專利名稱：用于mRNA擴(kuò)增的改進(jìn)的裂解和逆轉(zhuǎn)錄的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過進(jìn)行RT-PCR而監(jiān)測基因表達(dá)的新方法。更精確地，本發(fā)明公開 了在培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的小瓶中裂解貼壁細(xì)胞，并且隨后在同一小瓶中將裂解物中包含的RNA 轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA的可能性?，F(xiàn)有
背景技術(shù)：
群體中的細(xì)胞在很多方面的特征是獨(dú)特的，甚至在看起來均質(zhì)的培養(yǎng)物或組織中也是 如此?；虮磉_(dá)水平顯示很大的細(xì)胞與細(xì)胞之間的變異，這是由于各種因素的外部(外在) 和內(nèi)部(內(nèi)在)來源。同樣，當(dāng)暴露于相同刺激時(shí)，細(xì)胞通常隨機(jī)表現(xiàn)。這表示獲自細(xì)胞群的 數(shù)據(jù)不能假定反映單個(gè)細(xì)胞的行為。已經(jīng)提示細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)錄活性爆發(fā)反應(yīng)于刺激并作 為二元轉(zhuǎn)換而運(yùn)轉(zhuǎn)；這是以全或無的方式。通常，通過多步程序，在常規(guī)基礎(chǔ)上監(jiān)測RNA水平上的基因表達(dá)。首先，從培養(yǎng)容 器取出各自的細(xì)胞樣品。在貼壁細(xì)胞的情況下，可以通過胰蛋白酶消化(用胰蛋白酶-EDTA 溶液處理)支持收獲，從而使貼壁細(xì)胞從固相支持體脫離。其次，沉淀收集的細(xì)胞，并且進(jìn) 行細(xì)胞裂解。作為第三步，通常需要至少部分純化存在于樣品中的RNA或mRNA(EP 0 389 063)。此后，用 RNA 依賴性 DNA 聚合酶如 AMV(Roche Applied Science 目錄號 11 495 062) 或MMuLV (Roche 11 062 603)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA合成步驟。隨后，通過定量 PCR(Sagner, G. , and Goldstein, C. , BIOCHEMICA 3 (2001) 15-17)，或者，通過擴(kuò)增和隨后雜交到DNA微陣列上(Kawasaki, Ε. S.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 1020 (2004) 92-100)，對產(chǎn)生的cDNA的量進(jìn)行定量。在PCR的情況下，可以進(jìn)行一 步RT-PCR，特征在于通過相同的聚合酶如T. th聚合酶(Roche Applied Science目錄號11 480 014)催化第一鏈cDNA合成和隨后的擴(kuò)增。在傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)RT-PCR或qRT-PCR中，首先在耗時(shí)的程序中從細(xì)胞分離RNA，這會(huì)導(dǎo) 致材料的損失。使用CellsDirect cDNA合成系統(tǒng)(Invitrogen目錄號11737-030)，在單 個(gè)試管中以最少的操作裂解細(xì)胞并且從裂解物產(chǎn)生cDNA并且沒有樣品損失。在第一鏈合 成前加入DNA酶I，以消除基因組DNA。合成后，第一鏈cDNA可以直接轉(zhuǎn)移到qPCR反應(yīng)中 而沒有中間有機(jī)萃取或乙醇沉淀。針對從10，000個(gè)細(xì)胞低至單個(gè)細(xì)胞的小的細(xì)胞樣品優(yōu) 化了該試劑盒。相似的流程公開于(W0 08/135197)。在上下文中，本發(fā)明的根本技術(shù)問題是提供高通量方法和試劑盒，其允許進(jìn)一步 簡化的基因表達(dá)監(jiān)測分析流程。簡沭
因此，本發(fā)明涉及進(jìn)行用于擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以下步驟
a)在細(xì)胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞群，
b)在所述樣品容器中用包含0.05M-I M離液劑的裂解緩沖液裂解推測含有所述靶 RNA的所述貼壁細(xì)胞群，
c)在所述樣品容器中加入進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品 容器中以約10-60 mM的濃度存在，并且將所述靶RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，d)通過進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)流程，擴(kuò)增所述第一鏈cDNA。在一個(gè)主要的實(shí)施方案中，實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增步驟。優(yōu)選地，離液劑是硫氰酸胍。同樣優(yōu)選地，裂解緩沖液包含約0. 2-0. 5 M的離液劑。在本發(fā)明方法的步驟c)中，離液劑以約30-50 mM，優(yōu)選約40 mM的濃度存在。同樣優(yōu)選地，該新方法的步驟b)在非離子型去污劑的存在下進(jìn)行，所述去污劑例 如可以是NP40。在步驟c)中，所述非離子型去污劑具有0. 1-2%的V/V。同樣優(yōu)選地，步驟a)包含加入碳水化合物，其可以是糖或葡聚糖。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，在步驟b)和C)之間或在步驟c中加入DNA酶。優(yōu)選地， 所述DNA酶主要是雙鏈特異性DNA酶，并且優(yōu)選是DNA酶I或蝦核酸酶(Shrimp Nuclease)。在另一特定實(shí)施方案中(其不與上文公開的實(shí)施方案互相排他)，在步驟b)中或在 步驟c)之前加入蛋白酶K。第二方面，本發(fā)明也提供了試劑盒，其包含
-用于培養(yǎng)至少一個(gè)細(xì)胞樣品的一次性容器(disposable)， -裂解緩沖液，和
-包含逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。此外，所述試劑盒可進(jìn)一步包含至少一種另外的組分，所述組分選自非離子型去 污劑、碳水化合物、DNA酶和蛋白酶。附圖簡述
所有圖包括代表qPCR擴(kuò)增曲線的上圖和代表解鏈曲線分析的下圖。存在于更左側(cè) 位置的擴(kuò)增曲線對應(yīng)于重復(fù)測量值，而更右側(cè)的擴(kuò)增曲線對應(yīng)于未加入Transscriptor酶 的對照。右側(cè)的解鏈峰對應(yīng)于重復(fù)樣品的特定擴(kuò)增產(chǎn)物，而更左側(cè)的解鏈峰對應(yīng)于不含 Transcriptor酶的對照中的引物二聚體形成。

圖1如實(shí)施例1所具體描述的本發(fā)明的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中ACTB表達(dá)的qPCR和 解鏈曲線分析(1:1樣品稀釋)
圖2如實(shí)施例1所具體描述的本發(fā)明的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中ACTB表達(dá)的qPCR和解鏈 曲線分析(1:4樣品稀釋)
圖3如實(shí)施例1所具體描述的本發(fā)明的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中TUBB5表達(dá)的qPCR和解 鏈曲線分析(1:1稀釋)
圖4如實(shí)施例1所具體描述的本發(fā)明的HeLA細(xì)胞中ACTB表達(dá)的qPCR和解鏈曲線分 析(1:1稀釋) 詳述
根據(jù)本發(fā)明，可以在特定培養(yǎng)容器中進(jìn)行貼壁真核細(xì)胞或甚至原核細(xì)胞的裂解，并且 在同一培養(yǎng)容器中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而制備單鏈cDNA。因此，本發(fā)明更精確地涉及進(jìn)行用于擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以 下步驟
a)在細(xì)胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞群，
b)在所述樣品容器中用包含0.05M-I M離液劑的裂解緩沖液裂解推測含有所述靶 RNA的所述貼壁細(xì)胞群，c)在所述樣品容器中加入進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品 容器中以約10-60 mM的濃度存在，并且將所述靶RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，
d)通過進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)流程，擴(kuò)增所述第一鏈cDNA。因此，細(xì)胞培養(yǎng)、裂解和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，S卩，步驟a) - c)，都在同一容器中進(jìn)行。因 此，并且與大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)的方法相反，在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前不需要純化裂解物。也就是 說，步驟c)緊接著步驟b)，無需任何中間的純化步驟。步驟a)，S卩，在細(xì)胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞群，定義為在確定的時(shí)間段中使所 述貼壁細(xì)胞群在合適的培養(yǎng)條件下生長，使得細(xì)胞具有分裂可能性并且活細(xì)胞的總數(shù)增加 到至少2倍的步驟。此外，重要的是注意本領(lǐng)域使用的流程需要胰蛋白酶消化步驟，這表示為了使貼 壁細(xì)胞從固相支持體分離，用含有可商購的胰蛋白酶-EDTA (例如^witrogen目錄號 25200 056，Genaxxon目錄號4260. 0500)的合適緩沖液溫育細(xì)胞培養(yǎng)物。相反，本發(fā)明 不需要通過胰蛋白酶使細(xì)胞從固相支持體分離，因?yàn)榧?xì)胞直接在原位裂解。根據(jù)步驟d)的擴(kuò)增通常以使用特異性擴(kuò)增引物對的PCR反應(yīng)的形式進(jìn)行，所述引 物對設(shè)計(jì)為允許檢測特異性cDNA種類。本發(fā)明的方法可以用于多種不同的定性和定量應(yīng)用。原則上，任何類型的RNA都 可以被轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。最重要地，本發(fā)明的方法適用于以定性和定量方式擴(kuò)增和檢測mRNA。 因此，本發(fā)明特別適用于監(jiān)測基因表達(dá)。為了控制收獲、細(xì)胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄的過程，可以將對照RNA摻入樣品。對照RNA優(yōu) 選是人工RNA，其在逆轉(zhuǎn)錄步驟中轉(zhuǎn)錄為能夠與樣品中的RNA區(qū)分開的cDNA。在使用用于 逆轉(zhuǎn)錄步驟的特異性引物的情況下，人工RNA可以來源于基因工程DNA模板的體外轉(zhuǎn)錄，所 述模板包含插入，或僅部分代表應(yīng)該要分析的靶序列。生物樣品優(yōu)選由貼壁真核細(xì)胞組成，S卩，通過附著于作為培養(yǎng)容器的部分的固相 支持體而培養(yǎng)所述細(xì)胞并使其生長。對于本發(fā)明的方法，可以使用任何類型的培養(yǎng)容器。實(shí) 例(但是其不限制本發(fā)明的范圍)是培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶，其具有適于作為用于貼壁細(xì)胞生長的 固相支持體的內(nèi)表面。這些類型的培養(yǎng)瓶使得能夠大量制備特定類型的cDNA。其它實(shí)例是6孔、M孔、96孔、384孔或1536孔形式的微量滴定板，因?yàn)樗鼈兪潜?領(lǐng)域常用的。在本發(fā)明的方法在所述微量滴定板中進(jìn)行的情況下，可以平行培養(yǎng)、裂解和逆 轉(zhuǎn)錄多個(gè)樣品。更精確地，在同一反應(yīng)容器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞裂解、稀釋、任何添加劑的 加入和逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。因此，本發(fā)明的方法對于自動(dòng)化過程中多個(gè)貼壁細(xì)胞樣品的高通量 分析特別有用。如果反應(yīng)容器根據(jù)本領(lǐng)域建立的標(biāo)準(zhǔn)以M、96、384或1536孔微量滴定板 的形式排列在一起，可以通過液體操作自動(dòng)儀器將裂解試劑、各種添加劑和進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶 反應(yīng)所必需的試劑加入樣品中。因此，在一個(gè)特定方面，本發(fā)明涉及進(jìn)行用于平行擴(kuò)增至少一個(gè)靶RNA的多個(gè) RT-PCR反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟
a)在微量滴定板的分開的孔中培養(yǎng)多個(gè)貼壁細(xì)胞群，
b)在所述微量滴定板的所述孔中用包含0.05 M-I M離液劑的裂解緩沖液裂解推測含 有所述靶RNA的所述多個(gè)貼壁細(xì)胞群，從而產(chǎn)生多個(gè)樣品，
c)在所述孔中的所述多個(gè)樣品中的每個(gè)樣品中加入進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的所有試劑，使得所述離液劑在所述微量滴定板的所述孔中以約10-60 mM的濃度存在，并且將存在 于每個(gè)樣品中的所述靶RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，
d)通過進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)流程，擴(kuò)增每個(gè)樣品中包含的所述第一鏈cDNA。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選可以平行處理6、M、96、384或甚至1536個(gè)群體。同樣，根 據(jù)步驟d)的擴(kuò)增通常以使用特異性擴(kuò)增引物對的PCR反應(yīng)的形式進(jìn)行，設(shè)計(jì)所述引物對， 使得能夠檢測特異性cDNA種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大量的多個(gè)孔可以含有源自不同 細(xì)胞系或相同細(xì)胞系的不同細(xì)胞群，所述細(xì)胞群已經(jīng)在不同條件下進(jìn)行了預(yù)處理。在這種 情況下，用相同的擴(kuò)增引物對進(jìn)行多個(gè)PCR擴(kuò)增，從而研究不同條件下特定基因的表達(dá)?；蛘撸蟛糠挚卓梢院性醋韵嗤瑏碓吹南嗤愋偷募?xì)胞群。在這種情況下，可以 選擇多個(gè)不同的擴(kuò)增引物對，從而平行研究很多個(gè)不同基因的表達(dá)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解，公開的這兩種方法都不是互相排他的，并且，依賴于要分析的科學(xué)問題，本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠用合適數(shù)目的不同細(xì)胞類型和合適數(shù)目的不同PCR引物對設(shè)計(jì)陣列設(shè)置，從 而實(shí)現(xiàn)各個(gè)微量滴定板中存在的全部數(shù)目的孔的最佳使用。此外，甚至可以通過多路PCR改進(jìn)所述平行分析的潛能，所述多路PCR的特征在于 用于擴(kuò)增不同cDNA種類的多個(gè)引物對被用于相同的樣品。特別是，這樣的設(shè)置對于相對 RT-PCR定量實(shí)驗(yàn)是有利的，所述相對RT-PCR定量實(shí)驗(yàn)特征在于特定基因的表達(dá)相對于所 謂的管家基因(其以相同水平組成型表達(dá))的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測。所述管家基因的突出實(shí)例是 PBDG, GAPDH 和 ACTB 以及 18S 和 26S RNA 基因。根據(jù)本發(fā)明，通過直接加入裂解緩沖液實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的裂解，而細(xì)胞仍然附著于 固相支持體表面。這僅僅在裂解緩沖液包含離液劑時(shí)是可能的。根據(jù)本領(lǐng)域通常的理解， 離液劑是破壞大分子如蛋白、DNA或RNA中的三維結(jié)構(gòu)并使其變性的物質(zhì)。離液劑干擾由 非共價(jià)力，如氫鍵、范德華力和疏水作用介導(dǎo)的分子內(nèi)相互作用的穩(wěn)定化。離液劑包括但不 限于脲、一些鋰鹽如高氯酸鋰和胍鹽，如氯化胍。在本發(fā)明的上下文中，特別優(yōu)選的試劑是 硫氰酸胍。為了能夠直接在裂解物內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)而不采用任何中間純化步驟，需要僅 僅使用有限量的所述離液劑來裂解細(xì)胞樣品，使得在步驟b)中，逆轉(zhuǎn)錄酶的活性不會(huì)受到 可察覺的影響。因此，在步驟b )中加入的裂解緩沖液優(yōu)選包含約0.2 - 0.5 M的離液劑。 此外，在步驟c)開始時(shí)加入另外的試劑后，離液劑以約30 - 50 mM，優(yōu)選約40 mM的濃度存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟b)在非離子型去污劑如NP40的存在下進(jìn)行?；?者，如果需要處理僅具有小體積的樣品，步驟b)包括加入PCR相容的濕潤劑，其導(dǎo)致有效避 免蒸發(fā)效應(yīng)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，碳水化合物如糖或葡聚糖可以用作濕潤劑。如 果加入了 NP40或另一種非離子型去污劑，則應(yīng)該選擇去污劑的量，選擇的方式使得在步驟 c)中，所述去污劑以0. 1 - 2%的V/V量存在?？梢栽诙喾N溫度下進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞收獲和裂解。本發(fā)明方法的步驟b)通 常進(jìn)行至少5分鐘，即，在16°C 進(jìn)行。在這些情況下裂解所需的最長時(shí)間是大約30 分鐘。類似地，甚至是在低于環(huán)境溫度但高于5°C的溫度下，步驟b)可以進(jìn)行至少10分鐘。 在這些情況下裂解所需的最長時(shí)間是大約60分鐘。如果處理非常小體積的樣品，這些條件 對于避免任何蒸發(fā)效應(yīng)是非常有利的。它也消除了對加熱的需要。
但是，為了加速和改進(jìn)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞的裂解，裂解緩沖液可以補(bǔ)充蛋白酶K。在 這種情況下，在濃度為約0.05 - 5 mg/ml，優(yōu)選0. 1-1 mg/ml的蛋白酶K的存在下，在約 550C - 85°C的溫度下，步驟b)進(jìn)行至少5分鐘。任選地，可以通過隨后在約80°C - 90°C 的溫度下，在步驟b)和步驟c)之間或步驟c)和步驟d)之間溫育至少5分鐘，通常不超過 30分鐘，將所述蛋白酶K不可逆地滅活。根據(jù)本發(fā)明，在同一反應(yīng)容器中進(jìn)行細(xì)胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄，已經(jīng)證明了如果裂解的 細(xì)胞中含有的基因組DNA可以被選擇性除去同時(shí)細(xì)胞RNA保持完整，則這是高度有利的。實(shí) 現(xiàn)這種效果的最有效的可能性是通過引入DNA酶消化步驟而酶促除去。因此，在本發(fā)明的 一個(gè)主要實(shí)施方案中，在雙鏈特異性DNA酶存在下進(jìn)行步驟b)。優(yōu)選地，這樣的DNA酶是專 門的雙鏈特異性DNA如DNA酶I (Roche Applied Science目錄號04 716 728)或蝦DNA 酶(US 6，541, 204)，其濃度為每50 μ 反應(yīng)物約0. 1單位(USB，目錄號73814)。但是， 由于在步驟d)中單鏈cDNA進(jìn)一步進(jìn)行DNA聚合酶催化的擴(kuò)增反應(yīng)，如PCR反應(yīng)，在擴(kuò)增反 應(yīng)前滅活所述DNA酶是高度有利的。因此，為了滅活DNA酶活性，在特定實(shí)施方案中，在約 80°C-90°的溫度下，在步驟b)和步驟c)之間或步驟c)和步驟d)之間，將樣品溫育至少 5分鐘，但不超過60分鐘?；蛘?，如果DNA酶是蝦DNA酶，在步驟d)中PCR反應(yīng)的第一個(gè)循 環(huán)中的變性通常是足夠的。對于第一鏈cDNA合成，使用具有反義序列的引物。這些引物是特異性引物，即結(jié) 合mRNA的聚腺苷酸尾的寡-dT引物，或隨機(jī)引物，如隨機(jī)六聚體引物。對于后續(xù)PCR，將有 義方向的序列特異性引物用作正向引物。反向引物是可以與第一鏈cDNA合成反應(yīng)中使用 的特異性引物相同的特異性引物?；蛘?，反向引物與位于已經(jīng)用于逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的引物的 結(jié)合側(cè)上游的序列雜交。本發(fā)明可適用于進(jìn)行序列的一步RT-PCR，所述序列可行地具有最多5 kb的任何 擴(kuò)增子大小。本發(fā)明特別可用于進(jìn)行2步RT 0 ，8卩，在第一反應(yīng)中，將1 嫩逆轉(zhuǎn)錄為單鏈(^嫩。 可以用于該步驟的RNA依賴性DNA聚合酶的實(shí)例是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science 目錄號 11 495 062) ,MMuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science 目錄號 Oil 062 603)和 重組 iTranscriptor 逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science 目錄號 03 531 317)。隨后，加入 通過PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的單鏈cDNA所需的所有試劑，例如耐熱DNA依賴性DNA聚合酶以及靶 特異性正向和反向擴(kuò)增引物。本發(fā)明的方法也可以用于進(jìn)行1步PCR，特征在于在逆轉(zhuǎn)錄之前，在步驟C) 中加入RT-PCR必需的所有試劑和酶。例如，生氫氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的 DNA 聚合酶能夠進(jìn)行 1 步 PCR(Roche Applied Science 目錄號 12016338001)?；蛘撸妹富旌衔镞M(jìn)行本發(fā)明的一步RT-PCR方法，所述酶混合物包含能夠 進(jìn)行PCR反應(yīng)的DNA模板依賴性的耐熱DNA聚合酶和能夠進(jìn)行一步RT-PCR反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄 酶步驟的RNA模板依賴性的DNA聚合酶，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。但是，通常，用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)容器的材料不是耐熱的，并且各 自的小瓶不能適合熱循環(huán)儀。因此，對于1步RT-PCR方案，在逆轉(zhuǎn)錄步驟后，將產(chǎn)生的第一 鏈cDNA的樣品從培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移到可以與熱循環(huán)儀設(shè)備結(jié)合使用的反應(yīng)容器中，而不需要 中間加入另外的試劑。然而，如果用于培養(yǎng)所述貼壁細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器的材料是耐熱的，則步驟d)也可以在所述容器中進(jìn)行。特別是，如果細(xì)胞培養(yǎng)容器是以微量滴定板形式安排， 則所述微量滴定板可以直接轉(zhuǎn)移到配置用于取走所述板的熱循環(huán)儀設(shè)備中。在一個(gè)主要實(shí)施方案中，實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增步驟。所述實(shí)時(shí)監(jiān)測的特征在于所述一步 RT-PCR反應(yīng)的過程是實(shí)時(shí)監(jiān)測的。不同的檢測形式是本領(lǐng)域已知的。已經(jīng)證明了下面提到 的檢測形式對于RT - PCR有用，因此提供了基因表達(dá)分析的容易和直接的可能性。a) TaqMan水解探針形式
用兩種組分標(biāo)記單鏈雜交探針。當(dāng)用合適波長的光激發(fā)第一組分時(shí)，根據(jù)熒光共振能 量轉(zhuǎn)移的原理，將吸收的能量轉(zhuǎn)移到第二組分，即所謂的猝滅劑。在PCR反應(yīng)的退火步驟 中，雜交探針與靶DNA結(jié)合，并且在隨后的延伸階段中通過Taq聚合酶的5’_3’核酸外切酶 活性降解。結(jié)果，激發(fā)的熒光組分和猝滅劑在空間上彼此分開，因此可以測量第一組分的熒 光發(fā)射。TaqMan探針測定詳細(xì)公開于US 5, 210, 015, US 5，538，848和US 5，487，972中。 TaqMan雜交探針和試劑混合物公開于US 5，804, 375中。b)分子信標(biāo)
這些雜交探針也用第一組分和猝滅劑標(biāo)記，標(biāo)記優(yōu)選位于探針的兩端。由于探針的二 級結(jié)構(gòu)，兩種組分在溶液中空間上鄰近。在與靶核酸雜交后，兩種組分彼此分開，使得在用 合適波長的光激發(fā)后，可以測量第一組分的熒光發(fā)射(US 5，118，801)。c) FRET 雜交探針
FRET雜交探針測試形式對于所有類型的均相雜交測定特別有用(Matthews，J. Α., and Kricka, L. J.，Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25)。其特征在于同時(shí)使用 并且與擴(kuò)增的靶核酸的同一鏈的相鄰位點(diǎn)互補(bǔ)的兩個(gè)單鏈雜交探針。用不同的熒光組分標(biāo) 記這兩個(gè)探針。當(dāng)用合適波長的光激發(fā)時(shí)，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，第一組分將吸收 的能量轉(zhuǎn)移到第二組分，使得當(dāng)這兩個(gè)雜交探針與要檢測的靶分子的相鄰位置結(jié)合時(shí)能夠 測量第二組分的熒光發(fā)射。作為監(jiān)測FRET受體組分的熒光增加的替代，也可以監(jiān)測作為雜 交事件的定量測量值的FRET供體組分的熒光減少。特別是，F(xiàn)RET雜交探針形式可以用于實(shí)時(shí)PCR中，從而檢測擴(kuò)增的靶DNA。實(shí)時(shí) PCR領(lǐng)域已知的所有檢測形式中，已經(jīng)證明了 FRET-雜交探針形式是高度靈敏、準(zhǔn)確和可靠 的(W0 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。作為使用兩個(gè)FRET雜交探針的替代， 也可以使用熒光標(biāo)記的引物和僅僅一個(gè)標(biāo)記的寡核苷酸探針(Bernard，P. S., et al., Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107)。在這一點(diǎn)上，它可以任意選擇，無論引 物是用FRET供體還是用FRET受體化合物標(biāo)記。d) SybrGreen 形式
在用雙鏈核酸結(jié)合部分檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的情況下，如果在本發(fā)明的添加劑存在下進(jìn)行實(shí) 時(shí)PCR，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，也可以通過熒光DNA結(jié)合染料根據(jù)本發(fā)明檢測各自 的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述染料在用合適波長的光激發(fā)后一旦與雙鏈核酸相互作用就發(fā)射相應(yīng)的熒 光信號。已經(jīng)證明染料SybrGreenI和SybrGold (Molecular Probes)特別適于本申請?？?以替代地使用嵌入染料。但是，對于這種形式，為了區(qū)分不同的擴(kuò)增產(chǎn)物，必須進(jìn)行各自的 解鏈曲線分析(US 6，174,670)。根據(jù)本發(fā)明的試劑念
另一方面，本發(fā)明也提供了試劑盒，其包含(i)用于培養(yǎng)至少一個(gè)細(xì)胞樣品的一次性容器，
( )裂解緩沖液，和
(iii)包含逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。一次性容器(i)可以是適于培養(yǎng)至少一個(gè)細(xì)胞群的任何類型的一次性容器。優(yōu)選 地，所述一次性容器是優(yōu)選具有6孔、M孔、96孔、384孔或1535孔的微量滴定板。在特定 實(shí)施方案中，所述一次性容器是耐熱的，并且與熱循環(huán)儀設(shè)備相容。裂解緩沖液(ii)是包含0. 05 M-IM離液劑的緩沖液。試劑本身優(yōu)選是硫氰酸胍。 任選地，試劑盒可以包含蛋白酶K，其以約0.05 - 5 mg/ml，優(yōu)選0. 1-1 mg/ml的濃度存在 于在裂解緩沖液中，或作為具有至少5倍的原液濃度的單獨(dú)的試劑。同樣任選地，試劑盒可 以包含葡聚糖或非離子型去污劑(其優(yōu)選是NP)，其以0.1 - 2 %的V/V量存在于裂解緩沖 液中，或以至少5倍的原液濃度存在于分開的小瓶中。同樣任選地，試劑盒可以主要含有雙 鏈特異性DNA酶，例如DNA酶I或蝦核酸酶，其存在于分開的小瓶中，濃度是至少0. 02個(gè)單 位。逆轉(zhuǎn)錄酶(iii)是專門的RNA依賴性DNA聚合酶，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science 目錄號 11 495 062)、MMuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science 目錄號 Oil 062 603)和重組 Transcriptor 逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science 目錄號 03 531 317)。組分 (iii)也可以是1步RT PCR酶，例如，生氫氧化碳嗜熱菌的DNA聚合酶，或逆轉(zhuǎn)錄酶和耐熱 DNA依賴性DNA聚合酶的混合物。本發(fā)明的試劑盒可以包含緩沖液、第一鏈cDNA合成所需的脫氧核苷三磷酸，以及 各自的引物，如寡-dT引物、隨機(jī)六聚體引物，或甚至特異性引物。與聚合酶一起，這些試劑 中的一種、幾種或全部，可以組合到一個(gè)小瓶中，作為各自的主混合物。此外，本發(fā)明的這樣的試劑盒可以包含耐熱DNA聚合酶，如Taq聚合酶，和進(jìn)行擴(kuò) 增反應(yīng)所必需的所有其他試劑，包括但不限于緩沖試劑、另外的脫氧核苷三磷酸，以及序列 特異性擴(kuò)增引物。此外，試劑盒可以包含在雜交qPCR過程中檢測擴(kuò)增子所必需的試劑，例 如至少一個(gè)熒光標(biāo)記的雜交探針或雙鏈熒光染料。
實(shí)施例實(shí)施例1
以每個(gè)小瓶大約1000或250個(gè)細(xì)胞，將小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以兩種不同的濃度(1:1， 1:4)接種到384孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。約96小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌細(xì)胞。加入2μ1 裂解緩沖液，將細(xì)胞在室溫下溫育10分鐘。裂解緩沖液的組成如下 0. 2Μ硫氰酸胍 10 ng/ul聚肌苷酸
加入 Transcriptor RT 試劑(Roche Applied Science 目錄號 03 531 317)到終 RT 體 積為20μ1。在無RT對照中，從RT混合物省略了逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)以下熱循環(huán)流程，溫育含 RT反應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板 25°C下10分鐘 55°C下30分鐘 85 °C下5分鐘在冰上冷卻
隨后，在無核酸酶的水中將cDNA稀釋到50μ1。用LightCycler 480 SYBR Green I Master 預(yù)混合物(Roche Applied Science 目錄號 04 707 516)和適于擴(kuò)增 ACTB 和 18S rRNA的弓丨物(TATAA Biocenter,內(nèi)源對照基因系列(endogenous control gene panel)) 在 10μ1 PCR 中分析 2μ1 cDNA。在 LightCycler 480 實(shí)時(shí) PCR 儀(Roche Applied Science 目錄號05 015 278)上對ACTB和18S rRNA基因的表達(dá)進(jìn)行定量，并且根據(jù)制造商的說明 書測定Ct值。低Ct值對應(yīng)高度表達(dá)。
表1:獲自1:1稀釋的Ct值
權(quán)利要求
1.進(jìn)行用于擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以下步驟a)在細(xì)胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞群，b)在所述樣品容器中用包含0.05M-I M離液劑的裂解緩沖液裂解推測含有所述靶 RNA的所述貼壁細(xì)胞群，c)在所述樣品容器中加入進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品 容器中以約10-60 mM的濃度存在，并且將所述靶RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，d)通過進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)流程，擴(kuò)增所述第一鏈cDNA。
2.權(quán)利要求1的方法，其中實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增步驟。
3.權(quán)利要求1-2的方法，其中所述離液劑是硫氰酸胍。
4.權(quán)利要求1-4的方法，其中所述裂解緩沖液包含約0.2-0. 5M的離液劑。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中步驟b)在非離子型去污劑的存在下進(jìn)行，所述去污劑優(yōu) 選是NP40，并且其中在步驟c)中，所述非離子型去污劑具有0. 1-2 %&V/V。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中在步驟b)和c)之間加入DNA酶。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其中在步驟b)中或在步驟c)之前加入蛋白酶K。
8.試劑盒，其包含-用于培養(yǎng)至少一個(gè)細(xì)胞樣品的一次性容器， -裂解緩沖液，其任選包含離液劑 -包含逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，進(jìn)一步包含至少一種另外的組分，所述組分選自非離子型去 污劑、碳水化合物、DNA酶和蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及進(jìn)行用于擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以下步驟(i)在細(xì)胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞群，(ii)在所述樣品容器中用包含0.05M-1M離液劑的裂解緩沖液裂解推測含有所述靶RNA的所述貼壁細(xì)胞群，(iii)在所述樣品容器中加入進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品容器中以約10-60mM的濃度存在，并且逆轉(zhuǎn)錄所述靶RNA，和(iv)通過使所述樣品進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)流程，擴(kuò)增所述第一鏈cDNA。
文檔編號C12Q1/68GK102112631SQ200980130405
公開日2011年6月29日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者L.斯特雷姆博姆, M.庫比斯塔, N.佐里克 申請人:塔塔生物中心有限公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司