專利名稱：豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量pcr檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù) 的熒光定量PCR檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著移植醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)研究的進(jìn)展，也由于人源供體器官的短缺，豬被選定為最 合適的異種移植供體。培育SPF豬可以消除許多病原體，但內(nèi)源性病毒無法去除。1997年 Pateince 等(“Infection of human cells by an endogenous retrovirus ofpigs. "Nat Med, 1997,3(3) =282-286.)首次發(fā)現(xiàn)豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(porcineendogenous retrovirus,PERV)在體外可以感染多種人源細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)引起了人們對異種移植安全性 的廣泛關(guān)注。PERV是指以前病毒DNA形式整合進(jìn)豬細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞染色體復(fù)制而 復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄病毒，在形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上具有哺乳動物C型病毒的典型特征。雖然目前尚 無證據(jù)表明PERV可在體內(nèi)感染人源細(xì)胞，且也無證據(jù)表明PERV在豬體內(nèi)和接受異種組織/ 器官移植的人體內(nèi)可產(chǎn)生任何病理作用，但人們?nèi)該?dān)心由于接受異種移植的人體處于高度 免疫抑制狀態(tài)，PERV會跨越種間屏障，并且發(fā)生突變或與其它人類病毒重組而獲得毒力及 傳染性。由于PERV是在長期的進(jìn)化過程中整合進(jìn)豬的基因組中的，所以不同品系間存在 著不同的拷貝數(shù)，同一品系的不同個體中也存在不同的拷貝數(shù)，且其中僅有少量為具有傳 染性的完整的前病毒，因此有必要通過篩選得到并選育PERV低拷貝豬，從而有助于進(jìn)一步 獲得不含可復(fù)制的嗜人性PERV的豬作為異種移植的優(yōu)良供體。與其它反轉(zhuǎn)錄病毒相似，PERV的基因組結(jié)構(gòu)包括5'區(qū)、gag、p0l、enV、3'區(qū)等5 部分。Pol為多聚酶基因，在各個品系豬種的PERV中均較為保守。Argaw等(“Development of a real time quantitative PCR assay for detection of porcineendogenous retrovirus. ” J Virol Med. 2002,106(1) :97_106.)建立了基于 Taqman 探針的實時定量 PCR與RT-PCR方法，用于檢測組織或細(xì)胞中的PERV DNA或RNA。Taqman探針特異性好，但 除需要合成序列特異性引物外，還需合成熒光探針，成本較高；SYBRGreen I法經(jīng)濟(jì)，只需合 成序列特異性引物，然而反應(yīng)特異性相對較差。但通過熔解曲線和凝膠電泳證實特異性，確 認(rèn)沒有產(chǎn)生引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，SYBR GreenI熒光定量PCR也可以成為一種高特 異性的方法。建立豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測方法，既可用于異種移植的小型豬供體及豬源生物材料基因組中整合的PERV拷貝數(shù)的快速篩選，也可用于異種 移植后PERV傳播的長期監(jiān)測與遠(yuǎn)期評估，具有較強的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測方法。
本發(fā)明所提供的檢測方法，是采用基于SYBR Green I染料的熒光定量PCR技術(shù)對整 合在基因組中的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，檢測對象是PERV pol基因保守區(qū)。所述檢測體系中使用的上游引物和下游引物分別具有序列表中序列1和序列2的 核苷酸序列。所述上、下游引物濃度為50nmol/L。
所述PCR反應(yīng)的退火溫度是60°C。所述檢測體系中的被檢樣品包括來源于豬的血液與組織樣品、異種移植受者的血 液與組織樣品、豬源生物材料。具體來講，所述豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測方法包括以 下步驟1)分離外周血單個核細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后提取基因組DNA ；2)采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行熒光定量PCR，其PCR反應(yīng)體系為 RealMasterMix (SYBR Green Ι)9μ L, DNA 樣本 1 μ L，上、下游引物各 lpmol，加無菌去離子 水補充反應(yīng)體系至20 μ L ；3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序為先94°C變性5min ；然后94°C 30s, 60°C 30s， 68°C 30s，共循環(huán)42次；最后72°C延伸5min。PCR完成后，按0. 2°C s—1的升溫速率從60°C 升至90°C進(jìn)行熔解曲線的分析驗證；4)擴(kuò)增出特異性PCR產(chǎn)物后，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，并按10倍梯度稀釋將其稀釋成 IO8-IO4拷貝/ μ L 5個濃度梯度，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾值(Ct)采用計算機(jī)軟件自 動繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)取步驟1)中制備的基因組DNA為模板，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程 序在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并同時進(jìn)行陰性對照(不加模板，NTC)和陽性對照(如 ΡΚ15細(xì)胞基因組DNA為模板)的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值(Ct)與標(biāo)準(zhǔn)曲 線對照，可計算出DNA樣本中PERV的拷貝數(shù)，再根據(jù)該DNA樣本所來源的細(xì)胞數(shù)，即可估算 出單細(xì)胞基因組中整合的PERV拷貝數(shù)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR 檢測試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒包括RealMasterMix (SYBR Green I) 9 μ L，上、下游引物各 Ipmol。本發(fā)明涉及一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測方法。該檢 測方法具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，并具有快速、簡便、費用低廉的優(yōu)點，能夠快速 準(zhǔn)確的檢測出PERV的拷貝數(shù)，并估算出單細(xì)胞基因組中整合的PERV拷貝數(shù)，既可用于異種 移植的小型豬供體及豬源生物材料基因組中整合的PERV拷貝數(shù)的快速篩選，也可用于異 種移植后PERV傳播的長期監(jiān)測與遠(yuǎn)期評估，具有較大的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為PCR擴(kuò)增pol基因保守區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果
圖2為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線圖3為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR的熔解曲線圖4為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖5為樣品為模板進(jìn)行熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線圖6為樣品為模板進(jìn)行熒光定量PCR的熔解曲線
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測1、PBMC基因組DNA的獲取取來源于小型豬的EDTA-K2抗凝血(例如實驗中可以從前腔靜脈采集)，采用 FicolI-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。方法為取抗凝血2mL，與 RPMI1640培養(yǎng)液(購自美國Sciencell公司)1 1混勻后，小心加于4mL的人淋巴細(xì)胞分 離液的液面上，以2000r/min離心15min，用毛細(xì)吸管收集界面上的細(xì)胞，放入含RPMI1640 培養(yǎng)液5mL的離心管中，充分混勻后，以1500r/min離心lOmin。小心棄去上清液，加入4mL RPMI1640培養(yǎng)液吹打混勻，1500r/min離心lOmin，再重復(fù)洗一次即得PBMC，并進(jìn)行細(xì)胞計 數(shù)。PBMC還可以通過其它方式獲取或直接利用商業(yè)渠道來源的PBMC。利用Promega 公司 Genomic DNA purification kit 制備 PBMC 基因組 DNA，用 紫外分光光度計測定基因組DNA濃度，分別稀釋至50-100ng/ μ L，再次測定其濃度，儲存 于-20°C備用。根據(jù)PERV核苷酸序列(GenBank登錄號EF133960)，設(shè)計并合成了檢測PERV pol基因的引物，序列如下上游引物qpolF:5' -TTTCTGGTCATCCCTGAGTGC-3‘(序列表中序列 1);下游引物qpolR :5' -CCCATCCCTGCGGTTTCT-3 ‘(序列表中序列 2)。引物序列經(jīng)過BLAST檢索(www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)，具有很強的特異性。以上詳述了實驗中獲得PBMC基因組DNA的過程，僅提供參考，不作為對以其它方 式獲得或直接利用小型豬PBMC基因組DNA的限制。2、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建以小型豬基因組DNA為模板，進(jìn)行pol基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在50 μ L體系 中進(jìn)行，取1 μ L基因組DNA作模板，依次加入10 XPCR buffer5 μ L，10mmol/L dNTP混合物 4口1^，上、下游引物各10 11101，1^39 DNA聚合酶2. 5U，加無菌去離子水至50 μ L。PCR擴(kuò)增 程序為先94°C變性5min ；然后94°C 30s, 60°C 30s, 68°C 30s，循環(huán)42次；最后72°C延伸 5min。在擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物IOyL與DNA Marker DL 2000同時進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電 泳。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收并與pMD18simple-T載體(購自Takara生物工程公司) 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli ToplO，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取4個白色克隆，菌落PCR鑒定得 到陽性克隆后，小量制備質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行PCR鑒定并測序(由北京華大中生公司完成)，測 序結(jié)果表明該序列具有序列表中序列3的核苷酸序列。用紫外分光光度計準(zhǔn)確定量后，根 據(jù)以下公式計算出其拷貝數(shù)，進(jìn)行10倍梯度稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品保存于-20°C備用。, / . / τ、 6.02xl023copies/mol丄丄. ,,τ Ν
copy number (copies/ μ L)=---X concentration (g/ μ L)
MW(g/mol) MW= size in bpX660g/ (mol bp) 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如 圖1所示(MDL2000Marker，a_g梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)依次為 8. 25X IO8-S. 25X IO2Copies/μ L, h陰性對照)擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期約245bp，未見非特 異性條帶及引物二聚體條帶。PERV-pol標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒拷貝數(shù)以108-104COpieS/μ L的梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模 板，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在20 μ L體系中進(jìn)行，包括RealMasterMix (SYBR Green 1)9 μ L，模板1 μ L，上、下游引物各lpmol，加無菌去離子水至20 μ L。PCR擴(kuò)增程 序為先94°C變性5min;然后94°C 30s, 60°C 30s, 68°C 30s，循環(huán)42次；最后72°C延伸 5min。PCR完成后，按OJOiT1的升溫速率從60°C升至90°C進(jìn)行熔解曲線的分析驗證。用 起始模板拷貝數(shù)的Ig值對每個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線如 圖 2(由左至右依次為以 8. 25X 108、-8. 25Χ107、8. 25Χ106、8· 25Χ105、8· 25X 104copies/ μ L標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線，均重復(fù)3次。NTC:無模板對照。)，標(biāo)準(zhǔn)品熔 解曲線如圖3 (曲線為對應(yīng)圖2以8. 25X IO8-S. 25X IO4Copies/μ L標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行 擴(kuò)增的熔解曲線。NTC:無模板對照。)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸相關(guān)系 數(shù) r = -0. 997。3、樣品檢測實時定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，對五指山豬及巴馬小型豬共28份基因組 DNA樣品進(jìn)行檢測，同時設(shè)陰性對照(不加模板，NTC)及陽性對照(PK15細(xì)胞基因組DNA為 模板)。根據(jù)測得的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中pol基因拷貝數(shù)，其與相應(yīng)細(xì)胞數(shù)的比值 即為單細(xì)胞基因組中Pol基因的拷貝數(shù)。50-100ng范圍內(nèi)的各樣品基因組DNA為模板，用定量PCR檢測pol基因，部分樣 品的擴(kuò)增曲線如圖5(各曲線為部分樣品基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線。圖中選 擇樣品1、樣品2和樣品3為代表)，熔解曲線如圖6 (各曲線為對應(yīng)圖5的樣品基因組DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增的熔解曲實驗)。根據(jù)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到單細(xì)胞基因組中PERV的 拷貝數(shù)。兩組數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布，五指山豬單細(xì)胞基因組中PERV的拷貝數(shù)為1.38士0.33 至14. 23 士 3.31之間，巴馬小型豬單細(xì)胞基因組中PERV的拷貝數(shù)為2.96士0. 76至 58. 46士3. 50之間。陽性對照PK15細(xì)胞基因組中PERV的拷貝數(shù)為61. 79士6. 99。實施例2、豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的實時熒光定量PCR檢測試劑盒的制 備將RealMasterMix 9 μ 1、上、下游引物各Ipmol共同包裝，得到豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病 毒整合拷貝數(shù)的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的實時熒光定量PCR檢測試劑盒。使用時 用戶根據(jù)實驗需要加入模板即可。序列表<160>3<210>1<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223><400>1tttctggtca tccctgagtg c21<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2cccatccctg cggtttct18<210>3<211>245<212>DNA<213> 豬<400>3tttctggtca tccctgagtg cccagtaccc cttctaggta gagacttact gaccaagatg 60ggagctcaaa tttcttttga acaaggaaga ccagaagtgt ctgtgaataa caaacccatc 120actgtgttga ccctccaatt agatgatgaa tatagactat attctcccca agtaaagcct 180gatcaagata tacagtcctg gttggagcag tttccccaag cctgggcaga aaccgcaggg 240atggg24權(quán)利要求
一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測方法，是采用基于SYBR Green I染料的熒光定量PCR技術(shù)對整合在基因組中的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，檢測對象是PERV pol基因保守區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述檢測體系中使用的上游引物和 下游引物分別具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述上、下游引物濃度為50nmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的退火溫度是60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述檢測體系中的被檢樣品包括來 源于豬的血液與組織樣品、異種移植受者的血液與組織樣品、豬源生物材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝 數(shù)的熒光定量PCR檢測方法包括以下步驟1)分離外周血單個核細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后提取基因組DNA;2)采用SYBRGreen I嵌合熒光法進(jìn)行熒光定量PCR，其PCR反應(yīng)體系為 RealMasterMix 9 μ L，DNA樣本1 μ L，上、下游引物各Ipmol，加無菌去離子水補充反應(yīng)體系 至 20 μ L ；3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序為先94°C變性5min；然后94°C 30s, 60°C 30s, 68°C 30s，共循環(huán)42次；最后72°C延伸5min。PCR完成后，按0. 2°C s—1的升溫速率從60°C升至 90°C進(jìn)行熔解曲線的分析驗證；4)擴(kuò)增出特異性PCR產(chǎn)物后，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，并按10倍梯度稀釋將其稀釋成IO8-IO4 拷貝/ μ L 5個濃度梯度，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序在熒光定量PCR儀上進(jìn) 行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾值采用計算機(jī)軟件自動繪制熒光 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)取步驟1)中制備的基因組DNA為模板，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序在 熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并同時進(jìn)行陰性對照和陽性對照的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，將DNA 樣本的循環(huán)閾值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，可計算出DNA樣本中PERV的拷貝數(shù)，再根據(jù)該DNA樣本 所來源的細(xì)胞數(shù)，即可估算出單細(xì)胞基因組中整合的PERV拷貝數(shù)。
7.一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括SYBRGreen I，權(quán)利要求2所述具有序列表中序列1和序列2核苷酸序列的上、下游引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述上、下游引物濃度為50nmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒整合拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測方法及其應(yīng)用。該方法是采用基于SYBR Green I染料的熒光定量PCR技術(shù)對整合在基因組中的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，檢測對象是PERV pol基因保守區(qū)。該檢測方法具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，并具有快速、簡便、費用低廉的優(yōu)點，能夠快速準(zhǔn)確的檢測出PERV的拷貝數(shù)，并估算出單細(xì)胞基因組中整合的PERV拷貝數(shù)，既可用于異種移植的小型豬供體及豬源生物材料基因組中整合的PERV拷貝數(shù)的快速篩選，也可用于異種移植后PERV傳播的長期監(jiān)測與遠(yuǎn)期評估，具有較大的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/70GK101845518SQ20091024339
公開日2010年9月29日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者馮書堂, 呂茂民, 吳健敏, 楊勇賢, 章金剛, 馬玉媛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所;廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所