專利名稱：一種新型抗eb病毒所致腫瘤多肽及其應用與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領(lǐng)域，特別涉及一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽及其應 用與制備方法。
背景技術(shù)：
在抗生素研究領(lǐng)域，人們一直在致力于開發(fā)模仿同種異株細菌之間互相殺傷的工 作方式來開發(fā)新型抗生素，自然界中有不少細菌毒素直接在細菌胞膜上形成離子通道來殺 死細菌，其模式標本就是大腸桿菌分泌的一種細菌毒素-大腸菌素。其中大腸菌素Ia自 1952年被Jacob發(fā)現(xiàn)之后，經(jīng)過數(shù)代人的努力，1996年Qiu et al (Major transmemebrane movementsoociated with colicin Ia channel gating. J. Gen. Physiology, 107 313-328(1996))終于揭示了大腸菌素Ia在人工脂質(zhì)雙分子膜上所形成離子通道開放和關(guān) 閉時的跨膜立體結(jié)構(gòu)，為在分子水平上設(shè)計和制備新型的抗菌素奠定了理論基礎(chǔ)。并相繼 有大腸菌素多肽與白色連珠球菌信息素、葡萄球菌信息素等信號肽分子連接而成的多肽分 子能夠通過信息素識別靶細菌細胞，將大腸菌素引導到靶細菌細胞膜上形成跨膜離子通道 導致胞容物外泄致死細胞。惡性腫瘤是對人類健康的巨大威脅。全世界每年死于惡性腫瘤的患者約有七百萬 人，其中中國就占有六分之一，惡性腫瘤已是我國第二位的死亡原因。由于其病因、發(fā)病機 制、臨床表現(xiàn)尚未闡明，故防治效果不理想?，F(xiàn)有抗腫瘤藥物在腫瘤治療中占重要地位，雖 然對一些腫瘤已取得一定的療效，但仍存在著對腫瘤細胞的選擇性差，免疫抑制及不良反 應多而嚴重，產(chǎn)生耐藥性等缺陷。EB病毒所致的非洲兒童惡性淋巴肉瘤，Hodgkin' s淋巴肉瘤和鼻咽癌細胞表面 均帶有特異的EB病毒表面抗原，因此，EB病毒表面抗原可以認為是該類腫瘤細胞的一種 特異性標志物。在EB病毒所致的腫瘤藥物上，專利號為ZL200410081446. 8的發(fā)明，公開 了大腸菌素與識別EB病毒表面抗原的模擬抗體結(jié)合形成的抗腫瘤多肽，能夠特異性殺 死機體中的EB病毒所致癌細胞，而對正常細胞沒有傷害，殺傷力是其他抗癌藥物的若干 倍，克服了近年來使用的抗腫瘤藥物中存在的藥物選擇性差、產(chǎn)生耐藥性、殺死癌細胞的 同時正常組織也受到嚴重損傷等問題，Xiao-Qing Qiu等，2007的文章中對比了一系列結(jié) 構(gòu)的模擬抗體與大腸菌素構(gòu)成的抗腫瘤多肽的殺腫瘤的能力，發(fā)現(xiàn)VhCDR1-VhF&-VlCDR3 及八CDR1-VHFR2-VHCDR3兩種結(jié)構(gòu)的模擬抗體與大腸菌素構(gòu)成的抗腫瘤多肽具有較好的 殺傷能力(Xiao-Qing Qiu et al. , 2007, Small antibody mimetics comprising two complementarity-determining regions and aframework region for tumor targeting, Nature Biotechnology 25,921-929,1 August 2007)，這為進一步制備抗EB病毒所致腫瘤 多肽提供了更多的候選模擬抗體。但是在上述抗腫瘤多肽中，由于大腸菌素多肽的熟睡端存在較易引起超敏反應的 氨基酸殘基，有可能導致含有大腸桿菌多肽的藥物較易引起機體異常的免疫應答；有研究 報道，很多癌癥患者由于其代謝機制受到癌細胞干擾而不正常，對多肽類藥物容易產(chǎn)生過敏反應，而導致不能用藥，因此有必要對大腸菌素多肽進行改進，以獲得更安全適合更多患 者的抗癌藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的不足，提供一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽及其應 用與制備方法。為治療EB病毒所致腫瘤提供高殺傷力、高特異性，且致敏可能性較低的藥 物?！N新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，由可形成離子通道的大腸菌素變構(gòu)多肽與抗 EB病毒抗體多肽或者抗EB病毒抗體的模擬抗體多肽可操作地連接構(gòu)成，所述可形成離子 通道的大腸菌素變構(gòu)多肽由野生型大腸菌素El、la、ΠκΑ、Β、Ν或其水性孔道結(jié)構(gòu)域的肽鏈 突變了氨基酸殘基G11A、H22G、A^G、V31L和H40D而獲得，所述抗EB病毒抗體多肽的氨基 酸序列與ATCC HB-168雜交瘤分泌的抗體多肽相同。所述模擬抗體多肽指所述抗EB病毒抗體的重鏈⑶Rl區(qū)、重鏈⑶R1-CDR2連接肽 段和輕鏈⑶R3的連接肽。所述可形成離子通道的大腸菌素變構(gòu)多肽由野生型大腸菌素Ia突變而來。所述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，具有如SEQ ID NO.四所示的氨基酸序列。編碼所述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因。所述基因，具有如SEQ ID NO. 30所示的核苷酸序列。含有上述基因的重組質(zhì)粒。上述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的制備方法，步驟如下將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 表達系統(tǒng)中進行表達，分離純化表達的多肽。上述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽在制備治療和預防EB病毒所致腫瘤的藥物中的 應用。一種大腸菌素Ia的變構(gòu)多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 24所示。編碼大腸菌素Ia的變構(gòu)多肽的基因。所述基因在制備多肽藥物中的應用，指將所述基因與誘導多肽的基因可操作地連 接并克隆到表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)化到表達系統(tǒng)中，分離純化表達的多肽本發(fā)明提供的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，由可形成離子通道的大腸菌素變構(gòu) 多肽與抗EB病毒的抗體多肽或者抗EB病毒的抗體的模擬抗體多肽構(gòu)成。由于野生大腸菌 素多肽分子中存在容易引起超敏反應的氨基酸殘基，本發(fā)明在可形成離子通道結(jié)構(gòu)的大腸 菌素的多肽分子中，選擇性地突變了疏水區(qū)段部分容易引起機體超敏反應的氨基酸殘基， 如本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，大腸菌素Ia的多肽突變位置為G11A、H22G、A^G、V31L和 H40D，實驗數(shù)據(jù)表明，采用大腸菌素Ia多肽和變構(gòu)的Ia多肽分別注射免疫小鼠，注射變構(gòu) 的Ia的小鼠產(chǎn)生的血清效價要比前者低1 2個數(shù)量級，即免疫應答水平較低，證明變構(gòu) 的多肽降低了引起機體過敏的可能性；同時變構(gòu)多肽仍然保留了在細胞膜上形成跨膜離子 通道的功能，實驗證明，本發(fā)明的重組多肽對腫瘤細胞的殺傷能力未受影響，說明突變的氨 基酸殘基沒有影響大腸菌素形成離子通道的功能。本發(fā)明提供的新型抗EB病毒所致腫瘤 多肽中，抗EB病毒的抗體多肽或者抗EB病毒的抗體的模擬多肽通過與EB病毒所致的腫瘤 細胞的表面特異性抗原識別，大腸菌素變構(gòu)多肽引導至靶細胞膜上，大腸菌素變構(gòu)多肽的跨膜離子通道結(jié)構(gòu)域疏水區(qū)段插入腫瘤細胞膜中，進而形成離子通道，靶腫瘤細胞因內(nèi)容 物泄漏而被致死；抗EB病毒的抗體多肽的氨基酸序列完全參照ATCC HB-168雜交瘤細胞分 泌單克隆抗體的多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的實施例中優(yōu)選采用上述抗EB病毒抗體的模擬抗體多肽可操作地連接在 大腸菌素變構(gòu)多肽的羧基端而獲得分子量較小的本發(fā)明的抗腫瘤多肽，即這些小分子模擬 多肽僅包括該抗EB病毒的抗體多肽的VhCDRI區(qū)、Vf DR3區(qū)，VHOTR1-VHCDR2連接肽段和輕鏈 VlCDR3區(qū)連接的肽鏈VhCDR1-VhF&-VlCDR3，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 25所示的新型抗 腫瘤多肽1的模擬抗體，模擬抗體僅包含不到30個氨基酸，在分子量上遠遠小于天然抗體 150個氨基酸，既達到了對抗原識別能力的要求又大幅度消減了抗腫瘤多肽的分子量，有利 于提高本發(fā)明抗腫瘤多肽在組織中的穿透能力。本發(fā)明的另一目的是提供編碼本發(fā)明所述抗腫瘤多肽的基因序列。本發(fā)明抗腫瘤 多肽的基因由編碼大腸菌素變構(gòu)多肽的基因與編碼抗EB病毒的抗體多肽的基因或者其模 擬抗體多肽的基因可操作地連接構(gòu)成，其中大腸菌素多肽和抗EB病毒抗體的基因序列是 已知的，大腸菌素變構(gòu)多肽的基因是在大腸菌素多肽基因的相應密碼子上進行如下點突變 而得G11A、H22G、A26G, V31L和H40D。由于密碼子的兼并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不改變 氨基酸序列的前提下對編碼本發(fā)明所述的抗腫瘤多肽的核苷酸序列進行調(diào)整。本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒，是指將裝載了野生大腸菌素基因的原始載體進行雙鏈核 苷酸點突變，在目標突變位置上插入突變密碼子，獲得含有大腸菌素變構(gòu)多肽的基因的突 變載體，相同的點突變技術(shù)將編碼抗EB病毒的抗體的模擬抗體基因經(jīng)插入到大腸菌素變 構(gòu)多肽基因的羧基端，得到本發(fā)明的重組質(zhì)粒。原始載體PSELECTtm-I購于!Iomega公司，其 中裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因，點突變操作按照Mrategene公司試劑盒說明 書；本發(fā)明針對點突變制備大腸菌素變構(gòu)多肽，其中突變了 5個密碼子，因此設(shè)計了 5對引 物序列(SeqID No. 1 10)；本發(fā)明實施例中針對模擬抗體基因設(shè)計了 6對引物序列(Seq ID No. 11 2 。本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述抗腫瘤多肽的方法，是將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染入大腸桿菌BL21(DE3)工程菌中，篩選出陽性克隆，分離純化陽性克隆表達的蛋白即能 得到為本發(fā)明新型抗EB病毒所致腫瘤多肽。本發(fā)明提供的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，可在制備治療或預防EB病毒所致腫 瘤的藥物中應用?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明中獲得的新型抗生素的多肽添加到藥學上可接受的載 體或者賦形劑或可選的其它成分而制成臨床上適用的藥物組合物。本發(fā)明還提供了大腸菌素Ia變構(gòu)多肽的氨基酸序列和基因序列，該變構(gòu)多肽不 僅可用于本發(fā)明中，還可以與其他引導多肽構(gòu)成抗體多肽，本發(fā)明實施例3的實驗數(shù)據(jù)一 方面證明了含有該變構(gòu)多肽的多肽藥物具有較低的抗原性，也證明該變構(gòu)多肽與其他引導 多肽構(gòu)成抗體多肽具有殺菌能力，而制備方法是本領(lǐng)域的常規(guī)實驗操作。本發(fā)明提供的新型抗腫瘤多肽，具有專利號ZL200410081446.8的發(fā)明所公開的 抗腫瘤多肽的優(yōu)點，即高特異性的靶向性和對正常細胞的安全性，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點， 同時本發(fā)明的抗腫瘤多肽通過對大腸菌素多肽中易引起超敏反應的氨基酸殘基進行了突 變，降低了含該變構(gòu)多肽的抗腫瘤多肽的免疫原性，即降低了引起過敏反應的可能性，改進 了現(xiàn)有該類多肽的藥物使用安全性和殺腫瘤效果，還為其他含大腸菌素多肽的藥物提供了改進的參考。


圖1.含有模擬抗體多肽VhCDR1-VhF&-\CDR3的基因和大腸菌素Ia變構(gòu)多肽基因 的重組質(zhì)粒pCHCEBll的結(jié)構(gòu)示意2.含有模擬抗體多肽VhOTRI-VhFI^2- (Rev) Vf DR3的基因和大腸菌素Ia變構(gòu)多 肽基因的重組質(zhì)粒PCHCEB22的結(jié)構(gòu)示意3.大腸菌素Ia變構(gòu)多肽的致敏效果實驗1(A)昆明小鼠腹腔注射致死劑量的耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA42)，隨機分組為 (1)對照組，⑵氨芐青霉素組，⑶抗金葡菌多肽(ZL 01128836. 1)組，⑷抗金葡菌多肽 1組。(B) 14天后，再取昆明小鼠一批作為對照和氨芐青霉素組，抗金葡菌多肽組及抗金 葡菌多肽1組存活鼠作為抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組重復上述試驗。(041天后，再取昆明小鼠一批作為(1)對照組、(2)左氧氟沙星組和(3)頭孢曲 松鈉組，(4)抗金葡菌多肽組及( 抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗綠膿桿菌多肽2組及 抗綠膿桿菌多肽1組。。圖4.大腸菌素Ia變構(gòu)多肽的低致敏效果實驗2(A)抗金葡菌多肽/抗綠膿桿菌多肽2組血清，1 50，000滴度；(B)抗金葡菌多肽1/抗綠膿桿菌多肽1組血清，1 50，000滴度。(1)第一周，(2)第二周，⑶第7周血清。(4)陰性對照。圖5.新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致人惡性淋巴肉瘤(Burkitt，s lymphoma)體 外殺傷效果比較(A)對照組，⑶新型抗腫瘤多肽1處理組，(C)新型抗腫瘤多肽2處理組。圖6.新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’ s人惡性淋巴肉瘤細胞和其它腫瘤 細胞的體外殺傷作用(A)EBV病毒陽性的Burkitt，s人惡性淋巴肉瘤細胞，(B)EBV病毒陰性的Burkitt，s人惡性淋巴肉瘤細胞，(C)EBV病毒陽性的愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞。(1)對照組，(2)新型抗腫瘤多肽1處理組。。圖7新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’ s人惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠 體內(nèi)生長出的實體腫瘤的殺傷作用(A)對照組。(B)新型抗腫瘤多肽1處理組的SCID免疫缺陷鼠，鼠雙腋下均接種Burkitt’s人 惡性淋巴肉瘤細胞。左邊箭頭，EBV病毒陰性的淋巴肉瘤，右邊箭頭，EBV病毒陽性的淋巴肉瘤。圖8新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitts人惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠體 內(nèi)生長出的實體腫瘤的殺傷作用(A)對照鼠EBV病毒陰性的淋巴肉瘤切片，⑶對照鼠EBV病毒陽性的淋巴肉瘤切 片，(C)新型抗腫瘤多肽1處理鼠EBV病毒陰性的淋巴肉瘤切片，(D)新型抗腫瘤多肽1處理鼠EBV病毒陽性的淋巴肉瘤切片。
具體實施例方式結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施例的描述具體說明本發(fā)明。本發(fā)明所用的原始質(zhì)粒pSELECT -l購于Promega公司。工程菌E.coli BL-21(DE3)工程菌，購于 Novagen 公司。實施例1.構(gòu)建含編碼突變大腸菌素Ia的基因的重組質(zhì)粒原始質(zhì)粒為原始質(zhì)粒為裝載了大腸菌素多肽Ia和immunity蛋白基因 的pSELECT -l質(zhì)粒(8. 3kb)(購于!Iomega公司)，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(shù) (QuickChange Kit, Strategene公司)分別將編碼突變氨基酸的基因如=SEQ ID NO 1 10所示的寡聚核苷酸引物序列與野生型大腸菌素Ia的基因可操作地連接，獲得如SEQ ID NO. 23所示編碼大腸菌素Ia變構(gòu)多肽的基因，同時得到突變質(zhì)粒；再將編碼模擬抗體的基 因SEQ ID NO. 26或SEQ IDN0. 28插入到突變質(zhì)粒中大腸菌素Ia變構(gòu)多肽的基因的16 位密碼子之后，制備出到新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的兩種重組質(zhì)粒pCHCEBll (如圖1 所示)，pCHCEB22 (如圖2所示)，為制備重組質(zhì)粒中編碼抗EB病毒抗體的模擬抗體基因 所設(shè)計的6條寡聚核苷酸引物序列如SEQ ID NOll 22所示。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入E. coli BL21(DE3)工程菌(購于Novagen公司)里制備多肽，獲得序列表中SEQ ID NO. 25(在后面 的實施例中稱為“新型抗腫瘤多肽1”)和SEQID NO. 27(在后面的實施例中稱為“新型抗腫 瘤多肽2”)所示。雙鏈寡聚核苷酸點突變程序按Strategene QuickChang Site-Directed MutagenesisKit (catalog#200518)試齊[J盒進行。1.準備點突變反應物5ul IOX buffer2ul (IOng)裝載了野生型大腸菌素變構(gòu)多肽和immunity蛋白基因的原始質(zhì)粒 pSELECT -l。1. 25ul (125ng)設(shè)計的5，_3，寡聚核苷酸引物1. 25ul (125ng)設(shè)計的3，_5，寡聚核苷酸引物Iul dNTP雙蒸水50ulIul pfu(除質(zhì)粒、引物和雙蒸水外，均為試劑盒所備試劑)2.進行PCR擴增，擴增條件變性950C，35秒，退火53°C，70秒，延伸68°C，17分， 共20個循環(huán)；3.加入Dpn 1內(nèi)切酶Iul消化母體DNA鏈(37 °C，1小時)，取Iul反應物與 XLl-Blue感受態(tài)細胞50ul冰孵30分鐘，熱沖擊42°C，45秒，再置入冰中2分鐘；4.加入NZY培基0. 5ml，220rpm，37°C搖菌1小時，取50_100ul反應物鋪板(LB培 基加瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素，37 °C過夜)；5. 18小時后挑菌，提取質(zhì)粒后測序確定突變成功；6.將完成多個位點突變的最終獲得的重組質(zhì)粒50ng與制備的Ε. coliBL-21 (DE3)工程菌感受態(tài)細胞40ul冰孵5分鐘，42°C熱沖擊30秒，再置入冰中2分鐘，加 入Novagen公司SOC培養(yǎng)液160ul后220rpm，37°C搖菌1小時后鋪板(LB培基加1 %瓊脂， 加50ug/ml氨芐青霉素)37°C過夜。 7.挑取單克隆菌落大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，30°C，4-5小時，熱沖擊 250rpm，42°C，30 分鐘，250rpm，37°C，2 小時；離心沉淀菌體，4°C，6000g，20 分鐘，取 4°C， 50mM硼酸緩沖液OmM EDTA+2mM DTT) 50_80ml懸浮菌體，加入0. 2M PMSF 250毫升后，使 用超聲破碎(40C，400W, 2分鐘，)，高速離心沉淀破碎的菌體(40C，75，OOOg, 90分鐘)，取上 清加入硫酸鏈霉素500萬單位沉淀DNA，15000g, 4°C，10分鐘離心沉淀后，取上清裝入分子 量15，000透析袋于4°C，50mM硼酸緩沖液4升透析過夜后，再次15000g，4°C，10分鐘離心 沉淀，取上清上樣于CM離子交換柱，經(jīng)0. 1-0. 3M NaCl+50mM硼酸緩沖液梯度洗脫即可得到 重組抗腫瘤多肽。
點突變設(shè)計的引物序列如下
Seq ID NO. 1突變大腸菌素基因中GllA所設(shè)計的寡聚引物5，_3， cgt att aca aat ccc GCA gca gaa tcg ctg ggg Seq ID NO. 2突變大腸菌素基因中GllA所設(shè)計的寡聚引物3，_5， ccc cag cga ttc tgc TGC ggg att tgt aat acg Seq ID NO. 3突變大腸菌素基因中H22G所設(shè)計的寡聚引物5，_3， gat tea gat ggc GGT aaa tta tgg gtg
Seq ID NO. 4突變大腸菌素基因中H22G所設(shè)計的寡聚引物3，_5， cac cca taa ttt ACC gcc ate tga ate
Seq ID NO. 5突變大腸菌素基因中A26G所設(shè)計的寡聚引物5，_3， gaaa ttatgGGTgt tgatatttat
Seq ID N0. 6突變大腸菌素基因中A26G所設(shè)計的寡聚引物3，_5， ataaatatacaacACCcataatttc
Seq ID N0. 7突變大腸菌素基因中V31L所設(shè)計的寡聚引物5’ _3’ gt tgatatttat CTC aaccctc cacgtgtc
Seq ID N0. 8突變大腸菌素基因中V31L所設(shè)計的寡聚引物3’ _5’ gacacgtggagggttGAGataaatatcaac
Seq ID N0. 9突變大腸菌素基因中H40D所設(shè)計的寡聚引物5，_3， cgtgtcga tgtctttGATggtaccccgc ctgcat
Seq ID NO. 10突變大腸菌素基因中H40D所設(shè)計的寡聚引物3，_5， atgcaggcggggtaccATCaaagacatcgacacg Seq ID NO. 11 重組質(zhì)粒 pCHCEBll 中 VhCDRI 基因引物 5，-3， gcg aat aag ttc tgg ggt att TOC TTC GGT ATG CAT TGG GTG OGTCAGtaa ata aaa tat aag aca ggc
Seq ID NO. 12 重組質(zhì)粒 pCHCEBll 中 VhCDRI 基因引物 3，-5， gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG AOG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc
Seq ID NO. 13 重組質(zhì)粒 pCHCEBll 中 VhFR2 基因引物 5’ _3’
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaatat aag aca ggcSeq ID NO. 14 重組質(zhì)粒 pCHCEBll 中 VhFR2 基因引物 3，_5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg caccca atg cat accSeq ID NO. 15 重組質(zhì)粒 pCHCEBll 中(Rev) VLCDR3 基因引物 5’ _3’aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT CAG GGT taa ata tataag aca ggcSeq ID NO. 16 重組質(zhì)粒 pCHCEBll 中(Rev) VLCDR3 基因引物 3，_5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta AOC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cac cca ctc cagacc tttSeq ID NO. 17 重組質(zhì)粒 pCHCEB22 中 VhCDRI 基因引物 5，_3，gcg aat aag ttc tgg ggt att TOC TTC GGT ATG CAT TGG GTG OGT CAG taa ata aaa tataag aca ggcSeqID NO. 18 重組質(zhì)粒 pCHCEB22 中 VhCDRI 基因引物 3，_5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG AOG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaactt att cgcSeq ID NO. 19 重組質(zhì)粒 pCHCEB22 中 VhFI^2 基因引物 5’ -3’ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaatat aag aca ggcSeq ID NO. 20 重組質(zhì)粒 pCHCEB22 中 VhFI^2 基因引物 3’ -5’gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg caccca atg cat accSeq ID NO. 21 重組質(zhì)粒 pCHCEB22 中 VLCDR3 基因引物 5，-3，aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tataag aca ggcSeq ID NO. 22 重組質(zhì)粒 pCHCEB22 中 VLCDR3 基因引物 3，-5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctccag acc ttt實施例2.重組質(zhì)粒pCHCEBll、pCHCEB22制備的新型抗腫瘤多肽的免疫效果觀察取實施例1制備獲得重組質(zhì)粒pCHCEB 11、pCHCEB22制備得到的新型抗 腫瘤多肽1，新型抗腫瘤多肽2，發(fā)明人的前期專利中的抗腫瘤多肽1、抗腫瘤多肽 2(ZL200410081446. 8)各一份免疫小鼠上述各蛋白與佐劑混合后，基礎(chǔ)量和追加量為腹 腔注射每只50 μ g(0.5ml) 1次。間隔兩周，免疫5針。ELISA間接法檢測小鼠血清效價，本 發(fā)明制得的新型抗腫瘤多肽1和2所免疫小鼠血清效價為10_3至10_4而抗腫瘤多肽1、抗 腫瘤多肽2所免疫小鼠的血清效價為10_4至10_5?？梢姳景l(fā)明新型抗腫瘤多肽造成宿主致敏反應的可能性要比含野生型大腸菌素 Ia的抗腫瘤多肽造成宿主致敏反應的可能性低一至兩個數(shù)量級。
實施例3.構(gòu)成新型抗腫瘤多肽的大腸菌素Ia變構(gòu)多肽的低致敏效果實驗取實施例1中大腸菌素Ia變構(gòu)多肽(其水性孔道結(jié)構(gòu)域的肽鏈中突變了氨基酸 殘基Gl 1A、H22G、A26G、V31L和H40D)的突變質(zhì)粒，在其氨基端或羧基端可操作地連接金黃 色葡萄球菌信息素AgrDl (YSTCDFIM)，制備出兩種抗菌多肽。AgrDl連接在變構(gòu)的大腸菌素 Ia羧基端制備而得的多肽命名為抗金葡多肽l，AgrDl連接在變構(gòu)的大腸菌素Ia氨基端制 備而得的多肽命名為抗綠膿桿菌多肽1。取野生型大腸菌素Ia的質(zhì)粒，在其氨基端連接金 黃色葡萄球菌信息素AgrDl制備出抗綠膿桿菌多肽2。實驗1 取昆明小鼠一批，腹腔注射致死劑量耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA42)，隨 機分組為(1)對照組，(2)氨芐青霉素組，(3)抗金葡菌多肽組，(4)抗金葡菌多肽1組。每 組小鼠均為10只。處理方法腹腔注射致死劑量耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA42) 一小時后，對照組尾靜脈注射0. 5毫升0. 3M NaCl+50mM硼酸緩沖液一次；氨芐青霉素組尾靜脈注射氨芐青霉素2. 5mg/kg 一次；抗金葡菌多肽組尾靜脈注射發(fā)明人發(fā)明的抗金葡菌多肽(ZL 01128836. l)6mg/ kg 一次；抗金葡菌多肽1組尾靜脈注射抗金葡菌多肽16mg/kg —次。結(jié)果對照組及氨芐青霉素組鼠在兩天內(nèi)全部死亡。抗金葡菌多肽組及抗金葡菌 多肽1組有85%的鼠存活。實驗2 實驗1的第14天后，再取昆明小鼠一批作為對照和氨芐青霉素組，抗金葡 菌多肽組及抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組重復上述試 驗。對照組及氨芐青霉素組鼠在兩天內(nèi)全部死亡?？菇鹌暇嚯慕M有75%的鼠存活，抗金 葡菌多肽1組有90%的鼠存活。實驗3 實驗1的41天后，再取昆明小鼠一批作為對照組、左氧氟沙星組和頭孢曲 松鈉組，抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗綠膿桿菌多肽2組及抗綠膿桿 菌多肽1組。小鼠腹腔注射致死劑量多重耐藥綠膿桿菌(四川大學華西醫(yī)院試驗醫(yī)學系臨床 分離株13578) —小時后，對照組尾靜脈注射0. 5毫升0. 3M NaCl+50mM硼酸緩沖液一次，左氧氟沙星組尾靜脈注射左氧氟沙星5mg/kg —次，頭孢曲松鈉組尾靜脈注射頭孢曲松鈉30mg/kg —次，抗綠膿桿菌多肽2組尾靜脈注射綠膿桿菌多肽28mg/kg —次，抗綠膿桿菌多肽1組尾靜脈注射抗綠膿桿菌多肽18mg/kg —次。對照組和左氧氟 沙星組鼠在一天內(nèi)全部死亡。頭孢曲松鈉組有25%的鼠存活。抗綠膿桿菌多肽2組有60% 的鼠存活?？咕G膿桿菌多肽1組鼠全部存活，說明宿主抗體對變構(gòu)多肽殺傷效用的干擾比 對野生型多肽的干擾要低。見附圖3。在試驗第一周、第二周和第7周分別采取上述抗金葡菌多肽/抗綠膿桿菌多肽2 組和抗金葡菌多肽1/抗綠膿桿菌多肽1組存活鼠的血清進行ELISA間接法檢測其血中的抗體，酶標板的孔中分別包被野生型大腸菌素Ia和大腸菌素Ia變構(gòu)多肽，lOOng/well，一 抗分別為抗金葡菌多肽/抗綠膿桿菌多肽2組和抗金葡菌多肽1/抗綠膿桿菌多肽1組存 活鼠血清，2抗為山羊抗小鼠標記抗體，陰性對照以5%牛奶-PBS為一抗，1 50，000滴度 的所得結(jié)果如下(見附圖4)
權(quán)利要求
1.一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，由可形成離子通道的大腸菌素變構(gòu)多肽與抗EB 病毒抗體多肽或者抗EB病毒抗體的模擬抗體多肽可操作地連接構(gòu)成，所述可形成離子通 道的大腸菌素變構(gòu)多肽由野生型大腸菌素El、la、ΠκΑ、Β、Ν或其水性孔道結(jié)構(gòu)域的肽鏈突 變了氨基酸殘基G11A、H22G、A26G、V31L和H40D而獲得，所述抗EB病毒抗體的氨基酸序列 與ATCC HB-168雜交瘤分泌的單克隆抗體相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，所述模擬抗體多肽指所述抗 EB病毒抗體的重鏈⑶Rl區(qū)、重鏈⑶Rl-⑶R2連接肽段和輕鏈⑶R3的連接肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，所述可形成離子通道的大腸菌 素變構(gòu)多肽由野生型大腸菌素Ia突變而來。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽，所述新型抗EB病毒所致腫瘤 的多肽，具有如SEQ ID NO.四所示的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求1 4任一所述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，具有如SEQID NO. 30所示的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求5所述基因的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1 4任一所述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的制備方法，步驟如下將權(quán) 利要求7所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達系統(tǒng)中進行表達，分離純化表達的多肽。
9.權(quán)利要求1 4任一所述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽在制備治療和預防EB病毒所 致腫瘤的藥物中的應用。
10.一種大腸菌素Ia的變構(gòu)多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 24所示。
11.編碼權(quán)利要求10所述的大腸菌素Ia的變構(gòu)多肽的基因。
12.權(quán)利要求11所述的基因在制備多肽藥物中的應用，指將所述基因與誘導多肽的基 因可操作地連接并克隆到表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)化到表達系統(tǒng)中，分離純化表達 的多肽。
全文摘要
本發(fā)明“一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽及其應用與制備方法”，屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，由可形成離子通道的大腸菌素變構(gòu)多肽與抗EB病毒抗體多肽或者抗EB病毒抗體的模擬抗體多肽構(gòu)成，所述可形成離子通道的大腸菌素變構(gòu)多肽由野生型大腸菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道結(jié)構(gòu)域的肽鏈突變了氨基酸殘基G11A、H22G、A26G、V31L和H40D而獲得，所述抗EB病毒抗體的氨基酸序列與ATCC HB-168雜交瘤分泌的單克隆抗體相同。為治療EB病毒所致腫瘤提供一種改進的殺傷力強、安全性高，高特異性且致敏可能性較低的藥物及其制備方法。
文檔編號C12N15/62GK102101888SQ200910242838
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者丘小慶 申請人:畿晉慶三聯(lián)(北京)生物技術(shù)有限公司