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一種通過溫度控制反應進程的反應管的制作方法

文檔序號:576898閱讀:206來源:國知局
專利名稱:一種通過溫度控制反應進程的反應管的制作方法
技術領域
本發(fā)明屬于基因工程領域,涉及一種通過溫度控制反應進程的反應管。
背景技術
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點;能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷;可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。
滾環(huán)擴增技術(Rolling Circle Amplification,RCA)是一種等溫信號擴增方法,DNA可在很短時間內實現(xiàn)指數(shù)擴增,因此,可用于痕量分子的檢測。目前,該技術既可以擴增環(huán)狀DNA、RNA,也可以擴增線性DNA,甚至全基因組DNA,主要用于全基因組擴增、核酸測序、單核苷酸多態(tài)性以及DNA芯片、蛋白質芯片分析等廣泛領域。 環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal Amplification,LAMP)技術是近年來發(fā)展出的一種可替代PCR的敏感、特異、方便快捷的核酸擴增技術。其反應在不到l個小
時的時間里進行核酸的擴增,其效率可達到iog-i(^個拷貝數(shù)量級。該方法具有簡單、快速、
準確、廉價、易檢測等特點。 隨著生物技術的發(fā)展,聚合酶鏈式反應(PCR)、滾環(huán)擴增反應(RCA)和環(huán)介導等溫核酸擴增(LAMP)等核酸擴增技術在生物分析、病原微生物檢測和疾病診斷等臨床和基礎研究中均有廣泛應用,但作為核酸擴增技術,其最大的不足之處就是容易產(chǎn)生產(chǎn)物的滯后污染,尤其是在對擴展產(chǎn)物進行檢測需要開管時,極易造成產(chǎn)物的污染。而這些核酸擴增技術的反應進程包括反應起始、終止和檢測等均需要通過打開反應管加入或取出試劑才能進行,尤其是某些反應進程中若提前加入在后反應進程所需的試劑則會造成干擾甚至影響反應的繼續(xù)進行,這些不足使得相應技術對操作人員和實驗環(huán)境有很高的要求,限制了其應用范圍,尤其是現(xiàn)場快速檢測。 作為核酸擴增技術,由于聚合酶在低溫仍有活性,引物錯誤退火可能導致非特異性的擴展。目前克服這種非特異擴增主要通過熱啟動聚合酶,其成本較普通聚合酶高很多,增加了實驗成本,不利技術的推廣。 目前沒有一種無需在反應過程中添加反應試劑、減少操作污染、只需調節(jié)溫度就能控制反應進程的溫控反應管。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用溫度控制反應進程的反應管。
本發(fā)明的目的是通過下列技術方案實現(xiàn)的 —種通過溫度控制反應進程的反應管,該反應管是在管內設計密封層,將需要控制的反應進程所需的反應試劑封于密封層中,通過控制溫度的變化實現(xiàn)密封材料的熔化,釋放被密封的反應試劑,從而實現(xiàn)反應進程的控制。 所述的反應管,當密封層為多層時,根據(jù)不同反應進程的先后順序將密封層設置于該密封層熔化(實際上是構成該密封層的密封材料熔化,為表述方便而采用"密封層熔化"的描述,下同)后該密封層中的反應試劑能與前一反應進程反應體系(通常是反應液)相接觸的位置,各密封層的熔化溫度小于等于對應的反應進程的反應溫度且高于在先反應進程的反應溫度并低于與在后反應進程對應的密封層的熔化溫度(最先的反應進程若采用密封層時因不存在在先反應進程而不考慮該密封層的熔化溫度是否高于在先反應進程的反應溫度,同理,最后熔化的密封層由于不存在在后反應進程對應的密封層而不考慮低于該密封層的熔化溫度是否低于在后反應進程對應的密封層的熔化溫度)。各密封層熔化順序的設置按照反應溫度從低至高的順序。 所述的反應管,根據(jù)需要采用密封層控制的不同反應進程的先后順序依次設置密封層,最外層的密封層(即最接近反應管管口的密封層)對應在先進行的反應進程。
所述的反應管,該反應管溫度調節(jié)按照所需控制的反應進程分段調節(jié),高于等于相應反應進程的反應溫度且低于在后反應進程對應的密封層的熔化溫度。優(yōu)選將反應管溫度調節(jié)至相應反應進程所需的反應溫度,與相應反應進程對應的密封層因熔點小于等于該反應溫度而熔化,將預先封于該密封層內的試劑釋放,使相應的反應進程能夠進行。
所述的反應管,其中反應管溫度調節(jié)應按照反應進程的先后順序從低溫向高溫調節(jié)。 所述的反應管,其中不同的密封層采用不同熔點的物質作為密封材料。 所述的反應管,其中不同熔點的物質為不同熔點的石蠟或不同熔點的的低熔點聚
四氟乙烯。 所述的反應管,根據(jù)所需反應階段的數(shù)目設計密封層的數(shù)量;不同溫度的反應進程其相應密封層的熔點不同。 所述的反應管,其中密封層中的反應試劑混合在密封材料中或由密封材料隔開。
制備溫控反應管時首先在管內加入相應反應階段所需試劑,然后在所需試劑表面加入選擇適當?shù)氖?以石蠟為例,亦可采用其他密封層材料),加熱至石蠟融化,冷卻至室溫后實際即被石蠟密封。根據(jù)整個反應中需要采用密封層控制的不同進程的數(shù)量和反應溫度設計反應管中密封層的數(shù)量和次序(或位置),根據(jù)不同反應進程的溫度選擇熔點合適的石蠟作為密封層材料。 本發(fā)明所述溫控反應管不限于應用于基因工程領域。
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明提供的能夠通過溫度改變控制反應進程的反應管,通過改變溫度,釋放預先保存于反應管內的試劑,從而實現(xiàn)控制反應起始、終止和檢測等進程。這種反應管有效避免了反應過程中頻繁打開反應管添加試劑造成的污染及反應結束后的滯后污染,減少反復添加試劑對反應過程的干擾,易于自動化控制,在一定程度上還可以控制各反應進程的起始時間,提高反應的特異性。這種反應管可以廣泛應用于生物醫(yī)學領域的基礎研究以及生物分析、病原微生物檢測、疾病診斷的領域。另外,本發(fā)明溫控反應管根據(jù)反應進程將所需反應試劑事先封好,便于攜帶和運輸,無需要臨時配制,節(jié)省操作時間。


圖l是本發(fā)明溫控反應管示意圖。其中1、密封材料一 ;2、密封材料二 ;3、試劑一 ;4、試劑二;5、管身;6、管蓋。密封材料一與試劑一構成密封層一,密封材料二與試劑二構成密封層二。 圖2本發(fā)明溫控反應管不同溫度密封層示意圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
石蠟供應廠商南陽石蠟精細化工廠。
石蠟規(guī)格及特性
石蠟型號 熔點rc) 52# 52-54
54弁 54-56
56#56-58
58#58-60
60#60-62
62#62-64
64#64-66
70#67-72
75#72-77
80#77-82
85#82-87
90#87-92
95#92-97 實施例1 結合圖2,根據(jù)不同反應進程的先后順序將密封層設置于該密封層熔化后該密封層中的反應試劑能與前一反應進程反應體系(通常為反應液,對于首次反應,由于不存在前一反應進程,故反應體系通常為待檢物以及首次反應所需的不包含被密封的反應試劑的其他反應試劑)相接觸的位置,各密封層的熔化溫度小于等于對應的反應進程的反應溫度且高于在先反應進程的反應溫度(對應首次反應的密封層不考慮此條件,如本例中3(TC密封層)并低于與在后反應進程對應的密封層的熔化溫度(對應最后熔化的密封層不考慮此
5條件,如本例中8(TC密封層)。各密封層中的反應試劑分別混合在構成各反應進程對應的密封層的密封材料中或由該密封材料隔開。進行反應時,反應管溫度調節(jié)按照所需控制的反應進程分段調節(jié),高于等于相應反應進程的反應溫度且低于在后反應進程對應的密封層的熔化溫度(為避免反應管溫度高于相應反應進程的反應溫度時會對某些反應進程造成不利影響,本例中各階段反應管溫度調節(jié)至相應反應進程所需的反應溫度即可)。假設圖2中各反應進程的反應溫度依次為30°C 、40°C 、50°C 、60°C 、70°C 、80°C ,構成各反應進程對應的密封層的密封材料(如石蠟)的熔化溫度分別為28 30°C 、38 40°C 、48 50°C 、58 60°C、68 70°C、78 8(TC,起始反應溫度為30°C 。加入待檢物,反應管溫度升至3(TC時,3(TC密封層熔化,釋放第一階段所需的反應試劑,第一階段反應進行,熔化的石蠟浮于反應液上部;反應適當時間后,再將反應管溫度升至4(TC,4(TC密封層熔化,釋放第二階段所需的反應試劑,第二階段反應進行,熔化的石蠟浮于反應液上部;反應適當時間后,再將反應管溫度升至5(TC, 5(TC密封層熔化,釋放第三段階段所需的反應試劑,第三階段反應進行,熔化的石蠟浮于反應液上部;以此類推,在6(TC進行第四階段反應,在8(TC進行第五階段反應。反應結束后,降低溫度(或冷卻),浮于反應液上部的全部或部分石蠟凝固將反應液密封,避免滯后污染。 實施例2 :溫度控制實現(xiàn)反應終止 本方案通過溫度控制密封層內反應終止劑的釋放,實現(xiàn)溫度控制反應終止,主要針對RCA以及LAMP等恒溫反應的終止。本方案可以使用簡單的恒溫裝置,實現(xiàn)對反應的控制,適合在病原微生物、疾病診斷等快速檢驗條件下使用。 在反應管底加入反應終止劑如乙二銨四乙酸鈉(EDTA)溶液或其他金屬絡合劑以及蛋白變性劑。在其上表面加入10 iU石蠟(80#)。將反應管加熱到石蠟熔點使石蠟融化,將反應管取出冷卻,使石蠟重新凝固形成密封層。 在進行RCA或LAMP反應時,在石蠟密封層上加入反應體系。恒溫反應(60°C )結束后,將反應管加熱至石蠟熔點,由于石蠟密度小于水,故石蠟融化后會漂浮于液體表面上層,反應體系則會與石蠟密封層下的反應終止劑混合,在反應終止劑所需要反應溫度滿足時,使RCA或LAMP反應終止。 將反應管取出冷卻后,石蠟會再次凝固,使液體表面與空氣隔絕,避免了反應產(chǎn)物可能造成的滯后污染。 實施例3 :溫度控制實現(xiàn)產(chǎn)物檢測 本方案通過溫度控制密封層內產(chǎn)物指示劑的釋放,實現(xiàn)擴增反應和產(chǎn)物指示在同一管內進行。本方案主要針對RCA和LAMP等等溫擴增反應,可以實現(xiàn)病原微生物現(xiàn)場快速、簡便、可視化檢測。 在反應管底部加入產(chǎn)物指示劑如SYB Green,Gold View等。在其上表面加入10 iU石蠟(64#)。將反應管加熱至石蠟熔點,使石蠟融化。取出反應管冷卻至室溫,使石蠟重新凝固形成密封層。 在進行RCA和LAMP等等溫擴增反應時,在石蠟密封層上加入反應體系。恒溫反應(60°C )結束后,將反應管加熱至石蠟熔點,由于石蠟密度小于水,故石蠟融化后會漂浮于液體表面上層,反應體系則會與產(chǎn)物指示劑混合,在產(chǎn)物指示劑所需要反應溫度滿足時,產(chǎn)生肉眼可觀測到的變化,實現(xiàn)對擴增產(chǎn)物的可視化檢測。
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本方案設計的檢測方法一方面避免了在反應體系內加入產(chǎn)物指示劑造成的對擴增反應的抑制,另一方面實現(xiàn)了在同一反應管內實現(xiàn)反應和監(jiān)測,不需要打開反應管,避免了產(chǎn)物的滯后污染。
實施例4 :溫度控制實現(xiàn)普通耐熱聚合酶的熱啟動反應 本方案通過溫度控制密封層內反應體系中關鍵成分的釋放,實現(xiàn)在低溫下非特異擴增反應被抑制,即實現(xiàn)普通耐熱聚合酶的熱啟動反應。本方案主要針對PCR反應,可以實現(xiàn)使用價格低廉的普通耐熱聚合酶進行熱啟動PCR。 在反應管底部加入PCR反應的關鍵成分,如耐熱聚合酶、鎂離子、dNTP等的一種或幾種。在其上表面加入10iU石蠟(85#)。將反應管加熱至石蠟熔點,使石蠟融化。取出反應管冷卻至室溫,使石蠟重新凝固形成密封層。 在進行PCR反應前,在石蠟密封層上加入除密封層內關鍵成分以外的反應體系。在進行反應時,首先加熱到石蠟熔點之上并恒溫5分鐘,使石蠟充分融化。由于石蠟密度小于水,故石蠟融化后會漂浮于液體表面上層,反應體系將會與石蠟密封層之下的反應關鍵成分混合,擴增反應所需的反應溫度亦滿足,從而啟動擴增反應。 本方案設計能夠利用普通耐熱聚合酶進行熱啟動反應,抑制了非特異擴增反應,提高了PCR反應的特異性,并且較熱啟動酶成本大大降低,有利于熱啟動技術的推廣。
實施例5 :溫度控制實現(xiàn)普通耐熱聚合酶熱啟動及顯色反應 結合圖l,本方案通過溫度控制密封層二內反應體系中關鍵成分的釋放,實現(xiàn)在低溫下非特異擴增反應被抑制,同時通過更高的溫度控制密封層一內的顯色試劑釋放,即在單管內實現(xiàn)普通耐熱聚合酶的熱啟動及顯色反應。本方案主要針對PCR反應,可以實現(xiàn)使用價格低廉的普通耐熱聚合酶進行熱啟動PCR并且對PCR產(chǎn)物進行顯色檢測。
在反應管5的底部加入產(chǎn)物指示劑如SYB Green,Gold View等(即試劑一 )。在其上表面加入10iU石蠟一 (95#)(即密封材料一 )。將反應管加熱至石蠟一熔點,使石蠟一融化。取出反應管冷卻至室溫,使石蠟一重新凝固形成密封層一。 在密封層一表面加入PCR反應的關鍵成分,如耐熱聚合酶、鎂離子、dNTP等的一種或幾種(即試劑二)。在其上表面加入10iU石蠟二 (85#)(即密封材料二),其溫度低于PCR變性溫度且低于密封層一的石蠟一的熔點。將反應管加熱至石蠟二的熔點,使石蠟二融化。取出反應管冷卻至室溫,使石蠟二重新凝固形成密封層二 。 在進行PCR反應前,在石蠟密封層二上加入除密封層內關鍵成分外反應體系,蓋上管蓋6。在進行反應時,首先加熱到石蠟二的熔點之上并恒溫5分鐘,使石蠟二充分融化。由于石蠟密度小于水,故石蠟二融化后會漂浮于液體表面上層,反應體系將會與石蠟二之下的反應關鍵成分(即試劑二)混合,反應管溫度符合擴增反應所需溫度,從而啟動擴增反應。 擴增反應結束后,將反應管加熱至石蠟一的熔點,由于石蠟密度小于水,故石蠟一融化后會漂浮于液體表面上層,反應體系則會與產(chǎn)物指示劑(即試劑一)混合,反應管溫度符合產(chǎn)物指示劑所需溫度,產(chǎn)生肉眼可觀測到的變化,實現(xiàn)對擴增產(chǎn)物的可視化檢測。
本方案設計能夠利用普通耐熱聚合酶進行熱啟動反應,抑制了非特異擴增反應,提高了 PCR反應的特異性的同時能夠進行在同一管內對擴增產(chǎn)物進行顯色反應。
權利要求
一種通過溫度控制反應進程的反應管,其主要特征是在管內設計密封層,將需要控制的反應進程所需的反應試劑封于密封層中,通過控制溫度的變化實現(xiàn)密封材料的熔化,釋放被密封的反應試劑,從而實現(xiàn)反應進程的控制。
2. 根據(jù)權利要求1所述的反應管,其特征在于密封層為多層時,根據(jù)不同反應進程的先后順序將密封層設置于該密封層熔化后該密封層中的反應試劑能與前一反應進程反應體系相接觸的位置,各密封層的熔化溫度小于等于對應的反應進程的反應溫度且高于在先反應進程的反應溫度并低于與在后反應進程對應的密封層的熔化溫度。
3. 根據(jù)權利要求2所述的反應管,其特征在于根據(jù)需要采用密封層控制的不同反應進程的先后順序依次設置密封層,最外層的密封層對應在先進行的反應進程。
4. 根據(jù)權利要求2所述的反應管,其特征在于反應管溫度調節(jié)按照所需控制的反應進程分段調節(jié),高于等于相應反應進程的反應溫度且低于在后反應進程對應的密封層的熔化溫度。
5. 根據(jù)權利要求4所述的反應管,其特征在于將反應管溫度調節(jié)至相應反應進程所需的反應溫度,與相應反應進程對應的密封層因熔點小于等于該反應溫度而熔化,將預先封于該密封層內的試劑釋放,使相應的反應進程能夠進行。
6. 根據(jù)權利要求4或5所述的反應管,其特征在于反應管溫度調節(jié)應按照反應進程的先后順序從低溫向高溫調節(jié)。
7. 根據(jù)權利要求2所述的反應管,其特征在于不同的密封層采用不同熔點的物質作為密封材料。
8. 根據(jù)權利要求2所述的反應管,其特征在于不同熔點的物質為不同熔點的石蠟或不同熔點的的低熔點聚四氟乙烯。
9. 根據(jù)權利要求2所述的反應管,其特征在于根據(jù)所需反應階段的數(shù)目設計密封層的數(shù)量;不同溫度的反應進程其相應密封層的熔點不同。
10. 根據(jù)權利要求1所述的反應管,其特征在于密封層中的反應試劑混合在密封材料中或由密封材料隔開。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領域,公開了一種通過溫度控制反應進程的反應管。該反應管是在管內設計密封層,將需要控制的反應進程所需的反應試劑封于密封層中,通過控制溫度的變化實現(xiàn)密封材料的熔化,釋放被密封的反應試劑,從而實現(xiàn)反應進程的控制。這種反應管有效避免了反應過程中頻繁打開反應管添加試劑造成的污染及反應結束后的滯后污染,減少反復添加試劑對反應過程的干擾,易于自動化控制,在一定程度上還可以控制各反應進程的起始時間,提高反應的特異性,也便于攜帶和運輸,所需反應試劑無需要臨時配制,節(jié)省操作時間。
文檔編號C12M1/24GK101787347SQ20091026417
公開日2010年7月28日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權日2009年12月30日
發(fā)明者周國華, 成思佳, 梁超 申請人:華東醫(yī)學生物技術研究所
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