接的核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列的陣列。如本文所用，“植物啟動(dòng)子”是在植物中起作用的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子包括在轉(zhuǎn)錄的開始位點(diǎn)附近的必需的核酸，如在聚合酶II型啟動(dòng)子的情況下，其為TATA元件。啟動(dòng)子還可任選地包括遠(yuǎn)側(cè)增強(qiáng)子或抑制子元件，其可以與轉(zhuǎn)錄的開始位點(diǎn)相距數(shù)千個(gè)堿基對(duì)?！敖M成型”啟動(dòng)子為在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下激活的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子為在環(huán)境或發(fā)育條件下激活的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”是指核酸表達(dá)控制序列和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換地用于表示氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及氨基酸類似物和以天然存在氨基酸相似的方式起作用的氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基7酸以及之后經(jīng)修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即與氫結(jié)合的α-碳、羧基、氨基和R基團(tuán))的化合物，例如，高絲氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亞砜，蛋氨酸甲基锍。這些類似物具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或者經(jīng)修飾的肽骨架。但是保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、但是卻以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以以其通常已知的三字母符號(hào)或者由IUPAC-IUB生物化學(xué)體系命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)進(jìn)行引用。同樣，核苷酸可以以其通常接受的單字母編碼進(jìn)行引用。術(shù)語(yǔ)“植物”包括完整的植物、植物器官(例如，葉子、干部、花、根部等)，種子和植物細(xì)胞及其后代。在本發(fā)明的方法中可以使用的植物的類別通常寬泛地包括可接受轉(zhuǎn)化技術(shù)的更高級(jí)的植物，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)以及裸子植物。其包括各種倍性水平(包括多倍性、二倍性、單倍性和半合子)的植物。術(shù)語(yǔ)“GPT多核苷酸”和“GPT核酸”可以在本文中互換使用，并且可以指編碼參與催化2-氧戊二酸酰胺的合成的多肽的基因的全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)多核苷酸，其包括既含有被轉(zhuǎn)譯(編碼)、又含有未轉(zhuǎn)譯序列的多核苷酸以及其補(bǔ)體。術(shù)語(yǔ)“GPT編碼序列”是指基因的被轉(zhuǎn)錄并且編碼GPT蛋白的那部分。術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)序列”是指蛋白的引導(dǎo)該蛋白進(jìn)入細(xì)胞的亞細(xì)胞室(如植物細(xì)胞中的葉綠體)內(nèi)的氨基末端部分。GPT多核苷酸還由其在限定的條件下雜化為本文具體公開的GPT多核苷酸或由其得到的PCR產(chǎn)物的能力所定義。"GPT轉(zhuǎn)基因”是包含GPT多核苷酸的核酸分子，所述GPT多核苷酸對(duì)于具有該核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或植物胚芽、器官或種子是外源的，或者對(duì)于該GPT多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物的原種植物或植物胚芽、器官或種子是外源的。本文提供了示例性的本發(fā)明的GPT多核苷酸，并且包括用于擬南芥、水稻、大麥、竹子、大豆、葡萄和斑馬魚GPT的GPT編碼序列。部分長(zhǎng)度GPT多核苷酸包括編碼GPT的N-末端或C-末端的切斷物、成熟GPT(沒有目標(biāo)序列)的多核苷酸序列以及編碼GPT區(qū)域的序列。示例性的編碼GPT的N-末端切斷物的多核苷酸包括擬南芥-30、-45和-56構(gòu)造體，其中分別用于SEQIDNO2的全長(zhǎng)GPT結(jié)構(gòu)的頭30、45和56個(gè)氨基酸的編碼序列被除去。在采用本發(fā)明的GPT多核苷酸產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因細(xì)胞時(shí)，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，所插入的多核苷酸序列不必是一致的，而是只可以與其衍生的基因的序列是“基本一致的”，如下文所進(jìn)一步定義的那樣。術(shù)語(yǔ)“GPT多核苷酸”具體涵蓋這種基本一致的變體。相似地，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，由于密碼子簡(jiǎn)并性，大量的多核苷酸會(huì)編碼相同的多肽，并且所有這些多肽序列都旨在包括在術(shù)語(yǔ)GPT多核苷酸內(nèi)。此外，該術(shù)語(yǔ)具體地包括與本文所公開的GPT多核苷酸序列基本上一致(按照下文所述方式確定)的那些序列，并且這些序列編碼作為野生型GPT多肽的突變體或者保留GPT多肽的功能(由GPT多肽中的氨基酸的保守置換而實(shí)現(xiàn))的多肽。因此，術(shù)語(yǔ)“GPT多核苷酸”還包括這種基本一致的變體。術(shù)語(yǔ)“保守修飾的變體”既用于氨基酸序列，又用于核酸序列。關(guān)于特定的核酸序列，保守修飾的變體是指編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸不將氨基酸序列編碼至基本一致的序列的核酸。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，因此大量的功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶均編碼氨基酸-丙氨酸。由此，在丙氨酸由密碼子規(guī)定的每個(gè)位置處，密碼子可以被改變?yōu)樗龅南鄳?yīng)密碼子的任意一者，而不改變所編碼的多肽。這些核酸變型為“靜默變型”，其為保守修飾的變型的一個(gè)具體種類。本文中的編碼多肽的每一個(gè)核酸序列均還描述核酸的每一個(gè)可能的靜默變型。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的各密碼子(除了通常作為蛋氨酸的唯一密碼子的AUG和通常作為色氨酸的唯一密碼子的TGG之外)均可以被修飾為產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各靜默變型暗含在每一個(gè)所述的序列中。關(guān)于氨基酸序列，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單獨(dú)置換、缺失或添加(其改變、添加或除去編碼序列中的單獨(dú)氨基酸或小比例的氨基酸)為“保守修飾的變體”，其中該變型使得用化學(xué)相似的氨基酸置換氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守置換表為本領(lǐng)域內(nèi)公知的。這些保守修飾的變體還包括并且不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源體和等位基因。以下的8組均包含對(duì)于另一者為保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺酸(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(參見，例如，Creighton，Proteins(1984))ο諸如多肽結(jié)構(gòu)等大分子結(jié)構(gòu)可以用各種層次的構(gòu)造進(jìn)行描述。對(duì)于這種構(gòu)造的一般討論，參見文獻(xiàn)(例如)Alberts等，MolecularBiologyoftheCell(3rded.，1994)和CantorandSchimmel,BiophysicalChemistryPartI:TheConformationofBiologicalMacromolecυIes(1980)?！耙患?jí)結(jié)構(gòu)”是指特定肽的氨基酸序列?！岸?jí)結(jié)構(gòu)”是指多肽內(nèi)的局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常被稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域?yàn)槎嚯闹械男纬啥嚯牡木o湊單元的部分，并且其長(zhǎng)度通常為25至約500個(gè)氨基酸。典型的結(jié)構(gòu)域由較少的構(gòu)造的部分構(gòu)成，如片和α-螺旋的伸長(zhǎng)物?！叭?jí)結(jié)構(gòu)”是指多肽單體的完全三維的結(jié)構(gòu)?！八募?jí)結(jié)構(gòu)”是指由單獨(dú)的三級(jí)單元的非共價(jià)締合。各向異性項(xiàng)也被稱為能量項(xiàng)。術(shù)語(yǔ)“分離”是指這樣的材料，其基本上不含或者根本不含通常在材料以其本身狀態(tài)或天然狀態(tài)存在時(shí)伴隨的成分。然而，術(shù)語(yǔ)“分離”并不是指存在于電泳凝膠或其它分離介質(zhì)中的成分。分離的成分不含這種分離介質(zhì)，并且處于即將用于其它應(yīng)用或已經(jīng)用于新應(yīng)用/環(huán)境的形式?！胺蛛x”的抗體為已經(jīng)被確認(rèn)并且與其天然環(huán)境的成分分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分為干擾抗體的診斷或治療用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)類或非蛋白質(zhì)類溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體被純化為(1)通過Lowry法測(cè)定，占抗體的大于95重量％，并且最優(yōu)選大于99重量％，(2)通過使用旋杯序列分析儀，達(dá)到足以獲得至少15個(gè)N-末端殘基或內(nèi)部氨基酸序列，或者C3)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選使用銀染料在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE使其達(dá)到同質(zhì)性。分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境中的至少一種組分不會(huì)存在。然而，通常分離抗體通過至少一個(gè)分離步驟進(jìn)行制備。參照核酸的一部分使用的術(shù)語(yǔ)“異源”是指核酸包括兩個(gè)或多個(gè)本身不以彼此相同的關(guān)系存在的子序列。例如，核酸通常以重組方式制備，從而具有兩個(gè)或多個(gè)來源于被布置為形成新功能的核酸的不相關(guān)基因的序列，例如編碼來自一個(gè)來源的蛋白的核酸和編碼9來自另一個(gè)來源的蛋白序列的核酸。相似地，異源蛋白是指蛋白包括兩個(gè)或多個(gè)本身不以彼此相同的關(guān)系存在的子序列。在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的情況下，術(shù)語(yǔ)“一致”或“一致”百分比是指這樣的兩個(gè)序列或子序列，它們相同或者具有特定百分比例的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在比較窗或通過使用序列比對(duì)算法測(cè)量的指定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行比較并且匹配以最大化對(duì)應(yīng)關(guān)系時(shí)，或者通過手工對(duì)準(zhǔn)并且目視檢測(cè)時(shí)，具有約70%的一致性、優(yōu)選75%、80%、85%、90%或95%的一致性)。該定義還指測(cè)試序列的補(bǔ)體，該補(bǔ)體在測(cè)試序列基本上與參照序列一致時(shí)基本上具有序列或子序列互配能力。該定義還指測(cè)試序列的補(bǔ)體，該補(bǔ)體在測(cè)試序列基本上與參照序列一致時(shí)基本上具有序列或子序列互配能力。在參照多肽使用序列一致性百分比時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，不同來源的殘基位置的區(qū)域通常在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被置換為具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，因此，并不改變多肽的功能特性。在序列的區(qū)別在于保守置換時(shí)，序列一致性百分比可以往上調(diào)節(jié)，以校正置換的保守性質(zhì)。為了序列比較，通常一個(gè)序列用作測(cè)試序列被比較的參照序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要的話，指定子序列坐標(biāo)軸，并且指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)程序參數(shù)或者可以指定可供選用的其它參數(shù)。序列比較算法然后基于程序參數(shù)，計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參照序列的序列一致性百分比。本文所用的“比較窗”包括對(duì)多個(gè)鄰接位置中的任意一者的片段的參照，所述位置選自由20至600組成的組，通常為約50至約200、更通常為約100至約150，其中在將兩個(gè)序列優(yōu)化對(duì)準(zhǔn)之后，可以將序列與具有相同數(shù)目的鄰接位置的參照序列進(jìn)行比較。對(duì)準(zhǔn)比較用序列的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的?？梢酝ㄟ^以下方法進(jìn)行比較用序列的優(yōu)化對(duì)準(zhǔn)，所述方法例如為Smith&Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2:482的局部同源算法；Needleman&Wunsch,1970,J.MoLBio048:443的局部同源算法；Pearson&Lipman，1988，Proc.Nat，1.Acad.Sci.USA85:2444的相似度檢索方法；這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(GAP，BESTFIT,FASTA禾口TFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr。，Madison，Wl)；或者手工對(duì)準(zhǔn)并且目視觀測(cè)(參見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，eds.1995supplement))。適合于確定序列一致性百分比和序列相似度的算法的優(yōu)選例子為BLAST和BLAST2.0算法，其分別在文獻(xiàn)Altschul等，1977，Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等，1990，J.MoI.Biol.215=403-410中有所描述。通常與本文所述的默認(rèn)參數(shù)一起使用BLAST和BLAST2.0，以確定本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)的序列一致性百分比。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過NationalCenterforBiotechnology^formation公開獲得。該算法包括首先通過識(shí)別研究序列中長(zhǎng)度為W的短字從而確認(rèn)高分值序列對(duì)(HSP)，在其與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中的相同長(zhǎng)度的字串匹配時(shí)，其匹配或者符合一些正值的閾分值T。T被稱為相鄰字串的分值閾(Altschul等，見下文)。這些初始的相鄰擊中字串用作引動(dòng)檢索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)的HSP的種子。將這些擊中字串在兩個(gè)方向上沿各序列延伸，以使得累積匹配分值盡可能增加。對(duì)于核苷酸序列而言，使用(例如)參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分值；總是>0)和N(殘基失配的罰分；總是<0)計(jì)算累積分值。對(duì)于氨基酸序列，采用計(jì)分矩陣計(jì)算累積分值。擊中字串在各方向的延伸在以下情況時(shí)終止累積匹配分值由其實(shí)現(xiàn)的最大值降低了量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)值殘基匹配而使得累積分值達(dá)到0或以下；或者達(dá)到任何一個(gè)序列的末端。BLAST參數(shù)W、T和X確定匹配的靈敏度和速率。BLASTN程序默認(rèn)采用的(對(duì)于核苷酸而言)字串長(zhǎng)度(W)為11，預(yù)期值(E)為10，M=5，N=-4并且采用兩股同時(shí)比對(duì)。對(duì)于氨基酸序列而言，BLASTP程序默認(rèn)采用的字串長(zhǎng)度為3，并且預(yù)期值(E)為10，以及BL0SUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff&Henikoff，Proc.Natl。Acad.ScLUSA8910915(1989))，匹配值(B)為50，預(yù)期值(E)為10，M=5，N=-4，以及采用兩股同時(shí)比對(duì)。BLAST算法還在兩個(gè)序列之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如，KarlinMltschul,1993,Proc.NatlAcad.Sci.USA90:5873-5787)。Onemeasureofsimilarityprovided由BLAST算法提供的一個(gè)相似度的量度為最小和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸和氨基酸序列隨機(jī)之間隨機(jī)實(shí)現(xiàn)匹配的概率的指標(biāo)。例如，如果在測(cè)試核酸與參照核酸比較時(shí)，最小和概率低于約0.2，最優(yōu)選低于約0.01并且最優(yōu)選低于約0.001，則認(rèn)為核酸與參照序列相似。短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針通常以核酸的復(fù)合混合物的形式與其目標(biāo)子序列雜交，但是與其它核酸并不雜交。嚴(yán)格條件具有序列依賴性，并且在不同情況下而有不同。較長(zhǎng)的序列特異性地在較高的溫度下雜交。核酸雜交的更深指導(dǎo)參見文獻(xiàn)Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes,"OverviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyOfnucleicassays”(1993)。通常，高度嚴(yán)格的條件在限定的離子強(qiáng)度pH下被選擇為比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10°C。低嚴(yán)格性的條件通常被選擇為比Tm低約15-30°C。Tm為50%的與目標(biāo)物互補(bǔ)的探針與目標(biāo)序列平衡雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度pH和核酸濃度下)，即當(dāng)目標(biāo)序列過量存在時(shí)，在Tm下，50%的探針被平衡占用)。嚴(yán)格條件為這樣的條件下，其中在pH為7.0至8的情況下，鹽濃度為低于約0.IM鈉離子濃度，通常為約0.01至IM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于較短的探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言為至少約30°C，并且對(duì)于較長(zhǎng)的探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)而言為約60°C。還可以添加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。為了選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)為背景雜交信號(hào)的至少2倍，優(yōu)選為背景雜交信號(hào)的10倍。如果核酸編碼的多核苷酸為基本上一致的，則在嚴(yán)格條件下不彼此雜交的核酸仍然是基本上一致的。(例如)當(dāng)使用由遺傳密碼許可的最大密碼子簡(jiǎn)并性來產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)會(huì)發(fā)生這種情況。在這種情況下，核酸通常在中等嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交?？梢圆捎帽疚墓_的GPT多核苷酸序列通過標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法在嚴(yán)格條件下確認(rèn)含有GPT多核苷酸的基因組DNA或cDNA。為了實(shí)現(xiàn)該目的，用于上述雜交的合適的嚴(yán)格條件為以下的條件或等價(jià)條件，所述條件包括在37°C的40%甲酰胺、IMNaClU%SDS的緩沖溶液中進(jìn)行雜交，并且在至少約50°C、通常約55°C至約60°C下進(jìn)行一次洗滌，洗滌時(shí)間為20分鐘。陽(yáng)性雜交信號(hào)為背景信號(hào)的至少2倍。普通的技術(shù)人員會(huì)容易理解，可以采用其它可供選用的雜交和洗滌條件來提供相似嚴(yán)格度的條件。兩個(gè)多核苷酸基本上一致的其它指標(biāo)是通過一對(duì)寡核苷酸引物將參照序列擴(kuò)增，然后可以將其在嚴(yán)格條件下用作探針，以從cDNA或基因組圖譜中分離出測(cè)試序列，或者以(例如)northern或Southern印跡法識(shí)別測(cè)試序列。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明提供表現(xiàn)出基本上增強(qiáng)的農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物，所述農(nóng)學(xué)特性包括較快的生長(zhǎng)、較高的成熟植物鮮重和總生物量、以及更充分的開花和更多的果實(shí)和種子產(chǎn)率。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物通過向植物中引入一個(gè)或多個(gè)可表達(dá)的基因構(gòu)造體而產(chǎn)生，所述基因構(gòu)造體能夠驅(qū)使編碼谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的表達(dá)。本發(fā)明的例子包括產(chǎn)生攜帶并且表達(dá)異源GPT基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物(下文的實(shí)施例幻。預(yù)期所有的植物也含有在相同的代謝途徑(即信號(hào)代謝物2-羥基-5-氧脯氨酸的生物合成)中起作用的GPT類似物。因此，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，編碼GPT類似物或其功能變體的任何植物基因均可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實(shí)施方案中，可表達(dá)的基因構(gòu)造體的一個(gè)或多個(gè)拷貝被整合到主體植物基因組中，從而為植物提供增強(qiáng)的GPT酶能力，其用于介導(dǎo)2-氧戊二酸酰胺的增強(qiáng)合成，2-氧戊二酸酰胺進(jìn)而傳導(dǎo)代謝基因表達(dá)的信號(hào)，從而產(chǎn)生增強(qiáng)的植物生長(zhǎng)和增強(qiáng)的其它農(nóng)學(xué)特性。2-氧戊二酸酰胺為用作基因表達(dá)、代謝和植物生長(zhǎng)的非常有效的效應(yīng)物的代謝物(美國(guó)專利6，555，500)，并且在協(xié)調(diào)碳代謝和氮代謝體系時(shí)起到重要的作用(Lancien等，2000,EnzymeRedundancyandtheImportance2-OxoglutarateinHigherplantsAmmoniumassimilation,PlantPhysiol.123:817-824)。還參見圖1所示的2-氧戊二酸酰胺途徑的示意圖。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，申請(qǐng)人已經(jīng)分離了編碼擬南芥谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)酶(參見以下的實(shí)施例)的核酸分子，并且首次證明了經(jīng)表達(dá)的重組酶是活性，并且能夠催化信號(hào)代謝物2-氧戊二酸酰胺的合成(下文的實(shí)施例幻。此外，申請(qǐng)人首次證明了擬南芥谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因在異源植物中的過度表達(dá)產(chǎn)生提高的(X)2固定速率和增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性(下文的實(shí)施例3)。如本文所公開(參見下文的實(shí)施例3)，包含全長(zhǎng)擬南芥GPT編碼序列的轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因煙草植物中的過度表達(dá)還產(chǎn)生更快的(X)2固定速率，以及增多的總蛋白、谷氨酰胺和2-氧戊二酸酰胺的水平。這些轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物還生長(zhǎng)更快(圖幻。相似地，在用番茄植物進(jìn)行的預(yù)研究中(參見下文的實(shí)施例4)，用擬南芥GPT轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的番茄植物與野生型對(duì)照植物相比，顯示出顯著提高的生長(zhǎng)速率，開花率和種子產(chǎn)率(圖3和下文的實(shí)施例4)。除了上述的轉(zhuǎn)基因煙草植物，還在番茄、胡椒、大豆、豇豆、紫花苜蓿、香瓜、南瓜、擬南芥和Camilena的兩個(gè)種系中產(chǎn)生了各種其它種系的轉(zhuǎn)基因植物，其包含GPT并且顯示出增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性(參見2009年8月31日提交的共有的、共同待審的案卷NO.S-112,983，其全文以引用方式并入本文)。通過使用各種GPT轉(zhuǎn)基因采用各種轉(zhuǎn)化方法并且借助于單獨(dú)轉(zhuǎn)基因植物的有性雜交產(chǎn)生上述的轉(zhuǎn)基因植物，所述方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化、蘸花轉(zhuǎn)化、豆莢接種和直接花朵接種以及它們的組合。本發(fā)明還提供產(chǎn)生具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性和其它農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性和其它農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括在能夠驅(qū)使轉(zhuǎn)基因表達(dá)的合適啟動(dòng)子的控制下，將包含編碼GPT轉(zhuǎn)基因的核酸分子的表達(dá)盒引入到植物細(xì)胞中，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且獲得表達(dá)經(jīng)編碼的GPT的轉(zhuǎn)基因植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性和其它農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括在能夠驅(qū)使轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)合適啟動(dòng)子(可任選的其它調(diào)節(jié)元件)的控制下，將包含編碼GPT轉(zhuǎn)基因的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)造體或表達(dá)盒引入到植物細(xì)胞中，從而產(chǎn)生由此轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且獲得表達(dá)GPR轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物?？梢圆捎萌我鈹?shù)量的GPT多核苷酸來產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。GPT蛋白在各種不同的植物品種之間是高度保守的，并且由本文公開的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，緊密相關(guān)的非植物GPT(例如，斑馬魚GPT)也可以使用。關(guān)于GPT，來自不同品種的多種GPT多核苷酸已經(jīng)顯示出具有活性，并且可用作GPT轉(zhuǎn)基因。在具體的實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自擬南芥的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDNO2,SEQIDNO:21禾口SEQIDN0:30所示的GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO1所示的核苷酸序列；與SEQIDNO1具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；SEQIDNO:2所示的編碼多肽的核苷酸序列或編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；以及編碼在SEQIDNO2中的氨基末端切下30至56個(gè)氨基酸的多肽的核苷酸序列或者編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自葡萄的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDNO:9和SEQIDNO:31所示的葡萄GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO8所示的核苷酸序列；與SEQIDNO8具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；編碼SEQIDNO:9或SEQIDNO:31所示的多肽的核苷酸序列或編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自水稻的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDNO:11和SEQIDNO32所示的水稻GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO10所示的核苷酸序列；與SEQIDNO10具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%一致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；編碼SEQIDN0:11和SEQIDNO32所示的多肽的核苷酸序列或編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自大豆的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDNO13,SEQIDNO:33或在序列的N末端具有另外的異亮氨酸的SEQIDNO33的大豆GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO12所示的核苷酸序列；與SEQIDNO:12具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；編碼SEQIDNO13,SEQIDNO:33或在序列的N末端具有另外的異亮氨酸的SEQIDNO33的多肽的核苷酸序列或編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自大麥的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDN0:15禾口SEQIDNO:34的大麥GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO:14所示的核苷酸序列；與SEQIDNO:10具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；編碼SEQIDNO:15和SEQIDNO:34的多肽的核苷酸序列或編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。13在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自斑馬魚的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDNO:17和SEQIDNO:35的斑馬魚GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO16所示的核苷酸序列；與SEQIDNO16具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%一致性并且編碼具有GPT活性的多肽的核苷酸序列；編碼SEQIDNO:17或SEQIDNO35的多肽的核苷酸序列或編碼與其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，GPT轉(zhuǎn)基因是編碼得自竹子的GPT的GPT多核苷酸，如SEQIDNO36的竹子GPT。GPT轉(zhuǎn)基因可以由以下的序列編碼SEQIDNO:36的核苷酸序列；或編碼其具有至少75%—致性、優(yōu)選至少80%—致性并且具有GPT活性的多肽的核苷酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施中，其它適合用作GPT轉(zhuǎn)基因的GPT多核苷酸可以由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的各種手段獲得，并且測(cè)試其在重組表達(dá)載體體系(即大腸桿菌(參見實(shí)施例20-23)中、在瞬間的植物表達(dá)體系(參見實(shí)施例19)中或在轉(zhuǎn)基因植物(參見實(shí)施例1-18)中指導(dǎo)GPT的表達(dá)以及GPT活性的能力。轉(zhuǎn)基因構(gòu)造體/表汰載體為了產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，必須將用于所需轉(zhuǎn)基因的基因編碼序列引入到核酸構(gòu)造體(在本文中其還可互換地稱為(轉(zhuǎn)基因)表達(dá)載體、表達(dá)盒、表達(dá)構(gòu)造體或表達(dá)可表達(dá)基因構(gòu)造體)中，所述構(gòu)造體能夠在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因序列的表達(dá)?？梢允褂枚喾N本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法(其包括但是不限于電穿孔法、DNA槍轟擊法或粒子傳遞法、微注射法)并且借助于各種基于DNA的載體(如根癌土壤桿菌和毛根土壤桿菌)將攜帶所關(guān)注轉(zhuǎn)基因的這種核酸構(gòu)造體引入到植物細(xì)胞內(nèi)。一旦將核酸構(gòu)造體引入到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞內(nèi)，其可以采用瞬間或穩(wěn)定方式指導(dǎo)所引入的轉(zhuǎn)基因(即GPT)的表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的，并且可以利用能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因構(gòu)造體的染色體整合的植物轉(zhuǎn)化載體來實(shí)現(xiàn)。一旦植物細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化，可以將其培育，以使轉(zhuǎn)基因植物再生。多種適合于在轉(zhuǎn)化植物內(nèi)驅(qū)使所插入基因的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的表達(dá)載體是已知的。此外，各種瞬間表達(dá)載體和體系是已知的。在很大程度上，選擇合適的表達(dá)載體用于基因轉(zhuǎn)化的特定方法中(參見下文)。寬泛地說，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的典型植物表達(dá)載體包括在啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)節(jié)控制下的所關(guān)注基因、用于輔助轉(zhuǎn)化株的選擇的選擇性標(biāo)記物和轉(zhuǎn)錄終止子序列。更具體而言，用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的核酸構(gòu)造體的基本元件為能夠在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)知道轉(zhuǎn)基因的功能表達(dá)的合適啟動(dòng)子；與啟動(dòng)子可操作地連接的轉(zhuǎn)基因(即GPT編碼序列)；與轉(zhuǎn)基因可操作地連接的優(yōu)選的合適轉(zhuǎn)錄終止序列(即胭脂堿合成酶基因終止子)和通常用于控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的其它元件，以及一個(gè)或多個(gè)適合于選擇所需轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的選擇性標(biāo)記物基因(即耐抗生素基因)。由于根癌土壤桿菌為用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的主要轉(zhuǎn)化體系，因此存在設(shè)計(jì)用于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的各種載體。為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，土壤桿菌體系利用“二元”載體，該載體允許質(zhì)粒在大腸桿菌和土壤桿菌均能操作，并且通常包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記物，以回收轉(zhuǎn)化的植物(Hellens等，2000,Technicalfocus:AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.TrendsPlant:446-451)。用于土壤桿菌轉(zhuǎn)化體系中的二元載體通常包含T-DNA的邊區(qū)、多個(gè)克隆位點(diǎn)、用于大腸桿菌和根癌土壤桿菌的復(fù)制功能區(qū)和選擇性標(biāo)記物以及報(bào)道基因。所謂的“超二元”載體提供更高的轉(zhuǎn)化效率，并且通常包含來自Ti的附加致病基因(Komari等，2006，MethodsMoI.Biol.34315-41)。超二元載體通常用于表現(xiàn)出較低的轉(zhuǎn)化效率的植物，如谷物。這種附加的致病基因包括而不限于virB、virE和VirG(Vain等，2004，Theeffectofadditionalvirulencegenesontransformationefficiency,transgeneintegrationandexpressioninriceplantsusingthepGreen/pSoupdualbinaryvectorsystem.TransgenicRes.13:593-603;Srivatanakul等，2000,Additionalvirulencegenesinfluencetransgenexpression:transgencopynumber,integrationpatternandexpression,J.PlantPhysiol.157,685-690；Park等，2000，ShorterT-DNAoradditionalvirulencegenesimproveAgrobacteriυm-mediatedtransformation.Theor.Appl.Genet.101,1015-1020；Jin等，1987,GenesresponsibleforthesupervirulencephenotypeofAgrobacteriumtumefaciensA281.J.Bacteriol.1694417-4425)。在本文示例的實(shí)施方案中(參見下文的實(shí)施例)，采用其中將插入的轉(zhuǎn)基因置于組成型CaMV35S啟動(dòng)子的控制下的表達(dá)載體。多種利用CaMV35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體是已知的并且/或者是市售可得的。植物啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”用于指示基因轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)(TSS)上游的基因組序列內(nèi)的區(qū)域，但是TSS下游的序列還可以影響轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。啟動(dòng)子元件選擇轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄特異性和速率。根據(jù)距TSS的距離，還可以采用“近端啟動(dòng)子“(TSS周圍的數(shù)百個(gè)核苷酸)和“遠(yuǎn)端啟動(dòng)子”(TSS上游的數(shù)千和更多的核苷酸)這樣的術(shù)語(yǔ)。近端啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子均包括參與細(xì)胞階段、組織階段、器官階段、發(fā)育階段的復(fù)雜過程和轉(zhuǎn)錄的環(huán)境因素調(diào)節(jié)的各種元件的組合。大多數(shù)調(diào)節(jié)TSS選擇的啟動(dòng)子位于近端啟動(dòng)子。在植物中起作用的多種啟動(dòng)子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。在構(gòu)造GPT轉(zhuǎn)基因構(gòu)造體時(shí)，選擇的啟動(dòng)子可以為組成型的、非特異性的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S核糖體啟動(dòng)子(CaMV35S啟動(dòng)子)，其廣泛用于轉(zhuǎn)基因在植物內(nèi)的表達(dá)。其它的強(qiáng)效組成型啟動(dòng)子包括而不限于水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子、CaMV19S啟動(dòng)子、Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶啟動(dòng)子、醇脫氫酶啟動(dòng)子和蔗糖合成酶啟動(dòng)子。或者，在一些實(shí)施方案中，可能有利的是，基于以下因素選擇啟動(dòng)子，所述因素為旨在由轉(zhuǎn)基因構(gòu)造體轉(zhuǎn)化的所需植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因的所需表達(dá)水平、用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的所需組織或亞細(xì)胞區(qū)室、所針對(duì)的發(fā)育階段等。例如，當(dāng)需要在光合組織和區(qū)室中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，可以采用核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)基因啟動(dòng)子。當(dāng)需要在種子內(nèi)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，可以采用種子存儲(chǔ)蛋白基因啟動(dòng)子。當(dāng)需要在果實(shí)內(nèi)表達(dá)時(shí)，可以采用果實(shí)特異性啟動(dòng)子，如番茄2A11。其它組織特異性啟動(dòng)子的例子包括編碼以下物質(zhì)的啟動(dòng)子植物血凝素(Vodkin等，1983，Cell34:1023-31；Lindstrom等，1990，DevelopmentalGenetics11:160-167)，玉米醇脫氫酶1(Vogel等，1989，J.Cell.Biochem.(Supp1.0)13=PartD；Dennis等，1984，Nucl.AcidsRes.,12(93983-4000)，玉米光捕集復(fù)合物(Simpson，1986，Science,233:34-38；Bansal等，1992，Proc.NatlAcad.Sci.USA,89:3654-3658)，玉米熱沖擊蛋白(Odell等，1985，Nature,313810-812；Rochester等，1986，EMBOJ.，5:451-458)，豌豆小子單元RuBP羧化酶(Poulsen等，1986，MoI.Gen.Genet,205(2:193-200；Cashmore等，1983，Gen.Eng,Plants,PlenumPress,NewYork,pp29-38)；Ti質(zhì)粒甘露堿合成酶和Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶(Langridge等，1989,Proc.Natl,Acad.Sci.USA,86:3219-3223)，矮牽牛花查耳酮異構(gòu)化酶(VanTunen等，1988，EMBOJ.7(5:1257-1263)，大豆甘氨酸富集酶1(Keller等，1989，EMBOJ.8(51309-1314)，切斷的CaMV35(Odell等，1985，上文)，番茄儲(chǔ)藏蛋白(Wenzler等，1989，PlantMoI.Biol.12:41-50)，根細(xì)胞(Conkling等，1990,PaintPhysiol.93:1203-1211)，玉米蛋白(Reina等，1990，Nucl.AcidsRes.18Ql:6426;Kriz等，1987，MoI.Gen.Genet.207(1):90-98；WandeltandFeix,1989,Nuc.AcidsRes.17(6:2354；Langridge和Feix，1983，Cell34:1015-1022;Reina等，1990，Nucl.AcidsRes.18(21:6426),球蛋白-l(BelangerandKriz,1991,Genetics129:863-872),α-微管蛋白(Carpenter等，1992，PlantCell4(5:557-571;Uribe等，1998，PlantMoI.Biol.37(6:1069-1078),cab啟動(dòng)子(Sullivan等，1989，MoI.Gen.Genet.215(3):431-440)，PEPCase(Hudspeth和Grula,1989，PlantMoI.Biol.12:579-589)，R基因復(fù)合物(Chandler等，1989，ThePlantCell1:1175-1183)，查耳酮合成酶(Franken等，1991，EMBOJ.10(9):2605-2612)和谷氨酰胺合成酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，391，725；Edwards等，1990,Proc.Natl,Acad.Sci.USA87:3459-3463；Brears等，1991，PlantJ.1(2:235-244)。除了組成型啟動(dòng)子以外，在轉(zhuǎn)基因植物再生、成熟、開花等時(shí)需要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的情況下還可以采用各種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括熱沖擊基因、保護(hù)反應(yīng)基因(即苯基丙氨酸解氨酶；參見，例如，Bevan等，1989，EMBOJ.8(7=899-906)、創(chuàng)傷反應(yīng)基因(即細(xì)胞壁蛋白基因)、化學(xué)誘導(dǎo)基因(即硝酸鹽還原酶，幾丁質(zhì)酶)和黑暗誘導(dǎo)基因(即天冬酰胺酸合成酶；例如，參見美國(guó)專利N0.5，256，558)的啟動(dòng)子。此外，多種植物核基因由光激活，其包括編碼主葉綠素a/b結(jié)合蛋白(cab)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶rbcS)的小子單元的基因家族(例如，參見iTobin和Silverthome，1985，Annu,Rev.PlantPhysiol.36:569-593；Dean等，1989,Annu.Rev.PlantPhysiol.40:415-439)。其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括ABA誘導(dǎo)啟動(dòng)子和細(xì)胞組織膨脹誘導(dǎo)啟動(dòng)子，生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白啟動(dòng)子Gchwob等，1993，PlantJ.4(3):423-432)，UDP葡萄糖類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子(Ralston等，1988，Genetics119(1:185-197)；MPI蛋白酶抑制劑啟動(dòng)子(Cordero等，1994，PlantJ.6O:141-150)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子基因啟動(dòng)子(Kohler等，1995，PlantMoI.Biol.29(6:1293-1298；Quigley等，1989，J.MoI.Evol,29(5:412-421；Martinez等，1989，J.MoI.Biol.208(4):551-565)和得自豌豆的光誘導(dǎo)質(zhì)體谷氨酰胺合成酶基因(美國(guó)No.5,391,725；Edwards等，1990,上文)。關(guān)于在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中使用的植物啟動(dòng)子的綜述，參見文獻(xiàn)Potenza等，2004，InVitroCell.Devel.Biol-Plant,40(1):1_22。關(guān)于合成植物啟動(dòng)子工程的綜述，參見(例如)文獻(xiàn)Venter，M.，2007，TrendsPlantScL，12(3:118-124)。_o]谷氨安轉(zhuǎn)(GPT)m^m本發(fā)明首次公開了植物含有在信號(hào)代謝物2-羥基-5-氧脯氨酸的合成中直接起作用的谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)。迄今為止，尚未記載具有限定功能的植物轉(zhuǎn)氨酶。申請(qǐng)人已經(jīng)分離并且測(cè)試了得自幾種植物和動(dòng)物品種的GPT多核苷酸編碼序列，并且成功地將基因引入到異源轉(zhuǎn)基因主體植物中，所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性，包括較快的生長(zhǎng)、較高的葉子蛋白含量和較快的ω2固定速率。預(yù)期所有植物品種均含有在相同的代謝途徑起作用的GPT，從而參與信號(hào)代謝物2-羥基-5氧脯氨酸的生物合成。因此，在本發(fā)明的實(shí)施中，編碼GPT類似于或其功能變體的任何植物基因均可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。此外，考慮到各種植物GPT基因蛋白結(jié)構(gòu)和來自斑馬魚的突變(并且生物活性)的GPT類似物之間(參見實(shí)施例22)的相似性，因此可以在制備用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)采用其它的非植物GPT類似物。當(dāng)與SEQIDNO:30提供的擬南芥成熟蛋白序列進(jìn)行單獨(dú)比較(通過BLAST匹配)時(shí)，針對(duì)以下的成熟GPT蛋白獲得下述的序列一致性和同系性(BLAST“陽(yáng)性率”，包括類似氨基酸)來源%—致性%陽(yáng)性率[31]葡萄8493[32]水稻839103]大豆8393P4]大麥829105]斑馬魚8392P6]竹子8190玉米7990蓖麻8493白楊8593通過強(qiáng)調(diào)大多數(shù)植物品種之前的GPT蛋白的結(jié)構(gòu)的保守性質(zhì)，在上述植物品種中觀察到的保守性擴(kuò)大至來自于斑馬魚和衣滴蟲的非人類突變GPT。在斑馬魚的情況下，一致程度極高(與SEQIDNO:30的成熟擬南芥GPT具有83%的氨基酸序列一致性，并且考慮了相似的氨基酸序列具有92%的同系性)。斑馬魚成熟GPT通過在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并且證明其生物活性(2-氧戊二酸酰胺的合成)而進(jìn)行了確認(rèn)。為了確認(rèn)突變GPT類似物是否適合于產(chǎn)生本發(fā)明的生長(zhǎng)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物，需要最初在大腸桿菌或其它合適的主體中表達(dá)其編碼序列，并且確定2-氧戊二酸酰胺信號(hào)代謝物是否以升高的水平合成(參見實(shí)施例19-2。在證明上述的增加時(shí)，然后可以將編碼序列同時(shí)引入同種的植物主體以及異源的植物主體內(nèi)，并且評(píng)價(jià)生長(zhǎng)特性。能夠特異性地檢測(cè)2-氧戊二酸酰胺的任何分析方法均可以用于該目的，包括而不限于在下文的實(shí)施例2中所述的NMR和HPLC分析方法。此外，可以采用直接測(cè)量GPT活性的分析方法?？梢詫⒕哂?-氧戊二酸酰胺合成活性的任意植物GPT用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。在植物品種中出現(xiàn)高水平的結(jié)構(gòu)同系性，其似乎超出了植物的范圍，如各種植物GPT蛋白和突變斑馬魚GPT類似物之間的密切同系性所證明的那樣。因此，可以采用各種植物GPT基因在多種醫(yī)異源的植物品種中產(chǎn)生生長(zhǎng)增強(qiáng)的植物。此外，在同種植物中表達(dá)的GPT轉(zhuǎn)基因預(yù)期也會(huì)產(chǎn)生期望的生長(zhǎng)增強(qiáng)特性(即水稻谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在轉(zhuǎn)基因水稻植物中過度表達(dá))，但是在一致細(xì)胞中的調(diào)節(jié)也可能以在異源細(xì)胞中不可操作的某種方式減弱表達(dá)。轉(zhuǎn)錄終Ih子在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將3’轉(zhuǎn)錄終止序列引入到轉(zhuǎn)基因的下游，以引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的終止并且允許mRNA轉(zhuǎn)錄的正確多腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子為已知在植物中起作用的那些，其包括而不限于根癌土壤桿菌的胭脂堿合成酶(N0Q和章魚堿合成酶(0CQ基因、得自章魚堿合成酶基因的T7轉(zhuǎn)錄、得自馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II的3’末端、CaMV35S終止子、tml終止子和豌豆rbcSE9終止子。此外，可以采用基因本身的轉(zhuǎn)錄終止子。在具體的實(shí)施方案中，由下文的實(shí)施例所述，采用了胭脂堿合成酶轉(zhuǎn)錄終止子。詵擇件標(biāo)記物通常在轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中包括選擇性標(biāo)記物，以提供選轉(zhuǎn)化株的手段。雖然可以利用各種類型的標(biāo)記物，但是通常采用各種負(fù)選擇標(biāo)記物，包括賦予選擇劑(其抑制或殺滅未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)抗性的那些，如賦予抗生素(如卡那霉素、慶大霉素、anamycin、潮霉素和潮霉素B)抗性的基因，或賦予除草劑(如磺脲、草丁膦、草胺磷和草甘膦)抗性的基因?？珊Y選的標(biāo)記物包括(例如)編碼β-葡萄糖苷酸酶的基因(Jefferson,1987,PlantMoI.Biol.Rep5:387-405)、編碼熒光素酶的基因(Ow等，1986，Science234:856-859)和編碼參與產(chǎn)生或控制花青素顏料的蛋白的各種基因(例如，參見美國(guó)專利6，573，43。大腸桿菌葡萄糖苷酸酶(gus、gUsA或uidA)已經(jīng)在植物轉(zhuǎn)化中稱為廣泛使用的選擇標(biāo)記物，這主要是因?yàn)槠咸烟擒账崦傅姆€(wěn)定性、高靈敏度和容易檢測(cè)(例如，熒光測(cè)定法、分光光度法、各種組織化學(xué)法)。此外，在大多數(shù)高等植物品種中，基本上沒有可檢測(cè)的葡萄糖苷酸酶。轉(zhuǎn)化方法和體系各種用于將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)造體引入到植物或植物細(xì)胞內(nèi)的方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的，并且可以利用能夠轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物或植物細(xì)胞的任何方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法可能是在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中利用最普遍的方法，并且用于多種植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的規(guī)程在以下文獻(xiàn)中具有詳盡描述(例如，參見AgrobacteriumProtocols,Wan,ed.,HumanaPress,2ndedition,2006)。根癌農(nóng)桿菌為革蘭陰性土壤細(xì)菌，其通過在植物細(xì)胞內(nèi)插入腫瘤誘導(dǎo)DNA(“T-DNA”、“轉(zhuǎn)移DNA”)的小片段而在大量的雙子葉植物品種中導(dǎo)致腫瘤(冠癭病)，該細(xì)菌在半隨機(jī)位置被并入到植物基因組內(nèi)，并且最終可能變得穩(wěn)定地并入其中。直接重復(fù)地DNA序列(稱為界區(qū))限定T-DNA的左端和右端。T-DNA可以與Ti-質(zhì)粒的其余部分物理分離，從而產(chǎn)生“二元”載體。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化可以用于穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化雙子葉植物、單子葉植物及其細(xì)胞(Rogers等，1986，MethodsEnzymo1.，118:627-641；Hemalsteen等，1984，EMBOJ.，3:3039-3041；Hoykass-VanSlogteren等，1984，Nature,311:763-764；Grimsley等，1987，Nature325:167-1679；Boulton等，1989，PlantMoI.Biol.12:31-40；Gould等，1991，PlantPhysiol.95:426-434)0各種用于將細(xì)胞DNA引入到農(nóng)桿菌內(nèi)的方法是已知的，包括電穿孔法、冷凍/融解法和三親本雜交。將異源DNA置于農(nóng)桿菌內(nèi)的最有效的方法是借助于電穿孑L法(Wise等，2006，ThreeMethodsfortheIntroductionofForeignDNAintoAgrobacterium,MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/18e,volume1；Ed.,Wang,HumanaPressInc.,Totowa,NJ,pp.43—53)。此夕卜,考慮至Ij大量的T-DNA沒有整合，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法可以用于通過未引入的轉(zhuǎn)基因構(gòu)造體分子的轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的瞬間表達(dá)(Helens等，2005，PlantMethods1:13)。大量的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體和方法已經(jīng)有所描述(Karimi等，2002，TrendsPlantki.7(5:193-5)，并且許多這種載體可以是市售可得的(例如，hvitrogen公司)。此外，大量的“開源”農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體是可得到的(例如，pCambia載體；Cambia，Canberra,Australia)。還參見下文的轉(zhuǎn)基因構(gòu)造體上的小部分。在實(shí)施例進(jìn)一步描述的具體實(shí)施方案中，基于PM0N316的載體被用于Horsch等人的葉盤轉(zhuǎn)化體系中(Horsch等，1995，Science227:1229-1231)，以產(chǎn)生生長(zhǎng)增強(qiáng)的煙草植物和番茄植物?？捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的其它常用的方法包括而不限于微彈轟擊法或粒子專遞轉(zhuǎn)化；通過鈣、聚乙二醇(PEG)或電穿孔而進(jìn)行的裸DNA的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法(Paszkowski等，1984，EMBOJ.3:2727-2722；Potrykus等，1985，MoI.Gen.Genet.199169-177；Fromm等，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828；Shimamoto等，1989，Nature,338:274-276)。粒子傳遞轉(zhuǎn)化法包括采用粒子傳遞裝置(或“基因槍”)將數(shù)百萬(wàn)的包被DNA的金屬顆粒注射到靶細(xì)胞或組織內(nèi)，其中的數(shù)種裝置是市售可得的；一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，DNA從顆粒上脫離，并且其一部分穩(wěn)定地并入一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞染色體內(nèi)(關(guān)于其綜述，參見Kikkert等，2005，StableTransformationofPlantCellsbyParticleBombardment/Biolistics，in:MethodsinMolecularBiology,vol.286TransgenicPlant:MethodsandProtocols,Ed.LPena，HumanaPressInc.，Totowa,NJ)0電穿孔是利用短的高強(qiáng)度電場(chǎng)可逆地滲入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層內(nèi)的技術(shù)(例如，參見Fisk禾口Dandekar，2005，IntroductionandExpressionofTtransgenesinPlantProtoplasts，in:MethodsinMolecularBiology,vol.286TransgenicPlantMethodsandProtocols，Ed.LPena,HumanaPressInc.，Totowa,NJ,pp.79—90；Fromm等，1987，ElectroporationofDNAandRNAintoPlantprotoplasts，inMethodsinEnzymology,Vol.153，Wu禾口Grossman，eds.，AcademicPress，London，UKlpp.351-366；Joersbo禾口Brunstedt，1991，Electroporation:mechanismandtransientexpression,stabletransformationandbiologicaleffectsinPlantprotoplasts.Physiol.Plant.81，256—264；Bates，1994，GenetictransformationofPlantsbyprotoplastelβctroporation.MoI.Biotech.2:135-14；Dillen等，1998，Electroporation-mediatedDNAtransfertoPlantprotoplastsandintactPlanttissuesfortransientgeneexpressionassays,inCellBiology,Vol.4,ed.，CeNs,AcademicPress，London，UK,PP.92-99)。這種技術(shù)通過在細(xì)菌膜上產(chǎn)生水性孔而操作，所述孔具有足夠大的尺寸，以允許DNA分子(和其它大分子)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)造體(T-DNA的形式)可以穩(wěn)定地并入植物基因組DNA內(nèi)，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，該細(xì)胞隨后能夠再生為轉(zhuǎn)基因植物。更新的轉(zhuǎn)化方法包括所謂的“花序浸漬”法，其提供簡(jiǎn)便的潛能，而不需要在其它所有通常使用的轉(zhuǎn)化方法情況采用的植物組織培養(yǎng)物(Bent等，2006，ArabidopsisthaiianaFloralDipTransformationMethod，MethodsMoIBiol，vol.343:AgrobacteriumProtocols，2/e，volume1；Ed.，Wang,HumanaPressInc.，Totowa,NJ,pp.87-103；CloughandBent,1998,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium—mediatedtransformationofArabidopsisthaliana,PlantJ.16735-74；3)。然而，除了擬南芥之外，這些方法尚未在寬泛的不同植物品種之間廣泛使用。簡(jiǎn)而言之，花序浸漬法涉及用適當(dāng)?shù)母┩寥罈U菌菌株浸漬或噴灑開花植物。然后使由這些TO植物收集的種子在選擇性條件下發(fā)育，以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的Tl個(gè)體。實(shí)施例16證明了擬南芥的花序浸漬接種能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的擬南芥植物。其它的轉(zhuǎn)化的方法包括其中采用諸如土壤桿菌載體等載體對(duì)發(fā)育的種子或植物的秧苗進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。例如，可以通過將載體的懸浮液或載體混合物(即土壤桿菌)直接注射到發(fā)育的莢果的種子空穴內(nèi)，從而采用這種載體來轉(zhuǎn)化發(fā)育的種子(Wang和Waterhouse,1997,PlantMoI.Biol.Reporter15:209-215)?？梢园凑瘴墨I(xiàn)Yasseem，2009，PlantMoI.Biol.Reporter27:20-所述的方法轉(zhuǎn)化秧苗?？梢园凑瘴墨I(xiàn)Chee等，1989，PlantPysiol.91:1212-1218所述的方法轉(zhuǎn)化發(fā)育的種子。還可以采用果實(shí)內(nèi)方法，其中載體被注射到果實(shí)或發(fā)育的果實(shí)內(nèi)。其它的轉(zhuǎn)化方法包括其中針對(duì)花結(jié)構(gòu)進(jìn)行載體接種的那些方法，如花接種方法。上述的植物轉(zhuǎn)化方法可以用于將轉(zhuǎn)基因引入到大量的不同植物細(xì)胞和組織內(nèi)，所述植物細(xì)胞和組織包括而不限于完整的植物、組織和器官外植體(包括葉綠體、開花組織和細(xì)胞)、原生質(zhì)體、分裂組織細(xì)胞、愈傷組織、未成熟的胚芽和配子細(xì)胞(如花粉粒，花粉、精子和卵細(xì)胞)、上述物質(zhì)的任何組織培養(yǎng)細(xì)胞、可以由其生成可繁殖的再生植物的任意其它細(xì)胞。愈傷組織起源于以下的組織來源，其包括(但是不限于)未成熟的胚芽、秧苗頂端分生組織、花粉粒等。能夠增生為愈傷組織的細(xì)胞還能夠容納用于基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官再生單獨(dú)的植物的方法是已知的，并且針對(duì)大量植物品種進(jìn)行了描述。作為一個(gè)例子，將轉(zhuǎn)化的植物幼苗(得自轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織)在補(bǔ)充有在轉(zhuǎn)化方案中所用的選擇性試劑(即諸如卡那霉素等抗生素)的允許根生長(zhǎng)的介質(zhì)中培養(yǎng)。一旦生根，就將轉(zhuǎn)化的植物幼苗轉(zhuǎn)移至土壤中，并且允許其生長(zhǎng)至成熟。在開花后，優(yōu)選使成熟的植物自體受精(自受精)，并且收獲所得的種子，并且將其用于生長(zhǎng)出后代。實(shí)施例3-6描述了轉(zhuǎn)基因煙草和番茄植物的再生。通過一代或二代轉(zhuǎn)化株的自體受精或者通過使一代或二代轉(zhuǎn)化株與其它植物(轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化的植物)進(jìn)行有性雜交，Ttl轉(zhuǎn)基因植物可以用于生成后代(例如，1\、1~2等)。生長(zhǎng)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物選擇可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行選擇、篩選并且表征。本發(fā)明的優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出一種或多種表型特征，其表示增強(qiáng)的生長(zhǎng)和/或其它有利的農(nóng)學(xué)性能。通常在選擇性壓力下江轉(zhuǎn)基因植物再生，以在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的后代之前選擇轉(zhuǎn)化株。此外，所用的選擇壓力可以超過Ttl代，以便確保存在所需的轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)造體或盒?？梢酝ㄟ^選擇或篩選在用于轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)造體中所含的標(biāo)記基因的基因組成和/或編碼的表型特征，從而識(shí)別Ttl轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或植物。例如，可以通過使?jié)撛谵D(zhuǎn)化的植物、組織或細(xì)胞在含有抑制量的抗生素或除草劑(可以賦予轉(zhuǎn)化基因構(gòu)造體對(duì)其的抗性)生長(zhǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)，從而進(jìn)行選擇。此外，可以通過篩選可能存在于轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)造體中的標(biāo)記基因(如β-葡萄糖苷酸酶)的活性來確認(rèn)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織和植物。如所熟知的那樣，可以采用各種物理和生物化學(xué)方法來識(shí)別含有所需基因表達(dá)構(gòu)造體的植物。這些方法的例子包括用于識(shí)別轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)造體或其元件的Southern印跡分析或各種核酸擴(kuò)增方法(即PCR)；用于檢測(cè)并且確定RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的Northern印跡、Sl核糖核酸酶保護(hù)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)擴(kuò)增方法；以及用于識(shí)別由轉(zhuǎn)基因編碼并且表達(dá)的蛋白的蛋白凝膠電泳、Western印跡、免疫沉淀、酶聯(lián)免疫分析等。在另一種方法中，可以采用基因、蛋白和/或代謝化合物的表達(dá)水平(其已知由在目標(biāo)植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而調(diào)節(jié))來識(shí)別轉(zhuǎn)化株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用信號(hào)代謝物2-氧戊二酸酰胺的水平增加來篩選所需的轉(zhuǎn)化株。最終，可篩選出本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性和/或其它有利的農(nóng)學(xué)特性。實(shí)際上，為了確認(rèn)具有具有最快生長(zhǎng)速率、最高種子產(chǎn)率等的轉(zhuǎn)化譜系，某些程度的表型篩選通常是有利的，當(dāng)識(shí)別用于隨后的自體受精、雜交育種和回交育種的植物時(shí)尤其是如此。可以采用各種參數(shù)來實(shí)現(xiàn)該目的，其包括而不限于生長(zhǎng)速率、總鮮重、干重、種子和果實(shí)產(chǎn)率(數(shù)量、重量)、種子和/或種子莢產(chǎn)率、種子莢產(chǎn)率(例如數(shù)量、重量)、葉子大小、植物大小、增多的開花、開花的時(shí)間、總蛋白含量(在種子、果實(shí)、植物組織內(nèi))、具體的蛋白含量(即GS)、氮含量、游離氨基酸和具體的代謝化合物水平(即2-氧戊二酸酰胺)。通常，將這些表型測(cè)量結(jié)果與由親本的相同或類似植物譜系、未轉(zhuǎn)化的相同或類似植物或者相同或類似的野生型植物(即正常或親本植物)所獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。優(yōu)選的是，至少首先是，按照與測(cè)量正?；蛴H本植物中的所選表型特征一致的方式對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物中的相同特征進(jìn)行測(cè)量。通常，針對(duì)任何特定的表型特征，采用多個(gè)植物來確立轉(zhuǎn)基因植物的表型有利性和/或優(yōu)越性。優(yōu)選的是，選擇最初的轉(zhuǎn)化株，然后用其通過自體受精(自受精)生成Tl代和隨后的代，直至轉(zhuǎn)基因表型純一傳代為止(即植物對(duì)于轉(zhuǎn)基因而言是純合的)。這通過以下方法實(shí)現(xiàn)將其自體受精3或4代，在每一代篩選所需的特征，并且將這些個(gè)體進(jìn)行自體受精?？梢詫⒎€(wěn)定的轉(zhuǎn)基因譜系進(jìn)行雜交育種和回交育種，以產(chǎn)生具有任何數(shù)量的所需特征的品種，包括具有疊加的轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝等的那些品種。此外，可以通過用其它的轉(zhuǎn)基因或親本轉(zhuǎn)基因的附加拷貝對(duì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步進(jìn)行基因修飾。本發(fā)明還涵蓋由單個(gè)轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)化事件包括引入給定轉(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝或多種轉(zhuǎn)基因。各種常規(guī)的繁育方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言是熟知的(例如，參JALBreedingMethodsforCultivarDevelopment,WilcoxJ.ed.，AmericanSocietyofAgronomy,MadisonWis.(1987))。實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)一步進(jìn)行描述，并且通過以下的多個(gè)實(shí)施例進(jìn)行闡釋，這些實(shí)施例均無意義限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1擬南芥谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)基因的分離為了將直接參與信號(hào)代謝物2-氧戊二酸酰胺的合成的植物酶定位，申請(qǐng)人假定突變植物酶可以與已經(jīng)表征為參與2-氧戊二酸酰胺的合成的人蛋白具有一定程度的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。人蛋白谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶K(E.C.2.6.1.64)(在文獻(xiàn)中也稱為半胱氨酸結(jié)合物β-裂解酶、犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶以及其它名稱)已經(jīng)顯示出參與鹵化異源物質(zhì)的半胱氨酸結(jié)合物的處理(Perry等，1995，F(xiàn)EBSLetters360:277-280)。雖然不具有參與氮代謝的活性，但是人半胱氨酸半胱氨酸結(jié)合物裂解酶在人體和動(dòng)物內(nèi)具有脫毒活性(參考)。然而，該蛋白對(duì)于2-氧戊二酸酰胺的合成的潛在參與性受到了關(guān)注。通過采用人半胱氨酸結(jié)合物β-裂解酶的蛋白序列，經(jīng)過對(duì)TIGR擬南芥植物蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索確認(rèn)了一種潛在相關(guān)的序列(即由在Atlq77670的擬南芥基因位點(diǎn)的部分序列編碼的多肽)，它們?cè)谄ヅ涞膮^(qū)域之間具有約36%的序列同系性/一致性。隨后采用以下的引物對(duì)將該基因的全編碼區(qū)域由擬南芥cDNA庫(kù)(Stratagene)進(jìn)行擴(kuò)增5’-CCCATCGATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATG-3’5，-GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3，。這些引物被設(shè)計(jì)為并入CIaI(ATCGAT)和KpnI(GGTACC)限制件位點(diǎn)，以有利于隨后將其亞克隆至用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)載體內(nèi)。在以下條件下將TakaraExTaqDNA聚合酶用于高保真PCR開始在94°C下變性4分鐘；進(jìn)行94°C、30秒的30個(gè)循環(huán)，在55°C下退火30秒；在72°C下延伸90秒；最后在72°C下延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用CIaI和KpnI限制酶消化，由瓊脂糖凝膠電泳分離，并且將其連接入載體pMon316內(nèi)(Rogers等，1987MethodsinEnzymology153:253-277)，所述載體含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S組成型啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶(N0Q3’終止子。將連接物轉(zhuǎn)化入DH5ci細(xì)胞內(nèi)，并且對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行測(cè)序，以核實(shí)插入物。分離出1.3kb的cDNA，并且測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其編碼長(zhǎng)度為440個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)蛋白，包含突變?nèi)~綠體信號(hào)序列。實(shí)施例2制備生物活性的擬南芥谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶為了測(cè)試由按照上述實(shí)施例1所述方法分離的cDNA編碼的蛋白是否能夠催化2-氧戊二酸酰胺的合成，將cDNA在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，純化，并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法分析其合成2-氧戊二酸酰胺的能力。2-氧戊二酸酰胺的NMR分析簡(jiǎn)言之，將所得的純化蛋白加入到含有以下成分的反應(yīng)混合物中150mMTris-HCl(pH8.5)UmMβ巰基乙醇、200mM谷氨酰胺、IOOmM乙酸酸和200microM吡哆酸5’-磷酸鹽。將不加入測(cè)試蛋白的反應(yīng)混合物用作對(duì)照物。將測(cè)試和對(duì)照反應(yīng)混合物在37°C下孵育20小時(shí)，然后通過離心澄清，以除去沉淀的材料。使用精確化學(xué)合成的2-氧戊二酸酰胺作為參照，利用13CNMR測(cè)試上清液中2-氧戊二酸酰胺的存在及其量。反應(yīng)的產(chǎn)物為2-氧戊二酸酰胺和甘氨酸，而底物(谷氨酰胺和乙醛酸)大量減少。環(huán)狀的2-氧戊二酸酰胺產(chǎn)生明顯的信號(hào)，從而允許其容易地與開環(huán)的谷氨酰胺前體區(qū)分。2-氧戊二酸酰胺的HPLC分析GPT活性的另一種分析方法根據(jù)以下文獻(xiàn)的更改方法采用HPLC來確定2_氧戊二酸酰胺的產(chǎn)生=Calderon等，1985，JBacteriol161(2):807_809。簡(jiǎn)言之，更改的提取緩沖液由25mMTris-HCKpH8.5)UmMEDTA、20yMFAD、IOmM半胱氨酸和1.5%(ν/ν)巰基乙醇構(gòu)成。以約1/3的比例(w/v)將得自測(cè)試材料(即植物組織)的組織樣品加入到提取緩沖液內(nèi)，在37°C下孵育30分鐘并且用200μ1的20%TCA終止。在5分鐘后，將分析混合物離心，并且采用上清液通過HPLC對(duì)2-氧戊二酸酰胺定量，HPLC條件為采用I0N-3007.8mmIDX30cmL柱，流動(dòng)相為0.OlNh2S04，流速為約0.anl/min，在40°C下進(jìn)行。注射體積為約20μ1，并且保留時(shí)間為約38至39分鐘。采用210nm紫外光進(jìn)行檢測(cè)。采用NMR分析的結(jié)果該試驗(yàn)顯示，測(cè)試蛋白能夠催化2-氧戊二酸酰胺的合成。因此，這些數(shù)據(jù)表明，分離的cDNA編碼直接參與植物內(nèi)2-氧戊二酸酰胺的合成的谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶。因此，測(cè)試蛋白被稱為擬南芥谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶或“GPT”。擬南芥GPT編碼序列的核苷酸序列示于序列表中的SEQIDNO.1。GPT蛋白的轉(zhuǎn)譯的氨基酸序列示于SEQIDNO.2中。實(shí)施例3產(chǎn)生過度表達(dá)擬南芥GPT的轉(zhuǎn)基因煙草植物獲得棺物表汰載體dMON-P.TU簡(jiǎn)言之，按照如下方式構(gòu)造植物表達(dá)載體pMon316-PJU。將分離的編碼擬南芥GPT的cDNA(實(shí)施例1)克隆入pM0N316載體的Clal-Kpnl多聚接頭位點(diǎn)，其將GPT基因置于組成型花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶(N0Q轉(zhuǎn)錄終止子的控制下。引入卡那霉素抗性基因以提供選擇性標(biāo)記物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棺物轉(zhuǎn)化使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔方法將pMON-PJU和對(duì)照載體pMon316(沒有插入的DNA)轉(zhuǎn)移至根癌農(nóng)桿菌菌株pTiTT37ASE內(nèi)(McCormac等，1998，MolecularBiotechnology9155-159)，隨后將其涂敷至含有抗生素奇霉素(100微克/ml)和卡那霉素(50微克/ml)的LB板上。通過PCR檢測(cè)農(nóng)桿菌的抗生素抗性克隆，以確保它們含有質(zhì)粒。采用Horsch等(Horsch等1995，Science227:1229-1231)的葉盤轉(zhuǎn)化體系、用pMON-PJU轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化珊西煙(Nicotianatabacumcv.Xanthi)植物。簡(jiǎn)言之，將滅菌葉盤接種，并且培養(yǎng)2天，然后將其轉(zhuǎn)移至含有100μg/ml卡那霉素和500μg/ml的凱福隆(clafaran)的選擇性MS基質(zhì)內(nèi)。確認(rèn)轉(zhuǎn)化株在選擇性基質(zhì)內(nèi)形成根的能力。產(chǎn)生GPT轉(zhuǎn)化煙草植物允許滅菌葉片段在Murashige&Skoog(M&S)基質(zhì)上發(fā)育出愈傷組織，由此得到轉(zhuǎn)化株幼苗。然后將這些幼苗轉(zhuǎn)移至允許生根的選擇性基質(zhì)(M&S基質(zhì)，其中卡那霉素作為選擇試劑)上。然后將健康并且已經(jīng)生根的轉(zhuǎn)化煙草幼苗轉(zhuǎn)移至土壤內(nèi)，并且允許其生長(zhǎng)至成熟，并且在開花后，使植物自體受精，并且收獲所得的種子。在生長(zhǎng)階段，已經(jīng)檢測(cè)了植物的生長(zhǎng)表型，并且測(cè)量了許多幼小轉(zhuǎn)基因植物的(X)2固定速率。產(chǎn)生Tl代和T2代GPT轉(zhuǎn)基因植物收獲的種子形成轉(zhuǎn)基因煙草植物的Ttl代，使其在含有卡那霉素(100mg/L)的M&S基質(zhì)上發(fā)芽，以富集轉(zhuǎn)基因。至少四分之一的種子在該基質(zhì)上不會(huì)發(fā)芽(預(yù)期卡那霉素抑制沒有抗性的種子發(fā)芽，這是由于基因的正常基因分離而產(chǎn)生的)，并且其余的種子中超過一半被除去，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)了其對(duì)卡那霉素的敏感性(甚至是中度敏感)。使得存活的植物(1\代)繁育，然后使這些植物自體受精，以產(chǎn)生T2代的種子。使得自T1代的種子在補(bǔ)充有含卡那霉素(IOmg/升)的轉(zhuǎn)化株譜系的MS基質(zhì)上發(fā)芽。在14天后，將它們轉(zhuǎn)移到沙土上，并且提供1/4強(qiáng)度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(其補(bǔ)充有25mM硝酸鉀)。在900微摩爾/立方米/秒的光強(qiáng)度下，使得它們?cè)谙律L(zhǎng)經(jīng)過16小時(shí)的光照期和8小時(shí)的黑暗期。在將它們轉(zhuǎn)移至沙土培養(yǎng)物之后14天進(jìn)行收獲。GPT轉(zhuǎn)基因棺物的表征分析收獲的轉(zhuǎn)基因植物(GPT轉(zhuǎn)基因以及載體對(duì)照轉(zhuǎn)基因)在根和葉子內(nèi)的谷氨酰胺合成酶活性、完整植物的鮮重、根和葉子內(nèi)的蛋白含量和CO2固定速率(Knight等，1988,PlantPhysiol.88:333)。還就相同的參數(shù)分析了未轉(zhuǎn)化的根癌土壤桿菌植物和野生型根癌土壤桿菌植物，以便確立基線對(duì)照。生長(zhǎng)特性結(jié)果列于以下的表1中。此外，GPT轉(zhuǎn)基因植物與野生型對(duì)照植物的比較照片示于圖2中(與GSl轉(zhuǎn)基因煙草植物一起)。在所有評(píng)價(jià)的參數(shù)中，GPT轉(zhuǎn)基因煙草植物顯示出增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性。特別是，與野生型對(duì)照植物相比，GPT轉(zhuǎn)基因植物的(X)2固定速率表現(xiàn)出50%的增加，并且在葉子組織內(nèi)的谷氨酰胺合成酶的活性表現(xiàn)出大于2倍的增加。此外，與野生型對(duì)照植物相比，在轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)基因植物中葉至根的GS比例增加了幾乎三倍。與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植物的鮮重和總蛋白量還分別增加了約50%和80%(葉子)。這些數(shù)據(jù)證明了過量表達(dá)擬南芥GPT轉(zhuǎn)基因的煙草植物實(shí)現(xiàn)了顯著增強(qiáng)的生長(zhǎng)和CO2固定速率。表權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因植物，包含與植物啟動(dòng)子可操作地連接的GPT轉(zhuǎn)基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述GPT轉(zhuǎn)基因編碼具有選自由以下序列組成的組中的氨基酸序列的多肽，并且具有GPT活性(a)SEQIDN0:2、SEQIDNO:9、SEQIDNO:15,SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO24、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO35和SEQIDNO:36；以及(b)與SEQIDNO:2、SEQIDNO:9、SEQIDNO:15、SEQIDNO:19,SEQIDNO:21、SEQIDNO24、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33,SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36中的任一者具有至少75%一致性的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述GPT轉(zhuǎn)基因引入所述植物的基因組內(nèi)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，其還被限定為單子葉植物。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，其還限定為雙子葉植物。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物的任意代次的后代，其中所述后代包含所述GPT轉(zhuǎn)基因。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物的任意代次的種子，其中所述種子含有所述GPT轉(zhuǎn)基因。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的生長(zhǎng)速率。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的生物量產(chǎn)率。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的種子產(chǎn)率。11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的花朵或花蕾產(chǎn)率。12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的果實(shí)或莢果產(chǎn)率。13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出較大的葉子。14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的GPT活性。15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的GS活性。16.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的2-氧戊二酸酰胺水平。17.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)與類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，其顯示出提高的氮利用效率。18.—種產(chǎn)生相對(duì)于類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性的植物的方法，包括(a)將GPT轉(zhuǎn)基因引入所述植物內(nèi)，并且進(jìn)行表達(dá)；以及(b)選擇這樣的植物，該植物相對(duì)于不含GPT轉(zhuǎn)基因的相同品種的植物具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性選自由以下方面組成的組提高的生物量、較高開花、較早發(fā)芽、增加的植物高度、增加的開花量、增加的發(fā)芽率、較大的葉子、增加的果實(shí)或莢果產(chǎn)率以及增加的種子產(chǎn)率。20.一種產(chǎn)生相對(duì)于類似野生型植物或未轉(zhuǎn)化的植物具有增加的氮利用效率的植物的方法，包括(a)將GPT轉(zhuǎn)基因引入所述植物內(nèi)，并且進(jìn)行表達(dá)；(b)選擇這樣的植物，該植物相對(duì)于不含GPT轉(zhuǎn)基因的相同品種的植物具有增加的氮利用效率。21.根據(jù)權(quán)利要求18、19或20所述的方法，還包括由這樣選擇的種子使所述植物繁殖，并且由所述植物收獲種子。全文摘要本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物以及產(chǎn)生生長(zhǎng)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出提高的生長(zhǎng)速率、種子和果實(shí)產(chǎn)率和總生物量產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了被工程化為過度表達(dá)谷氨酰胺苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的轉(zhuǎn)基因植物。文檔編號(hào)C12N5/10GK102387701SQ200980134337公開日2012年3月21日申請(qǐng)日期2009年8月31日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者P·J·安克福,P·S·安德森,T·J·奈特申請(qǐng)人:洛斯阿拉莫斯國(guó)家安全有限公司,緬因大學(xué)系統(tǒng)理事會(huì)