專利名稱：應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用應(yīng)激條件提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase,簡(jiǎn)稱TGase, EC 2.3.2.13, R-glutaminyl-peptide:amnie- Y -glutamyl-transferase)又名轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,它通過催化蛋白質(zhì)中的谷氨酸殘基上的甲酰胺與賴氨酸殘基上的ε -氨基進(jìn)行?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，使蛋白質(zhì)在分子內(nèi)或分子間形成交聯(lián)。
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在二十世紀(jì)八十年代，Ikura等人報(bào)道了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)食物蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用。他們用哺乳動(dòng)物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)幾種食物蛋白質(zhì)，如酪蛋白、大豆蛋白等。這些蛋白的交聯(lián)，提高了其產(chǎn)品的功能性，如凝膠性、溶解性和乳化性等。然而，由于其高昂的價(jià)格和低效的利用率限制了它在食品工業(yè)上的應(yīng)用。從鏈霉菌中成功分離到微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是促進(jìn)其在食品工業(yè)上應(yīng)用的一個(gè)里程碑。它使得這種酶可以大規(guī)模地生產(chǎn)，并且被商業(yè)利用。由于鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶底物的催化特性，以及它在食品、紡織和醫(yī)藥行業(yè)中的廣闊應(yīng)用前景，受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，在亞洲的日本、臺(tái)灣，歐洲的丹麥、荷蘭、法國(guó)、德國(guó)、愛爾蘭以及巴西等國(guó)家均投入了大量的人力、物力、財(cái)力進(jìn)行研究，并取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的來源主要有3種:一是從動(dòng)物的組織或體液中提取，例如牛、豬或魚等，由于動(dòng)物組織種類有限、來源稀少、含量低、組織特異性又極高，而且分離精制過程復(fù)雜，價(jià)格十分昂貴；在歐洲，商業(yè)化的凝血因子XIII (谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的一種)主要通過宰殺?；蜇i等動(dòng)物來獲得，但由于血液中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少應(yīng)用于食品工業(yè)中。二是以大腸桿菌、棒狀桿菌和鏈霉菌等為宿主，用基因工程手段來生產(chǎn)此酶。基因工程菌表達(dá)效果較差，遠(yuǎn)不能達(dá)到原有水平；雖然有些報(bào)道產(chǎn)量較高，但某些國(guó)家對(duì)基因工程產(chǎn)品限制比較嚴(yán)格。三是直接篩選產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的微生物，通過發(fā)酵法來生產(chǎn)。由于此方法技術(shù)可行、成本較低、生產(chǎn)不受出發(fā)材料和季節(jié)限制，最有可能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。但是目前食品級(jí)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶來源單一、產(chǎn)量較低、價(jià)格昂貴，限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外提高微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的報(bào)導(dǎo)大多集中在優(yōu)化發(fā)酵條件，改善培養(yǎng)基組成等方面。雖然這些研究都取得了一些成果，但是此酶的產(chǎn)量仍然較低。目前商業(yè)化的產(chǎn)品主要由日本味之素等公司生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶尚處于起步階段，產(chǎn)量較低。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法存在的問題，本發(fā)明提供一種應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
采用茂原鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在發(fā)酵過程中分別通過熱處理培養(yǎng)物、在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲醇或NaCl，發(fā)酵96h，最終實(shí)現(xiàn)了提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的目標(biāo)。具體技術(shù)方案如下:
1、菌種及發(fā)酵培養(yǎng)液:
(I)菌種:
茂原鏈霉菌印iOffiiFce1S mobaraense) DSM40587:購(gòu)于日本 NBRC。(2)斜面培養(yǎng)基(g/L):高氏一號(hào)培養(yǎng)基。(3)種子培養(yǎng)基(g/L):聚蛋白胨20，可溶性淀粉20，磷酸氫二鉀2，磷酸二氫鉀2，酵母粉2，無水硫酸鎂2，pH 7.0。(4)初始發(fā)酵培養(yǎng)基(kg/1000L):聚蛋白胨30，可溶性淀粉10，果糖10，磷酸氫二鉀2，酵母粉2，無水硫酸鎂1，pH 7.0。

2、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活的測(cè)定方法:
采用分光光度法37 1:下測(cè)定。吸取5(^1^發(fā)酵液，加入0.51^試劑4，371:水浴保溫IOmin,加入0.5mL試劑B，終止反應(yīng)，500nm比色。試劑A:1OOmg 的 N-CBZ-Gln-Gly 溶解于 2mL、0.2mol/L 的 NaOH，依次加入 0.2mol/L、pH 6.0的Tris-HCl緩沖液4mL，0.lmol/L的羥胺2mL，0.01mol/L的還原型谷胱甘肽2mL，并調(diào)節(jié)pH至6.0。試劑B:3mol/L鹽酸、12%三氯乙酸、5%FeCl3.6H20 (溶解于0.lmol/L的鹽酸)按1:1:1的比例混合。I單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性(U)定義為:37°C，pH 6.0的條件下反應(yīng)，每分鐘產(chǎn)生濃度為Iymol的單羥肟酸所需的酶量。3、培養(yǎng)方法:
用5mL無菌生理鹽水將培養(yǎng)7d的斜面孢子洗下，接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，30°C、200r/min培養(yǎng)48h后，按10%的接種量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、200 r/min采用提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾器過濾或壓濾，再經(jīng)
0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，制成無細(xì)胞的酶液，添加載體保護(hù)劑充分混溶，或這些保護(hù)劑與無細(xì)胞酶液充分混合再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌。采用低溫噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉。4、上述提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式如下:
(I)熱處理提高酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式:
將發(fā)酵48 h茂原鏈霉菌發(fā)酵液，快速加熱至60-65 V，保持Imin后，將溫度快速冷卻到30°C,200 r/min條件下培養(yǎng)至96h,得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活1.16U/mL,顯著地高于不加熱對(duì)照組0.71U/mL,為對(duì)照樣品的1.6倍。(2)甲醇脅迫提高酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式:
發(fā)酵起始時(shí)加入培養(yǎng)基重量的1%_3%甲醇，在30°C、200 r/min條件下培養(yǎng)96h后酶活達(dá)1.77U/mL，顯著地高于以未加入甲醇的發(fā)酵培養(yǎng)物對(duì)照組0.67U/mL。(3) NaCl脅迫提高酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式:在發(fā)酵起始時(shí)向培養(yǎng)基中添加0.15-0.25 mol/LNaCl，在30°C、200 r/min條件下培養(yǎng)96h酶活力為3.0U/mL，顯著地高于以未添加NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)物對(duì)照組(1.25U/mL)，為對(duì)照組的2.4倍。5、載體保護(hù)劑添加:
上述所涉及的保護(hù)劑為以無細(xì)胞的酶液計(jì)蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%，經(jīng)IOO0CU小時(shí)烘干，無菌條件下混料機(jī)充分混合；或這些保護(hù)劑與無細(xì)胞酶液充分混溶再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌。6、低溫噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉: 將載體添加保護(hù)劑后，采用低溫噴霧干燥方法干燥，條件為進(jìn)風(fēng)溫度80°C，出風(fēng)溫度55- 60°C?；蛘卟捎谜婵绽鋬龈稍餀C(jī)干燥，凍干機(jī)冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。本發(fā)明采用應(yīng)激條件促進(jìn)茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，本法得到的酶經(jīng)純化后熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性均高于吸水鏈霉菌合成的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，它在食品加工、紡織行業(yè)和組織支架制備行業(yè)中具有很大的潛力。所用的添加劑價(jià)格低廉，實(shí)施方法方便，可顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量，在其它培養(yǎng)條件相同的情況下，本發(fā)明比不改變培養(yǎng)條件的對(duì)照例產(chǎn)量分別提高60%、160%和140%，達(dá)到發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的先進(jìn)水平。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一:在發(fā)酵48h后,將發(fā)酵培養(yǎng)物置于水浴60_65°C加熱Imin,繼續(xù)發(fā)酵96h時(shí)得到的酶活1.16U/mL。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾器過濾或壓濾，再經(jīng)
0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，制成無細(xì)胞的酶液。載體保護(hù)劑蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%經(jīng)100°C、1小時(shí)烘干，無菌條件下與無菌酶液充分混溶；或無細(xì)胞酶液與載體保護(hù)劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌，采用低溫噴霧干燥方法干燥，條件為進(jìn)風(fēng)溫度80°C，出風(fēng)溫度55-60°C，或者采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，凍干機(jī)冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。
具體實(shí)施方式
二:發(fā)酵起始時(shí)向培養(yǎng)基中加入1%_4%甲醇，發(fā)酵96h后酶活達(dá)
1.77U/mL。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾器過濾或壓濾，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，制成無細(xì)胞的酶液。載體保護(hù)劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%經(jīng)100°C、I小時(shí)烘干，無菌條件下與無菌酶液充分混溶；或無細(xì)胞酶液與載體保護(hù)劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌，采用低溫噴霧干燥方法干燥，條件為進(jìn)風(fēng)溫度80°C，出風(fēng)溫度55-60°C，或者采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，凍干機(jī)冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。
具體實(shí)施方式
三:在發(fā)酵起始時(shí)向培養(yǎng)基中添加0.15-0.25 mol/L NaCl，發(fā)酵96h后酶活力為3.0U/mL。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾器過濾或壓濾，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，制成無細(xì)胞的酶液。載體保護(hù)劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%經(jīng)100°C、I小時(shí)烘干，無菌條件下與無菌酶液充分混溶；或無細(xì)胞酶液與載體保護(hù)劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌，采用低溫噴霧干燥方法干燥，條件為進(jìn)風(fēng)溫度80°C，出風(fēng)溫度55-60°C，或者采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，凍干機(jī)冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。
權(quán)利要求
1.應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，采用茂原鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于在發(fā)酵過程中分別通過熱處理培養(yǎng)基、在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加醇類或NaCl，發(fā)酵96h提高鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述熱處理培養(yǎng)基的方法為將發(fā)酵48h的培養(yǎng)物加熱到60-65°C，處理0.5-1.5min，繼續(xù)發(fā)酵至96h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于在發(fā)酵起始時(shí)加入培養(yǎng)基重量比的1-3%甲醇或在發(fā)酵起始時(shí)添加0.15-0.25mol/L NaCl,發(fā)酵至 96h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述方法具體步驟如下:用5 mL無菌生理鹽水將培養(yǎng)7 d的斜面孢子洗下，接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，30 0C, 200 r/min培養(yǎng)48 h后，按10%的接種量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、200r/min采用提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾器過濾或壓濾，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，制成無細(xì)胞的酶液，添加載體保護(hù)劑充分混溶，采用低溫噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述保護(hù)劑為以無細(xì)胞的酶液計(jì)蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在 于所述保護(hù)劑經(jīng)100°C、1小時(shí)烘干，在無菌條件下與無細(xì)胞的酶液充分混溶。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在 于所述保護(hù)劑與無細(xì)胞酶液充分混溶，再經(jīng)0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除囷。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述低溫噴霧干燥的條件為進(jìn)風(fēng)溫度80°C，出風(fēng)溫度55- 60°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所述冷凍干燥采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，凍干機(jī)冷井溫度為_60°C，真空度為.0.05MPa。
全文摘要
應(yīng)激條件提高茂原鏈霉菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法，涉及鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用茂原鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在發(fā)酵過程中分別通過熱處理培養(yǎng)物、在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲醇或NaCl，實(shí)現(xiàn)了提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的目標(biāo)，并添加保護(hù)劑制成低溫噴霧干燥或冷凍干燥干粉。本發(fā)明得到的酶經(jīng)純化后熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均高于吸水鏈霉菌合成的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在食品加工、紡織行業(yè)和組織支架制備行業(yè)中具有很大的潛力。所用添加劑價(jià)格低廉，實(shí)施方法簡(jiǎn)便，可顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量，產(chǎn)量分別提高60%，160%和140%。
文檔編號(hào)C12R1/465GK103146660SQ20131007202
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者張?zhí)m威, 張莉麗, 易華西, 單毓娟, 馮鎮(zhèn), 杜明, 韓雪, 張英春, 李洪波, 焦月華 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)