專利名稱：反轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因方法，尤其是涉及以重組反轉(zhuǎn)錄病毒為介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞的轉(zhuǎn)基因方法。
目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)多數(shù)是在原有技術(shù)基礎(chǔ)之上改變某些參數(shù)，如注射DNA的質(zhì)量、胚胎移植的時間、胚胎受體等，使得這些技術(shù)有所改善或其效率有所提高。重組反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染獲得的轉(zhuǎn)基因動物，目的基因整合的位置在不同來源的細胞中表現(xiàn)不同，純合轉(zhuǎn)基因動物的獲得需經(jīng)過2-3代的繁育才能實現(xiàn)，且重組反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染時胚胎已發(fā)育為多細胞，而前病毒在每個細胞內(nèi)的整合位置不盡相同。由于體內(nèi)精原干細胞始終處于不斷的分裂增殖狀態(tài)，每次分裂形成兩個細胞，其中一個通過初級精母細胞→次級精母細胞→精子細胞等過程發(fā)育為精子；另一個仍為干細胞，保持原始未分化狀態(tài)和繼續(xù)分裂增殖的能力，因此，通過轉(zhuǎn)染精原干細胞的方法有可能實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。1994年有人開展了精原干細胞的異種動物移植研究(Brinster RL.And Avarbock MR.PNAS，1994)，并提出了體外培養(yǎng)精原干細胞實現(xiàn)種系修飾的可能，但迄今尚無有關(guān)成功的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是結(jié)合重組反轉(zhuǎn)錄病毒的高度主動感染性以及精原干細胞50％最終發(fā)育成為生殖細胞的特性，建立一種操作簡便，所需儀器設(shè)備簡單，基因轉(zhuǎn)移效果可靠的新的轉(zhuǎn)基因方法。
本發(fā)明通過重組技術(shù)將目的基因克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得帶有目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒，以顯微操作技術(shù)將重組病毒導(dǎo)入到小鼠曲細精管，由注射公鼠產(chǎn)生子代，對子代鼠的外源基因整合、表達和遺傳特性進行分析。本發(fā)明利用了反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以整合到細胞染色體上的這一特性，同時根據(jù)精原干細胞的一半基因組發(fā)育到精子中的事實和曲細精管的解剖結(jié)構(gòu)，建立了一種新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。本發(fā)明的工藝流程如下1.通過克隆技術(shù)，將目的基因克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體的啟動子下游，構(gòu)建目的基因的包裝載體；載體中含有新霉素(Neomycin)基因，用于陽性轉(zhuǎn)染細胞的篩選；2.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將2-20μg目的基因包裝載體轉(zhuǎn)染104-1010PA317細胞，加入到最終濃度400μg/ml的G418，篩選2-4周后，得到產(chǎn)毒細胞克隆，并繼續(xù)擴大培養(yǎng)，收集產(chǎn)毒細胞上清；3.應(yīng)用差速超速離心法，制備重組反轉(zhuǎn)錄病毒。溫度為4℃，用離心法10000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘后，拋棄沉淀；在溫度4℃，以離心法35000轉(zhuǎn)/分鐘，120分鐘后，取沉淀物，并將濃縮后的沉淀懸于0.1％～0.2％體積的含10％牛血清白蛋白的MEM中待用；4.取13～17日齡健康雄性鼠，“846”合劑肌注麻醉，手術(shù)暴露睪丸并在顯微鏡下找到外形結(jié)構(gòu)清晰的曲細精管，通過吸有病毒懸液的毛細玻璃針(由拉針儀拉制)，將病毒注入曲細精管管腔內(nèi)；手術(shù)縫合陰囊，飼養(yǎng)至可以配種時待用；5.取上述性成熟和體成熟、注射有重組反轉(zhuǎn)錄病毒的雄性鼠，與發(fā)情雌鼠同籠過夜；6.次日，檢查雌性鼠陰部，有陰栓者即可獨立飼養(yǎng)至分娩。子代鼠飼養(yǎng)至9日～9周齡待檢；7.剪取小鼠尾或耳組織，提取其染色體DNA用于目的基因整合檢測。檢測方法為Southern雜交(首先用限制性內(nèi)切酶對染色體DNA進行消化，于1％瓊脂糖凝膠上電泳，通過Southern印跡方法將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；同時以目的基因的片段作為探針，標(biāo)記以同位素，以該標(biāo)記探針和尼龍膜上的DNA進行雜交，自顯影，檢出雜交陽性鼠)；陽性鼠用于繁殖后代，后代的目的基因整合同樣采用Southern雜交方法。
8.Southern雜交陽性鼠即為轉(zhuǎn)基因鼠。可用于表達檢測和擴群傳代。
本發(fā)明建立了一種以重組反轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞為介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因新技術(shù)，其特點是操作簡單，投入費用低廉，具有重復(fù)性和可靠性。
實施例2以tPA(組織型纖溶酶原激活劑)為目的基因，將其克隆至重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN的5-LTR和pLNCX的CMV啟動子下游，構(gòu)建成包裝載體，轉(zhuǎn)染PA317細胞，經(jīng)篩選、增殖后，分別得到一產(chǎn)毒細胞株，收集細胞上清后以超速離心法對病毒進行濃縮。將濃縮的病毒溶于含0.05％(w/v)臺盼藍，0.008g/L Polybrene的PBS(pH7.2)中，在立體視鏡下手術(shù)，將其注入14-16日齡小鼠曲細精管內(nèi)。術(shù)后40天注射小鼠用于交配。取子代鼠尾組織用于DNA整合檢測(PCR、Southern hybridization)，胚胎成纖維細胞培養(yǎng)用于表達檢測(RT-PCR)，并進行傳代試驗。結(jié)果重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的產(chǎn)毒細胞株產(chǎn)毒量為107cfu/ml，濃縮后注射用病毒滴度達108.5-9cfu/ml。子代鼠目的基因整合率達12.5％，tPA基因在早期胚胎內(nèi)獲表達；傳代試驗表明，本研究所獲轉(zhuǎn)基因當(dāng)代鼠有33％的子代仍攜帶有目的基因。利用注射了重組反轉(zhuǎn)錄病毒的同一公鼠，可連續(xù)用于交配，獲得轉(zhuǎn)基因子代。因此，這一技術(shù)不僅操作簡單，投入費用低廉，而且具有重復(fù)性和可靠性，是一種可以推廣應(yīng)用的新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種反轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，包括以重組反轉(zhuǎn)錄病毒為介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞，目的基因首先重組到反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，重組病毒經(jīng)在PA317細胞上感染增殖后，收集重組病毒并進行濃縮，濃縮病毒注射到幼齡公鼠的曲細精管內(nèi)，小鼠發(fā)育至性成熟后，利用其繁殖子代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，其工藝過程首先將目的基因克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體的啟動子下游，構(gòu)建目的基因的包裝載體；將目的基因包裝載體轉(zhuǎn)染104-1010PA317細胞，得到產(chǎn)毒細胞克??；利用超速離心法，制備重組反轉(zhuǎn)錄病毒。之后取13～17日齡健康雄性鼠，在解剖顯微鏡下找到外觀結(jié)構(gòu)清晰的曲細精管，通過吸有病毒懸液的毛細玻璃針，將病毒注入曲細精管管腔內(nèi)；飼養(yǎng)至可以配種，配種后獲得的子代鼠，提取其染色體DNA，通過Southern雜交用于目的基因整合檢測；后代的目的基因整合同樣采用Southern雜交方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，部分子代的基因組內(nèi)，整合有目的基因，這種目的基因的整合效率可達12.5％。同時外源性目的基因可以遺傳給后代，遺傳特性遵循孟德爾定律。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因方法，尤其是涉及以重組反轉(zhuǎn)錄病毒為介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞的轉(zhuǎn)基因方法。將目的基因克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)化PA317細胞，收集并濃縮由陽性細胞克隆產(chǎn)生的重組病毒，將重組病毒注射到幼齡小鼠的曲細精管內(nèi)，由該公鼠繁殖子代，在公鼠精液和其子代鼠中均證明有目的基因的整合，整合率可達12.5％，并可遺傳給后代。本發(fā)明建立了一種以重組反轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞為介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因新技術(shù)，其特點是操作簡單，投入費用低廉，具有重復(fù)性和可靠性。
文檔編號C12N15/86GK1446918SQ0210935
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者扈榮良, 張守峰, 王鳳陽 申請人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所