專利名稱：：一種核酸快速檢測方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種核酸快速檢測方法及其裝置。
背景技術(shù)：
：近年來，多種烈性傳染病諸如SARS，禽流感H5m，豬鏈球菌，甲型流感Hmi等在全世界范圍內(nèi)廣泛流傳，給人類造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)嚴(yán)重威脅人類的生命健康。病原微生物檢測方法主要有顯微鏡形態(tài)觀察，免疫法檢測，核酸檢測等等。核酸檢測較其他檢測病原微生物檢測法具有靈敏度高，特異性好，窗口期短，檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。核酸擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)廣泛用于病原微生物的臨床檢測。目前病原微生物核酸檢測方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RollingCircleAmplification,RCA)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalAmplification,LAMP)等。現(xiàn)有的核酸檢測技術(shù)中，PCR技術(shù)最為普遍，其中又以實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-timePCR)技術(shù)最為常用。這種技術(shù)具有靈敏度高，特異性好等特點(diǎn)。但是需要比較昂貴的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，其價(jià)格均在幾十萬元。這種高昂的成本限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。RCA技術(shù)和LAMP技術(shù)最大的特點(diǎn)就是等溫?cái)U(kuò)增，因此不需要價(jià)格比較高的PCR儀，僅僅需要恒溫水浴等恒溫加熱器即可進(jìn)行反應(yīng)。作為核酸擴(kuò)增技術(shù)的一種，LAMP技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比最大的優(yōu)勢就是靈敏度高，恒溫反應(yīng)不需要價(jià)格昂貴的PCR儀。目前對(duì)RCA產(chǎn)物和LAMP產(chǎn)物的檢測大都是在反應(yīng)結(jié)束后開管進(jìn)行檢測，在增加操作過程的同時(shí)，極易引起擴(kuò)增產(chǎn)物的滯后污染。雖然核酸檢測病原微生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但是以上提到的一些缺點(diǎn)仍然難以根本解決。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題提供一種避免擴(kuò)增產(chǎn)物滯后污染、靈敏度高、成本低的核酸快速檢測方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述檢測方法所用的檢測儀。發(fā)明人在研究工作中發(fā)現(xiàn)1.LAMP技術(shù)能夠擴(kuò)增病原微生物核酸樣本，包括DNA和RNA，并且靈敏度很高；2.SYBRGreen1染料能夠嵌入核酸雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部，并且在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光?；谶@些，發(fā)明人提出如下技術(shù)方案一種核酸快速檢測方法，該方法是在含有至少一個(gè)密封層的溫控反應(yīng)管內(nèi)利用LAMP技術(shù)對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不需要開管，升高反應(yīng)管溫度，使封有熒光染料的密封層溶解，釋放熒光染料進(jìn)行熒光檢測。所述的檢測方法，其中溫控反應(yīng)管含有二個(gè)密封層，核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需試劑全部或部分封于在較低溫度熔化的密封層中，熒光染料封于在較高溫度熔化的密封層中，通過控制溫度的變化實(shí)現(xiàn)二個(gè)密封層依次溶解，控制反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)及熒光可視化檢測。所述的檢測方法，其中熒光染料為SYBRGreen1染料。所述的檢測方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測直接在儀器內(nèi)進(jìn)行。所述的檢測方法，其中熒光檢測是熒光染料在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光后采用肉眼觀察或者采用照相或光電傳感器進(jìn)行圖像或數(shù)據(jù)采集分析。上述檢測方法采用的檢測儀，該檢測儀包括分別與中央控制電路相連的反應(yīng)管震蕩裝置、溫度調(diào)節(jié)裝置、時(shí)間調(diào)節(jié)裝置和熒光顯色觀測裝置；還可以包括與中央控制電路相連的反應(yīng)管升降裝置；還可以包括溫控反應(yīng)管，該溫控反應(yīng)管含有至少一個(gè)在適當(dāng)溫度下熔化的密封層。密封層可以根據(jù)需要控制的反應(yīng)進(jìn)程的特點(diǎn)預(yù)先封入該反應(yīng)進(jìn)程所需的部分或全部試劑。所述的檢測儀，其中反應(yīng)管震蕩裝置包括反應(yīng)管支架、支架震蕩電機(jī)、支架震蕩電機(jī)與反應(yīng)管支架相連；反應(yīng)管升降裝置包括反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)、反應(yīng)管支架升降桿，反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)與反應(yīng)管支架升降桿相連，反應(yīng)管支架升降桿與反應(yīng)管支架相連。所述的檢測儀，其中溫度調(diào)節(jié)裝置包括溫度控制模塊、加熱裝置、測溫裝置；加熱裝置和測溫裝置分別與溫度控制模塊相連，溫度控制模塊與中央控制電路相連或直接構(gòu)成中央控制電路的一部分，測溫裝置的溫度傳感器位于反應(yīng)管下部附近或者位于加熱裝置附近；溫度調(diào)節(jié)裝置還可以包括與溫度控制模塊相連的散熱裝置。所述的檢測儀，其中熒光顯色觀測裝置包括熒光激發(fā)光源、熒光顯色觀察或采集裝置；熒光顯色觀察裝置為帶或不帶濾鏡的觀察窗；熒光顯色采集裝置為圖像采集裝置或光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)采集分析裝置；熒光激發(fā)光源發(fā)光照射反應(yīng)管中的反應(yīng)液，熒光顯色觀察或采集裝置可觀察或采集反應(yīng)管中反應(yīng)液發(fā)出的熒光信號(hào)。所述的檢測儀，其中中央控制電路還包括控制信息輸入或程控反應(yīng)類型選擇裝置。為節(jié)約儀器成本，熒光顯色觀測裝置優(yōu)選采用觀察窗方式，溫度、時(shí)間、震動(dòng)等信息調(diào)節(jié)優(yōu)選采用在中央控制電路預(yù)先設(shè)定程控反應(yīng)類型的方式。激發(fā)光源波長及濾鏡過濾波長根據(jù)該熒光染料激發(fā)光波長及發(fā)射熒光波長確定。本發(fā)明涉及SYBRGreenI熒光染料，其主要特征是在497nm被激發(fā)，發(fā)射熒光波長為520nm。本發(fā)明采用的溫控反應(yīng)管至少含有一個(gè)密封層，將需要控制的反應(yīng)進(jìn)程所需的反應(yīng)試劑封于密封層中，通過控制溫度的變化實(shí)現(xiàn)密封材料的熔化，釋放被密封的反應(yīng)試劑，從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)進(jìn)程的控制。當(dāng)密封層為多層時(shí)，根據(jù)不同反應(yīng)進(jìn)程的先后順序?qū)⒚芊鈱釉O(shè)置于該密封層熔化(實(shí)際上是構(gòu)成該密封層的密封材料熔化，為表述方便而采用“密封層熔化”的描述，下同)后該密封層中的反應(yīng)試劑能與前一反應(yīng)進(jìn)程反應(yīng)體系(通常是反應(yīng)液)相接觸的位置，各密封層的熔化溫度小于等于對(duì)應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度且高于在先反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度并低于與在后反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的熔化溫度(最先的反應(yīng)進(jìn)程若采用密封層時(shí)因不存在在先反應(yīng)進(jìn)程而不考慮該密封層的熔化溫度是否高于在先反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度，同理，最后熔化的密封層由于不存在在后反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層而不考慮低于該密封層的熔化溫度是否低于在后反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的熔化溫度)。各密封層熔化順序的設(shè)置按照反應(yīng)溫度從低至高的順序。所述的反應(yīng)管，根據(jù)需要采用密封層控制的不同反應(yīng)進(jìn)程的先后順序依次設(shè)置密封層，最外層的密封層(即最接近反應(yīng)管管口的密封層)對(duì)應(yīng)在先進(jìn)行的反應(yīng)進(jìn)程。所述的反應(yīng)管，該反應(yīng)管溫度調(diào)節(jié)按照所需控制的反應(yīng)進(jìn)程分段調(diào)節(jié)，高于等于相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度且低于在后反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的熔化溫度。優(yōu)選將反應(yīng)管溫度調(diào)節(jié)至相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程所需的反應(yīng)溫度，與相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層因熔點(diǎn)小于等于該反應(yīng)溫度而熔化，將預(yù)先封于該密封層內(nèi)的試劑釋放，使相應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程能夠進(jìn)行。所述的反應(yīng)管，其中反應(yīng)管溫度調(diào)節(jié)應(yīng)按照反應(yīng)進(jìn)程的先后順序從低溫向高溫調(diào)節(jié)。所述的反應(yīng)管，其中不同的密封層采用不同熔點(diǎn)的物質(zhì)作為密封材料。不同熔點(diǎn)的物質(zhì)為不同熔點(diǎn)的石蠟或不同熔點(diǎn)的的低熔點(diǎn)聚四氟乙烯。所述的反應(yīng)管，根據(jù)所需反應(yīng)階段的數(shù)目設(shè)計(jì)密封層的數(shù)量；不同溫度的反應(yīng)進(jìn)程其相應(yīng)密封層的熔點(diǎn)不同。所述的反應(yīng)管，其中密封層中的反應(yīng)試劑混合在密封材料中或由密封材料隔開。制備溫控反應(yīng)管時(shí)首先在管內(nèi)加入相應(yīng)反應(yīng)階段所需試劑，然后在所需試劑表面加入選擇適當(dāng)?shù)氖?以石蠟為例，亦可采用其他密封層材料)，加熱至石蠟融化，冷卻至室溫后實(shí)際即被石蠟密封。根據(jù)整個(gè)反應(yīng)中需要采用密封層控制的不同進(jìn)程的數(shù)量和反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)反應(yīng)管中密封層的數(shù)量和次序(或位置)，根據(jù)不同反應(yīng)進(jìn)程的溫度選擇熔點(diǎn)合適的石蠟作為密封層材料。由于本發(fā)明主要涉及等溫?cái)U(kuò)增的LAMP技術(shù)和熒光檢測反應(yīng)，因此，實(shí)際使用的溫控反應(yīng)管只需要設(shè)置一或二個(gè)密封層即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的快速檢測儀器能夠?qū)⒑怂岷銣財(cái)U(kuò)增技術(shù)和熒光技術(shù)結(jié)合起來，在反應(yīng)結(jié)束后利用熒光檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。本儀器的最大優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)試劑配制完成后，放入儀器進(jìn)行反應(yīng)，核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)進(jìn)行熒光檢測，不需要將反應(yīng)管取出，亦不需打開反應(yīng)管，可以在減少操作步驟的同時(shí)最大可能的避免反應(yīng)產(chǎn)物的滯后污染。本發(fā)明既降低了反應(yīng)儀器的成本，又能實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)和檢測反應(yīng)偶聯(lián)進(jìn)行，克服了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的滯后污染，同時(shí)具有結(jié)構(gòu)簡單，便于攜帶，成本較低，操作方便，反應(yīng)快速的特點(diǎn)，適合作為臨床或野外現(xiàn)場快速檢測儀器。本發(fā)明同時(shí)還提供的能夠通過溫度改變控制反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)管，通過改變溫度，釋放預(yù)先保存于反應(yīng)管內(nèi)的試劑，從而實(shí)現(xiàn)控制反應(yīng)起始、終止和檢測等進(jìn)程。這種技術(shù)有效避免了反應(yīng)開始前頻繁打開反應(yīng)管可能造成的模板污染以及反應(yīng)結(jié)束后打開反應(yīng)管造成的滯后污染，在一定程度上還可以控制反應(yīng)起始時(shí)間，提高反應(yīng)的特異性。這種反應(yīng)管可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究以及生物分析、病原微生物檢測、疾病診斷的領(lǐng)域。圖1檢測儀結(jié)構(gòu)圖。其中1、電源及中央控制電路；2、時(shí)間調(diào)節(jié)裝置(定時(shí)模塊)；3、溫度控制模塊；4、加熱裝置；5、支架震蕩裝置；6、反應(yīng)管支架；7、觀測窗口；8、樣品放入口；9、溫控反應(yīng)管；10、激發(fā)光源；17、反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)；18、反應(yīng)管支架升降桿；19、散熱裝置，20、測溫裝置。圖2檢測儀模塊示意圖。其中1、電源及控制電路；2、定時(shí)模塊；3、溫度控制模塊；4、加熱裝置；5、支架震蕩裝置；6、反應(yīng)管支架；10、激發(fā)光源；19、散熱裝置，20、測溫裝置。圖3檢測儀外觀示意圖。其中7、觀測窗口；8、樣品放入口。圖4激發(fā)光源示意圖。其中9、溫控反應(yīng)管；10、激發(fā)光源。圖5升降與振蕩裝置示意圖。其中4、加熱裝置；5、震蕩電機(jī)；6、反應(yīng)管支架；9、溫控反應(yīng)管；10、激發(fā)光源；17、反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)；18、反應(yīng)管支架升降桿。圖6溫控反應(yīng)管示意圖。其中11、密封材料一；12、密封材料二；13、試劑一；14、試劑二；15、管身；16、管蓋。密封材料一與試劑一構(gòu)成密封層一，密封材料二與試劑二構(gòu)成密封層二。圖7本發(fā)明溫控反應(yīng)管不同溫度密封層示意圖。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1檢測儀構(gòu)造及工作過程1、構(gòu)造結(jié)合圖15，該檢測儀包括分別與中央控制電路1相連的反應(yīng)管震蕩裝置、溫度調(diào)節(jié)裝置、時(shí)間調(diào)節(jié)裝置2(定時(shí)模塊2)和熒光顯色觀測裝置；還可以包括與中央控制電路1相連的反應(yīng)管升降裝置；(還可以包括溫控反應(yīng)管9，溫控反應(yīng)管詳情參見實(shí)施例2)。其中反應(yīng)管震蕩裝置包括反應(yīng)管支架6、支架震蕩電機(jī)(如凸輪電機(jī))5，支架震蕩電機(jī)與反應(yīng)管支架相連；反應(yīng)管升降裝置包括反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)17、反應(yīng)管支架升降桿18，反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)與反應(yīng)管支架升降桿相連，反應(yīng)管支架升降桿與反應(yīng)管支架相連。反應(yīng)管震蕩裝置可在反應(yīng)進(jìn)程中震動(dòng)反應(yīng)管，混勻反應(yīng)體系和促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)程的完成；反應(yīng)管支架升降裝置可方便取放反應(yīng)管，或者可將反應(yīng)管接近(置于)或遠(yuǎn)離加熱裝置。溫度調(diào)節(jié)裝置包括溫度控制模塊3、加熱裝置4、測溫裝置20；加熱裝置和測溫裝置分別與溫度控制模塊相連，溫度控制模塊與中央控制電路相連或直接構(gòu)成中央控制電路的一部分，測溫裝置的溫度傳感器位于反應(yīng)管下部附近或者位于加熱裝置附近(當(dāng)反應(yīng)管接近或置于加熱裝置上，加熱裝置的溫度與反應(yīng)管裝有反應(yīng)液的部分的溫度基本一致時(shí))；加熱裝置可位于反應(yīng)管支架下方，或者安置在儀器內(nèi)其他部位采用送風(fēng)等方法將加熱后的熱空氣送至反應(yīng)管所在區(qū)域(當(dāng)反應(yīng)管裝液量較多時(shí)，可避免對(duì)反應(yīng)管底部直接加熱造成局部溫度過高，使反應(yīng)液溫度保持均勻)；溫度調(diào)節(jié)裝置還可以包括與溫度控制模塊相連的散熱裝置19。熒光顯色觀測裝置包括熒光激發(fā)光源10、熒光顯色觀察或采集裝置；熒光顯色觀察裝置為帶或不帶濾鏡的觀察窗7；熒光顯色采集裝置為圖像采集裝置或光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)采集分析裝置；熒光激發(fā)光源10發(fā)光照射反應(yīng)管9中的反應(yīng)液，熒光顯色觀察或采集裝置可觀察或采集反應(yīng)管中反應(yīng)液發(fā)出的熒光信號(hào)。為節(jié)約儀器成本，優(yōu)選采用觀察窗方式。中央控制電路還可以包括控制信息輸入裝置。時(shí)間設(shè)置及溫度設(shè)置的裝置也可以整合到控制信息輸入裝置中，其他如反應(yīng)過程中是否需要震動(dòng)反應(yīng)管，反應(yīng)管震動(dòng)時(shí)間和頻率，反應(yīng)管支架是否需要升降等信息的輸入可以從控制信息輸入裝置中輸入中央控制電路，或者直接事先寫入中央控制電路的程序中?？刂品磻?yīng)進(jìn)程的時(shí)間調(diào)節(jié)、溫度調(diào)節(jié)、震動(dòng)調(diào)節(jié)等信息均可事先寫入中央控制電路的程序中，相應(yīng)程控反應(yīng)的類型可在控制信息輸入裝置上選擇。中央控制電路接受控制信息和反饋信息后，調(diào)節(jié)相應(yīng)裝置(加熱裝置、散熱裝置、反應(yīng)管支架升降或震動(dòng)裝置、激發(fā)光源等)的工作。2、工作過程1)、(接通電源)通過樣品放入口8將裝有反應(yīng)體系的溫控反應(yīng)管9放入儀器內(nèi)，置于反應(yīng)管支架6上(若設(shè)有反應(yīng)管支架升降裝置可方便取放反應(yīng)管)。2)、通過定時(shí)模塊2設(shè)定相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)時(shí)間，通過溫度控制模塊3設(shè)定相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度，相關(guān)控制信息經(jīng)中央控制電路1調(diào)控(或者選擇預(yù)先寫入中央控制電路的程序反應(yīng)類型)。完成設(shè)置后加熱裝置4開始工作，加熱至設(shè)定溫度，經(jīng)測溫裝置20的溫度傳感器反饋，停止加熱(若溫度過高可啟動(dòng)散熱裝置19)，核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始進(jìn)行(根據(jù)反應(yīng)需要確定是否震蕩反應(yīng)管)。3)、核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通過設(shè)定溫度控制模塊3將溫度設(shè)定至密封層融化所需溫度(或由中央控制電路預(yù)先設(shè)定的程控反應(yīng)類型調(diào)節(jié))，加熱裝置工作，升高至設(shè)定溫度，使反應(yīng)管中封有熒光染料的密封層融化。通過震蕩裝置5將熒光染料與反應(yīng)產(chǎn)物混合均勻。4)、啟動(dòng)激發(fā)光源10照射反應(yīng)管，通過觀測窗口7觀測熒光產(chǎn)生情況或者采用照相或光電傳感器等對(duì)反應(yīng)管中熒光信息進(jìn)行采集分析。實(shí)施例2溫控反應(yīng)管石蠟供應(yīng)廠商南陽石蠟精細(xì)化工廠。石蠟規(guī)格及特性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)合圖7，根據(jù)不同反應(yīng)進(jìn)程的先后順序?qū)⒚芊鈱釉O(shè)置于該密封層熔化后該密封層中的反應(yīng)試劑能與前一反應(yīng)進(jìn)程反應(yīng)體系(通常為反應(yīng)液，對(duì)于首次反應(yīng)，由于不存在前一反應(yīng)進(jìn)程，故反應(yīng)體系通常為待檢物以及首次反應(yīng)所需的不包含被密封的反應(yīng)試劑的其他反應(yīng)試劑)相接觸的位置，各密封層的熔化溫度小于等于對(duì)應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度且高于在先反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度(對(duì)應(yīng)首次反應(yīng)的密封層不考慮此條件，如本例中30°C密封層)并低于與在后反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的熔化溫度(對(duì)應(yīng)最后熔化的密封層不考慮此條件，如本例中80°C密封層)。各密封層中的反應(yīng)試劑分別混合在構(gòu)成各反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的密封材料中或由該密封材料隔開。進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)管溫度調(diào)節(jié)按照所需控制的反應(yīng)進(jìn)程分段調(diào)節(jié)，高于等于相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度且低于在后反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的熔化溫度(為避免反應(yīng)管溫度高于相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度時(shí)會(huì)對(duì)某些反應(yīng)進(jìn)程造成不利影響，本例中各階段反應(yīng)管溫度調(diào)節(jié)至相應(yīng)反應(yīng)進(jìn)程所需的反應(yīng)溫度即可)。假設(shè)圖7中各反應(yīng)進(jìn)程的反應(yīng)溫度依次為300C、40°C、50°C、60°C、70°C,80構(gòu)成各反應(yīng)進(jìn)程對(duì)應(yīng)的密封層的密封材料(如石蠟)的熔化溫度分別為2830°C、3840°C、4850°C、58606870°C、7880°C，起始反應(yīng)溫度為30°C。加入待檢物，反應(yīng)管溫度升至30°C時(shí)，30°C密封層熔化，釋放第一階段所需的反應(yīng)試劑，第一階段反應(yīng)進(jìn)行，熔化的石蠟浮于反應(yīng)液上部；反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，再將反應(yīng)管溫度升至40°C，4(TC密封層熔化，釋放第二階段所需的反應(yīng)試劑，第二階段反應(yīng)進(jìn)行，熔化的石蠟浮于反應(yīng)液上部；反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，再將反應(yīng)管溫度升至50°C，50°C密封層熔化，釋放第三段階段所需的反應(yīng)試劑，第三階段反應(yīng)進(jìn)行，熔化的石蠟浮于反應(yīng)液上部；以此類推，在60°C進(jìn)行第四階段反應(yīng)，在80°C進(jìn)行第五階段反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，降低溫度(或冷卻)，浮于反應(yīng)液上部的全部或部分石蠟?zāi)虒⒎磻?yīng)液密封，避免滯后污染。實(shí)施例3本實(shí)施例針對(duì)豬流感Hmi的HA基因設(shè)計(jì)了六條引物，LAMP擴(kuò)增體系如下表LHmiLAMP引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Y:t/u或c;R:g或a。25μLLAMP反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>LAMP反應(yīng)程序63°C/1.5h—80°C/5min溫控反應(yīng)管設(shè)有一個(gè)事先采用石蠟(如90#)密封有熒光染料(如SYBRGreenI)的密封層，反應(yīng)管中加入核酸擴(kuò)增體系以及待測樣品后，將反應(yīng)管放入本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測儀中，按LAMP反應(yīng)程序?qū)⒎磻?yīng)體系加熱至反應(yīng)所需溫度反應(yīng)相應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，不需要開管，升高溫度使密封層熔化，釋放熒光染料，震蕩，使核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料充分混合，作用適當(dāng)時(shí)間，激發(fā)光源照射反應(yīng)管，從觀察窗即可觀測反應(yīng)管熒光產(chǎn)生情況，用于分析待測樣本是否含有病原微生物，如產(chǎn)生熒光則待測樣品含有檢測病原微生物。該方法可直接在儀器中進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測，無需將反應(yīng)管取出。實(shí)施例4采用溫控反應(yīng)管實(shí)現(xiàn)反應(yīng)終止本方案通過溫度控制密封層內(nèi)反應(yīng)終止劑的釋放，實(shí)現(xiàn)溫度控制反應(yīng)終止，主要針對(duì)RCA、LAMP等恒溫反應(yīng)的終止。本方案可以使用簡單的恒溫裝置，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)的控制，適合在病原微生物、疾病診斷等快速檢驗(yàn)條件下使用。在反應(yīng)管底加入反應(yīng)終止劑如乙二銨四乙酸鈉(EDTA)溶液或其他金屬絡(luò)合劑以及蛋白變性劑。在其上表面加入10μ1石蠟(_。將反應(yīng)管加熱到石蠟熔點(diǎn)使石蠟融化，將反應(yīng)管取出冷卻，使石蠟重新凝固形成密封層。在進(jìn)行RCA或LAMP反應(yīng)時(shí)，在石蠟密封層上加入反應(yīng)體系。恒溫反應(yīng)(60°C)結(jié)束后，將反應(yīng)管加熱至石蠟熔點(diǎn)，由于石蠟密度小于水，故石蠟融化后會(huì)漂浮于液體表面上層，反應(yīng)體系則會(huì)與石蠟密封層下的反應(yīng)終止劑混合，使反應(yīng)終止。將反應(yīng)管取出冷卻后，石蠟會(huì)再次凝固，使液體表面與空氣隔絕，避免了反應(yīng)產(chǎn)物可能造成的滯后污染。實(shí)施例5采用溫控反應(yīng)管實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物檢測本方案通過溫度控制密封層內(nèi)產(chǎn)物指示劑的釋放，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物指示在同一管內(nèi)進(jìn)行。本方案主要針對(duì)RCA、LAMP等等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)病原微生物現(xiàn)場快速、簡便、可視化檢測。在反應(yīng)管底部加入產(chǎn)物指示劑如SYBGreen,GoldView等。在其上表面加入10μ1石蠟(64#)。將反應(yīng)管加熱至石蠟熔點(diǎn)，使石蠟融化。取出反應(yīng)管冷卻至室溫，使石蠟重新凝固形成密封層。在進(jìn)行RCA或LAMP反應(yīng)時(shí)，在石蠟密封層上加入反應(yīng)體系。恒溫反應(yīng)(60°C)結(jié)束后，將反應(yīng)管加熱至石蠟熔點(diǎn)，由于石蠟密度小于水，故石蠟融化后會(huì)漂浮于液體表面上層，反應(yīng)體系則會(huì)與產(chǎn)物指示劑混合，產(chǎn)生肉眼可觀測到的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化檢測。本方案設(shè)計(jì)的檢測方法一方面避免了在反應(yīng)體系內(nèi)加入產(chǎn)物指示劑造成的對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的抑制，另一方面實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)和監(jiān)測，不需要打開反應(yīng)管，避免了產(chǎn)物的滯后污染。實(shí)施例6采用溫控反應(yīng)管實(shí)現(xiàn)普通耐熱聚合酶熱啟動(dòng)及顯色反應(yīng)結(jié)合圖6，本方案通過溫度控制密封層二內(nèi)反應(yīng)體系中關(guān)鍵成分的釋放，實(shí)現(xiàn)在低溫下非特異擴(kuò)增反應(yīng)被抑制，同時(shí)通過更高的溫度控制密封層一內(nèi)的顯色試劑釋放，即在單管內(nèi)實(shí)現(xiàn)普通耐熱聚合酶的熱啟動(dòng)及顯色反應(yīng)。本方案主要針對(duì)PCR反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)使用價(jià)格低廉的普通耐熱聚合酶進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR并且對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行顯色檢測。在反應(yīng)管15的底部加入產(chǎn)物指示劑如SYBGreen,GoldView等(即試劑一)。在其上表面加入10μ1石蠟一(95#)(即密封材料一)。將反應(yīng)管加熱至石蠟一熔點(diǎn)，使石蠟一融化。取出反應(yīng)管冷卻至室溫，使石蠟一重新凝固形成密封層一。在密封層一表面加入PCR反應(yīng)的關(guān)鍵成分，如耐熱聚合酶、鎂離子、dNTP等的一種或幾種(即試劑二)。在其上表面加入10μ1石蠟二(85#)(即密封材料二)，其溫度低于PCR變性溫度且低于密封層一的石蠟一的熔點(diǎn)。將反應(yīng)管加熱至石蠟二的熔點(diǎn)，使石蠟二融化。取出反應(yīng)管冷卻至室溫，使石蠟二重新凝固形成密封層二。在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，在石蠟密封層二上加入除密封層內(nèi)關(guān)鍵成分外反應(yīng)體系，蓋上管蓋16。在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，首先加熱到石蠟二的熔點(diǎn)之上并恒溫5分鐘，使石蠟二充分融化。由于石蠟密度小于水，故石蠟二融化后會(huì)漂浮于液體表面上層，反應(yīng)體系將會(huì)與石蠟二之下的反應(yīng)關(guān)鍵成分(即試劑二)混合，反應(yīng)管溫度符合擴(kuò)增反應(yīng)所需溫度，從而啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管加熱至石蠟一的熔點(diǎn)，由于石蠟密度小于水，故石蠟一融化后會(huì)漂浮于液體表面上層，反應(yīng)體系則會(huì)與產(chǎn)物指示劑(即試劑一)混合，反應(yīng)管溫度符合產(chǎn)物指示劑所需溫度，產(chǎn)生肉眼可觀測到的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化檢測。本方案設(shè)計(jì)能夠利用普通耐熱聚合酶進(jìn)行熱啟動(dòng)反應(yīng)，抑制了非特異擴(kuò)增反應(yīng)，提高了PCR反應(yīng)的特異性的同時(shí)能夠進(jìn)行在同一管內(nèi)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顯色反應(yīng)。(二個(gè)密封層的反應(yīng)管也可以針對(duì)RCA、LAMP等等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需試劑全部或部分封于在密封層二(較低溫度熔化)中，熒光染料封于密封層一(較高溫度熔化)中，通過控制溫度的變化實(shí)現(xiàn)二個(gè)密封層依次溶解，控制反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)及熒光可視化檢測。)序列表<110>華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所<120>一種核酸快速檢測方法及其裝置<160>6<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>HmiLAMP引物F3<400>1ggtgctataaacaccagcc19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>HmiLAMP引物B3<400>2tgatggtgataaccgtacc19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>HmiLAMP引物L(fēng)F<400>3ggacattytccaattgtg18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>HmiLAMP引物L(fēng)B<400>4ttgccggtttcattgaagg19<210>5<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>HmiLAMP引物FIP<400>5ctgtrgccagtctcaattttgtgttttctgaagtyccatttcagaatatacatccr56<210>6<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>H1N1LAMP引物BIP<400>6atcccgtctattcaatctagaggcttttctgaagatccatctaccatccctgtc5權(quán)利要求一種核酸快速檢測方法，其特征是在含有至少一個(gè)密封層的溫控反應(yīng)管內(nèi)利用LAMP技術(shù)對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不需要開管，升高反應(yīng)管溫度，使封有熒光染料的密封層溶解，釋放熒光染料進(jìn)行熒光檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于溫控反應(yīng)管含有二個(gè)密封層，核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需試劑全部或部分封于在較低溫度熔化的密封層中，熒光染料封于在較高溫度熔化的密封層中，通過控制溫度的變化實(shí)現(xiàn)二個(gè)密封層依次溶解，控制反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)及熒光可視化檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于熒光染料為SYBRGreenl染料。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測直接在儀器內(nèi)進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于熒光檢測是熒光染料在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光后采用肉眼觀察或者采用照相或光電傳感器進(jìn)行圖像或數(shù)據(jù)采集分析。6.權(quán)利要求1所述檢測方法采用的檢測儀，其特征在于該檢測儀包括分別與中央控制電路相連的反應(yīng)管震蕩裝置、溫度調(diào)節(jié)裝置、時(shí)間調(diào)節(jié)裝置和熒光顯色觀測裝置；還可以包括與中央控制電路相連的反應(yīng)管升降裝置；還可以包括溫控反應(yīng)管，該溫控反應(yīng)管含有至少一個(gè)在適當(dāng)溫度下熔化的密封層。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測儀，其特征在于反應(yīng)管震蕩裝置包括反應(yīng)管支架、支架震蕩電機(jī)，支架震蕩電機(jī)與反應(yīng)管支架相連；反應(yīng)管升降裝置包括反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)、反應(yīng)管支架升降桿，反應(yīng)管支架升降驅(qū)動(dòng)電機(jī)與反應(yīng)管支架升降桿相連，反應(yīng)管支架升降桿與反應(yīng)管支架相連。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測儀，其特征在于溫度調(diào)節(jié)裝置包括溫度控制模塊、加熱裝置、測溫裝置；加熱裝置和測溫裝置分別與溫度控制模塊相連，溫度控制模塊與中央控制電路相連或直接構(gòu)成中央控制電路的一部分，測溫裝置的溫度傳感器位于反應(yīng)管下部附近或者位于加熱裝置附近；溫度調(diào)節(jié)裝置還可以包括與溫度控制模塊相連的散熱裝置。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測儀，其特征在于熒光顯色觀測裝置包括熒光激發(fā)光源、熒光顯色觀察或采集裝置；熒光顯色觀察裝置為帶或不帶濾鏡的觀察窗；熒光顯色采集裝置為圖像采集裝置或光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)采集分析裝置；熒光激發(fā)光源發(fā)光照射反應(yīng)管中的反應(yīng)液，熒光顯色觀察或采集裝置可觀察或采集反應(yīng)管中反應(yīng)液發(fā)出的熒光信號(hào)。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測儀，其特征在于中央控制電路還包括控制信息輸入或程控反應(yīng)類型選擇裝置。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，公開了一種核酸快速檢測方法及其裝置。該方法是在含有至少一個(gè)密封層的溫控反應(yīng)管內(nèi)利用LAMP技術(shù)對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不需要開管，升高反應(yīng)管溫度，使封有熒光染料的密封層溶解，釋放熒光染料進(jìn)行熒光檢測。該方法可直接在儀器中進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測，無需將反應(yīng)管取出。該裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本較低，操作簡便，可作為病原微生物核酸現(xiàn)場快速檢測儀器。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101824486SQ20091026417公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2009年12月30日優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日發(fā)明者周國華,李傳軍,梁超申請(qǐng)人:華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所