專利名稱：一種豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄pcr分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豇豆重花葉病毒(Cowpea severe mosaic virus, CPSMV)檢測(cè)的 試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豇豆重花葉病毒(CPSMV)屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)豇豆花葉病毒屬 (Comovirus)的確定種。該病毒的自然寄主為豆科植物，可嚴(yán)重侵染豇豆、大豆等多種作物。 該病毒侵染豇豆后，可造成葉片花葉和斑駁，嚴(yán)重的可導(dǎo)致整株枯死；在田間對(duì)豇豆的侵染 率可達(dá)100%，造成產(chǎn)量損失可達(dá)50%。目前CPSMV主要分布在美洲地區(qū)，如美國(guó)、巴西、秘魯、委內(nèi)瑞拉、特立尼達(dá)、波多 黎各、哥斯達(dá)黎加和蘇里南等國(guó)，中國(guó)尚無(wú)發(fā)生與危害的報(bào)道。CPSMV可通過(guò)種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，其中豇豆的種傳率為10 %，長(zhǎng)豇 豆(Vignasesquipedalis)的種傳率為8 % ；在田間，該病毒還可以通過(guò)菜豆葉甲 (Ceratomatrifurcata),帶斑黃瓜葉甲(Diabrotica balteata)禾口南美葉甲(D. speciosa) 等媒介昆蟲(chóng)及機(jī)械傳播。該病毒的自然寄主在中國(guó)廣泛種植，且氣候條件與該病毒發(fā)生地 的氣候條件相似，因此，CPSMV傳入、定殖和擴(kuò)散的可能性都很大，并可隨種子的調(diào)運(yùn)或害蟲(chóng) 的遷移而在國(guó)內(nèi)傳播。CPSMV已成為我國(guó)豆科植物尤其是豇豆和大豆生產(chǎn)潛在的巨大威脅。鑒于該病毒的自然寄主豇豆和大豆等為中國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物，能夠?qū)ζ湓斐珊艽?的危害，中國(guó)已將該病毒列入“中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄”。目前，CPSMV多采用DAS-ELISA試劑盒(即雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法)檢測(cè)，但該 方法不夠快速、靈敏、準(zhǔn)確，難以適合檢疫口岸使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適宜于檢疫口岸使用的豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分 子檢測(cè)試劑盒，以便于口岸簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)進(jìn)口的豇豆種子進(jìn)行豇豆重花葉病毒的檢 測(cè)。本發(fā)明從豇豆種子或植株中提取病毒RNA，進(jìn)行豇豆重花葉病毒RT-PCR檢測(cè)。本發(fā)明提供一種豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒，包括如下試劑 dNTP 混合物、無(wú) RNase 的 ddH20、5XRT Buffer、RNase 抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、IOXPCR Buffer、 MgCl2溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq DNA聚合酶和ddH20 ；所述CPSMVf序列 為 5，-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中 R = A 或 G，N = I (次黃嘌呤核苷酸)，M = A 或 C ； 所述CPSMVr序列為5，-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3，，其中N = I (次黃嘌呤核苷酸)，R = A 或G。該豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒，還含有用作陽(yáng)性對(duì)照的豇豆重花 葉病毒凍干粉。
本發(fā)明還提供利用所述試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒的方法，包括如下步驟(1)分別提取樣品及所述豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA ；(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以步驟⑴所述樣品RNA為模板，以CPSMVr為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；陽(yáng)性對(duì)照中的模板為所述的豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA ；(3)以步驟⑵所述的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以CPSMVf和CPSMVr為引物進(jìn)行PCR反 應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；(4)取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中，對(duì)應(yīng)于樣品RNA的泳道 在356bp處有特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了 CPSMV。步驟⑵所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟為在PCR管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其組成為IyL 濃度為10 μ M的CPSMVr，1 μ L濃度為l(kimol/L的dNTP混合物，樣品RNA，用無(wú)RNase的 ddH20補(bǔ)足體系至10 μ L ；反應(yīng)程序?yàn)?5°C反應(yīng)5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中繼續(xù) 添加如下成分4 μ L的5 X RT Buffer, 0. 5 μ L濃度為40U/ μ L的RNase抑制劑，1 μ L濃度 為 200U/ μ L 的 RTase，4· 5μ L 無(wú) RNase 的 ddH20,反應(yīng)程序?yàn)?2°C 反應(yīng) 60min，70°C 反應(yīng) 15min。步驟(3)所述PCR反應(yīng)體系的組成為2 μ L的10XPCR Buffer (不含Mg2+)、2 μ L 濃度為25mM的MgCl2、2 μ L濃度為2. 5mM的dNTP混合物、濃度為20 μ M的CPSMVf和CPSMVr 各0. 5 μ L、0. 2 μ L濃度為5U/ μ L的Taq DNA聚合酶以及2 μ L所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以ddH20補(bǔ) 足體系至20μ L ；所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；94°C變性45s，52°C復(fù)性45s，72°C 延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。本發(fā)明提供的豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。利用從 美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)引進(jìn)CPSMV標(biāo)準(zhǔn)菌種，經(jīng)測(cè)序后，綜合已知的GeneBank中CPSMV 外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的簡(jiǎn)并引物，能較好地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)條帶。該方法具有 快速、操作簡(jiǎn)便，特異性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)該病毒可以通過(guò)種子傳播的特點(diǎn)，對(duì)豇豆 種子或植株都可以直接進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明適合對(duì)進(jìn)出境豇豆等豆類蔬菜種子及種苗中豇豆 重花葉病毒的檢測(cè)，在各植物檢疫口岸具有良好的應(yīng)用前景。


圖1用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒(CPSMV)的電泳圖譜，其中M(bp)為 marker, ck為陰性對(duì)照(滅菌雙蒸水)，+為陽(yáng)性對(duì)照(CPSMV)，1為感染CPSMV的豇豆種子， 2為感染CPSMV豇豆葉片。圖2采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒的特異性驗(yàn)證電泳圖譜，其中M(bp) 為marker，ck為陰性對(duì)照(滅菌雙蒸水)，+為陽(yáng)性對(duì)照(CPSMV)，1為豇豆花葉病毒，2為 菜豆莢斑駁病毒，3為煙草環(huán)斑病毒，4為黑眼豇豆花葉病毒，5為大豆花葉病毒；圖3用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒(CPSMV)的靈敏度電泳圖譜，其中M(bp) 為marker，ck為陰性對(duì)照(滅菌雙蒸水)，1 8分別對(duì)應(yīng)的是總RNA量lOOng、10ng、lng、 lOOpg、10pg、lpg、0. lpg、0. Olpg ；
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒
本發(fā)明豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒的組成如下dNTP 混合物(10mmol/L)、無(wú) RNase 的 ddH20、5XRT Buffer、RNase 抑制劑(40U/ μ L)、RTase (200U/ μ L)、10 X PCR Buffer (不含 Mg2+)、MgCl2 (25mM)、dNTP 混合物(2. 5mM)、 CPSMVr (10 μ Μ)、CPSMVf (20 μ Μ)、CPSMVr (20 μ Μ)、Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)、ddH20 禾口陽(yáng)性 對(duì)照。其中CPSMVf，CPSMVr 設(shè)計(jì)過(guò)程如下如何通過(guò) GeneBank (http //www. ncbi. nlm. nih.gov)檢索，根據(jù)CPSMV外殼蛋白編碼基因(登錄號(hào)NC003544、M83309)中的保守序列 設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸引物，以CPSMV (美國(guó)菌種保藏中心標(biāo)準(zhǔn)菌種編號(hào)PV-273)為模板經(jīng)反轉(zhuǎn) 錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增出產(chǎn)物后測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果以及GeneBank中CPSMV外殼蛋白編碼基 因(登錄號(hào)NC003544、M83309、AF263549、GQ229416)設(shè)計(jì)如下一對(duì)豇豆重花葉病毒的特異 性寡核苷酸簡(jiǎn)并引物上游引物(CPSMVf) :5，-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3，，其中R = A或G、 N=I(次黃嘌呤核苷酸)、M = A 或 C)；下游引物(CPSMVr) 5，-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3，， 其中N = I (次黃嘌呤核苷酸)，R = A或G。引物CPSMVf和CPSMVr預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小 為356bp。引物CPSMVf和CPSMVr由金思特科技(南京)有限公司合成。陽(yáng)性對(duì)照為豇豆重花葉病毒凍干粉，其制備方法為利用CPSMV標(biāo)準(zhǔn)毒株(美國(guó)菌 種保藏中心編號(hào)PV-273)為材料，接種健康的感病豇豆品種(Blackeye EarlyRamshorn)。 植株發(fā)病后，采集發(fā)病的豇豆葉片，以1 5 (m/v)的比例加入樣品抽提緩沖液，充分研磨成 勻漿，制備成病汁液。將病汁液置于70°C水浴鍋中，處理10分鐘，使病毒滅活。然后將病汁 液分裝于安瓿瓶中，_40°C冷凍固化后，放入冷凍干燥機(jī)中，在_50°C、真空度0. 04mBar的條 件下冷凍干燥60小時(shí)，制備成豇豆重花葉病毒凍干粉。其中抽提緩沖液的成分如下2% (質(zhì)量濃度)聚乙烯基吡咯烷酮，0.05% (質(zhì)量 濃度)吐溫-20，ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L)。其他試劑按照本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)方法制備。實(shí)施例2利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)感病的豇豆葉片和種子樣品1.分別提取樣品及所述豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA采用Trizol法分別提取樣品及豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA。利用CPSMV標(biāo)準(zhǔn)毒株(美國(guó)菌種保藏中心編號(hào)PV-273)為材料，接種感病豇豆品 種(Blackeye Early Ramshorn)，發(fā)病后，采集葉片及發(fā)病種子，以發(fā)病植株的種子和葉片 為樣品。種子樣品的制備根據(jù)豇豆感染該病毒后的癥狀特點(diǎn)，挑選粒小，粒癟等癥狀的種 子，經(jīng)3% (m/v)次氯酸鈉表面消毒IOmin后，用無(wú)菌水洗滌三次，選取種胚，加入液氮，充分 研磨成粉狀，制成樣品。葉片樣品的制備豇豆出苗至第一對(duì)真葉展平后，選取有疑似癥狀的植株的葉片， 加入液氮，充分研磨成粉狀，制成樣品。采用Trizol法分別提取樣品稱取20mg樣品，迅速將其移入滅菌的1. 5ml離心管 中，加入ImL TRIzoL試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)劇烈震蕩搖勻3min后，在4°C、離心力 12000g的條件下離心lOmin，取上清液，加入0. 2mL氯仿，上下顛倒混勻，室溫靜置3min ；然 后再次4°C、12000g條件下離心lOmin，取上層水相，加等體積的異丙醇，顛倒混勻；在4°C、 12000g離心力的條件下離心lOmin，棄上清；加75% (體積濃度)的乙醇洗滌沉淀，在4°C、離心力7500g的條件下離心2min，棄乙醇；將沉淀在室溫下充分干燥后，溶于30 μ L經(jīng)焦碳 酸二乙酯處理的雙蒸水(ddH20)中，置于-20°C保存?zhèn)溆谩ｔ怪鼗ㄈ~病毒凍干粉的RNA的提取方法同上。2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR管中配制下列混合液CPSMVr(IOyM) =IyLdNTP 混合物(10mmol/L) =IyL
RNA (步驟1提取得到)1 μ g無(wú)RNase的ddH20 補(bǔ)足體系至10 μ L在PCR儀上進(jìn)行下列條件的變性、退火反應(yīng)65°C反應(yīng)5min，冰上急冷。在上述PCR管中繼續(xù)添加如下成分5 X RT Buffer :4μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L) :0· 5 μ LRTase (200U/ μ L) : 1 μ L無(wú) RNase 的 ddH20 :4· 5 μ L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積20 μ L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件42°C反應(yīng)60min，70°C反應(yīng)15min。注陽(yáng)性對(duì)照中的模板是豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA，陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水。3.豇豆重花葉病毒的特異性PCR擴(kuò)增按下列組分配制PCR反應(yīng)體系(20 μ L)10 X PCR Buffer (Mg2+-free) :2 μ LMgCl2(25mM) :2μ LdNTP 混合物(2· 5mM each) :2 μ LCPSMVf (20 μ Μ) :0· 5 μ LCPSMVr (20 μ Μ) :0· 5 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) :0· 2 μ L模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)2yLddH20 補(bǔ)足體系至 20 μ L反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ；94°C變性45s，52°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin，35個(gè) 循環(huán)；最后72°C延伸5min。此PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照為步驟2中的陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物。4.結(jié)果分析取8 μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察、拍照并記錄結(jié)果。電泳結(jié)果(圖1)表明，發(fā)病植株的種子和葉片均擴(kuò)增出356bp的 特異性條帶，并與陽(yáng)性對(duì)照大小一致，表明所檢測(cè)的樣品為陽(yáng)性，也說(shuō)明本發(fā)明提供的試劑 盒可以用來(lái)檢測(cè)豇豆重花葉病毒。實(shí)施例3利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR的特異性1.特異性驗(yàn)證材料及病毒RNA提取選取與豇豆重花葉病毒同屬(豇豆花葉病毒屬Comovirus)的豇豆花葉病毒(CPMV)和菜豆莢斑駁病毒(BPMV)，同科(豇豆花葉病毒科Comoviridae)的另外一個(gè)線 蟲(chóng)傳多面體病毒屬(N印ovirus)煙草環(huán)斑病毒(TRSV)，豇豆上另外一個(gè)重要種傳病毒馬 鈴薯Y病毒屬的黑眼豇豆花葉病毒(BlCMV)以及大豆花葉病毒(SMV)，進(jìn)行豇豆重花葉病 毒(CPSMV)RT PCR特異性驗(yàn)證。以上這些病毒毒源來(lái)源于美國(guó)典型微生物菌種保藏中心 (American Type Culture Collection，簡(jiǎn)稱 ATCC)。病毒 RNA 的提取采用 Trizol 方法提 取。2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR管中配制下列混合液CPSMVr(IOyM) =IyLdNTP 混合物(10mmol/L) =IyLRNA 1 μ g無(wú)RNase的ddH20 補(bǔ)足體系至10 μ L在PCR儀上進(jìn)行下列條件的變性、退火反應(yīng)65°C反應(yīng)5min，冰上急冷。在上述PCR管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液5 X RT Buffer :4μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L) :0· 5 μ LRTase (200U/μ L) =IyL無(wú) RNase 的 ddH20 :4· 5 μ L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積20 μ L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件42°C反應(yīng)60min，70°C反應(yīng)15min。注陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水。3.豇豆重花葉病毒的特異性PCR擴(kuò)增按下列組分配制PCR反應(yīng)體系(20 μ L)10XPCR Buffer(Mg2+-free) :2μ LMgCl2(25mM) :2μ LdNTP 混合物(2. 5mM each) 2. μ LCPSMVf (20 μ Μ) :0· 5 μ LCPSMVr (20 μ Μ) :0· 5 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) :0· 2 μ L模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)2yLddH20 補(bǔ)足反應(yīng)總體積20 μ L反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min :94°C變性45s，52°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin，35個(gè) 循環(huán)最后72°C延伸5min。此PCR反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照為步驟2中的陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物。4.結(jié)果分析結(jié)果如圖2，只有CPSMV在356bp處有擴(kuò)增片段，而其他五個(gè)病毒均無(wú)擴(kuò)增，表明用本發(fā)明提供的試劑盒來(lái)檢測(cè)豇豆重花葉病毒能滿足PCR特異性反應(yīng)的要求。實(shí)施例4利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR方法的靈敏度
1.分別提取樣品及所述豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA樣品為CPSMV標(biāo)準(zhǔn)毒株(美國(guó)菌種保藏中心編號(hào)PV-273)感染的豇豆葉片。采用Trizol法分別提取樣品及豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA。2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR管中配制下列混合液CPSMVr(IOyM) =IyLdNTP 混合物(10mmol/L) =IyLRNA (步驟1提取得到)500ng無(wú)RNase的ddH20 補(bǔ)足體系至10 μ L在PCR儀上進(jìn)行下列條件的變性、退火反應(yīng)65°C反應(yīng)5min，冰上急冷。在上述PCR管中繼續(xù)添加如下成分5 X RT Buffer :4μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L) :0· 5 μ LRTase (200U/μ L) =IyL無(wú) RNase 的 ddH20 :4. 5 μ L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積20 μ L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件42°C反應(yīng)60min，70°C反應(yīng)15min。注陽(yáng)性對(duì)照中的模板是豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA。陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水。3. PCR 反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的CDNA溶液用EASY Dilution (TAKARA公司產(chǎn)品)按10倍梯度逐級(jí)稀 釋，各取2 μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)。此時(shí)20 μ L PCR反應(yīng)液中的cDNA添加量分別相當(dāng)于lOOng、 10ng、lg、100pg、10pg、lpg、0. lpg、0. Olpg的總RNA量。此PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照為步驟2中 的陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物。按下列組分配制PCR反應(yīng)體系(20 μ L)10ΧPCR Buffer (Mg2+-free) :2 μ LMgCl2(25mM) :2μ LdNTP 混合物(2· 5mM each) :2 μ LCPSMVf (20 μ Μ) 0. 5μ LCPSMVr (20 μ Μ) :0. 5μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) :0· 2 μ L模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)2yLddH20 補(bǔ)足體系至 20 μ L反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ；94°C變性45s，52°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin，35個(gè) 循環(huán)；最后72°C延伸5min。4.結(jié)果分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，總RNA量從IOOng至Ipg均能擴(kuò)增出356bp的目的片段，表明本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒的靈敏度可達(dá)Ipg的總RNA量(如圖3)。SEQUENCE LISTING<110>江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心
<120> 一種豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法<130>JSCHJ0904<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPSMVf<220><221>misc_feature - - _<222>(9). . (9)<223>n = i<220><221>misc_feature<222>(12). . (12)<223>n = i<220><221>misc_feature<222>(15). . (15)<223>n = i<400>1acacargtnm gnccngatac 20<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPSMVr<220><221>misc_feature<222>(6). . (6)<223>n = i<400>2
gctacnggac trctrctca 19
權(quán)利要求
一種豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒，包括如下試劑dNTP混合物、無(wú)RNase的ddH2O、5×RT Buffer、RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、10×PCR Buffer、MgCl2溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq DNA聚合酶和ddH2O；所述CPSMVf序列為5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G，N＝次黃嘌呤核苷酸，M＝A或C；所述CPSMVr序列為5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝次黃嘌呤核苷酸，R＝A或G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征在于還 含有用作陽(yáng)性對(duì)照的豇豆重花葉病毒凍干粉。
3.一種采用權(quán)利要求2所述的試劑盒檢測(cè)豇豆重花葉病毒的方法，其特征在于包括如 下步驟(1)分別提取樣品及所述豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA；(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以步驟(1)所述樣品RNA為模板，以CPSMVr為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；陽(yáng)性對(duì)照中的模板為所述的豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA ；(3)以步驟(2)所述的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以CPSMVf和CPSMVr為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)， 獲得PCR產(chǎn)物；(4)取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中，對(duì)應(yīng)于樣品RNA的泳道在 356bp處有特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了 CPSMV。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)豇豆重花葉病毒的方法，其特征在于步驟(2)所述反 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟為在PCR管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其組成為樣品RNA、1 μ L濃度為10 μ M的 CPSMVr和1 μ L濃度為10mmol/L的dNTP混合物，用無(wú)RNase的ddH20補(bǔ)足體系至10 μ L ； 反應(yīng)程序?yàn)?5°C反應(yīng)5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中繼續(xù)添加如下成分4yL的 5 X RT Buffer,0. 5 μ L 濃度為 40U/ μ L 的 RNase 抑制劑、1 μ L 濃度為 200U/ μ L 的 Rtase 禾口 4. 5μ L無(wú) RNase 的 ddH20，反應(yīng)程序?yàn)?2°C 反應(yīng) 60min，70°C 反應(yīng) 15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測(cè)豇豆重花葉病毒的方法，其特征在于步驟(3)所述PCR反應(yīng)體系的組成為2yL的10XPCR Buffer、2 μ L濃度為25mM的MgCl2、 2 μ L濃度為2. 5mM的dNTP混合物、濃度為20 μ M的CPSMVf和CPSMVr各0. 5 μ L、0. 2 μ L濃 度為5U/ μ L的Taq DNA聚合酶和2 μ L所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以ddH20補(bǔ)足體系至20 μ L ；所述 PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；94°C變性45s，52°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸5min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種豇豆重花葉病毒反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。試劑盒包括引物CPSMVf和CPSMVr；CPSMVf為5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，R＝A或G，N＝I，M＝A或C；CPSMVr為5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，N＝I，R＝A或G。檢測(cè)步驟提取樣品RNA，以CPSMVr為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，CPSMVf和CPSMVr為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并進(jìn)行電泳，若樣品RNA在356bp處有特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了CPSMV。該方法具有快速、操作簡(jiǎn)便，特異性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101824485SQ200910264108
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者吳翠萍, 安榆林, 李彬, 李艷華, 楊靜, 粟寒, 鄭斯竹, 陳貫源 申請(qǐng)人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心