專利名稱：一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，屬于提取及分離純化技術(shù)領(lǐng)
域，具體涉及大豆異黃酮的分離、純化及高純度甙元產(chǎn)品的制備方法，用于商品化高純度大豆異黃酮產(chǎn)品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
大豆異黃酮是一種從大豆中提取的生物類黃酮，由于其具有多種重要生理功能而得到廣泛應(yīng)用。目前，大豆異黃酮多采用有機溶劑法提取，然后通過樹脂柱層析手段分離純化，由于分離純化步驟繁瑣，分離效率和生產(chǎn)效率均較低，由此導(dǎo)致高純度的大豆異黃酮產(chǎn)品的產(chǎn)量小、價格昂貴，極大的限制了其應(yīng)用范圍。天然大豆異黃酮主要以糖甙結(jié)合的形式存在，通過酸或酶的水解，大豆異黃酮甙可水解為異黃酮甙元，同時其在有機溶劑中的溶解性能也隨之發(fā)生改變。采用微生物酶水解結(jié)合有機溶劑的選擇性提取技術(shù)可直接獲得更容易被人體吸收利用的甙元形式的大豆異黃酮產(chǎn)品并能有效提高異黃酮產(chǎn)品純度，是一種更有效、更科學(xué)的制備高純度大豆異黃酮產(chǎn)品的方法。但是，采用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的方法進(jìn)行水解大豆異黃酮往往存在酶的純度低、微生物發(fā)酵產(chǎn)生新的雜質(zhì)成分的問題，而直接應(yīng)用商品酶作為水解酶源又因其高昂的價格使生產(chǎn)成本難以被生產(chǎn)廠家接受。中國專利(申請?zhí)?00710117756. 4)公開了 '一種酶水解大豆異黃酮的方法'，該方法通過固定化酶對大豆異黃酮產(chǎn)品進(jìn)行水解后用有機溶劑提取大豆異黃酮甙元，實現(xiàn)了大豆異黃酮的高效水解、部分純化和降低生產(chǎn)成本的目的。但該方法存在以下不足之處(l)酶固定化方法中使用了戊二醛作為交聯(lián)試劑，存在食品安全隱患的問題；(2)沒有在水解前脫除大豆異黃酮原料中與大豆異黃酮甙元溶解性相似的雜質(zhì)，有機溶解提取后制得的異黃酮甙元產(chǎn)品純度不高；(3)大豆異黃酮甙分子中存在的甲氧基、乙酰基等側(cè)鏈基團限制了酶與底物的接觸，酶水解效率不高；(4)在雙相體系中同時進(jìn)行酶的水解和有機溶劑提取過程，酶與有機溶劑接觸時間長，容易導(dǎo)致酶的失活。 基于以上分析，本發(fā)明的目的在于提供一種高效、安全的利用固定化酶水解手段制備高純度大豆異黃酮甙元產(chǎn)品的方法，提高高純度大豆異黃酮產(chǎn)品的生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 本發(fā)明公開的一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，它包括以下步驟 A、選用溶劑抽提的方法脫除大豆異黃酮原料中與大豆異黃酮甙元溶解性相似的
雜質(zhì)，再經(jīng)離心分離和干燥，制得預(yù)處理原料。 B、將上述預(yù)處理原料用磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖溶液溶解，然后在沸水浴中攪拌加熱，冷卻； C、在上述冷卻的料液中加入固定化酶，攪拌水解，再經(jīng)過過濾分離得到含異黃酮
3甙元的水解液； D、在上述水解液中加入溶劑進(jìn)行液_液萃取，待水解液分層后，收集上層液體，減壓回收溶劑，再經(jīng)過干燥制得高純度大豆異黃酮甙元產(chǎn)品。 所述步驟A中的溶劑為丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選正己烷或無水乙醚，尤其優(yōu)選無水乙醚；所述抽提共進(jìn)行3次，抽提溫度10 4(TC，優(yōu)選3(TC，每次抽提30min。 所述步驟B中的緩沖溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸，pH值3.0 7.0，優(yōu)選pH5.0，所述加熱時間1 10min，優(yōu)選5min。 所述步驟C中水解用酶為固定化13 -葡萄糖苷酶，固定化酶按以下方法制備
將0. 5 3% (w/v)的海藻酸鈉溶液與13 _葡萄糖苷酶溶液(0. 01U/mL 0. 05U/mL)混合均勻，海藻酸鈉溶液與13 _葡萄糖苷酶液的體積比為1 3 : l，攪拌5 10min，得共混液I。將0. 2 2% (w/v)的殼聚糖溶液與0. 5 3% (w/v)的CaCl2溶液混合均勻，殼聚糖溶液與CaCl2溶液體積比為1 3 : 1，用0. 2g/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH至5. O，得共混液II。分別調(diào)節(jié)共混液I和共混液II至相同溫度(20 40°C )，將共混液I均勻滴入共混液II中，形成顆粒均勻的凝膠小球，于2 l(TC條件下固定化1 4h，過濾分離凝膠顆粒并用蒸餾水洗滌后，得到固定化酶顆粒。 所述步驟D中的溶劑為丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選正己烷或無水乙醚，尤其優(yōu)選無水乙醚。 本發(fā)明所提供的固定化酶水解手段制備高純度大豆異黃酮甙元方法是首先利用
有機溶劑脫除大豆異黃酮原料中與異黃酮甙元溶解性相似的雜質(zhì)成分，所述溶劑可選擇丙
酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選為無水乙醚；然后對異黃酮原料進(jìn)行短時熱處理，其目
的是水解除去異黃酮甙分子中的甲氧基、乙?；葌?cè)鏈基團，有利于固定化酶與底物分子
的接觸，提高酶的水解效率。隨后，利用固定化酶水解，將原料中的大豆異黃酮甙水解為異
黃酮甙元，所述酶為P _葡萄糖苷酶，所述酶固定化方法為海藻酸鈉_殼聚糖包埋法；固定
化酶水解完成后分離固定化酶并重復(fù)利用；酶解液用有機溶劑專一性萃取大豆異黃酮甙
元，所述有機溶劑可選擇丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選為無水乙醚；萃取后分離有
機相并脫除有機溶劑后得到高純度異黃酮甙元產(chǎn)品。 本發(fā)明的優(yōu)點是 1、采用生物酶水解和有機溶劑的選擇性萃取相結(jié)合的技術(shù)對低純度商品大豆異黃酮進(jìn)行進(jìn)一步純化以制備高純度大豆異黃酮產(chǎn)品，其分離、純化操作簡便、投資小、生產(chǎn)效率高。 2、大豆異黃酮原料在酶水解前先通過加熱預(yù)處理水解除去異黃酮甙分子中的甲氧基、乙酰基等側(cè)鏈基團，有利于酶與P-葡萄糖甙的接觸，可提高酶的水解提取率。
3、大豆異黃酮原料通過預(yù)處理脫除與大豆異黃酮甙元溶解性相似的雜質(zhì)，制備所得的大豆異黃酮甙元產(chǎn)品的純度更高，并且是甙元形式的產(chǎn)品，人體更容易吸收利用，應(yīng)用范圍更廣。 3、固定化酶水解和有機溶劑選擇性萃取分為兩個步驟進(jìn)行，酶不會因與有機溶劑的接觸而導(dǎo)致失活。 4、固定化酶制備過程中不添加戊二醛等交聯(lián)試劑，固定化酶可多次重復(fù)使用，有
4效降低了生產(chǎn)成本并提高了產(chǎn)品的安全性。
具體實施例方式
1、固定化酶的制備將0.5 3% (w/v)的海藻酸鈉溶液與P-葡萄糖苷酶溶液(0. 01U/mL 0. 05U/mL)混合均勻，海藻酸鈉溶液與P _葡萄糖苷酶液的體積比為1 3 : 1，攪拌5 10min，得共混液I。將O. 2 2% (w/v)的殼聚糖溶液與0. 5 3% (w/v)的CaCl2溶液混合均勻，殼聚糖溶液與CaCl2溶液體積比為1 3 : l，用0. 2g/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH至5. O，得共混液II。分別調(diào)節(jié)共混液I和共混液II至相同溫度(20 40°C )，將共混液I均勻滴入共混液II中，形成顆粒均勻的凝膠小球，于2 l(TC條件下固定化1 4h，過濾分離凝膠顆粒并用蒸餾水洗滌后，得到固定化酶顆粒。
2、原料的前處理(脫雜)低純度大豆異黃酮商品(總黃酮含量小于25% )用有機溶劑回流抽提3次，有機溶劑可選擇丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選正己烷或無水乙醚，尤其優(yōu)選無水乙醚，抽提溫度10 4(TC，優(yōu)選3(TC，每次提取30min，離心，收集殘渣，干燥得預(yù)處理原料。 3、酶水解與溶劑的選擇性萃取純化預(yù)處理原料用pH值3. 0 7. 0的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液溶解，優(yōu)選pH5. 0，然后在沸水浴中攪拌處理1 10min，優(yōu)選5min，迅速冷卻至室溫，加入固定化酶顆粒(酶的用量為2 50活力單位/克原料)，于20 6(TC條件下攪拌水解1 5h，過濾分離水解液和固定化酶顆粒，固定化酶顆粒收集后重復(fù)使用；向水解液中加入有機溶劑進(jìn)行液_液萃取，分層后收集上層液體，有機溶劑可選擇丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選正己烷或無水乙醚，尤其優(yōu)選無水乙醚，減壓回收有機溶劑，干燥，得到85 95%的大豆異黃酮甙元產(chǎn)品。
實施例1 : 1、固定化酶的制備將2% (w/v)的海藻酸鈉溶液與13 -葡萄糖苷酶液(0. 03U/mL)混合均勻，海藻酸鈉溶液與P-葡萄糖苷酶液的體積比為1.5 : 1，攪拌10min，得共混液I。將1% (w/v)的殼聚糖溶液與2% (w/v)的CaCl2溶液混合均勻，殼聚糖溶液與CaC^溶液體積比為1 : l，用0. 2g/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH至5. O，得共混液II。分別調(diào)節(jié)共混液I和共混液II至相同溫度(20°C )，將共混液I均勻滴入共混液II中，形成顆粒均勻的凝膠小球，于4t:條件下固定化2h，過濾分離凝膠顆粒并用蒸餾水洗滌后，得到固定化酶顆粒。 2、原料的前處理低純度大豆異黃酮商品(總黃酮含量21%)用正己烷回流提取3次，提取溫度2(TC，每次提取30min，離心，收集殘渣，干燥得預(yù)處理原料。
3、酶水解與溶劑的選擇性萃取純化預(yù)處理原料用pH值5. 0的緩沖液溶解，然后在沸水浴中攪拌處理5min，迅速冷卻至室溫，加入固定化酶顆粒(酶的用量為15活力單位/克原料)，于5(TC條件下攪拌水解3h，過濾分離水解液和固定化酶顆粒，固定化酶顆粒收集后重復(fù)使用；向水解液中加入無水乙醚，進(jìn)行液_液萃取，分層后收集上層液體，減壓回收溶劑，干燥，得到92%的大豆異黃酮甙元成品。
實施例2 : 1、固定化酶的制備將3% (w/v)的海藻酸鈉溶液與13 -葡萄糖苷酶液(0. 05U/mL)混合均勻，海藻酸鈉溶液與P-葡萄糖苷酶液的體積比為2 : 1，攪拌10min，得共混液I。將2% (w/v)的殼聚糖溶液與3% (w/v)的CaC^溶液混合均勻，殼聚糖溶液與CaC^溶液體積比為1 : l，用0. 2g/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH至5. O，得共混液II。分別調(diào)節(jié)共混液I和共混液II至相同溫度(30°C )，將共混液I均勻滴入共混液II中，形成顆粒均勻的凝膠小球，于1(TC條件下固定化2h，過濾分離凝膠顆粒并用蒸餾水洗滌后，得到固定化酶顆粒。 2、原料的前處理低純度大豆異黃酮商品(總黃酮含量21%)用無水乙醚回流提取3次，提取溫度4(TC，每次提取30min，離心，收集殘渣，干燥得預(yù)處理原料。
3、酶水解與溶劑的選擇性萃取純化預(yù)處理原料用pH值7. 0的緩沖液溶解，然后在沸水浴中攪拌處理5min，迅速冷卻至室溫，加入固定化酶顆粒(酶的用量為6活力單位/克原料)，于3(TC條件下攪拌水解3h，過濾分離水解液和固定化酶顆粒，固定化酶顆粒收集后重復(fù)使用；向水解液中加入無水乙醚，進(jìn)行液_液萃取，分層后收集上層液體，減壓回收溶劑，干燥，得到89%的大豆異黃酮甙元成品。
權(quán)利要求
一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A、選用溶劑抽提的方法脫除大豆異黃酮原料中與大豆異黃酮甙元溶解性相似的雜質(zhì)，再經(jīng)離心分離和干燥，制得預(yù)處理原料。B、將上述預(yù)處理原料用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液溶解，然后在沸水浴中攪拌加熱，冷卻；C、在上述冷卻的料液中加入固定化酶，攪拌水解，再經(jīng)過過濾分離得到含異黃酮甙元的水解液；D、在上述水解液中加入溶劑進(jìn)行液-液萃取，待水解液分層后，收集上層液體，減壓回收溶劑，再經(jīng)過干燥制得高純度大豆異黃酮甙元產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，其特征在于所述步驟A中的溶劑為丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選正己烷或無水乙醚，尤其優(yōu)選無水乙醚；所述抽提共進(jìn)行3次，抽提溫度10 40°C ，優(yōu)選30°C ，每次抽提30min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，其特征在于所述步驟B中的緩沖溶液為磷酸氫二鈉_檸檬酸，pH值3. 0 7. 0，優(yōu)選pH5. 0，所述加熱時間1 10min，優(yōu)選5min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，其特征在于所述步驟C中水解用酶為固定化13 -葡萄糖苷酶，固定化酶按以下方法制備將0. 5 3% (w/v)的海藻酸鈉溶液與13 -葡萄糖苷酶溶液(0. 01U/mL 0. 05U/mL)混合均勻，海藻酸鈉溶液與P-葡萄糖苷酶液的體積比為l 3 : 1，攪拌5 10min，得共混液I。將0. 2 2% (w/v)的殼聚糖溶液與0. 5 3% (w/v)的CaCl2溶液混合均勻，殼聚糖溶液與CaCl2溶液體積比為1 3 : 1 ，用0. 2g/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH至5. 0，得共混液II。分別調(diào)節(jié)共混液I和共混液II至相同溫度(20 40°C )，將共混液I均勻滴入共混液II中，形成顆粒均勻的凝膠小球，于2 l(TC條件下固定化1 4h，過濾分離凝膠顆粒并用蒸餾水洗滌后，得到固定化酶顆粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法，其特征在于所述步驟D中的溶劑為丙酮、正己烷、石油醚或無水乙醚，優(yōu)選正己烷或無水乙醚，尤其優(yōu)選無水乙醚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度大豆異黃酮甙元的制備方法。該方法以低純度商品大豆異黃酮為原料，首先利用有機溶劑脫除原料中與大豆異黃酮甙元溶解性相似的雜質(zhì)，然后對原料進(jìn)行短時熱處理以提高酶水解效率，之后利用固定化酶水解技術(shù)將原料中的大豆異黃酮甙水解＝異黃酮甙元并用有機溶劑選擇性萃取大豆異黃酮甙元，最終獲得高純度的大豆異黃酮甙元產(chǎn)品。該方法的優(yōu)點是分離、純化操作簡便，酶水解效率高，水解酶不與有機溶劑接觸，酶活損耗小并可重復(fù)使用，成品得率高，可有效降低生產(chǎn)成本，成品純度高，應(yīng)用范圍更廣。
文檔編號C12P17/06GK101701232SQ200910272558
公開日2010年5月5日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者劉 英, 劉駿, 張寒俊, 汪海波, 黃愛妮 申請人:武漢工業(yè)學(xué)院