專利名稱：：一種評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，具體為評(píng)價(jià)鹿茸對(duì)胃腸道特征菌群生長(zhǎng)代謝影響的方法。
背景技術(shù)：
：鹿茸為鹿科云力物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿Cervusel即husLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有促生長(zhǎng)代謝、壯腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨等功效。隨著研究的深入，人們從鹿茸不同活性部位中提取分離出越來(lái)越多的化學(xué)成分，有關(guān)鹿茸藥理作用的研究報(bào)道也較多，但鹿茸調(diào)節(jié)補(bǔ)益的真正藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，嚴(yán)重影響其推廣應(yīng)用。因此，客觀且靈敏地對(duì)鹿茸藥效進(jìn)行表征，對(duì)于鹿茸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制及臨床有效用藥具有重要意義。鹿茸中含有大量的生物活性物質(zhì)，例如鹿茸的醇提物對(duì)四氯化碳和乙醇中毒所引起的小鼠和大鼠肝和血漿中丙二醛含量升高有明顯抑制作用，而正丁醇提取物和乙醚提取物等為抑制單胺氧化酶的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理認(rèn)為中藥調(diào)節(jié)代謝的藥效之一是源于中藥中含有調(diào)節(jié)胃腸道有益菌的活性部位或化學(xué)成分。傳統(tǒng)研究方法如細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)法、免疫組織化學(xué)法、血流動(dòng)力學(xué)、紅細(xì)胞凝集法等已用于鹿茸活性部位的評(píng)價(jià)，但這些方法往往存在評(píng)價(jià)指標(biāo)單一、整體信息易缺失、受干擾因素多、操作復(fù)雜等局限，難以全面表征機(jī)體受藥物干預(yù)過(guò)程中的特征信息，無(wú)法獲得實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)。微量熱法(Microcalorimetry)作為一種簡(jiǎn)便、可量化的測(cè)定熱變化的方法廣泛地應(yīng)用于物理、化學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域。該方法主要是通過(guò)獲得動(dòng)態(tài)的生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱譜曲線(P-t曲線)的特征信息來(lái)表達(dá)微生物、細(xì)胞、組織和器官等生物體在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的微量熱變化(吸熱或放熱)規(guī)律，具有實(shí)時(shí)、靈敏、高通量和指紋特性等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。在細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖、衰亡過(guò)程中，伴隨代謝、有熱量釋放，釋放的熱量隨生長(zhǎng)期的變化關(guān)系被稱為生物熱活性譜(又稱"熱譜曲線"或"生物效應(yīng)譜")。在既定的條件下，細(xì)菌的生長(zhǎng)符合微生物生長(zhǎng)曲線模型。生長(zhǎng)曲線分為四個(gè)期，即延滯期(lagphase)、指數(shù)生長(zhǎng)期(logphase)、穩(wěn)定期(stationaryphase)和衰亡期(declinephase)。指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線符合微生物指數(shù)生長(zhǎng)數(shù)學(xué)模型。Pt=P。exp(kt)或InPt=lnP。+kt(1)式中，P。為基線起點(diǎn)的細(xì)菌產(chǎn)熱功率，Pt為t時(shí)刻的細(xì)菌產(chǎn)熱速率，k為生長(zhǎng)速率常數(shù)。同時(shí)還可提取最大產(chǎn)熱功率(P^)、達(dá)峰時(shí)間(tp)、產(chǎn)熱量(Q)等熱譜曲線的特征參數(shù)。腸道中的菌群大致可分為有益菌、有害菌和利害均備菌，各種菌群互相制約、互相協(xié)調(diào)，共同維持腸道的微生態(tài)平衡，從而維護(hù)機(jī)體的健康。其中有益菌主要包括雙歧桿菌(Bifidobacterium)(占80%90%)和乳桿菌(Lactobacillus)等，雙歧桿菌是腸道的微生物種群中的優(yōu)勢(shì)種群并與宿主終生伴隨，對(duì)整體種群起決定作用。一旦失去了優(yōu)勢(shì)種群，則微生態(tài)平衡失調(diào)。作為雙歧桿菌重要組成之一的青春雙歧桿菌(Bifildobacteriumadolescentis)直接或間接影響著人和動(dòng)物的生理變化和免疫功能，在機(jī)體內(nèi)的有無(wú)或多寡是衡量健康狀況的指標(biāo)之一。有害菌主要包括綠膿桿菌(Pseudomonas)、霍舌L菌(Cholera)、葡萄球菌(Staphylococcus)等，其中金黃色葡萄球菌(St即hylococcusaureus)是一種廣泛存在的病原微生物，是交叉感染的主要病原菌和重要傳染源。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，該方法包括如下步驟(1)取鹿茸的乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的萃取部位干膏，溶于無(wú)菌水中，制成濃度為100-1200gmL—1的各供試品溶液；(2)在恒溫37t:、厭氧、無(wú)菌條件下，將雙歧桿菌接種到TPY培養(yǎng)基中形成雙歧桿菌的懸浮液，其濃度為0.55X106個(gè)細(xì)胞/mL;(3)取所述雙歧桿菌的懸浮液，分別與2939倍量的鹿茸各萃取部位的不同濃度供試品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量熱儀中檢測(cè)，記錄熱譜曲線；(4)分析熱譜曲線中各參數(shù)隨鹿茸各萃取部位的不同濃度的變化關(guān)系，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)鹿茸各萃取部位對(duì)胃腸道有益菌的特征菌群生長(zhǎng)代謝的影響。上述方法在步驟(4)之后還可以進(jìn)一步包括如下步驟(5)根據(jù)所述熱譜曲線的生長(zhǎng)速率常數(shù)k，得到促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的有效率E的最大值，依據(jù)該最大值確定促菌活性最強(qiáng)的部位，取該活性部位的干膏，加入無(wú)菌水溶解，制成濃度為100-1200gmL—1的活性部位的供試品溶液；(6)在恒溫37t:、無(wú)菌條件下，將葡萄球菌接種到蛋白胨培養(yǎng)基中形成葡萄球菌的懸浮液，其濃度為0.55X106個(gè)細(xì)胞/mL;(7)取所述葡萄球菌的懸浮液，與2939倍量的所述活性部位不同濃度的供試品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量熱儀中檢測(cè)，記錄熱譜曲線；(8)分析熱譜曲線中各參數(shù)隨所述活性部位的不同濃度的變化關(guān)系，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)鹿茸所述活性部位對(duì)胃腸道有害菌的特征菌群生長(zhǎng)代謝影響。其中，所述雙歧桿菌為青春雙歧桿菌；所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌；步驟(1)所述各萃取部位溶液的系列濃度為100iigmL—^200ygmL—\400iigmL—丄、600iigmL—丄、800iigmL—丄、1200iigmL—1;步驟(2)所述雙歧桿菌的懸浮液的濃度優(yōu)選1.5X106個(gè)細(xì)胞/mL;步驟(5)所述活性部位溶液的系列濃度為100iigmL—^200ygmL—\400iigmL—丄、600iigmL—丄、800iigmL—丄、1200iigmL—1;步驟(6)所述葡萄球菌的懸浮液的濃度優(yōu)選1.5X106個(gè)細(xì)胞/mL;所述干膏的制備步驟如下(1)取鹿茸粉末812g，加610倍量5080%乙醇回流提取2-3次，每次1_2小時(shí)，合并藥液，濃縮成相對(duì)密度為0.9g/ml的浸膏；(2)用乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)所述浸膏分別分級(jí)萃取，每種溶劑萃取23次，每次20ml，分別合并各萃取液，得到乙醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，將各萃取部位減壓干燥得干膏。本發(fā)明建立了靈敏表征鹿茸中具有補(bǔ)益活性的4種萃取部位對(duì)胃腸道特征菌群生長(zhǎng)代謝影響的評(píng)價(jià)方法。該方法著眼于捕獲微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能量變化的特征，采用微量熱法研究鹿茸中4種萃取部位的不同濃度對(duì)胃腸道主要有益菌(青春雙歧桿菌)生長(zhǎng)代謝的影響，以生長(zhǎng)速率常數(shù)(k)、最大產(chǎn)熱功率(Pmax)、達(dá)峰時(shí)間(tp)和有效率(E)等生物熱動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)為指標(biāo)，對(duì)其促菌活性進(jìn)行客觀、量化的評(píng)價(jià)，篩選鹿茸各萃取部位中促菌活性最強(qiáng)的部位；進(jìn)一步考察該活性部位對(duì)病原微生物(金黃色葡萄球菌)生長(zhǎng)抑制的作用規(guī)律，客觀且靈敏地對(duì)鹿茸藥效部位進(jìn)行評(píng)價(jià)，為名貴補(bǔ)益中藥鹿茸及其他化學(xué)成分復(fù)雜中藥的研究提供了新的研究思路、方法和試驗(yàn)基礎(chǔ)。本發(fā)明以腸道中兩種主要的有益菌(雙歧桿菌)和有害菌(葡萄球菌)為代表，通過(guò)獲取能全面反映作用過(guò)程、具有整體表達(dá)特征的熱譜曲線等綜合信息，客觀量化地評(píng)價(jià)鹿茸醇提液的不同萃取部位對(duì)胃腸道微生物生長(zhǎng)代謝的影響，篩選鹿茸促菌作用最強(qiáng)的活性部位，同時(shí)考察該活性部位的抑菌作用；本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單，易于檢測(cè)的規(guī)范化、自動(dòng)化。本發(fā)明的特點(diǎn)在于(1)建立了靈敏表征鹿茸中具有補(bǔ)益活性的4種萃取部位對(duì)胃腸道特征菌群生長(zhǎng)代謝影響的評(píng)價(jià)方法；(2)該方法在密封獨(dú)立的環(huán)境中進(jìn)行，干擾小，能夠真實(shí)動(dòng)態(tài)全面反映鹿茸活性部位與細(xì)菌的相互作用，客觀評(píng)價(jià)鹿茸的藥效；(3)所選生物模型之腸道有益菌(青春雙歧桿菌)能夠真實(shí)表征鹿茸補(bǔ)益的功效，從而來(lái)篩選鹿茸提取物中促菌作用最強(qiáng)的活性部位；(4)所選生物模型之腸道有害菌(金黃色葡萄球菌)能夠真實(shí)表征鹿茸藥效的毒副作用，從而為其安全性提供參考依據(jù)；(5)該方法優(yōu)化了測(cè)定條件，有利于準(zhǔn)確測(cè)定；(6)評(píng)價(jià)的參數(shù)全面，客觀并且能夠量化，自動(dòng)化操作簡(jiǎn)單，有利于檢測(cè)方法的規(guī)范化。(7)建立了綜合評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法。圖1為鹿茸醇提液的各萃取部位對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)代謝影響的熱譜曲線，其中(a)為正丁醇部位、(b)為乙醚部位、(c)為氯仿部位、(d)為乙酸乙酯部位(37t:，TPY培養(yǎng)基)；圖2為鹿茸醇提液的正丁醇萃取部位對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝影響的熱譜曲線(37t:，蛋白胨培養(yǎng)基)；圖3為鹿茸醇提液正丁醇萃取部位作用于兩種腸道特征菌群的生長(zhǎng)速率(k)比較分析圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。61.儀器TAMIII多通道微量量熱儀(ThermometricAB，瑞典)，配以TAMAssistant數(shù)據(jù)采集和分析軟件，實(shí)驗(yàn)時(shí)系統(tǒng)控溫于37t:;YXQLS-B全自動(dòng)立式電熱蒸汽滅菌器(上海降拓儀器設(shè)備有限公司)，BS210S型電子天平(Sartorious，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。2.試齊U菌株青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis，AS.1.2190)、金黃色葡萄球菌(St即hylococcusaureus,CCTCCAB910393)由中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。3.TPY培養(yǎng)基胰酶解酪朊10g，植質(zhì)蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，CaCl20.15g，葡萄糖5g，F(xiàn)eCl30.005g，K2HP042g，吐溫801mL，MgCl26H200.5g，半胱氨酸-HC10.5g，ZnS04*7H200.25g，瓊脂15g，溶于1L蒸餾水中，用lmol/LHC1溶液調(diào)節(jié)pH至6.8后分裝，12rC高壓蒸汽滅菌15min，4t:貯存?zhèn)溆谩?.蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，溶于1L蒸餾水中，用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2后分裝，12rC高壓蒸氣滅菌30min，4"貯存?zhèn)溆谩?.梅花鹿茸(批號(hào)20080119)購(gòu)于北京同仁堂吉林人參有限責(zé)任公司。6.所有試劑均為分析純。實(shí)施例1鹿茸醇提液各萃取部位對(duì)胃腸道有益菌生長(zhǎng)代謝的影響1.供試品溶液的配制取梅花鹿茸粉末12g，加10倍量80%乙醇回流提取3次，每次1小時(shí)，合并藥液，濃縮成相對(duì)密度為O.9g/ml的浸膏；采用系統(tǒng)溶劑萃取法，用乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)所述浸膏分級(jí)萃取，每種溶劑萃取3次，每次20ml，分別合并各萃取液，得到乙醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，將各萃取部位減壓干燥得干膏；分別取各萃取部位干膏0.2g，加入適量無(wú)菌水溶解，配制成濃度分別為100iig*mL—^200yg*mL—^400yg*mL—\600iig*mL—^800yg*mL—^1200yg*mL—1的各萃取部位溶液，用0.45ym的濾膜過(guò)濾除菌，得到鹿茸各萃取部位的供試品溶液。2.測(cè)定方法在恒溫37t:、厭氧、無(wú)菌條件下，將1Xl(f個(gè)青春雙歧桿菌接種到TPY培養(yǎng)基中形成青春雙歧桿菌的懸浮液，其濃度為1.5X106個(gè)細(xì)胞/mL;取青春雙歧桿菌的懸浮液0.05ml，分別與鹿茸各萃取部位的不同濃度供試品溶液1.95ml混合于安瓿瓶中，密封；在微量量熱儀中用安瓿提升器將安瓿放入測(cè)量筒上半部的預(yù)熱位置，將試樣預(yù)熱20分鐘，然后將試樣降落到測(cè)量杯(測(cè)量筒和測(cè)量杯均位于測(cè)量通道內(nèi)，測(cè)量筒是上半部分，當(dāng)樣品進(jìn)入儀器時(shí)，先要在上半部分預(yù)熱，之后降落到底部測(cè)量杯部位)中進(jìn)行檢測(cè)，記錄熱譜曲線；當(dāng)曲線重新返回基線時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。各萃取部位作用下青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)代謝熱譜曲線見(jiàn)圖1。3.結(jié)果3.1青春雙岐桿菌生長(zhǎng)速率常數(shù)k的測(cè)定將圖1中鹿茸各萃取部位的指數(shù)生長(zhǎng)期的Pt、t值代入式(1)中，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性擬合得到細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速率常數(shù)k，結(jié)果見(jiàn)表1。表1鹿茸各萃取部位作用下青春雙岐桿菌生長(zhǎng)代謝的生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.2有效率E的測(cè)定由于細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期的養(yǎng)分和氧氣供應(yīng)量有限，細(xì)菌在該期繁殖生長(zhǎng)十分迅速，熱譜曲線呈指數(shù)上升，此期細(xì)菌的形態(tài)、染色性、生理活性等對(duì)外界藥物等因素的作用都比較敏感，考察生物學(xué)各方面指標(biāo)多選用該期。由表1可知，青春雙岐桿菌的生長(zhǎng)狀況與其指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率常數(shù)(k)的相關(guān)性顯著，并且k與濃度的量效關(guān)系及其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均較好，即k能很好地表征藥物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響及其生長(zhǎng)規(guī)律，因此本發(fā)明選擇k作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行有效率E的計(jì)算。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中kt為鹿茸各萃取部位作用下的指數(shù)生長(zhǎng)期最大生長(zhǎng)速率常數(shù)，k。為空白樣品指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率常數(shù)。鹿茸各萃取部位作用下青春雙岐桿菌生長(zhǎng)的有效率見(jiàn)表2。表2鹿茸各萃取部位對(duì)青春雙岐桿菌生長(zhǎng)速率常數(shù)和有效率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*r:相關(guān)系數(shù)3.3鹿茸醇提液的各萃取部位促進(jìn)胃腸道有益菌生長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果分析將鹿茸醇提液各萃取部位促進(jìn)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)的有效率進(jìn)行比較，可以看出，相比于空白對(duì)照組，青春雙岐桿菌在鹿茸醇提液各萃取部位作用下的k均增大，表明醇提液各萃取部位均有促進(jìn)青春雙岐桿菌生長(zhǎng)的作用。各萃取部位E的大小順序均為正丁醇部位>乙醚部位>氯仿部位>乙酸乙酯部位。以上結(jié)果表明，4個(gè)萃取部位的促菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)檎〈疾课?gt;乙醚部位>氯仿部位>乙酸乙酯部位。結(jié)合圖1的熱譜曲線，可以發(fā)現(xiàn)圖l(a)曲線的整體走行趨勢(shì)最好、規(guī)律性最強(qiáng)，最能體現(xiàn)萃取部位的促菌特性。以上結(jié)果說(shuō)明，鹿茸醇提液正丁醇萃取部位所含的有效成分和活性物質(zhì)更多更完全，藥效更強(qiáng)，作用更持久，更能反應(yīng)鹿茸的促菌作用特點(diǎn)。因此，可以選擇正丁醇萃取部位對(duì)鹿茸的抑菌作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)施例2鹿茸醇提液正丁醇萃取部位對(duì)胃腸道有害菌生長(zhǎng)代謝的影響1.測(cè)定方法在恒溫37°C、無(wú)菌條件下，將1X106個(gè)金黃色葡萄球菌接種到蛋白胨培養(yǎng)基中形成金黃色葡萄球菌的懸浮液，其濃度為1.5X106個(gè)細(xì)胞/mL;取金黃色葡萄球菌的懸浮液0.05ml，與實(shí)施例1中制備的鹿茸正丁醇萃取部位不同濃度的供試品溶液1.95ml在安瓿瓶中混合，密封，用安瓿提升器將安瓿放入測(cè)量筒上半部的預(yù)熱位置，將試樣預(yù)熱20分鐘，，然后將試樣降落到測(cè)量杯中進(jìn)行檢測(cè)，記錄熱譜曲線；當(dāng)曲線重新返回基線時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。正丁醇萃取部位作用下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的熱譜曲線見(jiàn)圖2。2.鹿茸醇提液正丁醇萃取部位對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝測(cè)定結(jié)果將鹿茸醇提液正丁醇萃取部位的指數(shù)生長(zhǎng)期的Pt、t值代入式(1)中，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性擬合得到細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速率常數(shù)k，結(jié)果見(jiàn)表3。表3鹿茸醇提液正丁醇萃取部位作用下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.鹿茸醇提液正丁醇萃取部位對(duì)胃腸道有害菌生長(zhǎng)代謝的測(cè)定結(jié)果分析將金黃色葡萄球菌空白組的熱譜曲線與不同濃度正丁醇萃取部位作用下的熱譜曲線進(jìn)行比較(見(jiàn)圖2)可以看出，當(dāng)濃度c<200i!gmL—1時(shí)，供試品溶液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝影響不明顯，隨著濃度的增加，停滯期延長(zhǎng)，達(dá)峰時(shí)間t后移，生長(zhǎng)速率常數(shù)k、最大產(chǎn)熱功率P隨之降低，峰形變得平緩，其整體代謝時(shí)間延長(zhǎng)。表明鹿茸正丁醇萃取部位對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝有不同程度的抑制作用，其抑制程度隨濃度的增大而增強(qiáng)。通過(guò)篩選得指數(shù)生長(zhǎng)期的P和生長(zhǎng)速率常數(shù)k能較全面地代表細(xì)菌的熱譜信息，且兩參數(shù)與相應(yīng)濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系k=862.76-0.3359c，r=0.9903。這些參數(shù)均可作為評(píng)價(jià)正丁醇萃取部位對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)弱的客觀指標(biāo)。結(jié)論鹿茸醇提液中4種萃取部位均對(duì)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)代謝有促進(jìn)作用，其生物熱動(dòng)力學(xué)過(guò)程可借助熱譜曲線及其特征參數(shù)進(jìn)行客觀地表征。一方面，鹿茸不同活性部位促進(jìn)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)代謝的強(qiáng)度按正丁醇部位、乙醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位順序依次減弱；另一方面，乙醇部位、乙酸乙酯部位和氯仿部位對(duì)有益菌(青春雙岐桿菌)的作用強(qiáng)度差異較正丁醇部位的小，即選擇性不強(qiáng)，同時(shí)作為活性最強(qiáng)的正丁醇部位在一定濃度范圍內(nèi)能有效抑制有害菌(金黃色葡萄球菌)的生長(zhǎng)。這也是該部位活性最強(qiáng)、藥效最好的原因之一。另外，將能最大程度表征正丁醇萃取部位對(duì)兩種腸道特征菌群(青春雙岐桿菌、金黃色葡萄球菌)生長(zhǎng)代謝的熱力學(xué)參數(shù)k進(jìn)行對(duì)比分析(見(jiàn)圖3)可知，隨著正丁醇萃取部位濃度的增加，青春雙岐桿菌的生長(zhǎng)速率常數(shù)k逐漸增加，說(shuō)明該部位具有促進(jìn)有益菌(青春雙岐桿菌)生長(zhǎng)的作用；而且在較大濃度時(shí)，正丁醇萃取部位還會(huì)對(duì)有害菌(金黃色葡萄球菌)產(chǎn)生抑制作用。因此，臨床常用的調(diào)節(jié)代謝功能、抗衰老的鹿茸在規(guī)定的用量及服用時(shí)間間隔的條件下，可直接促進(jìn)有益菌的正常生長(zhǎng)代謝，待有益菌的數(shù)量和活力恢復(fù)到正常狀態(tài)時(shí)，亦可抑制腐敗菌或致病菌的生長(zhǎng)，維持腸道微生態(tài)平衡。本發(fā)明以鹿茸作為模型藥，根據(jù)生物熱力學(xué)的理論和方法，采用微量熱法研究鹿茸不同化學(xué)萃取部位對(duì)腸道特征菌群代謝的影響。結(jié)果表明，鹿茸不同活性部位促進(jìn)青春雙歧桿菌生長(zhǎng)代謝強(qiáng)弱順序?yàn)檎〈疾课?gt;乙醚部位>氯仿部位>乙酸乙酯部位?；钚宰顝?qiáng)的正丁醇萃取部位對(duì)金黃色葡萄球菌抑制影響的研究表明，正丁醇萃取部位的濃度大于200iig*mL—1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)具有抑制作用。此外，、隨供試品溶液濃度的增加而相應(yīng)地延長(zhǎng)；k、P和E均隨濃度的增加而相應(yīng)地減小。微量熱法具有靈敏準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可用于名貴藥材一一鹿茸的活性部位的篩選，也為藥效物質(zhì)的研究提供了一個(gè)新的研究思路和方法。權(quán)利要求一種評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，包括如下步驟(1)取鹿茸的乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的萃取部位干膏，溶于無(wú)菌水中，制成濃度為100-1200μg·mL-1的各供試品溶液；(2)在恒溫37℃、厭氧、無(wú)菌條件下，將雙歧桿菌接種到TPY培養(yǎng)基中形成雙歧桿菌的懸浮液，其濃度為0.5～5×106個(gè)細(xì)胞/mL；(3)取所述雙歧桿菌的懸浮液，分別與鹿茸各萃取部位的不同濃度供試品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量熱儀中檢測(cè)，記錄熱譜曲線；(4)分析熱譜曲線中各參數(shù)隨鹿茸各萃取部位的不同濃度的變化關(guān)系，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)鹿茸各萃取部位對(duì)胃腸道有益菌的特征菌群生長(zhǎng)代謝的影響。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，在步驟(4)之后進(jìn)一步包括如下步驟(5)根據(jù)所述熱譜曲線的生長(zhǎng)速率常數(shù)k，得到促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的有效率E的最大值，依據(jù)該最大值確定促菌活性最強(qiáng)的部位，取該活性部位的干膏，加入無(wú)菌水溶解，制成濃度為100-1200gmL—1的活性部位的供試品溶液；(6)在恒溫37t:、無(wú)菌條件下，將葡萄球菌接種到蛋白胨培養(yǎng)基中形成葡萄球菌的懸浮液，其濃度為0.55X106個(gè)細(xì)胞/mL;(7)取所述葡萄球菌的懸浮液，與所述活性部位不同濃度的供試品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量熱儀中檢測(cè)，記錄熱譜曲線；(8)分析熱譜曲線中各參數(shù)隨所述活性部位的不同濃度的變化關(guān)系，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)鹿茸所述活性部位對(duì)胃腸道有害菌的特征菌群生長(zhǎng)代謝影響。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，所述雙歧桿菌為青春雙歧桿菌。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，所述葡萄球菌為金黃色葡萄球菌。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，步驟(1)所述各萃取部位溶液的系歹'J濃度為100iigmL—丄、200iigmL—丄、400iigmL—丄、600iigmL—丄、800iigmL—\1200iigmL—、6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，步驟(2)所述雙歧桿菌的懸浮液的濃度為1.5X106個(gè)細(xì)胞/mL。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，步驟(5)所述活性部位溶液的系歹'J濃度為100iigmL—丄、200iigmL—丄、400iigmL—丄、600iigmL—丄、800iigmL—\1200iigmL—、8.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，步驟(6)所述葡萄球菌的懸浮液的濃度為1.5X106個(gè)細(xì)胞/mL。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，其特征在于，所述干膏的制備步驟如下(1)取鹿茸粉末812g，加610倍量5080%乙醇回流提取2-3次，每次1_2小時(shí)，合并藥液，濃縮成浸膏；(2)用乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)所述浸膏分別分級(jí)萃取，每種溶劑萃取23次，每次20ml，分別合并各萃取液，得到乙醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，將各萃取部位減壓干燥得干膏。全文摘要本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)鹿茸藥效的方法，該方法以胃腸道中雙歧桿菌為有益菌代表、葡萄球菌為有害菌代表，通過(guò)獲取能全面反映作用過(guò)程、具有整體表達(dá)特征的熱譜曲線等綜合信息，客觀量化地評(píng)價(jià)鹿茸醇提液的不同萃取部位對(duì)胃腸道微生物生長(zhǎng)代謝的影響，篩選鹿茸促菌作用最強(qiáng)的活性部位，同時(shí)考察該活性部位的抑菌作用；本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單，易于檢測(cè)的規(guī)范化、自動(dòng)化。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101768622SQ20091024315公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年12月30日優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日發(fā)明者唐慧英,張萍,肖小河,鄢丹,韓玉梅申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院