一種大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆通稱黃豆，豆科大豆屬一年生草本。原產(chǎn)中國，中國各地均有栽培，亦廣泛栽 培于世界各地。大豆是中國重要糧食作物之一，中國東北為主產(chǎn)區(qū)，是一種其種子含有豐富 植物蛋白質(zhì)的作物，大豆最常用來做各種豆制品、榨取豆油、釀造醬油和提取蛋白質(zhì)。豆渣 或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜飼料。
[0003] 20世紀80年代，孟山都公司研究人員從矮牽牛中克隆獲得了抗性基因（EPsPs基 因），并用農(nóng)桿菌介導法將矮牽牛的EPsPs基因?qū)舜蠖够蚪M中，進而培育出抗草甘膦大 豆品種。1994年，孟山都公司培育的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆首次獲得美國商業(yè)化種植許可。 轉(zhuǎn)基因大豆自推廣以來，種植面積一直高居各類轉(zhuǎn)基因作物之首，是世界上最早商品化、推 廣應(yīng)用速度最快的轉(zhuǎn)基因作物。
[0004] 大豆轉(zhuǎn)基因要經(jīng)過基因?qū)搿⑥D(zhuǎn)化不定芽誘導、不定芽伸長、不定芽生根、植株移 栽生長至開花結(jié)莢獲得轉(zhuǎn)基因后代。大豆轉(zhuǎn)化不定芽的生根及移栽后的成活率是影響大豆 轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在已公開的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根至植株 成熟一般經(jīng)過以下步驟：（1)將不定芽生切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；(2)從培 養(yǎng)瓶中取出生根的大豆再生苗，洗凈根上的培養(yǎng)基，（3)進一步移栽到基質(zhì)中；繼續(xù)培育使 新葉發(fā)生幼苗健壯；（4)然后移植到土壤中，正常管理直到結(jié)莢。在這其中，生根誘導對于 形成完整的植株至關(guān)重要，是芽苗能否自主生長的關(guān)鍵步驟，通過再生植株的自主營養(yǎng)吸 收和根毛吸收的養(yǎng)分供應(yīng)，芽苗才能夠健康地生長發(fā)育、長成健壯的植株。
[0005] 目前上述生根技術(shù)中普遍應(yīng)用的生根培養(yǎng)基以MS或B5為基本培養(yǎng)基，其中單獨 添加吲哚丁酸（IBA)O. 2-1. Omg/L，或者單獨添加萘乙酸（NAA)O. 37-1. Omg/L。
[0006] 關(guān)于大豆轉(zhuǎn)化不定芽的生根技術(shù)的研究，主要有朱木蘭等人發(fā)明的"大豆轉(zhuǎn)基因 株系混合生根方法"（【申請?zhí)枴緾N201310222316.0)、楊躍生等人發(fā)明的"一種解決大豆轉(zhuǎn)化 不定芽條難以生根的無菌嫁接方法"（【申請?zhí)枴緾N201210368585. 3)和姜國勇發(fā)明的一種大 豆組織培養(yǎng)分化苗的生根方法（【申請?zhí)枴緾N201410349357. 0)，以上生根技術(shù)中均需要在密 閉培養(yǎng)瓶中的無菌培養(yǎng)基上生根。現(xiàn)有技術(shù)中，需要配制固體生根培養(yǎng)基，技術(shù)復雜且在大 豆不定芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基以及后續(xù)的培養(yǎng)過程中容易感染細菌，固體生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)環(huán)境 是在密閉的培養(yǎng)瓶中，不利于再生苗生長的生理代謝，抑制再生苗的發(fā)根，并且在固體生根 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的不定根與正常根系相比，質(zhì)量差并且沒有根毛，吸收功能差。在瓶內(nèi)密閉 環(huán)境下培育的生根苗存活能力弱，通常要經(jīng)過瓶外馴化的過程，然后再進行定植，在此過程 中，有一些生根苗因不適應(yīng)外部環(huán)境而死亡，導致移栽成活率降低。
[0007] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的第一目的在于提供一種大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根的方法，該方法具有操作 簡單、改善生根質(zhì)量、提高轉(zhuǎn)化大豆不定芽的生根率以及再生大豆苗的成活率等優(yōu)點。同 時，避免了密封的容器環(huán)境對再生苗的發(fā)根抑制以及對再生苗生長和生理代謝的不利影 響，避免再生苗在生根過程中染菌，培育出健壯的再生苗。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0010] -種大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根的方法，包括以下步驟：將大豆轉(zhuǎn)化不定芽的下端浸泡 在生根液中，然后將浸泡后的大豆轉(zhuǎn)化不定芽植入不封閉的育苗缽中，覆膜，進行光照培 養(yǎng)，待長出新葉后，揭膜，繼續(xù)培養(yǎng)至生根壯苗。
[0011] 本發(fā)明提供的大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根的方法，可以有效地促進不定根發(fā)生。同時可 以抑制后續(xù)生根過程中的染菌，尤其是農(nóng)桿菌的滋生?？梢源娆F(xiàn)有技術(shù)中的固體生根培 養(yǎng)基，固體生根培養(yǎng)基制作過程繁瑣、技術(shù)復雜，整個過程要求無菌操作，并且，大豆不定芽 轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基以及后續(xù)培養(yǎng)過程中容易染菌，尤其是以農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化的大豆，形 成的再生不定芽本身攜帶農(nóng)桿菌，不定芽在生根之前或者轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基以后容易滋生 農(nóng)桿菌，染菌后的不定芽不能生根并死亡。該方法中，采用直接在不封閉的育苗缽中（開放 的環(huán)境）生根，避免了密封的容器環(huán)境對再生苗的發(fā)根抑制以及對再生苗生長和生理代謝 的不利影響。固體生根培養(yǎng)基制作過程繁瑣、技術(shù)復雜，整個過程要求無菌操作。生根液可 以在不定芽植入育苗缽中生根之前代替現(xiàn)有技術(shù)中的固體生根培養(yǎng)基，來提供生根所需要 的營養(yǎng)及生根環(huán)境，育苗基質(zhì)透氣疏松不利于細菌滋生，因此避免了再生苗生根過程中的 染菌。固體生根培養(yǎng)基質(zhì)地緊實不透氣，在其中生長出的不定根沒有根毛，而在育苗缽中育 苗基質(zhì)接近土壤環(huán)境，生長出的根具備豐富的根毛，根毛起著重要的吸收作用。因此該大豆 轉(zhuǎn)化不定芽生根的方法改善了生根質(zhì)量，培育獲得健壯再生苗，從而提高大豆轉(zhuǎn)化不定芽 的生根率、再生大?苗的移栽成活率，最終提尚大?轉(zhuǎn)化成功率。
[0012] 優(yōu)選的，所述的方法具體包括以下步驟：
[0013] (1)將大豆轉(zhuǎn)化不定芽的下端浸泡在的生根液中；
[0014] (2)將育苗基質(zhì)裝入不封閉的育苗缽中，澆水，然后將步驟（1)中的浸泡過的大豆 轉(zhuǎn)化不定芽植入該裝有育苗基質(zhì)的不封閉的育苗缽中，用薄膜覆蓋；
[0015] (3)將步驟（2)中的大豆轉(zhuǎn)化不定芽進行光照培養(yǎng)，待長出新葉后打開覆蓋的薄 膜，繼續(xù)培養(yǎng)該大豆轉(zhuǎn)化不定芽再生苗，直至再生苗健壯。
[0016] 經(jīng)過生根液浸泡有助于大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根，不封閉的育苗缽為不定芽的生根提 供開放的生長環(huán)境，使不定芽自然生根，不受拘束，得到健康健壯的根是大豆轉(zhuǎn)化不定芽的 移栽成活率和大豆苗成活的保證。澆水和覆膜提供和保持大豆轉(zhuǎn)化不定芽生根所需水分。 光照為大豆轉(zhuǎn)化不定芽提供光合作用所必須的能量。采用該方法，大豆轉(zhuǎn)化不定芽的生根 率可以達到96. 24%，移栽成活率達到100%。
[0017] 優(yōu)選的，所述生根液中，包括如下濃度的組分：吲哚丁酸0. 5-2. Omg/L，萘乙酸 0· 2-0. 5mg/L，頭孢霉素 200-300mg/L，pH = 5. 5-6. 0。
[0018] 優(yōu)選的，所述生根液中，包括如下濃度的組分：Π 引哚丁酸0. 5-1. 5mg/L，萘乙酸 0· 2-0. 5mg/L，頭孢霉素 240-260mg/L，pH = 5. 7-5. 9。
[0019] 該生根液中的吲哚丁酸是一種良好的生根劑，主要用于插條生根，可誘導根原體 的形成，促進細胞分化和分裂，有利于新根生成和維管束系統(tǒng)的分化，促進插條不定根的形 成，但是，吲哚丁酸在被植物吸收后不易在體內(nèi)運輸，往往停留在所施部位，主要用于促進 插條生根，所生出的根細而疏、分支多；萘乙酸是一種植物生長素，可用于植物組織培養(yǎng)。其 中，萘乙酸有助于促進主根的生成，而吲哚丁酸對于毛細根的形成起到促進作用，兩種生長 素單獨作用時，效果并不明顯，共同作用時效果明顯，生根率可以達到96. 24%。兩種生長素 在弱酸環(huán)境下可以穩(wěn)定存在。頭孢霉素是一種常用的抗生素，可以抑制農(nóng)桿菌以及其他細 菌的滋生。由于固體生根培養(yǎng)基中所含的生長素釋放緩慢，特采用生根液處理不定芽替代 固體生根培養(yǎng)基，可以使不定芽迅速吸收有效成分，并簡化操作過程，提高轉(zhuǎn)化大豆不定芽 的生根率。
[0020] 優(yōu)選的，所述浸泡的時間為5-30分鐘。
[0021] 充分的浸泡時間確保了大豆轉(zhuǎn)化不定芽充分吸收生根液中的生長素，促進主根和 毛細根的生長。
[0022] 優(yōu)選的，所述光