專利名稱：用于在去偶聯(lián)條件和/或安全操作范圍下產(chǎn)生不含c5烴的異戊二烯的方法和組合物的制作方法
用于在去偶聯(lián)條件和/或安全操作范圍下產(chǎn)生不含C5烴的異戊二烯的方法和組合物與相關(guān)申請的交叉參照本申請要求2008年7月2日提交的美國臨時申請61/134，094、2008年7月2日提交的美國臨時申請61/133，947和2008年7月2日提交的美國臨時申請61/134，011的優(yōu)先權(quán)，上述各個美國臨時申請的內(nèi)容在此完整引入作為參考。
背景技術(shù)：
異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多種合成聚合物的關(guān)鍵起始材料，最典型的是合成橡膠的關(guān)鍵起始材料。異戊二烯由多種微生物、植物和動物物種天然產(chǎn)生。特別地， 已鑒定出異戊二烯的兩種生物合成途徑甲羥戊酸(MVA)途徑和非甲羥戊酸(DXP)途徑(

圖19)。然而，來自天然生物體的異戊二烯的產(chǎn)量在商業(yè)上并不具吸引力。每年約800，000噸順式-聚異戊二烯產(chǎn)生自異戊二烯的聚合；這種聚異戊二烯大部分用在輪胎和橡膠工業(yè)。異戊二烯還共聚合，用作其他產(chǎn)品中的合成高彈體，如鞋類、機(jī)械產(chǎn)品、醫(yī)療產(chǎn)品、運(yùn)動產(chǎn)品和乳膠。目前，輪胎和橡膠工業(yè)基于天然和合成橡膠的使用。天然橡膠獲自橡膠樹或非洲雨林中發(fā)現(xiàn)的植物的乳汁。合成橡膠主要基于丁二烯聚合物。對于這些聚合物，丁二烯作為乙烯和丙烯生產(chǎn)的副產(chǎn)物而獲得。雖然異戊二烯可以通過石油分餾而獲得，但是這一物質(zhì)的純化是昂貴且耗時的。C5烴流的石油裂解只產(chǎn)生約15%的異戊二烯。因此，需要更加經(jīng)濟(jì)的方法來生產(chǎn)異戊二烯。尤其是，需要以足以滿足強(qiáng)大的商業(yè)加工需求的速度、滴定度和純度來生產(chǎn)異戊二烯的方法。還需要用于由廉價的起始材料生產(chǎn)異戊二烯的系統(tǒng)。發(fā)明概述—方面,本發(fā)明描述了產(chǎn)生異戍二烯的培養(yǎng)的細(xì)胞(cells in culture)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供培養(yǎng)的細(xì)胞，該細(xì)胞產(chǎn)生以異戊二烯的細(xì)胞濕重/小時(納摩爾/gWCffl/hr)計，大于約400納摩爾的異戊二烯/克細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有異源核酸，其(i)編碼異戊二烯合酶多肽和(ii)與啟動子有效連接。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于糖類、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質(zhì)、磷脂、甘油脂質(zhì)(glycerolipid)、單酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白質(zhì)或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分，或前述兩種或多種物質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在限量葡萄糖條件下培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供培養(yǎng)的細(xì)胞，該細(xì)胞將細(xì)胞培養(yǎng)基中大于約0.002%的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有異源核酸，其(i)編碼異戊二烯合酶多肽和(ii)與啟動子有效連接。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于糖類、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質(zhì)、磷脂、甘油脂質(zhì)、單酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白質(zhì)或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分，或前述兩種或多種物質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在限量葡萄糖條件下培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供培養(yǎng)的細(xì)胞，該細(xì)胞包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有異源核酸，其(i)編碼異戊二烯合酶多肽和(ii)與啟動子有效連接。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于糖類、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質(zhì)、磷脂、甘油脂質(zhì)、單酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白質(zhì)或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分，或前述兩種或多種物質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在限量葡萄糖條件下培養(yǎng)。一方面，本發(fā)明描述了產(chǎn)生異戊二烯的方法，如使用本文所述的任意細(xì)胞來產(chǎn)生異戊二烯的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法涉及在足以產(chǎn)生大于約400納摩爾異戊二烯/gway小時的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括回收由該細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該方法包括純化由該細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，·該方法包括聚合異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有異源核酸，其(i)編碼異戊二烯合酶多肽和(ii)與啟動子有效連接。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于糖類、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動物脂肪、動物油、月旨肪酸、脂質(zhì)、磷脂、甘油脂質(zhì)、單酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白質(zhì)或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分，或前述兩種或多種物質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在限量葡萄糖條件下培養(yǎng)。在多種實(shí)施方案中，在穩(wěn)定期產(chǎn)生的異戊二烯的量(如產(chǎn)生的異戊二烯的總量或每升培養(yǎng)液每小時每OD6tltl產(chǎn)生的異戊二烯的量)大于在生長期相同時長產(chǎn)生的異戊二烯的量，或?yàn)槠涞募s2倍或更多倍生長期。在一些實(shí)施方案中，氣相包含大于或約為9. 5% (體積)的氧氣，且氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限(lower flammability limit)或大于自燃的上限(upperfIammabilitylimit)。在特定實(shí)施方案中，(i)氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限或大于自燃的上限，且(ii)細(xì)胞產(chǎn)生大于約400納摩爾異戊二烯/gWM/小時。在一些實(shí)施方案中，該方法包括在足以將細(xì)胞培養(yǎng)基中大于約0.002%的碳(摩爾/摩爾)轉(zhuǎn)化成異戊二烯的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括回收由該細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該方法包括純化由該細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該方法包括聚合異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有異源核酸，其(i)編碼異戊二烯合酶多肽和(ii)與啟動子有效連接。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該碳源例如但不限于糖類、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質(zhì)、磷脂、甘油脂質(zhì)、單酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白質(zhì)或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分，或前述兩種或多種物質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在限量葡萄糖條件下培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，僅在穩(wěn)定期產(chǎn)生異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，在生長期和穩(wěn)定期產(chǎn)生異戊二烯。在多種實(shí)施方案中，在穩(wěn)定期產(chǎn)生的異戊二烯的量(如產(chǎn)生的異戊二烯的總量或每升培養(yǎng)液每小時每0D600產(chǎn)生的異戊二烯的量)大于在生長期相同時長產(chǎn)生的異戊二烯的量，或?yàn)槠涞募s2、3、4、5、10、20、30、40、50或更多倍。—方面，本發(fā)明描述了產(chǎn)生包含異戍二烯的組合物和系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含大于或約 2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000毫克異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含大于或約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100克異戊二烯(w/w)，異戊二烯是該組合物的揮發(fā)性有機(jī)組份。在一些實(shí)施方案中，與該組合物中的全部C5烴的總重量相比，該組合物包含以重量計大于或約99. 90,99. 92,99. 94,99. 96,99. 98或100 %的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，與該組合物中的全部C5烴的總重量相比，該組合物包含以重量計小于或約0. 12、0.10,0.08,0.06,0.04,0.02,0.01,0. 005,0. 001,0. 0005,0.0001,0. 00005 或 0.00001 %C5烴并非異戊二烯(如1，3_環(huán)戊二烯、順式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、I-戊炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、反式-戍間二烯、順式-戍間二烯、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔或順式-戊-3-烯-I-炔)。在一些實(shí)施方案中，與該組合物中的全部C5烴的總重量相比,該組合物包含以重量計小于或約0. 12、0. 10、0. 08、0. 06,0. 04,0. 02,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005,0. 0001,0. 00005 或 0. 00001% 的 1，3_ 環(huán)戊二烯、順式-I，3-戍二烯、反式-1,3-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲 基_1_ 丁炔、反式_戍間二烯、順式_戍間二烯、戍_4_烯-I-炔、反式-戍-3-烯-I-炔或順式-戊-3-烯-I-炔。在特定實(shí)施方案中，該組合物具有大于約2mg的異戊二烯，且與該組合物中的全部C5烴的總重量相比，以重量計具有大于或約99. 90,99. 92,99. 94,99. 96、99. 98或100%的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含小于或約50、40、30、20、10、5、1、0. 5,0. 1,0. 05、
0. 01，或0. 005 u g/L化合物，該化合物抑制用于抑制異戊二烯聚合的組合物中的任意化合物的異戊二烯聚合。在特定實(shí)施方案中，該組合物還具有大于約2mg異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該組合物具有一種或多種化合物，該化合物選自乙醇、丙酮、C5異戍烯醇(prenyl alcohol)和具有10個或更多個碳原子的類異戍二烯化合物。在一些實(shí)施方案中，該組合物具有大于或約 0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120 ii g/L乙醇、丙酮、C5異戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-I-醇或3-甲基_2_ 丁烯-I-醇)，或任意前述兩種或更多物質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，該組合物還具有大于約2mg異戊二烯且具有一種或多種化合物，該化合物選自乙醇、丙酮、C5異戊烯醇和具有10個或更多個碳原子的類異戊二烯化合物。在一些實(shí)施方案中，該組合物包括異戊二烯和一種或多種第二化合物，該化合物選自2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-I-烯酯、乙酸3_ 甲基-2- 丁 _1_ 稀酷、(E) -3, 7- _■甲基-1, 3,6_ —羊二稀、(Z) -3, 7- _■甲基-I，3,6_ —辛三烯和2, 3-環(huán)庚烯卩密唳(cycloheptenolpyridine)。在多種實(shí)施方案中，這些第二組份之一的量相對于以重量百分比單位計的異戊二烯的量(即組份的重量除以異戊二烯的重量，乘以 100)是大于或約 0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 或 110% (w/w)。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含(i)包含異戊二烯的氣相和(ii)產(chǎn)生大于約400納摩爾異戊二烯/gwcm/小時的培養(yǎng)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含封閉系統(tǒng)，且氣相包含大于或約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ii g/L異戊二烯(當(dāng)歸一化為培養(yǎng)I小時的I個0D_的ImL)。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含開放系統(tǒng)，且氣相包含大于或約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ii g/L異戊二烯(當(dāng)以Ivvm的速度噴射時)。在一些實(shí)施方案中，與揮發(fā)性有機(jī)級分中的全部C5烴的總重量相比,氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分包含以重量計大于或約99. 90,99. 92,99. 94,99. 96,99. 98，或100%異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，與揮發(fā)性有機(jī)級分中的全部C5烴的總重量相比，氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分包含以重量計小于或約 0. 12,0. 10,0. 08,0. 06,0. 04,0. 02,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005、0. 0001,0. 00005或0. 00001 %C5烴，而非異戊二烯(如I，3-環(huán)戊二烯、順式-I，3-戊二烯、反式-I，3-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯,2-甲基-I-丁烯、3-甲基-I-丁炔、反式-戍間二烯、順式-戍間二烯、戍_4_烯-I-炔、反式-戍-3_烯-I-炔或順式-戍-3_烯-I-炔)。在一些實(shí)施方案中，與揮發(fā)性有機(jī)級分中的全部C5烴的總重量相比，氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分包含以重量計小于或約 0. 12,0. 10,0. 08,0. 06,0. 04,0. 02,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005、
0.0001,0. 00005 或 0. 00001% 的 1，3-環(huán)戊二烯、順式 _1，3-戊二烯、反式 _1，3_ 戊二烯、
·I-戍炔、2_戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、反式-戍間二烯、順式_戍間二烯、戍_4_烯-I-炔、反式-戍-3-烯-I-炔或順式-戍-3-烯-I-炔。在特定實(shí)施方案中，該氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分具有大于約2mg的異戊二烯，且與揮發(fā)性有機(jī)級分中的全部C5烴的總重量相比，以重量計具有大于或約99. 90,99. 92,99. 94,99. 96,99. 98或100%的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分包含小于或約50、40、30、20、10、5、
1、0.5、0. 1、0. 05、0. 01或0. 005 ii g/L化合物，該化合物抑制(抑制異戊二烯聚合的)氣相揮發(fā)性有機(jī)級分中的任意化合物的異戊二烯聚合。在特定實(shí)施方案中，該氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分還具有大于約2mg異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分具有一種或多種化合物，該化合物選自乙醇、丙酮、C5異戊烯醇和具有10個或更多個碳原子的類異戊二烯化合物。在一些實(shí)施方案中，該氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分具有大于或約0. 005、0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120 u g/L乙醇、丙酮、C5異戊烯醇(例如3-甲基-3- 丁烯-I-醇或3-甲基-2-丁烯-I-醇)，或任意前述兩種或更多物質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，該氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分還具有大于約2mg異戊二烯且具有一種或多種化合物，該化合物選自乙醇、丙酮、C5異戊烯醇和具有10個或更多個碳原子的類異戊二烯化合物。在一些實(shí)施方案中，該氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分包含異戊二烯和一種或多種第二化合物，該化合物選自2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2，4，5_三甲基吡啶、2，3，5_三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-I-烯酯、乙酸3-甲基-2- 丁 -I-烯酯、(E) -3，7- 二甲基-I，3，6- —辛三烯、(Z) -3，7- 二甲基-1，3，6-—辛三烯和2，3-環(huán)庚烯嘧啶。在多種實(shí)施方案中，氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分中的這些第二組份之一的量相對于以重量百分比單位計的異戊二烯的量(即組份的重量除以異戊二烯的重量，乘以 100)是大于或約 0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 或 110% (w/w)。
在本發(fā)明任意組合物的一些實(shí)施方案中，至少部分異戊二烯處于氣相。在一些實(shí)施方案中，至少部分異戊二烯處于液相(如冷凝物)。在一些實(shí)施方案中，至少部分異戊二烯處于固相。在一些實(shí)施方案中，至少部分異戊二烯被固體支持物吸附，如包括二氧化硅和活性炭的支持物。在一些實(shí)施方案中，該組合物包括乙醇。在一些實(shí)施方案中，該組合物以重量計包括約75到約90%的乙醇，如以重量計約75到約80%、約80到約85%，或約85到約90%的乙醇。在一些實(shí)施方案中，該組合物以重量計包括約4到約15%的異戊二烯，如以重量計約4到約8%、約8到約12%，或約12到約15%的異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還描述了包括本文所述的任意細(xì)胞和/或組合物的系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括生物反應(yīng)器，該腔室包含培養(yǎng)的細(xì)胞，該細(xì)胞產(chǎn)生大于約 400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000,4,000、5，000或更多納摩爾異戊二烯/gWM/小時。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)不是封閉系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，至少該部分異戊二烯從系統(tǒng)中去除。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括包含異戊二烯的氣相。在多種實(shí)施方案中，該氣相包含本文所述的任意組合物。在一方面，本發(fā)明提供包含聚異戊二烯的輪胎。在一些實(shí)施方式中，該聚異戊二烯·是由(i)聚合在本文所述的任意組合物中的異戊二烯或(ii)聚合由本文所述的任意組合物回收的異戊二烯所產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方式中，聚異戊二烯包含順式-1，4-聚異戊二烯。本發(fā)明的任意組合物、系統(tǒng)和方法的一些實(shí)施方案中，在氣相中產(chǎn)生不燃性濃度的異戍二烯。在一些實(shí)施方案中，該氣相包含小于約9. 5% (體積)的氧氣。在一些實(shí)施方案中，該氣相包含大于或約9. 5% (體積)的氧氣，且氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限(lower flammability limit)或大于自燃的上限(upper flammabiIity limit)。在一些實(shí)施方案中，該氣相的非異戊二烯部分包含約0%至約100% (體積)的氧氣，如約10%至約100% (體積)的氧氣。在一些實(shí)施方案中，該氣相的非異戊二烯部分包含約0%至約99% (體積)的氮?dú)狻Ｔ谝恍?shí)施方案中，該氣相的非異戊二烯部分包含約1%至約50%(體積)的二氧化碳。本發(fā)明的任意方面的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生大于或約400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000,4, 000,5, 000，或更多納摩爾異戊二烯/gwcm/小時。本發(fā)明的任意方面的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞將細(xì)胞培養(yǎng)基中大于或約 0. 002,0. 005,0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 12,0. 14,0. 16,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 2,1. 4、1. 6%或更多的碳轉(zhuǎn)化為異戊二烯。本發(fā)明的任意方面的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生大于或約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3,000,4,000,5,000,10,000、100，000，或更多納摩爾異戊二烯/以細(xì)胞濕重計的細(xì)胞克數(shù)/小時(納摩爾/gwc;n/小時)。本發(fā)明的任意方面的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生大于或約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1,500,1,750,2,000,2,500、3，000,4, 000,5, 000、10，000、100，000或更多毫克異戊二烯/升培養(yǎng)液(毫克/升培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的體積)的累積滴定度(總量)。本文公開了其他其他示例性異戊二烯產(chǎn)生速率和異戊二烯總產(chǎn)量。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸拷貝的插入片段。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸拷貝的插入片段。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，一種載體編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，載體包含選擇標(biāo)記，如抗生素抗性核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接17啟動子，例如在中或高拷貝質(zhì)粒中含有的T7啟動子。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接Trc啟動子，例如在中或高拷貝質(zhì)粒中含有的Trc啟動子。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接Lac啟動子，例如在低拷貝質(zhì)粒中含有的Lac啟動子。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，異源異戊二烯合酶核酸有效連接內(nèi)源啟動子，例如內(nèi)源性堿性絲氨酸蛋白酶啟動子。在一些實(shí)施方式中，異源異戊二烯合酶核酸整合到不帶選擇標(biāo)記的細(xì)胞的染色體中。在一些實(shí)施方案中，一種或更多MVA途徑、IDI、DXP或異戊二烯合酶核酸置于在穩(wěn)·定期比在生長期更有活性的啟動子或因子的調(diào)控下。例如，一種或更多MVA途徑、IDI, DXP或異戊二烯合酶核酸置于穩(wěn)定期O因子如RpoS的調(diào)控下。在一些實(shí)施方案中，一種或更多MVA途徑、IDI、DXP或異戊二烯合酶核酸置于在穩(wěn)定期誘導(dǎo)的啟動子的調(diào)控下，如在穩(wěn)定期有活性的應(yīng)答調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)的啟動子的調(diào)控下。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，至少一部分細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)(如未稀釋的連續(xù)培養(yǎng))的至少或約5、10、20、40、50、60、65或更多次的細(xì)胞分裂中維持異源異戊二烯合酶核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，包括異戊二烯合酶、IDI或DXS核酸的核酸也包括選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼MVA途徑多肽(例如來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)或幾腸球菌(Enterococcus faecalis)的 MVA 途徑多肽)的異源核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含編碼MVA途徑多肽(例如來自釀酒酵母或糞腸球菌的MVA途徑多肽)的內(nèi)源核酸拷貝的插入片段。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含異戊二烯合酶、DXS和MVA途徑核酸。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和MVA途徑核酸(除了 IDI核酸以外)。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，異戊二烯合酶多肽是天然多肽，其來自植物如葛屬(Pueraria)(例如，葛麻姆(Pueraria montana)或野葛(Pueraria Iobata))。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(例如芽孢桿菌屬細(xì)胞如枯草桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞，或鏈霉菌屬(Streptomyces)細(xì)胞，如淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)或灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)細(xì)胞)。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞(例如埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞(Escherichia coli),或泛菌屬(Pantoea)細(xì)胞如朽1檬泛菌(Pantoeacitrea)細(xì)胞)。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是真菌細(xì)胞如絲狀真菌細(xì)胞(例如木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞如里氏木霉(Trichodermareesei)細(xì)胞或曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)或酵母細(xì)胞(如耶氏酵母屬(Yarrowia)細(xì)胞如解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)細(xì)胞)。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，微生物多肽碳源包括來自酵母或細(xì)菌的一或多種多肽。在本發(fā)明任意方面的一些實(shí)施方案中，植物多肽碳源包括來自大豆、玉米、卡諾拉油菜(canola)、麻風(fēng)樹、棕櫚樹、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻或亞麻籽的一種或多種多肽。在一方面，本發(fā)明描述了由任何的本發(fā)明組合物或方法所產(chǎn)生的產(chǎn)物。附圖簡述圖I是用于在大腸桿菌中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID N0:1)。atg起始密碼子為斜體，終止密碼子為粗體而添加的PstI位點(diǎn)有下劃線。
·
圖2 是 pTrcKudzu 的圖譜。圖3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO 2) JBS有下劃線，野葛異戊二烯合酶起始密碼子為粗體大寫字母而終止密碼子為粗體、大寫、斜體字母。載體骨架是pTrcHis2B。圖4 是 pETNHisKudzu 的圖譜。圖5 是 pETNHisKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :5)。圖6 是 pCL-lac-Kudzu 的圖譜。圖7 是 pCL-lac-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。圖8A是表示在沒有載體的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的圖。圖8B是表示在具有pCL-lac-Kudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的圖。圖8C是表示在具有pTrcKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的圖。圖8D是表示在具有pETN-HisKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的圖。圖9A是表示在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中大腸桿菌BL21/pTrcKudzu隨發(fā)酵進(jìn)程的OD的圖。圖9B是表示在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中大腸桿菌BL21/pTrcKudzu隨發(fā)酵進(jìn)程的異戊二烯產(chǎn)生的圖。圖IOA是表示在檸檬泛菌中的異戊二烯產(chǎn)生的圖。對照細(xì)胞沒有重組野葛異戊二烯合酶?；疑庑伪聿划愂┖铣桑谏綁K表不0D_。圖IOB是表示在表達(dá)pCL-lac Kudzu的檸檬泛菌中異戊二烯的產(chǎn)生的圖?；疑庑伪硎井愂┖铣?，黑色方塊表示0D_。圖IOC是表示在表達(dá)pTrcKudzu的檸檬泛菌中的異戊二烯產(chǎn)生的圖?；疑庑伪硎井愂┖铣?，黑色方塊表示0D_。圖11是表示在表達(dá)重組異戊二烯合酶的枯草桿菌中的異戊二烯產(chǎn)生的圖。BG3594comK是沒有質(zhì)粒的枯草桿菌菌株(天然異戊二烯產(chǎn)生)。CF443_BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草桿菌菌株(重組異戍二烯產(chǎn)生)。y_軸上的IS表示異戍二烯。圖12 是 pBS Kudzu#2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 57)。圖13是用于在耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 8)。圖14是包含用于在耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶基因的pTrex3g 圖譜。圖15 是載體 pSPZl(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO 11) 圖16是用于在耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的合成的野葛(葛麻姆)異戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)。圖17是合成的雜交楊(銀白楊X歐洲山楊(Populus alba x Populustremula))異戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 13)。ATG起始密碼子為粗體而終止密碼子有下劃線。圖18A表示描繪載體pYLAl、pYLl和pYL2的構(gòu)建的示意圖。圖18B表示描繪載體pYLA(POPl)的構(gòu)建的示意圖。圖18C表示描繪載體pYLA(KZl)的構(gòu)建的示意圖。·圖18D表示描繪載體pYLl (KZl)的構(gòu)建的示意圖。圖18E表示描繪載體pYLl (MAP29)的構(gòu)建的示意圖。圖18F表示描繪載體pYLA(MAP29)的構(gòu)建的示意圖。圖19表示異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(根據(jù)F. Bouvier等人，Progress inLipid Res. 44 =357-429,2005)。下面的描述包括對于途徑中每種多肽的替代名稱以及公開有用于測量所示多肽活性的測定法的參考(這些參考各在此通過整體引用作為參考，特別是對于在MVA和DXP途徑中的多肽的多肽活性測定法)。甲羥戊酸途徑AACT ；乙?；?CoA乙酰基轉(zhuǎn)移酶，MvaE, EC 2. 3. I. 9. Assay J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；HMGS ;羥甲基戊二?；?CoA 合成酶，MvaS, EC 2. 3. 3. 10. Assay JBacteriol.，184 :4065-4070, 2002 ；HMGR ；3-羥基-3-甲基戊二?；?CoA 還原酶，MvaE, EC I. I. I. 34. Assay I Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；MVK ;甲羥戊酸激酶，ERG 12，EC 2. 7. I. 36. Assay Curr Genet 19 9-14，1991.PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC 2. 7. 4. 2, Assay Mol Cell Biol. , 11 620-631，1991 ；DPMDC ;二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVDI, BC 4. I. I. 33. Assay biochemistry,33 :13355-13362,1994 ;IDI ;異戊烯二磷酸 8 異構(gòu)酶，IDI1, EC 5. 3. 3. 2. Assay I Biol.Chem. 264 :19169-19175，1989。DXP 途徑DXS ; I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs, BC2. 2. I. 7. Assay PNAS,94 :12857-62，1997 ；DXR ；1-脫氧 _D_ 木酮糖 ~5~ 磷酸還原異構(gòu)酶，dxr, BC2. 2. I. 7. Assay Eur. I Biochem. 269 :4446-4457,2002 ；MCT ；4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D 赤蘚糖醇合酶，IspD, EC 2. 7. 7. 60. Assay PNAS,97 :6451-6456,2000 ；CMK ；4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D 赤蘚糖醇激酶，IspE, BC 2. 7. I. 148. Assay PNAS,97 1062-1067,2000 ;MCS ;2C-甲基-D-赤蘚糖醇 2，4-環(huán)二磷酸合酶，IspF, BC 4. 6. I. 12.Assay PNAS,96 :11758-11763，1999 ；HDS ；1-羥基-2-甲基-2-(E)- T 烯基 _4_ 二磷酸合酶，ispG, EC I. 17. 4. 3. Assay I Org. Chem.，70 :9168_9174，2005 ;HDR ;1_ 羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶，IspH，BC I. 17. I. 2. Assay :JACS，126 :12847-12855，2004。圖20表示由沒有(左)或具有(右)野葛異戊二烯合酶基因的重組解脂耶氏酵母菌株產(chǎn)生的異戊二烯的GC-MS分析結(jié)果的圖。箭頭表示可信的異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)的洗脫時間。圖 21 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的圖。圖22 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 20)。圖23A是表示在BL21/pTrcKudzukan中從葡萄糖產(chǎn)生異戍二烯的圖。時間0是以IPTG(400umol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力O g/L頂空(headspace)或比生產(chǎn)力(U g/L頂空/OD)。菱形表示0D_,圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23B是表示在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中從葡萄糖產(chǎn)生的異戊二烯的圖。時間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。菱形表示0D_，圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23C是表示在BL21/pTrcKudzu DXS kan中從葡萄糖產(chǎn)生的異戊二烯的圖。時間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。菱形表示0D_，圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23D是表示在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中從葡萄糖產(chǎn)生的異戍二烯的圖?！r間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是OD6tltl并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。菱形表示0D_，圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23E是表示在BL21/pCL PTrcKudzu中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的圖。時間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。菱形表示0D_，圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23F是表示在BL21/pCL PTrcKudzu yIDI中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的圖。時間0是以IPTG (400 ii mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。菱形表示0D_，圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23G是表示在BL21/pCL PTrcKudzu DXS中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的圖。時間0是以IPTG (400 ii mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。菱形表示0D_，圓圈表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖23H是表示在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中從葡萄糖產(chǎn)生的異戍二烯的圖。箭頭指示以IPTG(400 ii mol)誘導(dǎo)的時間。x軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)力g/L頂空或比生產(chǎn)力(y g/L頂空/0D)。黑色菱形表示0D_，黑色三角表示總異戊二烯生產(chǎn)力(Ug/L)而白色方塊表示異戊二烯的比生產(chǎn)力(Ug/L/OD)。圖24 是 pTrcKKDylkIS kan 的圖譜。圖25 是 pTrcKKDylkIS kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)。圖26 是 pCL PtrcUpperPathway 的圖譜。圖27 是 pCL PtrcUpperPathway 的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)。圖28表示含有下游MVA途徑和用于整合到枯草桿菌染色體nprE基因座的酵母idi的表達(dá)盒的圖譜。nprE上游/下游表示來自nprE基因座用于整合的各Ikb序列。aprE啟動子(堿性絲氨酸蛋白酶啟動子)表示aprE基因的啟動子(-35,-10,+1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，RBS)。MVKl表示酵母甲羥戊酸激酶基因。RBS-PMK表示具有起始位點(diǎn)的芽孢桿菌RBS上游的酵母磷酸甲羥戊酸激酶基因。RBS-Mro表示具有起始位點(diǎn)上游的芽孢桿菌PBS的酵母二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因。RBS-IDI表示具有起始位點(diǎn)上游的芽孢桿菌RBS的酵母idi基因。終止子表示來自解淀粉芽孢桿菌(B. amyliquefaciens)的終止子堿性絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄終止子。SpecR表示壯觀霉素抗性標(biāo)記?！坝糜跀U(kuò)增的nprE上游重復(fù)”表示用于擴(kuò)增的上游區(qū)域的直接重復(fù)。圖29是含有下游MVA途徑和用于整合到枯草桿菌染色體nprE基因座的酵母idi的表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQ ID NO -Al)。圖30 是 p9796_poplar 的圖譜。圖31 是 p9796_poplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)。圖32 是 pTrcPoplar 的圖譜。
·
圖33 是 pTrcPoplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 49)。圖34 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的圖譜。圖35 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 50)。圖36 是 pTrcKudzuDXS Kan 的圖譜。圖37 是 pTrcKudzuDXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 51)。圖38 是 pCL PTrcKudzu 的圖譜。圖39 是 pCL PTrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 52)。圖40 是 pCL PTrcKudzu A3 的圖譜。圖41 是 pCL PTrcKudzu A3 的核苷酸序列(SEQ ID NO 53)。圖42 是 pCL PTrcKudzu yIDI 的圖譜。圖43 是 pCL PTrcKudzu yIDI 的核苷酸序列(SEQ ID NO 54)。圖44 是 pCL PTrcKudzu DXS 的圖譜。圖45 是 pCL PTrcKudzu DXS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 55)。圖46表示從生物質(zhì)原料產(chǎn)生異戊二烯的圖。小圖A表示來自玉米秸桿的異戊二烯產(chǎn)生，小圖B表示來自甘蔗渣的異戊二烯產(chǎn)生，小圖C表示來自軟木材木漿的異戊二烯產(chǎn)生，小圖D表示來自葡萄糖的異戊二烯產(chǎn)生，小圖E表示來自沒有添加原料的細(xì)胞的異戊二烯產(chǎn)生?；疑綁K表示在接種后的指定時間對培養(yǎng)物的OD6tltl測量，而黑色三角表示在接種后的指定時間的異戊二烯產(chǎn)生。圖47表示在沒有添加葡萄糖的培養(yǎng)物中由BL21 (入DE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)產(chǎn)生的異戊二烯的圖。方塊表示OD6tltl，而三角表示所產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ml)。圖47B表示由BL21 (入DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從I %葡萄糖原料轉(zhuǎn)化糖產(chǎn)生的異戊二烯的圖。方塊表示0D_，而三角表示所產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ml)。圖47C表示由BL21UDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從I %轉(zhuǎn)化糖原料產(chǎn)生的異戊二烯的圖。方塊表示0D_，而三角表示所產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ml)。圖47D 表示由 BL21 (入 DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1% AFEX 玉米秸桿原料產(chǎn)生的異戊二烯的圖。方塊表示0D_，而三角表示所產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ml)。圖48表示表明酵母提取物對異戊二烯產(chǎn)生的影響的圖。小圖A表示在供給不同量的酵母提取物的發(fā)酵罐中光密度的時間進(jìn)程。小圖B表示在供給不同量的酵母提取物的發(fā)酵罐中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。小圖C表示酵母提取物對在生長于補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中的大腸桿菌中異戊二烯產(chǎn)生的影響。圖49表示證明在500L生物反應(yīng)器中含有pTrcKudzu+ylDI+DXS質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的圖。小圖A表示在供給葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反應(yīng)器中的光密度的時間進(jìn)程。小圖B表示在供給葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。小圖C表示從供給葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進(jìn)程。圖50 是 pJMupperpathway2 的圖譜。圖51 是 pJMupperpathway2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 56)。圖52 是 pBS Kudzu#2 的圖譜。圖53A是表示在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中表達(dá)重組野葛異戊二烯合酶的芽孢桿菌發(fā)酵時間期間的生長。黑色菱形表示沒有重組異戊二烯合酶(天然異戊二烯產(chǎn)生)的對照菌·株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu (重組異戊二烯產(chǎn)生)的芽孢桿菌。圖53B是表示在14升補(bǔ)料分批發(fā)酵中表達(dá)重組野葛異戊二烯合酶的芽孢桿菌發(fā)酵時間期間的異戊二烯產(chǎn)生。黑色菱形表示沒有重組異戊二烯合酶(天然異戊二烯產(chǎn)生)的對照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu (重組異戊二烯產(chǎn)生)的芽孢桿菌。圖54為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖55為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖56為從供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進(jìn)程。圖57為在供給丙三醇的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖58為在供給丙三醇的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖59為從供給丙三醇的15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進(jìn)程。圖60A-60C為在供給葡萄糖的150-L生物反應(yīng)器中光密度、甲羥戊酸滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖61A-61C為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度、甲羥戊酸滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖62A-62C為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度、甲羥戊酸滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖63A-63C為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度、異戊二烯滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖64A-64C為在供給葡萄糖的15_L生物反應(yīng)器中光密度、異戊二烯滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖65A-65C為在供給葡萄糖的15_L生物反應(yīng)器中光密度、異戊二烯滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖66A-66C為在供給葡萄糖的15_L生物反應(yīng)器中光密度、異戊二烯滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖67A-67C為在供給葡萄糖的15_L生物反應(yīng)器中光密度、異戊二烯滴定度和比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。圖68為用于系列A的計算的絕熱火焰溫度圖，該絕熱火焰溫度為針對多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。例如，圖例中第一項(xiàng)(40°C時空氣中的異戊二烯)對應(yīng)圖中最上面的曲線。圖69為用于系列B的計算的絕熱火焰溫度圖,該絕熱火焰溫度為針對含有4%水的多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。圖70為用于系列C的計算的絕熱火焰溫度圖，該絕熱火焰溫度為針對含有5% 二氧化碳的多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。圖71為用于系列D的計算的絕熱火焰溫度圖，該絕熱火焰溫度為針對含有10% 二氧化碳的多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。圖72為用于系列E的計算的絕熱火焰溫度圖，該絕熱火焰溫度為針對含有15%二·氧化碳的多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。圖73為用于系列F的計算的絕熱火焰溫度圖，該絕熱火焰溫度為針對含有20 % 二氧化碳的多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。圖74為用于系列G的計算的絕熱火焰溫度圖，該絕熱火焰溫度為針對含有30% 二氧化碳的多種氧水平下燃料濃度的函數(shù)。圖例以其在圖中出現(xiàn)的順序列出曲線。圖75A為系列A的CAFT模型結(jié)果從重量百分比到體積百分比的轉(zhuǎn)化的表。圖75B為繪制為體積百分比的來自圖68中系列A的CAFT模型的可燃性結(jié)果圖。圖76A為系列B的CAFT模型結(jié)果從重量百分比到體積百分比的轉(zhuǎn)化的表。圖76B為繪制為體積百分比的來自圖69中系列B的CAFT模型的可燃性結(jié)果圖。圖77為可燃性測試容器圖。圖78A為測試系列1(0%蒸汽、Opsig(磅/平方英寸(表壓))和40°C )的可燃性曲線圖。圖78B為總結(jié)測試系列I的爆炸和非爆炸數(shù)據(jù)點(diǎn)的表。圖78C為與CAFT模型比較的測試系列I的可燃性曲線圖。圖79A為測試系列2 (4%蒸汽、Opsig)和40°C )的可燃性曲線圖。圖79B為總結(jié)測試系列2的爆炸和非爆炸數(shù)據(jù)點(diǎn)的表。圖79C為與CAFT模型比較的測試系列2的可燃性曲線圖。圖80A和80B為測試系列I的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果表。圖81為測試系列2的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果表。圖82為計算的絕熱火焰溫度作為在3個大氣壓下針對多種氧/氮比例的燃料濃度的函數(shù)繪制成的圖。圖83為計算的絕熱火焰溫度作為在I個大氣壓下針對多種氧/氮比例的燃料濃度的函數(shù)繪制成的圖。圖84為采用圖82的數(shù)據(jù)并按照實(shí)施例13中所述方法構(gòu)建的可燃性氣囊的圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)(圓圈)來自本文所述在I個大氣壓的初始系統(tǒng)壓力下進(jìn)行的測試。圖85為采用圖83的數(shù)據(jù)并按照實(shí)施例13中所述方法構(gòu)建的可燃性氣囊的圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)(圓圈)來自本文所述在I個大氣壓的初始系統(tǒng)壓力下進(jìn)行的測試。圖86A為發(fā)酵廢氣的GC/MS色譜圖。
圖86B為圖86A的擴(kuò)展來表示發(fā)酵廢氣中出現(xiàn)的少量揮發(fā)物。圖87A為_78°C下低溫捕獲(cryo-trapping)后廢氣中存在的痕量揮發(fā)物的GC/MS色譜圖。圖87B為-196 °C下低溫捕獲后廢氣中存在的痕量揮發(fā)物的GC/MS色譜圖。圖87C為圖87B的擴(kuò)展。圖87D為圖87C的擴(kuò)展。圖88A和88B是比較來自石油衍生的異戊二烯(圖88A)和生物學(xué)產(chǎn)生的異戊二烯(圖88B)的C5烴的GC/MS色譜圖。標(biāo)準(zhǔn)品包含在主異戊二烯峰值周圍洗脫的三種C5烴雜質(zhì)(圖88A)。相比而言，生物學(xué)產(chǎn)生的異戊二烯包含一定量乙醇和丙酮(3. 41分鐘的運(yùn)行時間)(圖88A)?！D89為表達(dá)野葛異戊二烯合酶且具有3g/L酵母提取物的葡萄糖供給的大腸桿菌BL21 (DE3) pTrc IS菌株的發(fā)酵廢氣的分析圖。圖90表示與異戊二烯結(jié)構(gòu)上相似且還可作為聚合催化劑毒物的幾種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。圖 91 為 pTrcHis2AUpperPathway (也稱為 pTrcUpperMVA)的圖。圖92A-92C 為 pTrcHis2AUpperPathway(也稱為 pTrcUpperMVA)的核苷酸序列(SEQ ID NO 86)。圖93為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖94為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖95為從供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進(jìn)程。圖96為在供給轉(zhuǎn)化糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖97為在供給轉(zhuǎn)化糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖98為從供給轉(zhuǎn)化糖的15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進(jìn)程。圖99為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖100為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖101為從供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的異戊二烯比活性的時間進(jìn)程。圖 102 是 pCLPtrcUpperPathwayHGS2 的圖。圖103A-103C 為 pCLPtrcUpperPathwayHGS2 的核苷酸序列(SEQ IDNO 87)。圖104為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖105為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖106為從供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進(jìn)程。圖107為質(zhì)粒MCM330的圖。圖108A-108C 為質(zhì)粒 MCM330 的核苷酸序列(SEQ ID NO 90)。圖109 為 pET24D_Kudzu 的圖。圖110A-110B 為 pET24D-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :101)。
圖IllA為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中光密度的時間進(jìn)程。圖IllB為在供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯滴定度的時間進(jìn)程。滴定度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖IllC為供給葡萄糖的15-L生物反應(yīng)器中異戊二烯的比生產(chǎn)力的時間進(jìn)程。發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明描述了產(chǎn)生增加量和/或純度的異戊二烯的方法和組合物。如本文所用的，術(shù)語“異戊二烯”或“2甲基-1，3-丁二烯”(CAS#78-79-5)指從3，3_ 二甲基烯丙焦磷酸(DMAPP)中去除焦磷酸的直接且最終揮發(fā)性C5烴產(chǎn)品，且不涉及一種或多種異戊烯二磷酸(IPP)分子與一種或多種DMAPP的連接或聚合。絕大部分異戊二烯衍生自作為非純凈C5烴級份的石化來源，在材料適合用于聚·合之前其要求全面純化(extensive purification)。幾種雜質(zhì)尤其是問題,如果它們的結(jié)構(gòu)與異戊二烯類似且它們可作為聚合催化劑的毒物。此類化合物包括1，3-環(huán)戊二烯、順式_和反式_1，3_戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、3-甲基-I- 丁炔、反式-戍間二烯、順式_戍間二烯、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔和順式-戊-3-烯-I-炔(圖90)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異戊二烯組合物基本上不含任意污染性的不飽和C5烴。如實(shí)施例10中的進(jìn)一步描述，使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的異戊二烯組合物中除異戊二烯外未發(fā)現(xiàn)可檢測量的不飽和C5烴(如1,3-環(huán)戍二烯、順式-1，3-戍二烯、反式-1，3-戍二烯、I-戍炔、
2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、反式-戍間二烯、順式-戍間二烯、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔或順式-戊-3-烯-I-炔)。使用本文所述方法產(chǎn)生的一些異戊二烯組合物包含乙醇、丙酮和C5異戊烯醇，如由GC/MS確定的。從異戊二烯流中去除所有這些組分遠(yuǎn)比從衍生自石化來源的異戊二烯組合物中除去出現(xiàn)的異構(gòu)C5烴級份容易。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異戊二烯組合物需要為了聚合用規(guī)格的最少的處理。一方面，本發(fā)明的組合物和方法增加異戊二烯生產(chǎn)力并且增加產(chǎn)生的異戊二烯的總量。例如，制備了產(chǎn)生4. SxlO4納摩爾/gWM/hr的異戊二烯的細(xì)胞培養(yǎng)體系(表I)。這些體系的效率被細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基所消耗的約2. 2%的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯所證明。如實(shí)施例和表2所示，產(chǎn)生了每升培養(yǎng)液約3g異戊二烯。如果需要，可以使用其他條件，如在此所述的那些，獲得更大量的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，將可再生的碳源用于異戊二烯的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯的產(chǎn)生與細(xì)胞的生長去偶聯(lián)(decouple)。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯和任意氧化劑的濃度在不可燃范圍內(nèi)以降低，或消除在異戊二烯的產(chǎn)生和回收期間出現(xiàn)著火的風(fēng)險。本發(fā)明的組合物和方法是想要的，因?yàn)樗鼈冊试S每細(xì)胞的高異戊二烯產(chǎn)量，允許高碳產(chǎn)量、高異戊二烯純度、高生產(chǎn)力、低能量利用、低生產(chǎn)成本和投資、以及最小的副反應(yīng)。這一用于異戊二烯產(chǎn)生的有效、大規(guī)模、生物合成工藝為合成異戊二烯類橡膠提供了異戊二烯來源，并且為使用天然橡膠提供了期望的低成本替代法。如下面進(jìn)一步討論，可以通過向細(xì)胞導(dǎo)入編碼異戊二烯合酶多肽(例如植物異戊二烯合酶多肽)的異源核酸來顯著增加由該細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯量。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化成異戊二烯。如在實(shí)施例中所示，在諸如大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草桿菌、解脂耶氏酵母菌和里氏木霉的多種宿主細(xì)胞中表達(dá)異源葛麻姆(野葛)異戊二烯合酶多肽。所有這些細(xì)胞比沒有異源異戊二烯合酶多肽的相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生出更多的異戊二烯。如表I和2所示，使用在此所述的方法產(chǎn)生了大量的異戊二烯。例如，具有異源異戊二烯合酶核酸的枯草桿菌細(xì)胞在14升發(fā)酵罐中比沒有異源核酸的相應(yīng)對照枯草桿菌細(xì)胞產(chǎn)生出高約10倍的異戊二烯(表2)。在發(fā)酵罐中由大腸桿菌產(chǎn)生出每升培養(yǎng)液(mg/L，其中培養(yǎng)液的體積包含細(xì)胞培養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積)30mg異戊二烯而由枯草桿菌產(chǎn)生的是30mg/L，這表明可以產(chǎn)生顯著量的異戊二烯(表2)。如果需要，可以在更大規(guī)模產(chǎn)生異戊二烯或者可以使用在此所述的其他條件來進(jìn)一步增加異戊二烯的量。在下面以及在實(shí)施例部分中進(jìn)一步詳述表I和2所列出的載體以及實(shí)驗(yàn)條件。表I :使用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物和方法，從搖瓶產(chǎn)生異戊二烯的示例性產(chǎn)量。用于測量異戊二烯產(chǎn)生的測定法描述于實(shí)施例I，第II部分。對于這一測定法，在一或多個時間點(diǎn)從搖瓶取出樣品并培養(yǎng)30分鐘。然后測量這一樣品中產(chǎn)生的異戊二烯量。表I中列出了異戊二烯產(chǎn)生的頂空濃度和比速率，并且在此進(jìn)一步描述。

·菌株I在頂空瓶中的異戊二烯產(chǎn)生*
頂空濃度 I比速率蚪g/L培養(yǎng)*^/hr/OD_颶/L 氣體 (nmoI/gwcm/hr )
大腸桿菌 BL21/ pTrcKudzu IS — 1.4053.2 ( 781.2 )
AU 菌 BL21/PC1 DXS- 289.1 (4.25 x IO3)yidiKudzu IS___
imn Ifimtmnt 途徑的230874 1 (L28 x 104)
BL21/Pet N- HisKudzu^(嶋)
Id
符檬泛菌/pTrcKudzu IS — 0.66一 25.1 (368.6 )—
大腸桿菌 W楊 IS [Miller(2001)]-一 5.6 ( 82.2 )—
地衣芽孢桿菌 (Bacillis(.
Iichenformis) Fall US 5849970"___
具有野葛異戌二烯合酶的解脂耶/T. (
氏酵母菌~ 0.05 2 ( 30 )
具有野葛異戊二烯合酶的里氏木 nft<1 /T 77TIT霉一 0.05 |iig/L 2 ( 30)*歸一化為IOD6tltl的lmL，在密封頂空瓶中培養(yǎng)I小時，其中液體與頂空體積比為I 19。表2 :使用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物和方法，在發(fā)酵罐中的示例性異戊二烯產(chǎn)量。用于測量異戊二烯產(chǎn)生的測定法描述于實(shí)施例I，第II部分。對于這一測定法，取發(fā)酵罐的廢氣樣品，并分析異戊二烯的量。表2中列出了峰值頂空濃度(其是發(fā)酵期間的最高頂空濃度)、滴定度(其是每升培養(yǎng)液所產(chǎn)生的異戊二烯的總量)以及異戊二烯產(chǎn)生的峰值比速率(其是發(fā)酵期間的最高比速率)，并且在此進(jìn)一步描述。

權(quán)利要求
1.能夠產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞處于穩(wěn)定期，且其中異戊二烯產(chǎn)量大于或約2倍于在生長期相同時間產(chǎn)生的異戊二烯的量。
2.權(quán)利要求I的細(xì)胞，其中所述異戊二烯在氣相產(chǎn)生，且 (a)其中所述氣相包含大于或約9.5% (體積)的氧，且所述氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限或大于自燃的上限，或 (b)所述氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限或大于自燃的上限，且所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約400nmole/gwem/hr的異戍二烯。
3.培養(yǎng)的細(xì)胞，其產(chǎn)生大于約400nmole/gwc;m/hr的異戊二烯，其中所述細(xì)胞在異戊二烯的產(chǎn)生與細(xì)胞生長去偶聯(lián)的條件下生長。
4.培養(yǎng)的細(xì)胞，其具有大于約O.lmg/L±if#a/hr的異戊二烯的平均容積生產(chǎn)力，其中所述細(xì)胞在異戊二烯的產(chǎn)生與細(xì)胞生長去偶聯(lián)的條件下生長。
5.培養(yǎng)的細(xì)胞，其從細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化超過約O.002摩爾百分比的細(xì)胞消耗的碳為異戊二烯，其中所述細(xì)胞在異戊二烯的產(chǎn)生與細(xì)胞生長去偶聯(lián)的條件下生長。
6.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在葡萄糖受限條件下生長。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中在穩(wěn)定期產(chǎn)生的異戊二烯的量大于或約2、3、4、5、10、20、30、40、50或更多倍于在生長期相同時間產(chǎn)生的異戊二烯的量。
8.權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其還包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。
9.組合物，其包含大于約2mg由權(quán)利要求I的細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯，且與該組合物中的全部C5烴的總重量相比，其包含以重量計大于或約99. 94%的異戊二烯。
10.組合物，其包含大于或約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000毫克權(quán)利要求I的細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。
11.組合物，其包含大于或約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100克權(quán)利要求I的細(xì)胞的揮發(fā)性有機(jī)級分的異戊二烯(w/w)。
12.組合物，其包含大于約2mg權(quán)利要求I的細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯，且包含小于或約O.5 μ g/L化合物，所述化合物用于抑制異戊二烯聚合的組合物中的任意化合物。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述抑制異戊二烯聚合的組合物與該組合物中全部C5烴的總重量相比，包含以重量計小于或約O. 12,0. 10,0. 08,0. 06,0. 04,0. 02,0. 01,0. 005、O.001,0. 0005,0. 0001,0. 00005 或 O. 00001% 的一種或多種 C5 烴，所述 C5 烴選自1，3_ 環(huán)戍二烯、順式-1，3-戍二烯、反式-1，3-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、反式-戍間二烯、順式_戍間二烯、戍_4_烯-I-炔、反式-戍-3_烯-I-炔或順式_戍_3_烯-I-炔。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述抑制異戊二烯聚合的組合物與該組合物中全部C5烴的總重量相比，具有以重量計小于或約O. 12,0. 10,0. 08,0. 06,0. 04,0. 02,0. 01,0. 005、O.001,0. 0005,0. 0001,0. 00005 或 O. 00001 % 的 1，3_ 環(huán)戊二烯、順式 _1，3_ 戊二烯、反式_1，3-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、反式-戍間二烯、順式-戍間二烯、戍-4-烯-I-炔、反式-戍-3-烯-I-炔或順式-戍-3-烯-I-炔。
15.組合物，其包含大于約2mg權(quán)利要求I的細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯，且與該組合物中全部C5烴的總重量相比，具有以重量計大于或約99. 90,99. 92,99. 94,99. 96,99. 98或100%異戊二烯。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述異戊二烯回收自廢氣部分。
17.組合物，其包含大于約2mg權(quán)利要求I的細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯，且包含一種或多種化合物，該化合物選自乙醇、丙酮、C5異戊烯醇，和具有10個或更多個碳原子的類異戊二烯化合物。
18.組合物，其包含大于約2mg權(quán)利要求I的細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯，且具有一種或多種第二化合物，該第二化合物選自2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I- 丁醛、3-甲基-2- 丁酮、I- 丁醇、2-戊酮、3-甲基-I- 丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-I-烯酯、乙酸3-甲基-2-丁-I-烯酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-—辛三烯、(Z) -3，7- 二甲基-1，3，6- —辛三烯和2，3-環(huán)庚烯嘧啶，其中所述第二化合物的量相對于異戊二烯的量是大于或約O. 01% (w/w) 0
19.組合物，其包含(i)包含異戊二烯的氣相，和(ii)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的培養(yǎng)的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述組合物包含封閉系統(tǒng)，且當(dāng)歸一化為培養(yǎng)I小時的 I 個 OD600 的 lmL，所述氣相包含大于或約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μ g/L 異戊二烯。
21.權(quán)利要求19的組合物，其中所述組合物包含開放系統(tǒng)，且當(dāng)以Ivvm的速度噴射時，所述氣相包含大于或約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μ g/L異戊二烯。
22.權(quán)利要求19的組合物，其中所述組合物包含氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分，與揮發(fā)性有機(jī)級分中的全部C5烴的總重量相比，所述氣相的揮發(fā)性有機(jī)級分包含以重量計大于或約99. 90,99. 92,99. 94,99. 96,99. 98 或 100%異戊二烯。
23.產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括 (a)在合適異戊二烯產(chǎn)生的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中穩(wěn)定期產(chǎn)生的異戊二烯的量大于或約2倍于在生長期相同時間產(chǎn)生的異戊二烯的量，和 (b)產(chǎn)生異戊二烯。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述細(xì)胞在葡萄糖受限條件下生長。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述異戊二烯回收自細(xì)胞培養(yǎng)的廢氣部分。
26.系統(tǒng)，其包含氣相中不可燃濃度的異戊二烯，其中所述氣相包含小于或約9.5%(體積)的氧，或大于或約9. 5% (體積)的氧，且氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限或大于自燃的上限。
27.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述氣相的非異戊二烯部分包含約10%至約100%(體積)的氧。
28.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述氣相的非異戊二烯部分包含約0%至約99%(體積)的氮。
29.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述氣相的非異戊二烯部分包含約1%至約50%(體積)的 C02。
30.產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括 (a)在合適異戊二烯產(chǎn)生的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述氣相包含大于或約9. 5%(體積)的氧，和 (b)產(chǎn)生異戊二烯，其中所述氣相中異戊二烯的濃度小于自燃的下限或大于自燃的上限，且所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約400nmole/gwc;m/hr的異戍二烯。
31.產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括 (a)在合適異戊二烯產(chǎn)生的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述氣相包含大于或約9.5%(體積)的氧，和 (b)產(chǎn)生異戍二烯，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約400nmole/gwc;m/hr的異戍二烯。
全文摘要
本發(fā)明描述了從培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的方法，其中該細(xì)胞處于穩(wěn)定期。本發(fā)明還提供了包含這些培養(yǎng)的細(xì)胞和/或提高的量的異戊二烯的組合物。本發(fā)明還提供了包含氣相中不可燃濃度的異戊二烯的系統(tǒng)。此外，本發(fā)明提供了異戊二烯組合物，例如具有提高的量的異戊二烯或提高的純度的異戊二烯的組合物。
文檔編號C12N1/20GK102791848SQ200980134182
公開日2012年11月21日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者A·R·卡拉布里亞, E·L·韋伯斯特, G·K·肖塔尼, G·M·懷特德, J·C·麥考利夫, K·J·桑福德, M·A·塞爾溫, M·C·米勒, R·拉杜卡, T·A·薩博 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司