專利名稱：以反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列為靶的核酶的表達(dá)構(gòu)建體及含有所述構(gòu)建體的重組反轉(zhuǎn)錄病毒的制作方法
本申請是美國系列申請No.08/178082(1994年1月5日申請)的繼續(xù)部分。在本申請中，各文獻(xiàn)的作者和年代在括號內(nèi)。所有的參考文獻(xiàn)按字母順序列在實驗部分的后面。這些文獻(xiàn)以其全部的公開內(nèi)容引入本文作為參考，以便更完整地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的背景反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒是以RNA為其基因組物質(zhì)的病毒。它們穩(wěn)定地將其基因組RNA的cDNA拷貝整合到宿主基因組中，這樣利用宿主細(xì)胞進(jìn)行其復(fù)制(Miller，1992，和Brown，1987)。病毒基因組由在病毒的原病毒cDNA形式兩個末端(5’和3’)的長末端重復(fù)片段(LTR)組成。從5’到3’，LTR由經(jīng)一稱為R的短序列相連的U3和U5組成。轉(zhuǎn)錄在5’LTR內(nèi)開始，在3’LTR內(nèi)在多聚腺苷酸位點終止。與LTR相鄰的是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶引發(fā)正負(fù)DNA鏈合成所必需的短序列。剪接供體和受體序列均在基因組內(nèi)，而且這些序列涉及亞基因組RNA的生產(chǎn)。直接接近5’LTR的是對于將病毒RNA包被到病毒粒子中所必需的序列。將其稱為Psi包裝序列。它是確保病毒RNA包裝的必要和特異性的信號序列。病毒RNA的主體由分別編碼核心蛋白(gag)，整合酶，蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶(pol)及被膜蛋白(env)的gag，pol和env復(fù)制基因組成。
反轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞是從病毒糖蛋白與細(xì)胞受體(A)的相互作用開始的(見附

圖1)。在吸附和脫殼后，病毒RNA進(jìn)入靶細(xì)胞，然后在反轉(zhuǎn)錄酶(病毒粒子中所攜帶的酶)的作用下，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA采用環(huán)狀形式(C)，轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA，然后通過整合酶(D)的作用整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA中。整合后，原病毒cDNA從5’LTR內(nèi)的啟動子(E)開始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄出的RNA要么作為mRNA并翻譯產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)(F)，要么作為新的病毒RNA保留。所述的病毒RNA含有對于其包裝成病毒粒子(G)所必需的Psi包裝序列。一旦產(chǎn)生出病毒粒子，通過從質(zhì)膜中長出芽狀物而從細(xì)胞中釋放出來?？傊?，反轉(zhuǎn)錄病毒不會引起宿主細(xì)胞的溶解；但HIV例外。原病毒cDNA仍穩(wěn)定地整合在宿主基因組中，而且隨宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制，以致于子代細(xì)胞也遺傳了原病毒。潛在的抗病毒劑可以以這些復(fù)制控制點中的任何一個為靶。人免疫缺損病毒(HIV)HIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，其復(fù)制與上述過程大體相同。HIV進(jìn)入到細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中，主要是受HIVgp120被膜蛋白與靶細(xì)胞表面的CD4受體的相互作用的影響。gp120的氨基酸序列在不同的患者(或甚至同一患者)中可以有高度的可變性，從而給疫苗生產(chǎn)帶來困難(Brown，1987，和Peterlin etal.，1988)。這種可變性表明與疾病的進(jìn)展有關(guān)。HIV的主要特征是i)(象慢病毒組的其他成員一樣)有一個潛伏期，其中原病毒在整合到宿主細(xì)胞基因組中后，可以進(jìn)入休眠狀態(tài)，和ii)它給T淋巴細(xì)胞靶細(xì)胞帶來細(xì)胞病。在帶有原病毒的細(xì)胞被激活后，HIV開始復(fù)制。細(xì)胞活化和伴隨病毒復(fù)制的刺激因素至今尚未清楚地鑒定出(Brown，1987和Peterlin et al.，1988)。象所有的反轉(zhuǎn)錄病毒一樣，gag，pol和env基因產(chǎn)物被翻譯成結(jié)構(gòu)和酶蛋白。對于HIV來說，還有其他的調(diào)節(jié)基因。具體地說，tat和rev基因產(chǎn)物被翻譯成調(diào)節(jié)蛋白，然后作為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子來誘導(dǎo)高水平的基因表達(dá)。Nef是另一個調(diào)節(jié)病毒復(fù)制水平的調(diào)節(jié)基因(Jones，1989，Greene，1990，和Epstein，1991)。
HIV復(fù)制水平在活化和正在增殖的細(xì)胞中最高；細(xì)胞活化引起核轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增強(qiáng)子因子與HIV LTR相結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平提高。與所有的反轉(zhuǎn)錄病毒一樣，包裝區(qū)(Psi)是位于HIV基因組中的順式作用的RNA序列，對基因組RNA的包被是必需的。摻入gag蛋白，pol酶和病毒RNA之核心的形成是在HIV復(fù)制周期的晚期。所述的核心得到一個膜，然后通過細(xì)胞膜長出芽狀物而脫離細(xì)胞(Peterlin etal.，1988，Jones，K.A.，1989，Greene，1990和Epstein，1991)。
迄今為止，已經(jīng)研究了許多抑制HIV復(fù)制的試劑。在附圖1中列出了以復(fù)制階段為靶的特定試劑的說明。(A)病毒對靶細(xì)胞的吸附已經(jīng)使用了可溶性CD4以便占據(jù)高比例的病毒受體，從而使病毒不能與細(xì)胞膜結(jié)合。但是，到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)這是一種成功的治療策略(Stevenson et al.，1992)。已經(jīng)表明硫酸化的多糖具有可能通過阻斷細(xì)胞-病毒融合來抑制HIV感染的能力(McClure et al.，1992)。針對HIV本身，宿主細(xì)胞受體或HIV被膜決定簇的抗體，以及CD4結(jié)合的外毒素(Stevenson et a.l.，1992)是阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的其他的可能的方法。(B)通過反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)例如疊氮基胸苷三磷酸(AZT)體外抑制反轉(zhuǎn)錄酶。目前常規(guī)地將AZT施用于AID患者和當(dāng)其接受骨髓移植時，后者是為了保護(hù)正常骨髓免于殘留的HIV的感染(Miller，1992)。(C)cDNA從胞質(zhì)中易位到核中可能可以阻斷cDNA跨越核孔易位或核運(yùn)輸?shù)谋旧?，但目前為止還未成功地做到這點。(D)cDNA整合到宿主基因組中可能還可以阻斷原病毒cDNA整合到宿主細(xì)胞基因組中(Stevenson et al.，1992)。迄今為止，沒有候選化合物被證明是有效的。(E)原病毒轉(zhuǎn)錄已知5，6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑干擾轉(zhuǎn)錄延長(Stevenson et al.，1992)。通過結(jié)合tat蛋白質(zhì)，由此抑制其激活HIV的能力，有意義TAR類似物也可以影響轉(zhuǎn)錄(Miller，1992和Sullenger et al.，1990)。(F)HIV mRNA的翻譯反義RNA通過與病毒RNA的結(jié)合，可以抑制病毒復(fù)制(Sczakielet al.，1992)。與mRNA結(jié)合可以抑制翻譯；與新生病毒RNA結(jié)合也可以抑制將RNA生產(chǎn)性包裝成病毒粒子。(G)病毒的包裝和成熟病毒粒子的產(chǎn)生蛋白酶誘導(dǎo)HIV多聚蛋白的特異性裂解。這種活性對于產(chǎn)生成熟的感染性病毒粒子是必需的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)種化合物，例如α，α-二氟酮抑制HIV蛋白酶，而且已經(jīng)表明在組織培養(yǎng)中有一定程度的抗病毒活性。但是大多數(shù)蛋白酶抑制劑只有短的血清半衰期、迅速的膽汁清除率和不佳的口服利用率(Debouck，1992)。核酶(Ribozyme)核酶是裂解RNA并有更新的酶解性RNA。在有些類型的核酶中，通過加入互補(bǔ)序列臂，它們可以與特異性的靶RNA配對并在RNA磷酸二酯骨架上的特異性位點誘導(dǎo)裂解(Haseloff et al.，1988；Rossi et al.，19992；Hampel，1990；Ojwang，1992)。錘頭核酶是小而簡單的，而且在摻入到各種側(cè)翼序列的基序中時，仍能保持位點特異性裂解(Haseloff et al.，1988；Rossi et al.，1992)。這些特征使其能特別好地適用于基因抑制。發(fā)明概述本發(fā)明涉及合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，含有其序列定義了一個保守催化區(qū)的核苷酸和其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)預(yù)定的靶序列雜交的核苷酸。優(yōu)選的，病毒包裝序列是反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列，而且在一個實施方案中，是HIV-1Psi包裝序列。RNA病毒可以是HIV-1，貓白血病病毒，貓免疫缺損病毒或表6中所列的病毒之一。保守催化區(qū)可以得自錘頭核酶，發(fā)夾核酶，肝炎δ核酶，RNAase P核酶，I組內(nèi)含子，II組內(nèi)含子。本發(fā)明還涉及多核酶，核酶的組合物和抗RNA病毒的反義鏈，而且所述的組合物還包括polyTAR，RRE或TAR引誘物。還描述了含有或不含有反義鏈和poly TAR，RRE或TAR引誘物的載體或核酶。此外，還描述了體內(nèi)和間接體內(nèi)(ex vivo)的治療方法和使用方法。附圖的簡要描述圖1典型反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制循環(huán)。
(A)病毒與靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后，在融合和病毒脫殼后，基因組RNA進(jìn)入靶細(xì)胞。(B)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。(C)cDNA進(jìn)入核，并轉(zhuǎn)變成環(huán)狀形式。(D)cDNA整合到宿主細(xì)胞基因組。(E)原病毒轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生病毒RNA和mRNA。(F)翻譯產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)。(G)從病毒編碼的蛋白質(zhì)和被包裝的病毒RNA形成病毒核心。(H)核心獲得膜，然后通過透細(xì)胞膜發(fā)芽而從細(xì)胞中出來。圖2在Mo-MLV Psi包裝區(qū)中的核酶靶位點。
Mo-MLV5’區(qū)代表pMLV-1(在本文中定義的)的BalI/BalI片段(nt 212-nt 747)。箭頭指示的是核酶靶位點，所有核酶靶位點都是GUC殘基。圖3莫洛尼氏小鼠白血病病毒的基因組MoMLV的基因組由復(fù)制基因gag，pol和env以及5’和3’的長末端重復(fù)(LTR)序列組成。Psi包裝位點對于將病毒RNA包裝成病毒粒子中是必需的。圖4抗Mo-MLV和抗HIV包裝位點構(gòu)建體。
標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)構(gòu)建體是以pSV2neo為基礎(chǔ)的，由neor基因上游的SV40啟動子和一個設(shè)計的核酶或與插入到neor的SmaI位點的Psi包裝序列互補(bǔ)的反義序列(抗Psi)組成。圖5以HIV包裝位點為靶。
本附圖是帶有核酶9的HIV基因組的簡圖，所述核酶9以Psi包裝位點內(nèi)的序列為靶。圖6用核酶體外裂解體外產(chǎn)生的Mo-MLV包裝區(qū)RNA。
道1是用HinfI消化的pBR322標(biāo)記DNA。道2是約550kb的底物。道3、5、7和9分別是體外產(chǎn)生的Rz243，Rz274，Rz366和Rz-M7。下列核酶被加到靶底物RNA中道4，Rz243；道6，Rz274；道8，Rz366；道10，Rz-M7。在將樣品在10mMTris·Cl，pH7.5中于80℃加熱2分鐘后，在37℃，10mM MgCl2，50mM Tris·Cl，pH7.5中30分鐘完成裂解反應(yīng)。圖7核酶或反義構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的DNA的Southern雜交。
分別用不同構(gòu)建體道1pSV243；道2pSV274；道3pSV366；道4pSV-M7；道5pSVAs-Psi；和道6pSV2neo轉(zhuǎn)染3T3-Mo-MLV細(xì)胞，用HindIII/NruI消化來自所述細(xì)胞的基因組DNA(10μg)，在0.6％瓊脂糖凝膠上分離，印跡到硝酸纖維素濾紙上，然后與32P-標(biāo)記的neor基因探針雜交。箭頭表明neor基因本身(1.34kb)和neor基因加一個核酶(1.38kb)，加多Rz(1.98kb)或加反義鏈(1.89kb)的預(yù)期大小。圖8為研究核酶/反義構(gòu)建體表達(dá)而進(jìn)行的RNase保護(hù)分析。
用32P-標(biāo)記的核糖探針分析一系列轉(zhuǎn)染細(xì)胞的20μg總RNA有關(guān)核酶或反義構(gòu)建體表達(dá)的情況。道1，用HinfI消化的末端標(biāo)記的分子量標(biāo)記物pBR322的DNA片段；道2，與酵母RNA雜交的RzM7的核糖探針，然后用RNase消化；道3，與酵母RNA雜交的RzM7的核糖探針，然后未用RNase消化；道4-8，分別與來自pSV243，pSV274，pSV366，pSV-M7和pSVAs-Psi轉(zhuǎn)染之細(xì)胞的RNA雜交的RzM7的核糖探針，然后用RNase消化；道9-13，分別是RzM7，Rz243，Rz274，Rz366和As-Psi的核糖探針。在檢測中使用對Mo-MLV有最好抑制水平的各構(gòu)建體的克隆。圖9來自不同的3T3細(xì)胞(產(chǎn)生Mo-MLV)的病毒RNA點印跡的放射自顯影。
用與前文所述的Mo-MLV Psi包裝區(qū)互補(bǔ)的32P-標(biāo)記的核糖探針檢測以1∶1，1∶5和1∶10稀釋的病毒RNA制品。道1，酵母RNA；道2-7，來自用pSV243，pSV274，pSV366，pSV-M7，pSVAs Psi和pSVneo轉(zhuǎn)染的3T3-Mo-MLV細(xì)胞上清的RNA?？梢钥闯鐾ㄟ^核酶在體外有效地裂解RNA靶分子以及通過反義序列，降低了病毒RNA的水平。圖10在長期檢測中的p24水平該直方圖表示了按在8、13和22天核酶9(Rz-9)的p24水平測量的HIV復(fù)制數(shù)據(jù)，核酶構(gòu)建體的靶為HIV包裝位點。載體是對照構(gòu)建體。Rz-2和Rz-M是兩種以HIV的tat基因為靶的核酶構(gòu)建體。Rz-M是含有以tat內(nèi)的不同位點為靶的幾種核酶的多核酶。這包括被Rz-2攻擊的位點。
圖11根據(jù)從Genebank(LOCUSHIVSF2CG)分離的HIV-1SF2的序列資料設(shè)計抗HIV-1tat核酶。靶位點是GUC(Rz1)，GUA(Rz2)，GUC(Rz3)和CUC(Rz4)。
圖12Tat保守序列。
圖13不同tat靶序列的比較。
圖14用Rz2(a，d，f)表明保護(hù)作用的轉(zhuǎn)染的克隆T細(xì)胞系(Sup T1)。克隆細(xì)胞系含有載體(pSV2 neo neo-a)和隨機(jī)對照(Rana，b，c，d，e，f)。
圖15A-15C圖示反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體及其表達(dá)(未畫出比例)。15A，核酶構(gòu)建體RRz2；15B，反義構(gòu)建體RASH5；15C，聚合物-TAR構(gòu)建體R20TAR。括號中注明了親本反轉(zhuǎn)錄病毒。參見文章中的詳細(xì)描述。
圖16A-16C反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體在轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中的表達(dá)。用相應(yīng)的32P-標(biāo)記的探針經(jīng)Northern分析檢測核酶(圖16A)、反義序列(圖16B)和20TAR RNA(圖16C)的表達(dá)。參見說明書中的詳細(xì)描述。
圖17A-17CHIV-1IIIB在轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中復(fù)制的抑制。按材料和方法部分的描述攻擊和檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)的和篩選的PBL。表明的數(shù)據(jù)是五個供體(圖17A，核酶構(gòu)建體和圖17B，反義構(gòu)建體)和兩個供體(圖17C，聚合物-TAR構(gòu)建體)的平均值。
圖18A-18C轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL對臨床分離物82H感染的抗性。按材料和方法部分的描述，用核酶構(gòu)建體(圖18A)，反義構(gòu)建體(圖18)和聚合物-TAR構(gòu)建體(圖18C)轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL，用82H感染。所列的數(shù)據(jù)是兩個供體的平均值。
圖19轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL的增殖實驗。所列的數(shù)據(jù)為平均值±SD(n＝3)。僅PBL，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL；帶有相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄病毒的LXSN，R-20TAR，LNHL，RASH-5，LNL6和RRz2，轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL。
圖20用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CEM T4 T淋巴細(xì)胞系，然后經(jīng)G418篩選。收集的群體含有帶隨機(jī)整合體和不同構(gòu)建體表達(dá)水平的細(xì)胞，該細(xì)胞隨后將用HIV-1進(jìn)行攻擊。
圖21A-21BRzM是針對tat的多核酶，RRzpsi/M是同時4針對包裝序列/抗tat的多核酶的核酶。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，含有其序列定義了一個保守催化區(qū)的核苷酸和其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)預(yù)定的靶序列雜交的核苷酸。優(yōu)選的，病毒包裝序列是反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列，而且在一個實施方案中，是HIV-1Psi包裝序列。RNA病毒可以是HIV-1，貓白血病病毒，貓免疫缺損病毒或表6-7中所列在病毒之一。保守的催化區(qū)可以得自錘頭核酶(見Haseloff et al.，美國專利5,245,678；Rossi et al.，美國專利5,249,796)，發(fā)夾核酶(見Hampel et al.，歐洲申請89 117424，1989年9月20日申請)，肝炎δ核酶(Goldberg et al，PCT國際申請WO 91/04319和WO 91/04324，1991年4月4日公開)，RNAaseP核酶(見Altman et al.，美國專利5,168,053)，I組內(nèi)含子(見Cech et al.，美國專利4,987,071)，或II組內(nèi)含子(見Pyle，1993)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物可以具有下列結(jié)構(gòu)(SEQID NO1) 其中X代表相同或不同的并且可以是在其糖、磷酸或堿基上有修飾或取代的核苷酸；各A，C，U和G代表在其糖，磷酸或堿基上可以沒有修飾或有修飾或取代的核糖核苷酸；3’-AAG…AGUCX-5’指保守的催化區(qū)；各(X)nA和(X)n指其序列能夠與在RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸；各*代表位于核苷酸任一側(cè)的核苷酸之間的堿基配對；每條實線代表在位于核苷酸任一側(cè)的核苷酸之間的提供共價鍵的化學(xué)鍵；虛線各自獨(dú)立地代表在位于核苷酸任一側(cè)的核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵或者沒有任何所述的化學(xué)鍵；a代表表示核苷酸數(shù)的一個整數(shù)，前提是a可以是0或1，而且如果是0，則位于(X)n5’的A與(X)n3’的X鍵合；各m和m’代表大于或等于1的整數(shù)；(X)b代表寡核苷酸，b代表大于或等于2的整數(shù)。
另外，化合物可以具有下列結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO2) 其中3’-AAG…AGUCX-5’指保守的催化區(qū)；m代表2-20的整數(shù)；其中(X)m中沒有核苷酸與所述化合物內(nèi)的任何其它核苷酸Watson-Crick堿基配對。在另一實施方案中，權(quán)利要求1的化合物具有下列結(jié)構(gòu)式(SEQ IDNO3) 其中3’(X)P4…(X)P1-5’指保守的催化區(qū)；(X)F4和(X)F3指其序列能夠與在RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸；每條實線代表在位于核苷酸任一側(cè)的核苷酸之間的提供共價鍵的化學(xué)鍵；F3代表定義寡核苷酸中核苷酸數(shù)的整數(shù)，條件是F3大于或等于3；F4代表定義寡核苷酸中核苷酸數(shù)的整數(shù)，條件是F4為3-5；各(X)P1和(X)P4分別代表含有預(yù)定序列的寡核苷酸以便(X)P4與(X)P1的3-6個堿基能夠堿基配對；P1代表定義寡核苷酸中的核苷酸數(shù)的整數(shù)，條件是P1是3-6，P1與F4的總和等于9；(X)P2和(X)P3各代表有預(yù)定序列的寡核苷酸，以致(X)P2與(X)P3的至少3個堿基配對；各虛線各自獨(dú)立地代表在位于核苷酸任一側(cè)的核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵或者沒有任何所述的化學(xué)鍵；其中(X)L2代表可以存在或不存在的寡核苷酸，條件是如果(X)L2存在，L2代表大于或等于3的整數(shù)。
在另一實施方案中，其序列定義一保守催化區(qū)的核苷酸是來自肝炎δ病毒的保守區(qū)。另外，其序列定義一保守催化區(qū)的核苷酸在其3’末端含序列NCCA。
本發(fā)明還涉及帶有相同或不同保守催化區(qū)的多化合物或多核酶，所述保守催化區(qū)以相同或不同的預(yù)定靶序列為靶目標(biāo)。在該實施方案中，合成的非天然存在的寡核苷酸化合物含有兩個或多個相同或不同的區(qū)域，其中各區(qū)域含有其序列定義一保守催化區(qū)的核苷酸以及其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸。所述化合物還可以與反義核酸化合物共價相連，所述反義核酸化合物可以是與所述寡核苷酸化合物相同或不同，而且能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定序列雜交。
在一優(yōu)選的實施方案中，核苷酸能夠與MoMLV中的243，274，366或553靶序列以及在HIV Psi包裝位點內(nèi)的位點749雜交。所述寡核苷酸化合物還含有至少一個共價相連的，以RNA病毒基因組的不同基因為靶的另一合成的非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物或反義分子。在RNA病毒是HIV的情況下，HIV基因組的不同區(qū)域可以選自長末端重復(fù)序列，5’非翻譯區(qū)，剪接供體-受體位點，引物結(jié)合位點，3’非翻譯區(qū)，gag，pot，蛋白酶，整合酶，env，tat，rev，nef，vif，vpr，vpu，vpx或tev區(qū)。
優(yōu)選的，第一個寡核苷酸化合物能夠與MoLV中的243，274，366或553靶位點或其結(jié)合物以及HIV Psi包裝位點中的位點749雜交，而第二個化合物的核苷酸能夠與HIV tat區(qū)中的5792，5849，5886或6042靶位點或其結(jié)合物雜交。在HIV基因組中可以發(fā)現(xiàn)其他靶目標(biāo)(表III)(SEQ ID NO4-7)，特別是在tat序列和psi包裝區(qū)(HIV-1 SF2)636 GUGGC GCCCG AACAG GGACGCGAAA GCGAA AGUAG AACCA GAGGA GCUCU CUCGACGCAG GACUC GGCUU GCUGA AGCGC GCACA GCAAGAGGCG AGGGG CGGCG ACUGG UGAGU ACGCC AAUUUUUGAC UAGCG GAGGC UAGAA GGAGA GAGAG AUGGGUGCGA GAGCG 805內(nèi)，或表III。這里所用的特異性核酶序列是Rz-2，Rz-M和Rz-φ?？笻IV核酶序列Rz-2(單個抗-tat)TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCRz-M(多個抗tat序列)CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAARz-φ(單個抗HIV-φ序列)GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG。
用核酶裂解HIV RNA是一種很有潛力的有用的方法。在治療學(xué)上，它有幾個重要的特征i)特異性，ii)以相對大量的潛在位點為靶的能力，iii)對細(xì)胞沒有毒性，iv)核酶分子的轉(zhuǎn)換，v)可應(yīng)用的傳遞方法的變化性和vi)潛在的不同生產(chǎn)方法a)化學(xué)合成(當(dāng)其為短分子時)，b)借助體外轉(zhuǎn)錄的生物化學(xué)方法生產(chǎn)和c)從整合的構(gòu)建體用啟動子驅(qū)動體內(nèi)生產(chǎn)。
本發(fā)明利用抗包裝位點(Psi)核酶以抑制HIV復(fù)制。該活性作用水平為A，E，F(xiàn)和G。在所述位點的切割可以對以下過程產(chǎn)生抑制作用i)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞ii)產(chǎn)生病毒RNA iii)病毒mRNA翻譯成病毒蛋白質(zhì)和iv)病毒基因組RNA包裝成病毒粒子。PSI包裝序列Psi包裝序列是對于病毒RNA特異性包裝成病毒粒子所必需的順式作用病毒基因組序列(Aronoff et al.，1991)。已經(jīng)標(biāo)明RNA包裝成病毒顆粒有高度特異性，而且這種特異性似乎是由Psi位點產(chǎn)生的。Mo-MLV和HIV-1Psi包裝位點的定位都是通過功能缺失來鑒定的，即除去特定的序列，然后觀察病毒RNA的包裝過程是否會繼續(xù)。已經(jīng)標(biāo)明，所述序列在反轉(zhuǎn)錄病毒的5’非翻譯區(qū)內(nèi)，而且在未被包裝的RNA內(nèi)沒有該序列。根據(jù)本發(fā)明，我們推斷為了使RNA像被包裝的RNA那樣容易識別，包裝序列就必須是暴露的，可接近的，而且是能夠識別的。對Mo-MLV和HIV-1Psi包裝信號的研究表明，在每種情況下都有一個保守的穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)(Alford et al.，1992和Harreson et al.，1992)。根據(jù)我們的觀點，這些特征使得Psi包裝位點成為有吸引力的核酶作用靶位點。以前用反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列的反義序列進(jìn)行的研究表明在轉(zhuǎn)基因動物中，通過用Psi序列干擾可以抑制莫洛尼氏鼠白血病病毒(mo-MLV)的復(fù)制(Han et al.，1992)。
莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo-MLV)和人免疫缺損病毒(HIV-1)Mo-MLV是一種不攜帶癌基因的鼠野生型反轉(zhuǎn)錄病毒(Teich etal.，1985)。由于插入性誘變而可導(dǎo)致小鼠患潛伏期長的白血病。我們用Mo-MLV作為用于評價抗病毒核酶效率之方法的證據(jù)的第一步。Mo-MLV是典型的反轉(zhuǎn)錄病毒，其中復(fù)制過程沿圖1所示的線路進(jìn)行，而且經(jīng)Psi包裝位點的包裝是有效的。在本發(fā)明的一個實施方案中，在組織培養(yǎng)中檢測抗Mo-MLV核酶降低病毒產(chǎn)生的能力，所述的抗-Mo-MLV核酶以Psi包裝位點為靶并被克隆在一表達(dá)載體中。
HIV-1，在獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)中的活性組分在T淋巴細(xì)胞中會導(dǎo)致細(xì)胞死亡(McCune，1991；Levy，1993)。這些細(xì)胞是引起免疫反應(yīng)的重要因素。在任何潛在的抗HIV方法中，它對于在免疫系統(tǒng)因損失了這些細(xì)胞而導(dǎo)致?lián)p傷之前實質(zhì)性地降低或抑制病毒復(fù)制是必不可少的。目前還沒有有效治愈AIDS的方法。但是，通過降低病毒滴度，期望可以減緩疾病的進(jìn)程，而且可能甚至使其得到抑制?？笻IV-包裝序列核酶的研制看起來是實質(zhì)性地抑制或甚至中止病毒產(chǎn)生的有效方法。
以前對抗HIV gag核酶的研究表明，其能夠在表達(dá)核酶的細(xì)胞中降低gag-RNA和p24的水平(Sarver et al.，1990)。已經(jīng)研究了錘頭核酶以使其在大腸桿菌中裂解HIV-1整合酶，從而阻斷整合酶蛋白質(zhì)的翻譯(Sioud et al.，1991)。研究已經(jīng)表明在HIV的U5，5’非翻譯區(qū)或tat裂解HIV-1RNA的核酶能夠保護(hù)T細(xì)胞免于HIV-1的攻擊(Dropulic et al.，1992，Ojwang et al.，1992，Lo et al.，1992，和Weerasinghe et al.，1991)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，抗HIV核酶以Psi包裝位點為靶，而且與抗Mo-MLV構(gòu)建體一樣被克隆在同一表達(dá)載體中。同樣在組織培養(yǎng)中檢測這些構(gòu)建體降低病毒產(chǎn)生的能力。表達(dá)構(gòu)建體的傳遞將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入靶細(xì)胞的主要方法是包括電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)的和反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)染方法。定義如本文所用的“Psi包裝位點”指與病毒RNA包被成病毒粒子有關(guān)的，直接鄰接5’LTR的區(qū)域。
如本文所用的“互補(bǔ)臂”是附著于核心錘頭核酶的序列，所述序列可以與靶RNA的特定區(qū)域結(jié)合。
如本文所用的“核酶”可以是能夠裂解靶RNA的錘頭、發(fā)夾、肝炎δ、RNase P、I組內(nèi)含子或II組內(nèi)含子。錘頭核酶是Haseloff和Gerlach(Haseloff et al.，1988)的文獻(xiàn)以及隨后許多實驗室文章的主題。描述本發(fā)明涉及病毒性疾病，特別是AIDS的治療，在所述的疾病中致病因子以RNA為其基因組物質(zhì)，而且將所述RNA包裝到病毒粒子中。所述方法通過破壞在Psi包裝位點的病毒RNA，包裝病毒基因組RNA所必需的識別序列來抑制病毒的復(fù)制。在所述位點的切割有下列抑制作用i)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞以及隨后的原病毒整合到宿主基因組中，ii)病毒RNA的產(chǎn)生，iii)病毒mRNA翻譯成病毒蛋白質(zhì)和iv)病毒基因組RNA包裝成病毒粒子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供含有所需核苷酸序列的特定表達(dá)構(gòu)建體。在優(yōu)選的表達(dá)構(gòu)建體中，提供了核酸表達(dá)構(gòu)建體，當(dāng)核酶表達(dá)構(gòu)建體被導(dǎo)入到細(xì)胞(可以是Mo-MLV或HIV-1感染的細(xì)胞)中后，所述的核酶表達(dá)構(gòu)建體由于核酶周圍的互補(bǔ)臂，而可以指導(dǎo)能夠與Mo-MLV或HIV-1RNA結(jié)合的RNA的轉(zhuǎn)錄。這些互補(bǔ)臂較短，存在于切割RNA的核酶序列中，由此干擾RNA分子的作用。
已經(jīng)以數(shù)種方法實驗了本發(fā)明。一組實驗表明核酶介導(dǎo)的體外Mo-MLV病毒Psi包裝序列的裂解與體內(nèi)Mo-MLV復(fù)制的抑制有直接的關(guān)系。為得出該結(jié)論用了下列三個主要步驟i)說明核酶介導(dǎo)的體外裂解。ii)含所述核酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到Mo-MLV感染的細(xì)胞。iii)用各種檢測來表明a)構(gòu)建體的整合，b)核酶構(gòu)建體表達(dá)，c)核酶構(gòu)建體對病毒復(fù)制水平的影響。
對于HIV，相似的步驟如下i)設(shè)計并構(gòu)建核酶構(gòu)建體。ii)將含核酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到人T淋巴細(xì)胞系中。iii)用各種檢測來表明a)構(gòu)建體的整合，b)核酶構(gòu)建體的表達(dá)，c)核酶構(gòu)建體對病毒復(fù)制水平的影響。
本發(fā)明作為病毒抑制劑以i)通過在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞時切去病毒RNA來抑制病毒進(jìn)入未感染的細(xì)胞，以及ii)降低受感染細(xì)胞排出的功能病毒的水平。在兩種情況下，它都可以切割病毒RNA，第一種情況下是在進(jìn)入點，在第二種情況下是在排出點。在后一種情況下，切割病毒和mRNA均會降低RNA水平。在Psi包裝位點的特異性切割也會抑制病毒RNA的包裝。
為了選擇抗病毒核酶作用的靶位置，使用了幾個標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明所用的標(biāo)準(zhǔn)如下i)靶位置必須是有重要功能的。ii)在不同HIV-1分離物靶區(qū)域中，必須有高度的序列保守性。iii)如果是錘頭核酶，核酶靶序列(如GUC或GUA)優(yōu)選的是存在于所述序列或有關(guān)的三聯(lián)體GUU，CUC等之中。(Perriman，et al.，1992)iv)靶序列應(yīng)該是容易接近的，例如它應(yīng)該沒有大范圍的二級結(jié)構(gòu)(Rossi et al.，1992)。
Psi包裝位點符合上述標(biāo)準(zhǔn)，因此將其選為核酶裂解的靶，該位點有i)在反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制循環(huán)中有必不可少的功能，ii)相對的易接近性，作為RNA上的位點，它必須要能夠被識別并且易于其他組分接近以便進(jìn)行包裝，和iii)相同病毒不同毒株之間的保守性。
已經(jīng)觀察到在Mo-MLV和HIV的不同毒株中，在各病毒的Psi包裝區(qū)中，在序列和結(jié)構(gòu)上有強(qiáng)的保守性。而在HIV和Mo-MLV包裝位點之間的結(jié)構(gòu)或序列方面，沒有明顯的保守性，由于在各病毒中的Psi位點有相同的功能，有理由推測必須有相似性。檢測病毒RNA的二級結(jié)構(gòu)，選擇核酶作用時易于接近的Psi序列上的位點。它們位于環(huán)區(qū)，即RNA的單鏈未配對的堿基區(qū)。用Zuker的FOLDRNA程序確定Psi包裝序列非堿基配對的區(qū)域。設(shè)計以這些位點為靶的核酶。所選的位點還有GUC堿基序列。
本發(fā)明所用的構(gòu)建體應(yīng)用了插入到新霉素抗性基因(neor)的3’非翻譯區(qū)的核酶?；緲?gòu)建體如圖4所示。所述構(gòu)建體可以對整合和表達(dá)進(jìn)行評價。用Southern分析確定前者，用對G418毒性的細(xì)胞抗性和RNase保護(hù)性測定確定后者。所使用的設(shè)計的其他優(yōu)點在于在較大neor基因信使的3’末端帶有小核酶序列的嵌合RNA可以使核酶穩(wěn)定地保持在細(xì)胞內(nèi)。后一點是極為重要的，因為沒有穩(wěn)定性，核酶的作用就會最小。討論本發(fā)明提供了一種方法的基礎(chǔ)，所述的方法利用核酶保護(hù)動物，包括人，免于由反轉(zhuǎn)錄病毒引起的疾病。本發(fā)明的基本原理是在較大的基因內(nèi)摻入針對反轉(zhuǎn)錄病毒包裝位點的核酶。載體基因可以是選擇性(如本發(fā)明所用的)或非選擇性的。較大載體基因的表達(dá)提供了更穩(wěn)定的嵌合核酶RNA分子。將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到天然細(xì)胞群體中以保護(hù)所述細(xì)胞或者將其導(dǎo)入到病毒感染的細(xì)胞群體中以降低病毒滴度。在另一個實施方案中，可以借助反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入核酶表達(dá)構(gòu)建體以提高導(dǎo)入的效率。本發(fā)明的第三種實施方案是攜帶抗包裝位點核酶的反轉(zhuǎn)錄病毒。如果反轉(zhuǎn)錄病毒載體是以MoMLV為基礎(chǔ)的，那么由于兩種反轉(zhuǎn)錄病毒的序列差異，以HIV的包裝位點為靶的核酶將不會裂解MoMLV包裝位點。
治療學(xué)上的應(yīng)用可能涉及將所述構(gòu)建體經(jīng)間接體內(nèi)導(dǎo)入T淋巴細(xì)胞或經(jīng)間接體內(nèi)導(dǎo)入到造血干細(xì)胞。一種優(yōu)選的方法是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如兩親(amphotropic)的Mo-MLV將核酶構(gòu)建體摻入到淋巴細(xì)胞或干細(xì)胞中。造血祖細(xì)胞和真干細(xì)胞是基因治療中有希望的靶，因為它們存在于骨髓中或可移動到外周血中。祖細(xì)胞可以產(chǎn)生髓樣和淋巴樣細(xì)胞，真干細(xì)胞產(chǎn)生所有細(xì)胞譜系的細(xì)胞。治療可包括輻射療法以破壞HIV感染的造血系統(tǒng)，然后將含核酶的干細(xì)胞注射到患者中。結(jié)果給患者的細(xì)胞提供了HIV抗性。
本發(fā)明還涉及由RNA或DNA或其結(jié)合物組成的轉(zhuǎn)移載體，所述RNA或DNA或其結(jié)合物含有在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生上述化合物的核苷酸序列。轉(zhuǎn)移載體可以是HIV長末端重復(fù)序列，腺病毒相關(guān)的轉(zhuǎn)移載體，SV40啟動子，Mo-MLV或兩性反轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述轉(zhuǎn)移載體還含有指導(dǎo)所述核苷酸化合物到體內(nèi)特定器官或細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)域的序列。定位到細(xì)胞特定區(qū)域的實例包括使用包裝信號(Sullenger et al，1993)。本發(fā)明還涉及在適宜的載體中含有上述化合物或轉(zhuǎn)移載體的組合物。所述載體可以是藥物學(xué)，獸醫(yī)學(xué)或農(nóng)業(yè)上可接受的載體或賦形劑。所述組合物還含有TAR引誘劑，polyTAR或RRE引誘劑。
為了在原核或真核宿主中生產(chǎn)本發(fā)明的DNA序列，本發(fā)明的啟動子序列可以是原核的，真核的或病毒的。適宜的啟動子是可誘導(dǎo)的，可阻遏的或更優(yōu)選的是組成型的。適宜的原核啟動子的實例包括能夠識別T4聚合酶的啟動子(Malik，S.et al.，J.Molec.Biol.195471-480(1987)Hu，M.et al.，Gene 4221-30(1986)，T3，Sp6，andT7(Chamberlin，M.，et al.，Nature 228227-231(1970)；Bailey，J.N.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)802814-2818(1983)；Davanloo，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)812035-2039(1984))；λ噬菌體的PR和PL啟動子(The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.，Ed.，Cold SpringHarbor press，Cold Spring Harbor，NY(1973)；Lambda II，Hendrix，R.W.，Ed.，Cold Spring Harbor press，Cold Spring Harbor，NY(1980)；大腸桿菌的trp，recA，熱休克和lacZ啟動子；λ噬菌體的int啟動子；pBR322 β-內(nèi)酰胺酶基基因的bla啟動子和pPR325氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子等。原核啟動子的綜述見Glick，B.R.，(J.Ind.Microbiol.，1277-282(1987))；Cenztiempo，Y.(Biochimie 68505-516(1986))；Watson，J.D.et al.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982))；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，s.，Cell 31；355-365(1982))；SV40早期啟動子)Benosist，C.，et al.，Nature(London)290304-310(1981)和酵母ga14基因啟動子(Johnston，S.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)796971-6975(1982)；Silver P.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)815951-5955(1984))。
如上所述，為了制備用于抑制反轉(zhuǎn)錄病毒感染的載體，在敏感的真核細(xì)胞或完整動物中，必須使用真核啟動子。優(yōu)選的啟動子和附加的調(diào)節(jié)元件，例如多聚腺苷酸信號，是在抑制反轉(zhuǎn)錄病毒感染的細(xì)胞類型中產(chǎn)生最大表達(dá)的那些。因此，例如，HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HTLV-2以及莫洛尼氏鼠白血病病毒，所有感染的淋巴樣細(xì)胞，并且為了有效地單獨(dú)表達(dá)核酶構(gòu)建體或有效地表達(dá)核酶構(gòu)建體和與這些病毒之一(或多個)的包裝序列互補(bǔ)的反義RNA的結(jié)合物，選擇在造血，特別是淋巴樣細(xì)胞(或組織)中能夠提供有效表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制單位(啟動子和多聚腺苷酸信號)。如下文所舉證的，優(yōu)選的啟動子是巨細(xì)胞病毒即早期的啟動子(32)，可選地與生長激素多聚腺苷酸信號(33)結(jié)合使用，莫洛尼氏-MuLV LTR啟動子，與淋巴細(xì)胞趨性的反轉(zhuǎn)錄病毒一起使用。CMV啟動子在淋巴細(xì)胞中表達(dá)。其它的啟動子包括VA1和tRNA啟動子。金屬硫蛋白啟動子有可誘導(dǎo)性的優(yōu)點。SV40早期啟動子在體外骨髓細(xì)胞中高水平的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述化合物的方法，包括步驟(a)將由DNA，RNA或其結(jié)合物組成的轉(zhuǎn)移載體與相應(yīng)于所述化合物的核苷酸序列相連；(b)用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄步驟(a)的核苷酸序列；和(c)回收所述化合物。
本發(fā)明還涉及含有核苷酸序列的原核或真核宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列是或在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生上述的化合物。所述細(xì)胞可以是動物細(xì)胞，產(chǎn)生所有造血細(xì)胞譜系中祖細(xì)胞更成熟的和完全成熟的細(xì)胞的造血干細(xì)胞，產(chǎn)生所有造血細(xì)胞譜系的成熟細(xì)胞的祖細(xì)胞，產(chǎn)生特定造血譜系的定型祖細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞，不成熟的T淋巴細(xì)胞，成熟的T淋巴細(xì)胞，髓樣祖細(xì)胞，或單核/巨噬細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及利用上述化合物保護(hù)造血干細(xì)胞，祖細(xì)胞，定型祖細(xì)胞，T淋巴祖細(xì)胞，未成熟的T淋巴細(xì)胞，成熟的T淋巴細(xì)胞，髓樣祖細(xì)胞，或單核/巨噬細(xì)胞。此外，還涉及抑制/治療或保護(hù)患者抗HIV的方法，包括將上述轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入造血細(xì)胞，由此使細(xì)胞具有HIV抗性，從而針對HIV產(chǎn)生抑制/治療或保護(hù)作用。導(dǎo)入是經(jīng)間接體內(nèi)進(jìn)行的，細(xì)胞是有或未骨髓抑制(myeloablation)的自體的或異源細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，設(shè)計三個單一和一個多錘頭核酶以便以Mo-MLV Psi包裝位點內(nèi)的不同位點為靶，同時設(shè)計一種以HIV Psi包裝位點內(nèi)的位點為靶的核酶(見圖2)。選擇Mo-MLV為反轉(zhuǎn)錄病毒的實例以確定其中的作用原理。這些原理可應(yīng)用于包括HIV的其他反轉(zhuǎn)錄病毒。也進(jìn)行了HIV-1的檢測。
在本發(fā)明中，非人動物和其子代含有至少一些表達(dá)或保持非天然存在的寡核苷酸化合物的細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因的非人動物的所有生殖和體細(xì)胞含有在如美國專利4,736,866，5,175,383，5,175,384，或5,175,385中所述，在胚胎階段導(dǎo)入到所述動物或其前代中的，可表達(dá)形式的非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物。另參見Vanbrunt，1988；Hammer，1985；gordon et al.，1987；Pittius et al.，1988；Simons et al.，1987；simons et al.，1988。
本發(fā)明還包括使細(xì)胞獲得對病毒感染的抗性的方法，包括用上述非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物處理細(xì)胞。優(yōu)選的，進(jìn)行間接體內(nèi)處理。除本文所用的外，術(shù)語反義序列和核酶還包括帶有修飾的核苷酸，脫氧核苷酸，肽，核酸等的化合物?？蓪⑵溆糜陂g接體內(nèi)處理或局部處理。
本發(fā)明非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物的有效量在例如用于局部應(yīng)用的乳膏,無菌可注射組合物或腸外施用的其他組合物的劑型中通常為1nM-1mM濃度。從局部配方來看，通常優(yōu)選的是施用約50μM-500μM的非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物。含有核苷酸衍生物的化合物在納摩爾濃度可以是有活性的，所述衍生物可以是化學(xué)修飾的基團(tuán)，例如偶磷硫代酸化物(phosphorothioate)或甲基膦酸化物(methyl phosphonate)衍生物。也可以施用所述濃度以避免毒性。
利用本發(fā)明的化合物進(jìn)行疾病治療的治療策略總的來講與用反義方法，例如在Chrisley.1991的反義目錄中所描述的相同。特別是，使用的化合物的濃度，施用的方法和方式，以及所用的配方可以與用于反義應(yīng)用時的那些相同。
本發(fā)明所用的“有效量”指在有特定的疾病和施藥方案的哺乳動物中提供所需效果的量。用于治療的是含有有效量以及適宜的稀釋劑，防腐劑，增溶劑，乳化劑，助劑和/或載體的組合物。所述組合物是液體或凍干的或其他干燥的配方，并包括各種緩沖成分(例如，Tris-HCl，乙酸鹽磷酸鹽)，pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑，防止吸附到表面上的添加劑，例如白蛋白或明膠，洗滌劑(例如吐溫20，吐溫80，Pluronic F68，膽酸鹽)，增溶劑(例如，Thimerosal，苯基醇)，填充物質(zhì)或張力改性劑(例如，乳糖，甘露醇)，聚合物例如聚乙二醇共價附著到所述非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物的表面，與金屬離子的復(fù)合物或?qū)Ⅳ人嵛镔|(zhì)摻入于或摻上于聚合化合物，例如聚乳酸，聚乙醇酸，聚丙烯吡咯烷酮顆粒制品等，或摻入到脂質(zhì)體，微乳劑，膠團(tuán)，單片層或多片層泡囊，紅細(xì)胞影或原生質(zhì)球。所述組合物將影響所述寡核苷酸的生理狀態(tài)，溶解性，穩(wěn)定性，體內(nèi)釋放率，和體內(nèi)清除率?？蛇x擇地加入其他成分，例如抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)的多肽，即多聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇?？删徛尫诺慕M合物包括親脂的貯存物(如脂肪酸，蠟，油)的配方。本發(fā)明還包括用聚合物(例如polyoxamer或polyoxamines)包被的顆粒組合物以及與抗組織特異性受體，配體或抗原的抗體結(jié)合的或與組織特異性受體的配體結(jié)合的非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物。此外，可以將特異性的核苷酸序列加到以核，質(zhì)體，胞質(zhì)或特定的細(xì)胞類型為靶的本發(fā)明的非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物中。本發(fā)明組合物的其他實施方案包括摻入用于各種施用途徑，包括經(jīng)腸外，肺，鼻和口的保護(hù)性包被，蛋白酶抑制劑或滲透增強(qiáng)劑而形成的顆粒形式。
適宜的局部配方包括凝膠，乳劑，溶液，乳液，碳水化合物聚合物，其生物可降解基質(zhì)；氣霧，氣溶膠或其他吸入劑。可以用薄膜，蠟，膠片或固體載體，包括口香糖，將所述非天然產(chǎn)生的寡核苷酸化合物封入膠囊中。為加強(qiáng)跨越上皮層的運(yùn)輸活力而使用的滲透增強(qiáng)劑是本領(lǐng)域已知，包括，單不限于二甲硫砜和甘油。
核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸衍生物或修飾物是本領(lǐng)域熟知的，而且可以與市售的DNA合成儀兼容。(見Saenger，1984，pp159-200)。核苷酸含有堿基，糖和單磷酸基團(tuán)。因此，在堿基，糖或單磷酸水平可以制備核苷酸衍生物，取代物或修飾物。
在自然界發(fā)現(xiàn)了大量的修飾的堿基，而且用合成的方法生產(chǎn)了其中許多的修飾的堿基(Saenger，1984；and CRC Handbook ofBiochemistry)。適宜的堿基包括肌苷，5’-甲基胞嘧啶，5’-溴尿嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤和其他類似的堿基。例如氨基和環(huán)氮可以被烷基化，例如環(huán)氮原子或碳原子，如鳥嘌呤N1和N7以及胞嘧啶C5烷基化；用硫代酮基取代酮；C＝C雙鍵的飽和，在假尿苷中C-糖基鍵的摻入。硫代酮衍生物的實例是6-巰基嘌呤和6-巰基鳥嘌呤。
可以用各種基團(tuán)，例如鹵素，羥基，胺基，烷基，疊氮基，硝基，苯基等取代堿基?？梢杂闷渌瘜W(xué)物，例如可以或不可摻入其他化學(xué)獨(dú)立體，如酸或堿性基團(tuán)的氨基酸側(cè)鏈或接頭取代堿基。例如可以用酪氨酸取代鳥嘌呤(G3)，相似地用組氨酸取代胞嘧啶(C1)或腺嘌呤(A11)。
可以用本領(lǐng)域熟知的方法修飾核苷酸的糖部分(Saenger，1984)。本發(fā)明修飾的糖的實例包括用鹵素，氨基或疊氮基取代二級羥基；2’-甲基化；構(gòu)型變異體，例如O2-羥基被順向成糖基C1’-N鍵以得到阿糖核苷，以及在C1’的構(gòu)型異構(gòu)體以得到α-核苷等。此外可以使用非核糖糖，例如六碳糖，如葡萄糖，五碳糖，如阿拉伯糖。
也可以用本領(lǐng)域熟知的方法對核苷酸的磷酸部分進(jìn)行衍生化或修飾。例如，用氮，硫或碳衍生物取代氧以分別得到氨基磷酸酯，偶磷硫代酸酯(phosphorothioates)，磷酸二硫代酸酯(phosphodithiolates)和膦酸酯。在橋鍵或非橋鍵的位置用碳衍生物的氮，硫取代氧。已經(jīng)從有關(guān)反義寡核苷酸的研究中確定磷酸二酯鍵和硫代磷酸衍生物可以有效地進(jìn)入細(xì)胞(特別是長度較短時)，可能是由于與細(xì)胞受體有關(guān)。利用其電中性，細(xì)胞可能很容易攝取甲基膦酸酯。
用肽核酸可以完全取代磷酸部分(見Hanvey et al.，1992；Nielson1991；and Egholm，1992)。其他取代是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的例如硅氧烷鍵，碳酸鹽橋鍵，acetamidate橋鍵，氨甲酸酯橋鍵，硫代醚橋鍵等(Uhlmann and Peymann，1990)。
下列實施例是為了說明本發(fā)明要求的范圍。將在下列實驗的詳細(xì)描述部分說明本發(fā)明。列出這些部分是為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，而不是，而且應(yīng)該不構(gòu)成以任何方式對此后權(quán)利要求所要求的本發(fā)明的限制。實施例1體外經(jīng)核酶催化裂解Mo-MLV Psi包裝序列為了表明靶位點確實是可裂解的，檢測核酶前，在細(xì)胞培養(yǎng)液中完成體外裂解反應(yīng)。
根據(jù)GUC堿基的存在以及從Zuker的FOLDRNA程序(Zukeret al.，1981)所建議的RNA二級結(jié)構(gòu)內(nèi)潛在的位點易接近性，在Mo-MLV包裝區(qū)選擇了四個位點。根據(jù)距病毒轉(zhuǎn)錄物5’末端的核苷酸距離，將這些位點命名為243,274,366和553(見圖2)。在RNA腫瘤病毒中描述了這些核苷酸位置(Coffin，1985)。設(shè)計了兩種類型的核酶具有12個核苷酸的臂長范圍的分別以位點243，274和366為靶的三個單核酶，以及以所有四個位點為靶的一個多核酶，該核酶帶有在各靶位點之間的序列長度的間接臂。所述位點和總設(shè)計示于圖2。
通過將含伸出Pst I和EcoR I末端的人工雙鏈插入段克隆到pGEB3Zf(+)中而構(gòu)建單核酶。所得的質(zhì)粒是pGEM243，pGEM274和pGEM366。通過標(biāo)準(zhǔn)體外誘變方法的變通法構(gòu)建多核酶(Warrilow et al.，1992)。該質(zhì)粒稱為pGEM-M7。用DNA測序確定成功的克隆和序列完整性。
將在得自pMLV-1(Coffin，1985)的Mo-MLV的BalI-BalI片段的Psi包裝序列克隆到pGEM3Zf(+)載體中，然后轉(zhuǎn)錄為體外核酶裂解的底物。為產(chǎn)生核酶或底物的轉(zhuǎn)錄混合物(50μl)含1μg線性化的蛋白酶K處理的DNA模板，30mM二硫蘇糖醇，各400μM的rNTP，40mM Tris-Cl，pH8.0，2mM亞精胺，6mMMgCl2，50mM NaCl，1μl[α-32P]-UTP(400-800Ci/mmole，10mCi/ml)，1單位RNasin和10單位T7或SP6 RNA聚合酶(Stratagene)。于37℃保溫1小時后，加入10單位的無RNase的DNase(Promega)，然后將混合物在37℃保溫15分鐘。酚-氯仿抽提后，加入0.1體積的3M乙酸鈉和2.5體積的乙醇沉淀RNA轉(zhuǎn)錄物。為了進(jìn)行裂解反應(yīng)，將核酶和底物(1∶1摩爾比)在80℃預(yù)保溫2分鐘，然后于37℃，在50mM Tris-Cl，pH7.5和10mM MgCl2存在的條件下，保溫30分鐘。加入等體積的終止混合物(8M脲，50mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)和0.05％二甲苯苯胺)使反應(yīng)終止，然后在含8M脲的變性6％聚丙烯酰胺凝膠上分析，然后放射自顯影。
結(jié)果表明以Mo-MLV原病毒包裝序列的不同位點為靶的工程核酶在所選擇的位點體外裂解了靶RNA。
對于大多數(shù)核酶構(gòu)建體，將32P-標(biāo)記的Psi轉(zhuǎn)錄物與32P-標(biāo)記的核酶RNA以近似等摩爾的量一起保溫可以導(dǎo)致在緩和的生理條件下(37℃，10mM MgCl2和50mM Tris-Cl，pH7.5)有效地裂解底物。在圖6中列出了這些消化性裂解的代表性實例。由Rz274和Rz366產(chǎn)生的裂解后的Psi片段的大小與預(yù)測的裂解位點的位置一致，得到分別為62nt+473nt和154nt+381nt的帶。正如預(yù)測的，多核酶(Rz-M7)產(chǎn)生四個片段(50nt，92nt，187nt和240nt)以及數(shù)個部分裂解的片段(圖3)。對于Rz243，在37℃沒有肉眼可見的裂解，在50℃沒有產(chǎn)生適宜大小的片段的弱裂解(數(shù)據(jù)未列出)。除核酶243外，這些結(jié)果表明了有效的位點特異性核酶介導(dǎo)的裂解。實施例2抗Mo-MLV包裝位點(Psi)構(gòu)建體在表現(xiàn)出有效的體外裂解后，工程核酶以及與Psi包裝區(qū)互補(bǔ)的長反義序列被克隆到與猴病毒40(SV40)早期啟動子結(jié)合的neor基因的3’非翻譯區(qū)(圖4)。neor是編碼磷酸化酶的原核基因，并由此使新霉素或新霉素類似物G418失活。后者對于哺乳動物細(xì)胞是有毒性的，外源neor基因的表達(dá)可以使細(xì)胞存活。帶有與neor基因結(jié)合的SV40啟動子的構(gòu)建體在哺乳動物表達(dá)載體pSV2neo內(nèi)并圖示于圖4中。
將核酶插入序列和反義對照經(jīng)平末端連接克隆到neor3’非翻譯區(qū)的Sma I位點。所得的載體分別稱為pSV243，pSV274，pSV366，pSVM7和pSVas Psi(反義構(gòu)建體)。實施例3將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到產(chǎn)生3T3-Mo-MLV細(xì)胞系中用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法(Chen et al.，1987)將各種pSV2neo為基礎(chǔ)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到3T3-Mo-MLV細(xì)胞中。陽性菌落是在存在500μg/ml G418的條件下生長了9-12天后形成的那些。對每個構(gòu)建體，用克隆柱(cloning cylinder)分離4-7個菌落。培養(yǎng)這些菌落，貯存于液氮中，然后用于進(jìn)一步的檢測。在500μg/ml G418中篩選了10-14天后，為每個構(gòu)建體建立數(shù)個穩(wěn)定的克隆細(xì)胞系。為了確定轉(zhuǎn)染的DNA表達(dá)構(gòu)建體的整合情況，從特定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系制備基因組DNA，然后進(jìn)行Southern分析。用限制酶HindIII和NruI消化基因組DNA以產(chǎn)生含neor加插入片段(核酶或反義序列)的片段。然后用neor特異性探針確定所述構(gòu)建體的存在。從圖7的Southern分析清楚地表明，用核酶和反義構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的并用G418篩選的細(xì)胞含有neor基因加上適宜的核酶或反義序列。已發(fā)現(xiàn)與neor探針雜交的HindIII-NruI片段的大小在不同情況下均與預(yù)期的一致，只有neor基因時，為1.3kb；neor加單核酶時，為1.38kb；neor加多核酶時，為1.98kb；neor加反義序列時，為1.89kb。
由于存在陽性轉(zhuǎn)染子中的G418抗性，所以預(yù)測了核酶或反義構(gòu)建體的表達(dá)。這一點用RNase保護(hù)作用測定法在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)一步檢測。用硫氰酸胍法，從特定的細(xì)胞系中提取總RNA，然后在含80％去離子甲酰胺，100mM檸檬酸鈉pH6.4，300mM乙酸鈉pH6.4，1mM EDTA的溶液中，用相應(yīng)的32P-標(biāo)記的核糖探針(5×104cpm)雜交20ug/ml的總RNA，然后用RNase消化雜交的RNA(5μg/ml Rnase A和10單位/ml RNaseTl)。如果未表達(dá)核酶，則互補(bǔ)的核糖探針就不能結(jié)合。RNA保持單鏈，并完全被RNase消化。然后用電泳分離反應(yīng)混合物。如圖8所示，檢測表明，所有的核酶和反義構(gòu)建體均如預(yù)期的那樣得到表達(dá)。受保護(hù)的片段是65bp(單核酶)；588bp(多核酶)和524bp(反義)。實施例4構(gòu)建體抑制Mo-MLV復(fù)制的能力在建立了用不同構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定3T3Mo-MLV克隆細(xì)胞系后，用XC噬菌斑實驗評價Mo-MLV復(fù)制的水平。XC實驗是Mo-MLV的syncitial噬菌斑實驗，它是以觀察到產(chǎn)生Mo-MLV的細(xì)胞可以導(dǎo)致XC細(xì)胞融合為基礎(chǔ)。按Gautsch等人(1976)所述滴定Mo-MLV，除在感染過程中有8ug/ml聚凝胺(Sigma)存在以增強(qiáng)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合外。將來自不同Mo-MLV產(chǎn)生細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液加到未感染的小鼠NIH3T3細(xì)胞中，所述細(xì)胞在感染前用8ug/ml聚凝胺預(yù)處理了1小時。在生長培養(yǎng)基中保溫20小時后，在2×2mm2的柵格平皿中將能夠受到感染的NIH3T3細(xì)胞與XC細(xì)胞共培養(yǎng)3-4天。然后用甲醇固定所述平皿，用1％亞甲蘭加0.1％龍膽紫染色，然后用顯微鏡對syncitium噬菌斑進(jìn)行掃描。為了確保檢測在劑量-反應(yīng)曲線的線性部分內(nèi)完成，用2倍的病毒系列稀釋液感染3.5×105細(xì)胞/平皿，傳代24小時后與XC細(xì)胞混合培養(yǎng)。表1中的結(jié)果來自三個獨(dú)立的實驗。相對于含pSVneo載體的細(xì)胞，在含Rz274，Rz366，Rz-M7和As-Psi的細(xì)胞中觀察到對syncitium噬菌斑形成有74％-77％的抑制作用，而在含Rz243的細(xì)胞中沒有明顯的抑制作用。這些數(shù)據(jù)與體外裂解結(jié)果(圖6)一致，在體外裂解中Rz243在所用的條件下，也沒有有效地裂解底物。
用病毒RNA點印跡確定這些抑制作用，其中通過在微離心管中離心16小時(12,000rpm，10分鐘，4℃)澄清1ml的生產(chǎn)NIH3T3病毒細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液。用8％PEG 8000和0.5M NaCl沉淀病毒RNA。酚-氯仿抽提后，在堿性轉(zhuǎn)移溶液中將RNA印跡到帶正電荷的尼龍膜(zetaOProbe，Bio-Rad)上(Reed et al.，1985)。在50％甲酰胺，5×SSPE，5×Denhardt溶液，0.5％SDS，100mg/ml變性的鯡魚精子DNA和從pGEM-Psi的T7啟動子轉(zhuǎn)錄的32P-標(biāo)記的核糖探針中，于42℃過夜完成雜交。通過點閃爍計數(shù)確定病毒RNA的量。測量在來自核酶或反義序列轉(zhuǎn)染的3T3-Mo-MLV細(xì)胞上清液中的病毒RNA，然后與來自pSVneo轉(zhuǎn)染的3T3-Mo-MLV細(xì)胞上清液的進(jìn)行比較。正如從圖9和表2中可看到的(除表達(dá)Rz243的細(xì)胞外)，從表達(dá)核酶或反義序列的所有細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒RNA的量與在合胞體實驗中見到的實質(zhì)上降低的量相似。
在將這些核酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到Mo-MLV感染的細(xì)胞中后，只有表現(xiàn)出有效體外裂解的那些核酶有體內(nèi)抑制Mo-MLV復(fù)制的能力(約70-80％)。這些結(jié)果說明在體外裂解和體內(nèi)核酶介導(dǎo)的病毒抑制之間有直接的關(guān)系。
前面的實驗成為進(jìn)一步研究以HIV Psi包裝序列為靶的核酶以便降低病毒滴度的基礎(chǔ)。表1.從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中釋放的由Mo-MLV誘導(dǎo)的合胞體噬菌斑細(xì)胞*合胞體噬菌斑φ抑制作用(％)Rz24332±12-Rz274 7±3 77Rz366 8±1 74Rz-M7 7±3 77As-Psi8±2 74pSV2neo 31±10*在NIH3T3細(xì)胞的感染中使用10-2稀釋的、來自含Rz或As構(gòu)建體細(xì)胞的上清液。φ數(shù)據(jù)是在三個獨(dú)立的實驗中來自每個構(gòu)建體的兩個克隆系的噬菌斑計數(shù)的平均值。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。有相同感染細(xì)胞稀釋度的復(fù)制平皿一般含有相似數(shù)目的合胞體噬菌斑。表2.與病毒RNA點印跡的雜交程度樣品cpm×10-3*抑制作用(％)tRNA 0.00 -Rz2432.59 21Rz2740.63 81Rz3661.36 59Rz-M70.93 72As-φ 0.96 71pSV2neo 3.30 0*cpm計數(shù)得自以1∶1稀釋的兩個印跡。按材料和方法中的描述完成病毒RNA點印跡。在放射自顯影后，切下對應(yīng)于各點的濾紙以便進(jìn)行液體閃爍計數(shù)。實施例5抗HIV包裝位點構(gòu)建體在HIV-1(HIVSF2，Levy，1984)Psi包裝區(qū)(從HIV基因組5’端核苷酸735-765)選擇一個GUA位點用于核酶攻擊。象前面的構(gòu)建體一樣，通過平末端連接，將合成的核酶插入序列克隆到pSV2neo載體neor基因的3’非翻譯區(qū)的Sma I位點。用DNA測序確定克隆是否成功以及序列的完整性。將所述構(gòu)建體稱為pSV-Rz-HIV-Psi。圖4是所述構(gòu)建體的圖示。實施例6將pSV-Rz-HIV-Psi構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到T淋巴細(xì)胞中將抗HIV包裝位點構(gòu)建體pSV-Rz-HIV-Psi電穿孔到Sup T-1細(xì)胞〔一種人T淋巴瘤細(xì)胞系〕中。收集對數(shù)生長細(xì)胞，然后，用染料排除法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。用PBS洗滌細(xì)胞，然后以在不含F(xiàn)CS，但含10mM葡聚糖和0.1mM二硫蘇糖醇的RPMI培養(yǎng)基中以1×107活細(xì)胞/ml的密度重懸。在0.4cm杯(Bio-Rad)中，每次電穿孔用0.4ml細(xì)胞懸浮液和10μg pSV-Rz-HIV-Psi質(zhì)粒DNA。使細(xì)胞和DNA混合物經(jīng)Gene Pulser(Bio-Rad)的960μF，200V的單脈沖。電擊后，在室溫將所述杯保溫10分鐘，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml含10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中，并放在保溫箱(5％CO2，37℃)中。電穿孔后48小時，在用800μg/ml G418補(bǔ)充的培養(yǎng)基中篩選細(xì)胞。9-12天后，分離陽性菌落并培養(yǎng)之，作為用于HIV保護(hù)實驗的克隆分離物。實施例7評價核酶表達(dá)構(gòu)建體賦予抗HIV攻擊的保護(hù)的能力完成兩個檢測p24抗原和合胞體形成的實驗以評價抗HIV Psi核酶構(gòu)建體在細(xì)胞培養(yǎng)中的功效。HIV-1 p24抗原檢測是酶免疫檢測，使用包被到微孔帶上的抗HIV核心抗原的鼠單克隆抗體。HIV-1合胞體測定是以觀察到HIV-1與靶T淋巴細(xì)胞，通過引起融合，從而導(dǎo)致合胞體，含有許多核的大細(xì)胞的形成而相互作用為基礎(chǔ)。用HIV-1(SF2)以0.1-1的m.o.i.感染表達(dá)克隆核酶構(gòu)建體的細(xì)胞和對照。2小時后，洗滌細(xì)胞，加入10ml新鮮的培養(yǎng)基。每隔3-4天，計數(shù)合胞體和活細(xì)胞的數(shù)量。為了形成合胞體，需要大約高兩個數(shù)量級的劑量，以便與不包括核酶的對照表現(xiàn)出相同的結(jié)果(表3)。此外，核酶的存在使得合胞體的形成延緩(表4)。
在另一實驗方法中，沉淀細(xì)胞，取1份上清液進(jìn)行p24檢測。有代表性的結(jié)果列于圖10。在該實驗中，在攻擊后22天對p24水平還有抑制作用。在感染后8天和13天，與只含有載體的細(xì)胞相比，在表達(dá)核酶的細(xì)胞中對p24的產(chǎn)生還有80％的抑制作用，而在22天，觀察到約60％的抑制水平。
這些結(jié)果提供的證據(jù)表明，通過將抗Psi包裝位點的核酶加到T淋巴細(xì)胞中可以抑制HIV的復(fù)制。表3.合胞體的形成病毒稀釋度*克隆10-310-410-510-6Rz-2+++++-----------Rz-M++++------------Rz-Psi ++++++--+-------隨機(jī)++++++++++--+---pSV2neo ++++++++++++++--*在感染性檢測(0.1-1的m.o.i.)中用HIV-1(SF33)。表4.被感染的SupT1細(xì)胞的合胞體形成感 染 后 天數(shù)組 67891011pSV-Rz------ +HIV PsipSV2neo-+++ +++ +++ +++模擬 ----- -用四個low-powerfield計數(shù)每個培養(yǎng)中的合胞體數(shù)，-，沒有合胞體；+，1-5個合胞體；++，6-10個合胞體；+++，10以上合胞體合胞體。模擬是未感染的SupT1細(xì)胞。實施例8我們還評估了其他(除以φ為靶外)核酶構(gòu)建體的效率。意想不到的是，我們發(fā)現(xiàn)，以HIV-1的tat基因為靶的單核酶(Rz2)也能有效地抑制HIV-1復(fù)制。我們檢測了tat中該區(qū)的序列保守性，發(fā)現(xiàn)在不同HIV-1分離物中是高度保守的(見圖12)。這些是以該tat序列為HIV-1核酶靶位點的第一個實驗。文獻(xiàn)中的報道在圖13中作了注明，其中注明的tat靶位點是由其他研究者確定的位點1(Crisell et al.，1993)和位點3(Lo et al.，1992和Zhou et al.，1992)。總結(jié)用大量的重組反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，所述重組反轉(zhuǎn)錄病毒包括RRz2，一種帶有以插入到新霉素抗性基因(neor)3’區(qū)的HIV tat基因轉(zhuǎn)錄物為靶的核酶的以LNL6為基礎(chǔ)的病毒；RASH-5，一種含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)啟動子HIV-1下游的5’前導(dǎo)區(qū)反義序列的以LNHL為基礎(chǔ)的病毒；和R20TAR，一種帶有用莫洛尼氏鼠白血病病毒長末端重復(fù)序列(LTR)驅(qū)動的HIV-1 TAR序列的20個串聯(lián)拷貝的以LXSN為基礎(chǔ)的病毒。G418選擇后，用HIV-1實驗室菌株IIIB和初級臨床分離物攻擊轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL。結(jié)果表明，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)來自不同供體的PBL，而且賦予對HIV-1感染的抗性。對于每個構(gòu)建體來說，與相應(yīng)對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL相比，p24抗原水平有約70％的降低。分子分析表明了從來自反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的所有轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的組成型表達(dá)，但由反義構(gòu)建體的內(nèi)部HCMV啟動子未觀察到有可檢測的轉(zhuǎn)錄物。轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL，隨后在其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)不會損壞CD4+/CD8+(由流式細(xì)胞計數(shù)測量的)的表面表達(dá)或細(xì)胞增殖(用[3H]胸苷攝取實驗測定)。這些結(jié)果表明了這些抗HIV-1基因治療劑的潛在實用性并說明了所述PBL檢測系統(tǒng)的前臨床價值。
已經(jīng)將人免疫缺損病毒(HIV)鑒定為獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)及其相關(guān)疾病的病原因素(Barre-Sinoussi，F(xiàn).et al.1983；Gallo，R.C.et al.，1984)目前，對該疾病沒有足夠的治療方法，而利用基因操作抑制HIV復(fù)制似乎是AIDS治療的一種新的有前途的方法。干擾HIV復(fù)制的可能的基因治療方法包括利用核酶的表達(dá)催化裂解并因此使HIV RNA失活；表達(dá)反義RNA以抑制HIV RNA的反轉(zhuǎn)錄，加工和翻譯；表達(dá)帶有顯著抑制活性的突變HIV結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)基因；表達(dá)RNA引誘物以抑制HIV-1的轉(zhuǎn)錄，加工和包裝。
在迄今為止的公開報道中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被選擇用來導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因和基因治療抗HIV-1劑的傳遞方法。在人造血T淋巴細(xì)胞系，例如CEM，SupT1和MOLT-4(Sarver，N.et al.1990；weerashingee，M.et al.1991；Yu，M.et al.1993；Yamada，O.et al.1994；Rhodes，A.and James W.1991；Sczakiel，G.et al.1992；Lisziewicz，J.et al.，1991，1993；Trono，D.et al.，1989；Malim，M.H.et al.1992)中檢測了這些載體，它們有許多令人滿意的特征，包括在體外檢測中無限生長潛力，但缺點是被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此，必需檢測抗HIV基因治療劑在人初級細(xì)胞，例如外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中的效率。對于這些細(xì)胞，CD4+亞群是HIV感染的關(guān)鍵靶細(xì)胞，而且在AIDS患者中主要是該種群貧乏。然而，目前還沒有將初級PBL檢測用于抗-HIV基因治療方法的報道。
我們已經(jīng)對人PBL完成了復(fù)雜的研究以便i)檢測抗HIV劑，包括核酶，反義序列和RNA TAR引誘物，和ii)用實驗室和臨床HIV-1分離物確定PBL轉(zhuǎn)導(dǎo)，G418選擇和HIV-1攻擊的條件。這些實驗表明，用表達(dá)以HIV-1 tat基因為靶的核酶的反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體；與HIV-15’前導(dǎo)區(qū)互補(bǔ)的反義序列；或20 TAR RNA引誘物轉(zhuǎn)導(dǎo)初級PBL實質(zhì)上賦予了其對HIV感染的抗性。該檢測系統(tǒng)是在以前抗HIV反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的檢測基礎(chǔ)上的改進(jìn)，而且用于補(bǔ)充現(xiàn)有的T細(xì)胞系檢測。利用該檢測系統(tǒng)，我們已經(jīng)得到了大量與HIV基因治療有關(guān)的臨床數(shù)據(jù)。材料和方法細(xì)胞系在含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改性的Eagle氏培養(yǎng)基(DME)中培養(yǎng)包裝細(xì)胞系φ2(Mann R.et al，1983)和PA317(ATCC CRL 9078)。在HAT培養(yǎng)基中，必須每隔6星期選擇PA317細(xì)胞(5-7天)。在DME加10％牛血清(BCF)中生長φCRE和φCRIP(Danos；O.and mulligan，R.C.1988)。反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體將化學(xué)合成的以HIV-1 tat基因轉(zhuǎn)錄物(HIV-1IIIB核苷酸5865-核苷酸5882，GGAGCCAGTAGATCCTA)為靶的錘頭核酶克隆到新霉素抗性基因3’非翻譯區(qū)內(nèi)LNL6載體(Bender，M.A.et al.1987)的Sal I位點(圖15A)。將該構(gòu)建體命名為RRz2。對于反義構(gòu)建體，將含部分R，U5和gag基因5’部分(核苷酸78-628)的HXB2克隆的550bp BamH I片段以反義方向克隆到LNHL載體的BamH I位點(圖15B)，所述LNHL載體得自除去在人BamH I位點的HPRT cDNA而得到的pNHP-1載體(Yee，J.K.et al.1987)。將所得的反義構(gòu)建體稱為RASH5。通過將20TAR片段(20串聯(lián)拷貝)插入到LXSN載體(Miller A.D.et al.1989)中的XhoI和BamHI位點制得聚合-TAR構(gòu)建體，稱為R20TAR(圖15C)。用DNA測序或限制酶圖譜確定構(gòu)建體的序列完整性和方向。
兩親反轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生用涉及包裝細(xì)胞系φ2和PA317細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法生產(chǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒LNL6和RRz2。用10μg的構(gòu)建體DNA經(jīng)鈣沉淀轉(zhuǎn)染80％匯合的φ2細(xì)胞，然后在含10％FBS的DME培養(yǎng)基(DME生長培養(yǎng)基)中保溫14小時。然后除去所述培養(yǎng)基，用新鮮的DME生長培養(yǎng)基代替，于37℃，5％CO2中保溫過夜。從轉(zhuǎn)染的φ2細(xì)胞中收集外生的病毒上清液，然后在存在4μg/ml聚凝胺的條件下，用其感染在DME生長培養(yǎng)基中亞匯合(60-80％)的PA317細(xì)胞。于37℃，5％CO2保溫24小時后，將感染的PA3.7細(xì)胞胰蛋白酶化，在含750μg/ml的G418的DME生長培養(yǎng)基中分成1∶20。每隔3-4天換一次培養(yǎng)基直到菌落形成。挑取10-29個來自各構(gòu)建體的克隆，擴(kuò)展進(jìn)行病毒滴定(新霉素抗性菌落檢測)和可復(fù)制反轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)檢測(Miller A.D.andRosma，G.J.1989)。用轉(zhuǎn)染的φCRE和感染的φCRIP細(xì)胞生產(chǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒LNHL，RASH5，LXSN和R20TAR。分離各構(gòu)建體的20-96個克隆以便進(jìn)行滴定和RCR檢測。
人PBL的轉(zhuǎn)導(dǎo)用Ficoll-Hypaque梯度離心，從健康供體的leukopacks制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。按制造商的說明，用MicroCELLector Flask(Applied Immune Science)通過消耗掉CD8+而富集CD4+細(xì)胞。在用10％FBS和20單位/ml人重組白細(xì)胞介素2補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI生長培養(yǎng)基)中，用5μg/ml植物凝血素(PHA，Sigma)或10ng/ml OKT3單克隆抗體(Janssen-Cilag)將CD4+富集的PBL(5×105細(xì)胞/ml)刺激48-72小時。存在4μg/ml聚凝胺(使用0.5的m.o.i.)的條件下，通過將細(xì)胞暴露于無生產(chǎn)者細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄病毒原液18小時而轉(zhuǎn)導(dǎo)受到刺激的PBL。轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時后，在含300-500μg/ml G418的RPMI生長培養(yǎng)基中選擇PBL 10-14天。然后是在用HIV-1攻擊PBL前，在不含G418的新鮮RPMI生長培養(yǎng)基中為期一周的回收期。
HIV-1感染按文獻(xiàn)所述(Johnson，V.A.et al.1990)對人PBL確定HIV-1實驗室菌株IIIB和臨床分離物82H的感染滴度(TCID50)。在37℃，用100 TCID50 HIV病毒將5/105轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL感染2小時，然后，用RPMI-1640將細(xì)胞洗滌兩次，并將細(xì)胞重懸于5ml RPMI生長培養(yǎng)基中。每隔3-4天，取若干等份上清液進(jìn)行p24抗原ELISA(Coulter)。
RNA分析用異硫氰酸胍方法(Chirgwin，J.H.et al.1979)從轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中提取總細(xì)胞RNA。在1％瓊脂糖-甲醛凝膠上分離15μg RNA，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N)上，然后與32P-標(biāo)記的neor-特異性探針，550bp的HIV-1HXB2的BamH I片段或20TAR片段雜交，以便分別檢測neor-核酶，反義分子和TAR的表達(dá)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL的FACS分析將1×105轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL與CD4或CD8特異的異硫氰酸熒光素鹽(FITC)結(jié)合的單克隆抗體(BectonDickinson)或與對照抗體(FITC鼠IgG1，Becton Dickinson)一起于4C保溫20分鐘。用PBS洗二次后，在Becton Dickinson FACScan上分析細(xì)胞。
增生測定按上文所述轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL。用G418選擇，并在新鮮的RPMI生長培養(yǎng)基中回收后，用臺盼蘭排除法評價其生存性，然后，將細(xì)胞數(shù)調(diào)到1×106活細(xì)胞/ml。用1×106細(xì)胞接種三份孔(Cornig 24孔平板)，然后將1μ Ci6-[3H]-胸苷(5Ci/mmol，Amersham)加到各孔中。培養(yǎng)48小時后，真空條件下將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到玻璃纖維濾器中，用冰冷的磷酸緩沖的溶液洗滌三次，用3×5ml冰冷的10％三氯乙酸(w/v)沉淀。用乙醇漂洗濾器，然后進(jìn)行β-閃爍計數(shù)。用Student t-檢驗完成統(tǒng)計分析。結(jié)果產(chǎn)生含各種轉(zhuǎn)基因的高滴度兩親反轉(zhuǎn)錄病毒。以不同載體骨架為基礎(chǔ)構(gòu)建三種不同的表達(dá)轉(zhuǎn)基因的反轉(zhuǎn)錄病毒(核酶，反義或聚合TAR)。通過將抗HIV tat核酶基因插入到由LNL6載體中MoMLV長末端重復(fù)序列(LTR)驅(qū)動的neor基因的3’非翻譯區(qū)而構(gòu)建RRz2(圖15A)。期望從該反轉(zhuǎn)錄病毒得到含neor和核酶基因的嵌合RNA轉(zhuǎn)錄物。在RASH5反轉(zhuǎn)錄病毒(圖15B)中，可以從病毒LTR或內(nèi)含的人CMV啟動子轉(zhuǎn)錄反義序列。在R20TAR構(gòu)建體中，從病毒LTR表達(dá)聚合的TAR(圖15C)。使用三個反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體和相應(yīng)的對照載體，以生產(chǎn)兩親的生產(chǎn)者細(xì)胞系。按用標(biāo)準(zhǔn)方法(Miller A.D.and Rosma，G.J.et al.1989)測量的，病毒滴度為105-5×106cfu/ml。總之，在轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗中，使用＞106cfu/ml的反轉(zhuǎn)錄病毒滴度。檢測所有病毒原液并確定沒有RCR，然后貯存于-80℃。
PBL的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了優(yōu)化用于反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL的刺激，比較CD4+富集的PBL與PHA或OKT3抗體的反應(yīng)。從細(xì)胞翻倍時間，生存性和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力來看，用PHA或OKT3在培養(yǎng)物中沒有觀察到差別。在本發(fā)明的實驗中，使用OKT3抗體，因為它適用于人類。用0.5m.o.i.的兩親反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)受到刺激的PBL。以用G418選擇后存活的細(xì)胞數(shù)量為基礎(chǔ)，確定相對的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。依不同的供體血pack，總的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為2-7％。被轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL的G418選擇是PBL檢測中的關(guān)鍵步驟。為了達(dá)到完全選擇而使用兩步法。對于各批的PBL，進(jìn)行G418毒性劑量檢測，同時，將300μg/ml的基線G418濃度用于在開始7-9天中的轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL。在所述的開始期之后，將G418濃度調(diào)整到在毒性劑量實驗中確定的濃度。從所試驗的10個供體中發(fā)現(xiàn)，用105細(xì)胞/ml的開始細(xì)胞濃度，G418的毒性劑量范圍在300-500μg/ml。轉(zhuǎn)導(dǎo)并選擇后，在不合G418的新鮮培養(yǎng)基中將PBL培養(yǎng)一周。所述回收步驟對于隨后HIV-1攻擊檢測中提高細(xì)胞生存性和增加細(xì)胞數(shù)量(相對于用G418所見到的，提高3-5倍)是非常重要的。
在轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。評價核酶，反義或TAR序列在轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中的表達(dá)。圖16A-16C表示Northern分析的代表性圖譜。在RRz2和LNL6轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中(圖16A)，用neor特異性探針檢測到了剪接和未剪接的含neor-核酶或neor信使的轉(zhuǎn)錄物(3.2kb和2.4kb)。占多數(shù)的RNA是未剪接的轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)用核酶特異性探針與印跡雜交時，只有在RRz2 RNA中觀察到相同的圖譜。在RASH5轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中，用550bp探針檢測到兩個來自5’LTR的轉(zhuǎn)錄物(剪接和未剪接的)，而且具有預(yù)期的大小(4.8kb和4.0kb)(圖16B)。然而，未表達(dá)預(yù)期來自內(nèi)CMV啟動子的較短的轉(zhuǎn)錄物，這說明CMV啟動子在該構(gòu)建體中已被切掉了。R20TAR載體產(chǎn)生了來自5’LTR的未剪接的4.6kb轉(zhuǎn)錄物，按預(yù)期的，由于LXSN中剪接供體的失活，該轉(zhuǎn)錄物與TAR探針雜交(圖16C)。
抑制HIV-1在人PBL中的復(fù)制。為了分析PBL檢測系統(tǒng)與HIV-1基因治療研究的相關(guān)性，用實驗室菌株(IIIB)和初級臨床分離物(82H)在轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL上完成HIV攻擊實驗。感染做雙份，用3-5個不同批次的PBL重復(fù)。通過測量在培養(yǎng)物上清液中p24抗原的水平來監(jiān)測HIV-1復(fù)制。在使用HIV-1 IIIB的攻擊實驗中，相對于用對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL，表達(dá)核酶(圖17A)，反義序列(圖17B)和TAR引誘物(圖17C)的PBL中的p24產(chǎn)生明顯降低(70％)。同樣轉(zhuǎn)導(dǎo)并選擇PBL以評估其對初級HIV-1分離物感染的抗性。從患者PBMC中直接得到初級臨床分離物82H，而且將其特征鑒定為T細(xì)胞趨向性的和誘導(dǎo)合胞體的分離物。與IIIB一樣，對82H復(fù)制的抑制(p24抗原ELISA評價)達(dá)到與HIV-1 IIIB感染的PBL中相似的水平(圖18A-18C)。這些結(jié)果表明，通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞到人PBL中的這些轉(zhuǎn)基因可以抑制HIV-1在初級造血細(xì)胞中的復(fù)制。
分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL。為了研究轉(zhuǎn)導(dǎo)和構(gòu)建體表達(dá)對PBL的潛在影響，對所有的轉(zhuǎn)化和篩選的PBL完成[3H]-胸苷-攝取檢測。與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常PBL相比，在用轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體和載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中沒有明顯的不利影響(P＜0.002)；(圖19)。此外，F(xiàn)ACS分析表明轉(zhuǎn)導(dǎo)后，CD4表面的標(biāo)記沒有改變(表5)。這說明在HIV-1攻擊檢測中觀察到的抑制作用不是由于在轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL中CD4受體數(shù)量的減少而造成的。表5.用FACS分析檢測在PBL上的CD4/CD8表面標(biāo)記細(xì) 胞 百 分 比(％)細(xì)胞*CD4+CD8+總PBL 83.808.40CD4+BL 93.650.42LNL6-PBL93.011.19RRz2-PBL94.020.92*按材料和方法中的描述分析PBL?？侾BL＝未轉(zhuǎn)導(dǎo)的總PBL；CD4+＝未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+富集的PBL；LNL6-PBL＝CD4+富集的用LNL6病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL；RRz2-PBL＝CD4+富集的用RRz2病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL。
圖20表明用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的并經(jīng)G418選擇的CEM T4 T淋巴細(xì)胞系的結(jié)果。所收集的種群含有帶隨機(jī)整合體和不同構(gòu)建體表達(dá)水平的細(xì)胞，然后用HIV-1攻擊所述細(xì)胞。
圖21A-21B列出了針對tat的RzM(多核酶)，以及針對包裝位點和tat的RRzpsi/M核酶的結(jié)果。討論為了用于基因治療以最終用于抑制HIV-1的體內(nèi)復(fù)制，首先在實驗系統(tǒng)中檢測所述的基因治療方法。迄今為止，這些實驗系統(tǒng)主要是利用人T淋巴細(xì)胞細(xì)胞系，而在初級PBL中沒有公開的數(shù)據(jù)(Yu，M.et al.1994)。為了得到前臨床數(shù)據(jù)，最重要的是在初級造血細(xì)胞中檢測抗HIV-1基因治療劑。這些細(xì)胞是HIV-1感染和復(fù)制的主要目標(biāo)，而且在細(xì)胞系和PBL之間，在生長特征，對體外操作的反應(yīng)以及對HIV-1感染的反應(yīng)性方面有明顯的差異。它就是HIV-1基因治療的CD4+PBL種群。由于這些原因，我們完成了本發(fā)明建立PBL檢測系統(tǒng)的研究。
在該研究中，檢測了表達(dá)核酶，反義序列或TAR引誘物基因的三個不同的反轉(zhuǎn)錄病毒載體在人PBL中抗病毒效力。盡管用不同反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了它們，但按照用3H-胸苷摻入實驗和FACS分析測量的，在HIV-1保護(hù)實驗中，它們的有效水平相似。這些觀察結(jié)果表明了PBL作為HIV-1基因治療靶的可行性。
為了利用PBL作為檢測系統(tǒng)或作為治療的靶細(xì)胞，應(yīng)該注意幾點。首先，高病毒滴度是達(dá)到PBL有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因素。在用G418不能令人滿意地選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL的情況下，這對于臨床目的是特別重要的。我們檢測了用高滴度治療性反轉(zhuǎn)錄病毒(＞106cfu/ml)轉(zhuǎn)導(dǎo)的選擇和未選擇的PBL。分析未選擇的PBL對HIV感染也有抗性，盡管抑制程度低于在選擇過的PBL中所見到的，這表明，在臨床上有可能使用未用G418選擇的間接體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL。但是G418選擇能夠使低滴度病毒被用于基因治療的體外檢測。我們還研制了兩步G418選擇方法，利用該方法可以很容易地完成完全的選擇。這些方法使體外培養(yǎng)的時間減少到最少，由此減少了對T細(xì)胞種群的任何改變。在我們的實驗中，將PBL體外連續(xù)培養(yǎng)兩星期并未損害表面標(biāo)記(CD4+和CD8+)。這一過程的長度(兩星期)對于用于治療目的的任何PBL體外操作已經(jīng)足夠了。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計是有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的另一重要方面。盡管沒有直接比較在本研究中所用的三種載體設(shè)計，但是注意到兩個觀察結(jié)果。首先，在人初級造血細(xì)胞中用組成型方法可以有效地表達(dá)由病毒LTR(但不是來自一個構(gòu)建體的CMV內(nèi)啟動子)控制的所有轉(zhuǎn)基因。第二，象在T細(xì)胞系中一樣，將核酶基因插入到反轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因(例如neor的3’非翻譯區(qū))的策略在PBL中也是有效的。這些結(jié)果在未來基因治療設(shè)計的改進(jìn)中可能是有用的。由此可以得出結(jié)論，用本發(fā)明公開的方法，可以完成人初級PBL的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并使其免于HIV間接體內(nèi)感染。本發(fā)明不僅提供了體外評價基因治療劑的有用的系統(tǒng)，而且形成了針對CD4+淋巴細(xì)胞的HIV-1基因治療的基礎(chǔ)。
表6
動 物 反 轉(zhuǎn) 錄 病 毒AIDS相關(guān)病毒(ARV)鳥成紅細(xì)胞增多癥病毒鳥造白細(xì)胞組織增生病毒(或淋巴樣造白細(xì)胞組織增生病毒)鳥成髓細(xì)胞血癥病毒鳥網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒鳥肉瘤病毒狒狒內(nèi)源病毒牛白細(xì)病病毒牛慢病毒牛合胞體病毒公山羊大腦炎-關(guān)節(jié)炎病毒(或山羊腦白質(zhì)炎病毒)鳥髓細(xì)胞組織增生病毒Corn snake反轉(zhuǎn)錄病毒雞合胞體病毒鴨傳染性貧血病毒鹿腎病毒馬皮膚纖維肉瘤病毒馬傳染性貧血病毒Esh肉瘤病毒貓免疫缺損病毒貓白血病病毒貓肉瘤病毒貓合胞體形成病毒Fujinami肉瘤病毒長臂猿白血病病毒(或猿猴淋巴瘤病毒或猿猴骨髓性白血病病毒)金野雞病毒人免疫缺損病毒1(HIV-1)人免疫缺損病毒2(HIV-2)人T淋巴營養(yǎng)性病毒1(HTLV-1)人T淋巴營養(yǎng)性病毒2(HTLV-2)
人T淋巴營養(yǎng)性病毒3(HTLV-3)類淋巴細(xì)胞增生病病毒成髓細(xì)胞血癥相關(guān)病毒髓紅細(xì)胞組織增生病毒貂細(xì)胞病灶誘導(dǎo)病毒髓紅細(xì)胞組織增生病毒13貂白血病病毒小鼠乳腺腫瘤病毒Mason-Pfizer猴病毒鼠肉瘤病毒髓樣白血病病毒髓紅細(xì)胞組織增生病毒進(jìn)行性肺炎病毒大鼠白血病病毒大鼠肉瘤病毒Rous相關(guān)病毒0Rous相關(guān)病毒60Rous相關(guān)病毒61網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生相關(guān)病毒網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒內(nèi)皮組織增生轉(zhuǎn)化病毒雉雞病毒Rous肉瘤病毒猿猴泡沫病毒猿猴免疫缺損病毒脾病灶形成病毒松鼠猴反轉(zhuǎn)錄病毒脾壞死性病毒綿羊肺腺瘤/癌病毒猿猴肉瘤相關(guān)病毒(或兔猴白血病病毒)猿猴肉瘤病毒(或兔猴病毒)表7包裝序列表1 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(Rev)基因組Wilhelmsen，et al.J.virol.52172-182(1984)。堿基1-3149；Shimotohno，et al.Nature 285550-554(1980)。堿基3150-3607。包裝序列(φ)相對于原病毒51末端，在0.676kbp和0.820kbp之間的144堿基。
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Sun，Lun-Quan(ii)發(fā)明題目以反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列為靶的核酶的表達(dá)構(gòu)建體及含有所述構(gòu)建體的重組反轉(zhuǎn)錄病毒(iii)序列數(shù)11(iv)通訊地址(A)受件人Cooper&Dunham LLP(B)街道 1185 Avenue of the american(C)城市 紐約(D)州紐約(E)國家 美國(F)郵政編碼10036(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件 PatentIn Release#1.24(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)柹胁恢?B)申請日1995年1月5日(C)分類號
(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/310,259(B)申請日1994年9月21日(viii)代理人/代理資料(A)姓名White，John P.
(B)注冊號28，678(C)文獻(xiàn)/檔案號43846-A-PCT(ix)電訊信息(A)電話212-278-0400(B)電傳212-391-0525(2) SEQ ID NO1的資料(I)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1NCUGANGANN NNNNGAAAN(3)SEQ ID NO2的資料(I)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO2NCUGANGANG AAAN(4)SEQ ID NO3的資料(I)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO3NGANNGAAAC NNNANANUAC N(5)SEQ ID NO4的資料(I)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO4TTAGGATCCT GATGAGTCCG TGAGGACGAA ACTGGCTC(6)SEQ ID NO5的資料(I)序列特征(A)長度114個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO5見原文67頁序列L46-49(7)SEQ ID NO6的資料(I)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO6GTCAAAAATT GGCGCTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTCACCAGTCGCC G(8)SEQ ID NO7的資料(I)序列特征(A)長度170個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO7見原文68頁序列L9-1權(quán)利要求
1.合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，含有其序列定義了一保守催化區(qū)的核苷酸和其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)預(yù)定的靶序列雜交的核苷酸。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述病毒包裝序列是反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中所述包裝序列是HIV-1的Psi包裝序列。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中所述RNA病毒是貓白血病病毒。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中所述RNA病毒是貓免疫缺損病毒。
6.具有下列結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1的化合物 其中各X代表相同或不同的并且可以是在其糖、磷酸或堿基上有修飾或取代的核苷酸；其中各A，C，U和G代表在其糖，磷酸或堿基上可以沒有修飾或有修飾或取代的核糖核苷酸；其中3’-AAG…AGUCX-5’限定保守的催化區(qū)；其中各(X)nA和(X)n’指其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸；其中各*代表位于核苷酸任一側(cè)的核苷酸之間的堿基配對；其中每條實線代表位于核苷酸任一側(cè)的在核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵；虛線各自獨(dú)立地代表位于核苷酸任一側(cè)的在核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵或者沒有任何所述的化學(xué)鍵；其中a代表表示核苷酸數(shù)的一個整數(shù)，前提是a可以是0或1，而且如果是0，則位于(X)a之5’端的A與位于(X)a之3’端的X鍵合；其中各m和m’代表大于或等于1的整數(shù)；其中(X)b代表寡核苷酸，b代表大于或等于2的整數(shù)。
7.具有下列結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1的化合物 其中各X代表相同或不同的并且可以是在其糖、磷酸或堿基上有修飾或取代的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸；其中各A，C，U和G代表在其糖，磷酸或堿基上可以沒有修飾或有修飾或取代的核糖核苷酸；其中3’-AAG…AGUCX-5’限定保守的催化區(qū)；其中各(X)nA和(X)n’指其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸；其中每條實線代表位于核苷酸任一側(cè)的在核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵；m代表2-20的整數(shù)；任何核苷酸(X)m都沒有一個與所述化合物內(nèi)的任何其它核苷酸Watson-Crick堿基配對。
8.具有下列結(jié)構(gòu)式的權(quán)利要求1的化合物 其中各X代表相同或不同的并且可以是在其糖、磷酸或堿基上有修飾或取代的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸；其中各A，C，U和G代表在其糖，磷酸或堿基上可以沒有修飾或有修飾或取代的核糖核苷酸；其中3’(X)P4…(X)P1-5’限定保守的催化區(qū)；其中(X)F4和(X)F3指其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸；其中每條實線代表位于核苷酸任一側(cè)的在核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵；其中F3代表定義寡核苷酸中核苷酸數(shù)的整數(shù)，條件是F3大于或等于3；其中F4代表定義寡核苷酸中核苷酸數(shù)的整數(shù)，條件是F4為3-5；其中各(X)P1和(X)P4代表含有預(yù)定序列的寡核苷酸，該預(yù)定序列使(X)P4與(X)P1的3-6個堿基能夠堿基配對；其中P1代表定義寡核苷酸中的核苷酸數(shù)的整數(shù)，條件是P1是3-6，P1與F4的總和等于9；其中(X)P2和(X)P3各代表有預(yù)定序列的寡核苷酸，該預(yù)定序列使(X)P2與(X)P3的至少3個堿基配對；虛線各自獨(dú)立地代表位于核苷酸任一側(cè)的在核苷酸之間提供共價鍵的化學(xué)鍵或者沒有任何所述的化學(xué)鍵；其中(X)L2代表可能存在或不存在的寡核苷酸，條件是如果(X)L2存在，L2代表大于或等于3的整數(shù)。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中其序列定義一保守催化區(qū)的核苷酸來自肝炎δ病毒保守區(qū)。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中其序列定義一保守催化區(qū)的核苷酸在其3’末端含有序列NCCA。
11.合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，含有兩個或多個可能相同或不同的功能區(qū)，各功能區(qū)含有其序列為保守催化區(qū)的核苷酸以及其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)的預(yù)定靶序列雜交的核苷酸。
12.權(quán)利要求1的化合物，還含有能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)可以相同或不同的預(yù)定序列雜交的共價連接的反義核酸化合物。
13.權(quán)利要求1的化合物，其中所述核苷酸能夠與MoMLV內(nèi)的243,274,366或553靶序列和HIV Psi包裝位點內(nèi)的位點749雜交。
14.含有權(quán)利要求1的化合物的化合物，還含有至少一個附加的合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，該化合物帶有或不帶有共價相連的反義分子，且以RNA病毒基因組的不同基因為靶。
15.權(quán)利要求14的化合物，其中RNA病毒是HIV，HIV基因組的不同區(qū)域選自長末端重復(fù)序列、5’非翻譯區(qū)、剪接供體-受體位點、引物結(jié)合位點、3’非翻譯區(qū)、gag、pol、蛋白酶、整合酶、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx或tev區(qū)。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中所述核苷酸能夠與MoMLV中的243,274,366或553靶位點或其組合以及HIV Psi包裝位點中的位點749雜交，所述附加化合物的核苷酸能夠與HIV tat區(qū)中的5792,5849,5886或6042靶位點或其組合物雜交。
17.含有權(quán)利要求1或14化合物以及藥物學(xué)，獸醫(yī)學(xué)或農(nóng)業(yè)可接受的載體或賦形劑的組合物。
18.一種組合物，含有帶有或不帶有反義序列的權(quán)利要求1的化合物，以及TAR引誘物，poly TAR或RRE引誘物。
19.生產(chǎn)權(quán)利要求1的化合物的方法，包括步驟(a)將對應(yīng)于所述化合物的核苷酸序列連接到由DNA，RNA或其組合物組成的轉(zhuǎn)移載體中；(b)用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄步驟(a)中的核苷酸序列；和(c)回收所述的化合物。
20.一種轉(zhuǎn)移載體，包括RNA或DNA或其組合，含有轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生權(quán)利要求1化合物的核苷酸序列。
21.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)移載體，其中所述轉(zhuǎn)移載體含有HIV長末端重復(fù)序列，腺病毒相關(guān)轉(zhuǎn)移載體，SV40啟動子，Mo-MLV或兩親反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
22.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)移載體，還含有指導(dǎo)所述寡核苷酸化合物到特定器官或體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)域的序列。
23.含有權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)移載體以及藥物學(xué)，獸醫(yī)學(xué)或農(nóng)業(yè)可接受的載體或賦形劑的組合物。
24.含有權(quán)利要求1之化合物或轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生權(quán)利要求1化合物的核苷酸序列的原核或真核細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是動物細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是產(chǎn)生全部造血細(xì)胞譜系的祖細(xì)胞，更成熟細(xì)胞以及完全成熟細(xì)胞的造血干細(xì)胞。
28.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是產(chǎn)生全部造血細(xì)胞譜系成熟細(xì)胞的祖細(xì)胞。
29.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是產(chǎn)生特定造血譜系的定型祖細(xì)胞。
30.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞。
31.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是未成熟的T淋巴細(xì)胞。
32.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是成熟T淋巴細(xì)胞。
33.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是髓樣祖細(xì)胞。
34.權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是單核/巨噬細(xì)胞。
35.權(quán)利要求1的化合物保護(hù)造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、定型祖細(xì)胞、T淋巴祖細(xì)胞、未成熟T淋巴細(xì)胞、成熟T淋巴細(xì)胞、髓樣祖細(xì)胞或單核/巨噬細(xì)胞的用途。
36.在AIDS患者中抑制HIV的方法，包括將權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入造血細(xì)胞中，由此使細(xì)胞獲得對HIV的抗性，從而抑制AIDS患者中的HIV。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述導(dǎo)入是間接體內(nèi)的，所述細(xì)胞是自體的或異源細(xì)胞。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述導(dǎo)入是間接體內(nèi)的，所述細(xì)胞是未經(jīng)骨髓抑制移植的。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述導(dǎo)入是間接體內(nèi)的，所述細(xì)胞是經(jīng)骨髓抑制移植的。
40.保護(hù)個體免于HIV感染的方法，包括將權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入所述個體的細(xì)胞中，由此保護(hù)個體免受高水平病毒的影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，該化合物含有其序列定義了一個保守催化區(qū)的核苷酸和其序列能夠與RNA病毒包裝序列內(nèi)預(yù)定的靶序列雜交的核苷酸。優(yōu)選的，病毒包裝序列是反轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列，或是HIV-1 Psi包裝序列。RNA病毒可以是HIV-1，貓白血病病毒，貓免疫缺損病毒或表I中所列病毒之一。保守催化區(qū)可以得自錘頭核酶，發(fā)夾核酶，肝炎δ核酶，RNAase P核酶，I組內(nèi)含子，II組內(nèi)含子。本發(fā)明還涉及以RNA病毒為靶的多核酶，含有或不含有反義鏈的核酶組合物和含有反義鏈和polyTAR，RRE或TAR引誘物的核酶組合物。本發(fā)明還描述了載體。此外，還描述了體內(nèi)和間接體內(nèi)的治療方法和使用方法。
文檔編號A61K35/28GK1145638SQ95191931
公開日1997年3月19日 申請日期1995年1月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月5日
發(fā)明者G·P·西蒙斯, L·Q·申 申請人:基因切變有限公司