專利名稱：乙型肝炎疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼對(duì)乙型肝炎病毒抗原有特異性的多肽的重組DNA分子。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于在人體中刺激針對(duì)變異乙型肝炎病毒的抗體產(chǎn)生的疫苗組合物。
乙型肝炎病毒粒子不同血清型基因組的克隆方法是本領(lǐng)域熟知的(Miller et.al)。丹氏粒是乙型肝炎病毒粒子，可以從被感染的病人分離，它具有約42nm的直徑。各個(gè)粒子由包含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的色膜、衣殼(HBcAg)、內(nèi)源性聚合酶和DNA基因組組成。第三種多肽“e”抗原(HBeAg)由乙型肝炎病毒產(chǎn)生，以溶解的形式在血清中發(fā)現(xiàn)。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的廣泛存在的問(wèn)題，但用于公眾免疫接種的疫苗目前是可廣泛獲得的。市售的抗HBV疫苗包括天然或重組形式的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。真正的(或野生型)乙型肝炎表面抗原可以從感染個(gè)體的血漿中以包含兩種蛋白質(zhì)的約22nm粒子回收，所述的蛋白質(zhì)稱作P24和其糖基化衍生物GP28，它們兩者都被HBV基因組上的226個(gè)氨基酸編碼序列編碼，所述編碼序列稱作S蛋白質(zhì)編碼序列或HBV S-基因(Tiollais et al.，(1985))。Valenzuelaet al.，Nature 280 815(1979)中給出了HBsAg的完整氨基酸序列和編碼核苷酸序列。本文中采用Tiollais et al.使用的指定核苷酸和氨基酸位置的編號(hào)系統(tǒng)。
Harford et al.Develop.Biol.Standard 54 125(1983)、Valenzuela etal.，Nature 298 347(1982)和Bitter et al.，J.Med.Virol，25 123(1988)已描述了在表達(dá)載體上在酵母啟動(dòng)子控制下插入HBV S-基因編碼序列以便能夠在啤灑糖酵母中表達(dá)用于制備疫苗的HBsAg的方法。Gregg etal.，Biotechnology 5 479(1987)已描述了在巴斯德畢赤氏酵母中的表達(dá)方法(也參見(jiàn)歐洲專利出版物0226846)，其在多形漢遜氏酵母中也有表達(dá)(歐洲專利出版物0299108)。
也已從包含HBsAg蛋白質(zhì)的雜種免疫原性粒子(歐洲專利出版物0278940描述)制備疫苗。這些免疫原性粒子可以含有，例如，HBsAg前體蛋白的全體或部分，所述前體蛋白被HBV基因組上緊靠在HBV-S基因前邊的編碼序列(本文稱作前-S編碼序列)編碼。該前-S編碼序列通常編碼163個(gè)氨基酸(在ay HBV亞型的情況下)，并且包含前-S1編碼序列和前-S2編碼序列。后者編碼55個(gè)氨基酸，并且緊靠在S蛋白質(zhì)編碼序列的前邊(歐洲專利出版物0278940)。
HBV-DNA的表面抗原(S抗原)開(kāi)放讀框分成三個(gè)區(qū)前-S1、前-S2和S。它編碼HBV的三種包膜蛋白質(zhì)，稱作大的、中等的和主要的蛋白質(zhì)。主要的蛋白質(zhì)HBsAg由226個(gè)氨基酸組成，并由S基因編碼(Tiollais et al.，(1981)；Tiollais et al.，(1987)和Leu et al.)。所有三種包膜蛋白質(zhì)都含有HBsAg抗原位點(diǎn)，并且易于由常規(guī)的HBsAg免疫測(cè)定方法檢測(cè)。這些免疫測(cè)定方法廣泛用于診斷HBV感染和篩選全球供血者。HBsAg反應(yīng)性取決于氨基酸124-147親水區(qū)(定義為“a”決定族(Ashton-Rickardt et al.和Brown et al.))的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。這一點(diǎn)對(duì)所有HBV亞型是共同的，其抗體賦予針對(duì)任何亞型再感染的保護(hù)作用。
在高度嚴(yán)格條件下與HBV探針雜交的HBV-DNA序列已表現(xiàn)在血清HBsAg陰性受試者的肝臟、血清和血單核細(xì)胞中(Brechot et al.(1985)和Thier et al.)。來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的最近的研究成果(使用斑點(diǎn)印跡雜交或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))證實(shí)了HBV DNA序列在HBsAg陰性受試者血清中的存在。PCR技術(shù)的發(fā)展已使得可以檢測(cè)許多病人中HBV復(fù)制的非常低的水平，并可以對(duì)許多分離物(已在某些病毒分離物中識(shí)別遺傳變異)測(cè)序(Carman et al.，(1990)；Brechot et al.，(1991)Blumet al.)。在HBV高流行的臺(tái)灣和撒丁島，1.7％和0.3％的HBsAg陰性鍵康供血者在他們的血清中具有斑點(diǎn)雜交印跡雜交可檢測(cè)的HBVDNA(Lai et al.，(1989)和Sun et al.)。在中國(guó)大陸在抗-HB-陽(yáng)性個(gè)體中使用PCR的分子流行病學(xué)研究表明具有不可檢測(cè)HBsAg的HBV載體的存在，總共占中國(guó)總?cè)丝诘?％(Luo et al.)。
HBV的抗原亞型由血清學(xué)定義，已顯示出由基因組HBsAg編碼區(qū)中單個(gè)堿基的變化引起(Okamoto et al.)。然而，所有目前已知的抗原亞型含有由HBsAg的氨基酸124到147組成的“a”決定簇?！癮”決定簇的抗體賦予針對(duì)所有亞型的保護(hù)作用。體外突變已表明在147位的半胱氨酸和在142位的脯氨酸對(duì)顯示“a”決定簇的全抗原性是重要的(Ashton-Rickardt et al.)。
此外，Howard Thomas和William Carman在WO 91/14703中詳細(xì)描述了在HBV感染母親生下的接種兒童中的HBsAg片段變體。測(cè)序揭示了導(dǎo)致HBsAg“a”決定簇中145位上甘氨酸到精氨酸的氨基酸變化的在核苷酸位置587上的鳥(niǎo)苷到腺苷的點(diǎn)突變(也參見(jiàn)Carman etal.，(1990))。已報(bào)道了類似的HBV突變體在體液免疫壓下被主動(dòng)(疫苗)或被動(dòng)(超免疫球蛋白)誘導(dǎo)的在宿主中的復(fù)制(Okamoto et al.，(1992)和McMahon et al.)。然而，在某些這類病人的血清中用常規(guī)的免疫測(cè)定方法檢測(cè)的HBsAg和抗HBs(疫苗誘導(dǎo)的)兩者的持續(xù)存在說(shuō)明突變不引起抗原性的完全喪失(Carman et al.，(1990)，Okamoto etal.，(1992)和McMahon et al.)。
從治療學(xué)和流行病學(xué)的觀點(diǎn)看，研究來(lái)源于在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試驗(yàn)中無(wú)任何HBsAg反應(yīng)的受試者的HBV的分子特征更重要。從HBeAg、HBV-DNA以及抗HBs陽(yáng)性的日本病人獲得的測(cè)序結(jié)果表明，前-S2區(qū)氨基酸9到22被缺失，而前S2的3和8位上的氨基酸以及HBs“a”決定簇的第一環(huán)的126、131和133位上的氨基酸被取代(Moriyaa etal.)。從另一種分離物推定的氨基酸序列的分析揭示了主要HBs蛋白質(zhì)的3、53和210位上的取代，所有這些都在普通“a”決定簇之外，且不能真正地解釋在血清中缺少HBsAg(Liang et al.)。
在過(guò)去的十年中，已描述了幾種推定的乙型肝炎病毒的變體或突變體。例如，McMahon等已描述了在用抗HBsAg單克隆抗體治療的肝移植病人的推定的單克隆抗體結(jié)合域(由DNA序列分析推斷)中精氨酸對(duì)甘氨酸的取代(Cold Spring Harbor Symposium on the MolecularBiodogy of Hepatitis B Viruses，September，1989)。
在Carman et al.的研究和專利申請(qǐng)WO 94/26904的主題中，突變體乙型肝炎病毒具有修飾的“a”決定簇，其中兩種特異性氨基酸(天冬酰胺和蘇氨酸)被插入到HBsAg序列的122位上。此外，145位上的突變(由甘氨酸取代野生型精氨酸)也詳細(xì)列在氨基酸序列表中。
在另一份報(bào)告中，盡管在用兩種許可使用的乙型肝炎疫苗之一免疫接種后存在特異性抗體(抗-HBs)，兒童和成年人中還是發(fā)現(xiàn)帶有循環(huán)乙型肝炎表面抗原(表明病毒復(fù)制)(Zanetti et al.)。用單克隆抗體對(duì)HBsAg的分析揭示所述循環(huán)抗原不攜帶“a”決定簇或者這一決定簇被隱蔽起來(lái)。由此出結(jié)論，已檢測(cè)到乙型肝炎病毒變體的出現(xiàn)，可能由于與感染流行區(qū)免疫接種有關(guān)的流行病學(xué)壓力。然而，沒(méi)有進(jìn)一步確定所述變體的特征。
從Zanetti等的工作可以清楚地看出，目前所能獲得的乙型肝炎疫苗的最大的缺點(diǎn)是它們可以(至少在具有素因性免疫遺傳特性的宿主中)引起出現(xiàn)“逃逸突變體”，即復(fù)制已突變而不受中和性免疫反應(yīng)影響的感染性病毒。這樣一種變體病毒明顯具有引起發(fā)生疾病的能力，并且可以認(rèn)為是可以傳遞的。因?yàn)樗槐换谄胀℉BsAg的疫苗產(chǎn)生的抗體有效地中和，所以該變體病毒可以引起嚴(yán)重的免疫問(wèn)題。已描述了HBV的其它突變，但有關(guān)其改變的抗原性的意義并不清楚(Moriyama et al.和Lai et al.，(1990))。
使用PCR在中國(guó)HBV感染高流行區(qū)最近的研究表明，30-40％的具有不明原因肝硬變、慢性活動(dòng)性肝炎(CAH)或慢性遷延性肝炎(CPH)的HBsAg陰性病人在其血清或肝組織中具有復(fù)制的HBV-DNA(Zhang et al.)。這些研究表明，在中國(guó)人群中存在一種HBV變體，以血清中不可檢測(cè)的HBsAg為特征。令人驚奇的是，這樣一種推定的突變體從來(lái)沒(méi)有在分子水平上確定特征。
從我們的中國(guó)病人(即無(wú)任何可檢測(cè)的HBsAg的病人)獲得的分離物是一些插入突變體，其中額外氨基酸插入到就在“a”決定簇之前的密碼子122和124之間。這一序列變異在任何已知的HBV亞型中以前沒(méi)有描述，并且在相同區(qū)的30個(gè)HBsAg陽(yáng)性中國(guó)病人中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。有趣的是注意到發(fā)生插入的區(qū)是重要的HBsAg表位區(qū)。發(fā)現(xiàn)插入序列就在決定亞型決定簇(d)的密碼子122的下游，并且就在“a”決定簇的上游。所有在密碼子位置122之前和之后的核苷酸和氨基酸序列詳細(xì)描述在野生型HBV中(圖6和7)。在不能與有關(guān)的理論聯(lián)系上的情況下，我們相信這一突變引起影響“a”決定簇和“d”亞型表位的構(gòu)象變化。一種很大的可能性是氨基酸的插入通過(guò)影響“a”決定簇的兩環(huán)的空間結(jié)構(gòu)改變表位。另一種可能性是由單克隆抗體限定(Waters et al.)的“a”決定簇的第一環(huán)可以包括(比原來(lái)認(rèn)為的)更上游的氨基酸。我們認(rèn)為這些氨基酸被按以前提出的(Waters et al.和Ashton-Richardt etal.)122而不是124上游的二硫鍵形成。所述插入的氨基酸會(huì)增加環(huán)從14到16或17氨基酸的長(zhǎng)度，從而改變這一環(huán)的構(gòu)象，阻止中和抗體結(jié)合。
在本發(fā)明中，我們描述了從中國(guó)病人分離的HBV的新變體或“逃逸突變體”，所述中國(guó)病人的血清在用斑點(diǎn)印跡雜交分析時(shí)為HBV-DNA陽(yáng)性，而用市售多克隆抗體進(jìn)行免疫試驗(yàn)時(shí)為HBsAg陰性。此外，本發(fā)明克服了或至少減少了與已知HBV疫苗相關(guān)的缺點(diǎn)(這些疫苗對(duì)這些新發(fā)現(xiàn)的突變體無(wú)效)。
本發(fā)明給出了新查明的HBV突變體的特征，所述突變體在HBV包膜區(qū)緊靠位置122下游至少有兩個(gè)氨基酸插入。本發(fā)明提供了在試驗(yàn)樣品中測(cè)定突變HBV存在的方法，以及在這些方法中有用的試劑。本發(fā)明的各方面提供了“a”決定簇的修飾，其中在HBsAg序列122位下游有至少2個(gè)氨基酸插入，相應(yīng)于HBsAg基因組核苷酸519下游至少6個(gè)核苷酸的插入。
得自突變HBV的核苷酸序列或其部分作為測(cè)定試驗(yàn)樣品中突變HBV存在的探針是有用的。所述序列也使得可獲得在這種突變HBV基因組內(nèi)編碼的突變HBV抗原的多肽序列，并允許產(chǎn)生作為診斷試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)或試劑和/或作為疫苗組分有用的多肽。針對(duì)包含在這些多肽序列內(nèi)的表位的單克隆和多克隆抗體對(duì)診斷試驗(yàn)以及治療劑，篩選抗病毒劑和分離突變HBV(所述核酸序列從其獲得)也是有用的。
將要理解的是，如果需要，這一突變HBsAg也可以包括前-S序列。
按照本發(fā)明的變體HBsAg蛋白質(zhì)或其片段此后縮寫為“mHBsAg”。
將意識(shí)到，這些mHBsAg突變體不是“天然產(chǎn)生”的形式，而是合成的和高度純化的物質(zhì)，不含血產(chǎn)物。
本發(fā)明中描述的較好的這些突變體相當(dāng)于全長(zhǎng)HBsAg，并且除了在122位下游插入至少兩個(gè)氨基酸殘基外，與野生型HBsAg相同。
優(yōu)選的HBsAg突變體為高度純化的形式，比如為純度大于75％，更優(yōu)選的大于90％，最優(yōu)選的為95-100％的狀態(tài)。
本發(fā)明另一方面提供了包含免疫保護(hù)量的這些HBsAg“逃逸突變體”以及合適載體的疫苗組合物。
此后描述本發(fā)明的其它方面。
本發(fā)明的mHBsAg和疫苗可以用于克服由出現(xiàn)以上定義的“逃逸突變體(其中，緊靠病毒HBsAg＂a＂決定簇上游的區(qū)(包膜區(qū))已進(jìn)行修飾)產(chǎn)生的問(wèn)題。特別是，本發(fā)明的疫苗具有可以用于抵抗和阻止變體HBV的出現(xiàn)或傳播，所述變體HBV被定義為在HBsAg氨基酸序列中具有修飾的HBV包膜區(qū)，其中至少有兩個(gè)插入到122位下游的氨基酸。
因此，本發(fā)明也提供了一種保護(hù)人體使其免受與所說(shuō)變體HBV感染相關(guān)的病癥折磨的方法，該方法包括給人體施用安全有效量的按照本發(fā)明的疫苗。
本發(fā)明另一方面提供了用于治療，尤其是預(yù)防的mHBsAg。
本發(fā)明也提供了mHBsAg在制造疫苗組合物上的用途，所說(shuō)疫苗組合物用于保護(hù)人體抵抗與所說(shuō)變體HBV感染相關(guān)的病癥。
當(dāng)用于抗存在的變體HBV病毒的人體免疫時(shí)，疫苗中的mHBsAg序列通常比得上或抗原性等同于變體HBV病毒中mHBsAg序列是合意的。
在本發(fā)明的mHBsAg中122位后插入的優(yōu)選的氨基酸殘基是可以由插入六個(gè)或更多個(gè)核苷酸衍生的那些。編碼額外氨基酸的插入核苷酸可以影響普通HBsAg中密碼子123的3個(gè)核苷酸的任何一個(gè)。
從理論上說(shuō)，改變包膜蛋白親水性的任何突變都能引起改變的抗原性和出現(xiàn)變體HBV。野生型的親水性和突變體的親水性在這一區(qū)是很不相同。這里所述的親水性降低常常與抗原性喪失相關(guān)聯(lián)。所述突變體在第一環(huán)中的增加的疏水性也可以產(chǎn)生在包膜脂質(zhì)中主要蛋白質(zhì)的改變的蛋白質(zhì)，從而對(duì)構(gòu)象具有很大的影響。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，普通HBsAg 122位之后的殘基可以降低“a”決定簇的親水性。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述mHBsAg除了在122位下游插入至少兩個(gè)氨基酸殘基外，與普通(野生型)HBsAg S-蛋白質(zhì)相同。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，122位下游的修飾是分別插入精氨酸，然后是丙氨酸。另一種優(yōu)選的是，可以以那種順序在122位下游插入精氨酸、甘氨酸和丙氨酸。
本發(fā)明各方面優(yōu)選的特征在細(xì)節(jié)上作必要的修改后是本發(fā)明的其它各方面。
現(xiàn)在，本發(fā)明將由下列實(shí)施例說(shuō)明。所述實(shí)施例涉及附圖，其中

圖1說(shuō)明1號(hào)病人的系列血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。正常水平在40iμ/L以下。在各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血清HBV標(biāo)記。1992年8月由PCR發(fā)現(xiàn)HBV DNA，而未測(cè)得HBsAg和其它HBV標(biāo)記。
圖2說(shuō)明2號(hào)病人的系列血清ALT水平以及血清乙型肝炎病毒標(biāo)記。縮寫W表示野生型，M表示突變體。
圖3是表面基因開(kāi)放讀框(PCR和測(cè)序引物的位置)和重疊聚合酶開(kāi)放讀框(PORF)的圖示說(shuō)明。黑圈代表起始和終止密碼子，而有陰影的方塊表示與“a”決定簇相關(guān)的插入熱點(diǎn)(522-593位)。核苷酸編號(hào)從如出版的HBV DNA序列中的假擬的EcoRI位點(diǎn)開(kāi)始，因?yàn)楸景l(fā)明的分離物不具有EcoRI位點(diǎn)。
圖4表示在PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序后與野生型(中間)比較在分離物1和2(左邊和右邊)中核苷酸插入的放射自顯影。箭頭表示插入點(diǎn)。
圖5表示與野生型(adw)比較的分離物1和2的核苷酸和氨基酸序列。插入序列的下面劃線。
圖6說(shuō)明mHBsAg分離物1的完整的核苷酸序列。上面的序列代表突變HBsAg分離物表面基因和“a”決定簇的序列，下面的序列代表野生型序列。(…)代表氨基酸插入位點(diǎn)。
圖7說(shuō)明mHBsAg分離物2的完整的核苷酸序列。上面的序列代表突變HBsAg分離物表面基因和“a”決定簇的序列，下面的序列代表野生型序列。(…)代表氨基酸插入位點(diǎn)。
表1描繪了用于聚合酶鏈反應(yīng)和測(cè)序反應(yīng)的合成寡核苷酸引物。
表2說(shuō)明以adw野生型為對(duì)照，1號(hào)和2號(hào)病人血清HBsAg與單克隆抗體的陽(yáng)性/陰性結(jié)合率。
表3給出了與以前出版過(guò)的野生型序列(adw)和來(lái)源于與野生型相同區(qū)的中國(guó)分離物比較的突變S基因的核苷酸和氨基酸序列同源性。
HBV突變更普遍地在以連續(xù)的堿基為特征的序列的特別區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。在研究中，所述的插入與連續(xù)四個(gè)腺嘌呤相關(guān)。這一區(qū)域看來(lái)是在某些來(lái)源于中國(guó)HBsAg陰性HBV攜帶者的分離物中插入的“熱點(diǎn)”。
本發(fā)明另一方面提供了制備mHBsAg和由此獲得的疫苗組合物的方法。
mHBsAg優(yōu)選地由合成法(經(jīng)肽合成或更優(yōu)選地經(jīng)重組DNA技術(shù))獲得。
構(gòu)建、操作和檢定重組DNA分子和序列的方法是本領(lǐng)域公知的。為了修飾HBsAg的HBV S蛋白質(zhì)并獲得本發(fā)明的mHBsAg，將密碼子CGG和GCA，或分別編碼精氨酸和丙氨酸的其它三聯(lián)密碼子組合插入到122位下游是合乎需要的。也可以將密碼子CAC、GGG或GCG，或者分別編碼精氨酸、甘氨酸和丙氨酸的其它三聯(lián)密碼子組合插入到122和124位核苷酸之間。
可以獲得引起序列合適變化的幾種方法。一種合適的方法是經(jīng)亞磷酸酯或亞磷酰胺化學(xué)，利用病毒或酵母密碼子頻率完全從頭合成所需編碼序列。
合成DNA可以經(jīng)商業(yè)途徑從幾個(gè)公司獲得。這種基因合成的一個(gè)例子由Hayden和Mandecki在DNA 7571(1988)中描述，此文作為參考。
第二種方法是如Botstein and Shortle，Science 229 1193(1982)所述的在單鏈載體上從已包含HBV基因組的載體克隆合適的限制片段，然后進(jìn)行位點(diǎn)特異性體外誘變。大腸桿菌K12菌株C600按照布達(dá)佩斯條約于1982年6月2日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為ATCC39132。該菌株含有重組質(zhì)粒pRIT 10601所述質(zhì)粒包含克隆在pBR 322上的ay亞型的HBV基因組。可以用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)從這種克隆切下編碼S-基因指定的226個(gè)氨基酸HBsAg蛋白質(zhì)的序列或編碼前S多肽的更長(zhǎng)的序列。
一種合適的限制片段是來(lái)源于pRIT 10601 S-基因編碼區(qū)內(nèi)的575bp XbaI-AccI片段。體外誘變有用的載體系統(tǒng)是商業(yè)上可獲得的。由此獲得的突變基因片段被再插入到S-基因中。
第三種方法是如Ho et al.，Gene 77 51(1989)描述的用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行所需的突變性改變。
在各種情況下mHBsAg編碼序列可以在任何合適宿主中合適啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
包含編碼mHBsAg的DNA序列的表達(dá)載體是新的，并且構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
在優(yōu)選的一面，啤酒糖酵母、巴斯德畢赤氏酵母或多形漢遜氏酵母可以用作宿主，并且在母啟動(dòng)子，例如酵母TDH3啟動(dòng)子(3-磷酸甘油醛脫氫酶基因，參見(jiàn)Valenzuela et al.，1982；Bitter et al.，1988)或PH05(Miyanohara et al.，1983)、MOX、FMDH(參見(jiàn)EP-A-0299108)和AOX(參見(jiàn)EP-A-022 6846)控制下表達(dá)。
可用常規(guī)方法培養(yǎng)或發(fā)酵轉(zhuǎn)化的宿主以及提取和純化mHBsAg。從mHBsAg酵母細(xì)胞純化HBsAg的方法是本領(lǐng)域公知的，可以按照美國(guó)專利4,649,192、4,683,294、4,694,074或4,738,926的任何方法進(jìn)行。本發(fā)明的mHBsAg的純化用類似的方式進(jìn)行。
用常規(guī)技術(shù)制備包含mHBsAg的疫苗，該疫苗含有免疫保護(hù)量的mHBsAg，mBHsAg最好在緩沖生理鹽水中，并且用任何各種已知的佐劑(包括氫氧化名和磷酸鋁)攙混或吸附?！懊庖弑Ｗo(hù)的”一詞指施用足量的mHBsAg，使得產(chǎn)生足量的保護(hù)性抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，給出針對(duì)感染因子的保護(hù)作用，而無(wú)嚴(yán)重的副作用。待施用的mHBsAg的量取決于疫苗是否含佐劑，一般包含1～100mcg的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是使用1～200mcg的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選的是5～40mcg的蛋白質(zhì)。待施用的劑量可以由涉及觀察受治療者中抗體滴度和其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)劑量范圍研究確定。
所述mHBsAg也可以與其它HBsAg(例如，普通的HBsAg或同源的或復(fù)合的HBsAg包含用于疫苗配方的全部或部分前S1或前S2多肽的顆粒混合。它也可以與攜帶有其它生物體蛋白質(zhì)表位的雜交HBsAg顆粒，和與其它免疫原混合，以形成二價(jià)或多價(jià)疫苗。“Vaccines”，editedby Voller et al.，University Park Press，Baltimore，MD，U.S.A.，1978中一般性地描述了疫苗制備方法。
所述mHBsAg作為免疫學(xué)試劑包含在用于變體HBV病毒感染等的檢測(cè)試劑盒中是有用的。它也可以用于用已知方法產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體，該單克隆抗體中的某些可能是對(duì)變體抗原特異性的，并且不識(shí)別普通HBsAg。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，與包含突變HBV抗體和其復(fù)合物發(fā)生免疫反應(yīng)的多肽和產(chǎn)生的針對(duì)這些多肽中的突變HBV特異性表位的抗體在檢測(cè)生物試驗(yàn)樣品中突變HBV抗體存在或病毒和/或病毒抗原存在的免疫測(cè)定中是有用的。可以變化這些免疫測(cè)定的方案，這些變化是本領(lǐng)域公知的，其中一種變化已在本文中描述。所述免疫測(cè)定可以使用一種病毒抗原，例如，得自含有突變HBV核酸序列的任何克隆的多肽，或得自這些克隆中突變HBV核酸序列的復(fù)合核酸序列的我肽，或得自衍生這些克隆中核酸序列的突變HBV基因組的多肽?；蛘撸雒庖邷y(cè)定可以使用這些來(lái)源的病毒抗原的組合。可以使用例如針對(duì)相同病毒抗原的單克隆抗體，或者針對(duì)不同病毒抗原的多克隆抗體。測(cè)定可以包括但不限于基于競(jìng)爭(zhēng)、直接反應(yīng)或夾心面包型測(cè)定的那些測(cè)定。測(cè)定可以使用固相或者可以經(jīng)免疫沉淀或不采用固相的任何其它方法完成。本文描述了使用作為信號(hào)產(chǎn)生化合物的標(biāo)記的測(cè)定的例子和那些標(biāo)記。也可以用如未決美國(guó)專利申請(qǐng)608,849、070,647、418,981和687,785中描述的生物素和抗生物素蛋白、酶標(biāo)記或生物素抗生物素系統(tǒng)擴(kuò)增信號(hào)。包括突變HBV免疫顯性區(qū)表位的重組多肽在感染病人的生物試驗(yàn)樣品中檢測(cè)病毒抗體上是有用的。也期望抗體在辨別急性和非急性感染中是有用的。通過(guò)包裝合適的材料與進(jìn)行測(cè)定所需的其它試劑和材料，以及合適的測(cè)定說(shuō)明構(gòu)建適用于免疫診斷并含有合適的反應(yīng)劑的試劑盒，所述材料包括本發(fā)明的含有突變HBV表位的多肽或在合適容器中的針對(duì)突變HBV表位的抗體。
本發(fā)明優(yōu)選的一面提供了用于接種后體外診斷檢測(cè)生物介質(zhì)中抗mHBsAg抗體，特別是中和抗體的試劑盒，其特征在于它包括a)本文所限定的mHBsAg，和b)用于檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法。
本發(fā)明另一方面提供了用于診斷、預(yù)防或治療人乙型肝炎感染的包含抗-mHBsAg抗體的抗體制劑。也提供了用有效量的這種抗-mHBsAg抗體處理人以預(yù)防或治療乙型肝炎感染的方法。
本發(fā)明將由下列實(shí)施例說(shuō)明。實(shí)施例1號(hào)病人是一名58歲男性，患非甲非乙型慢性肝炎6年。1992年8月，在不存在HBsAg和其它HBV標(biāo)記下用PCR發(fā)現(xiàn)HBV-DNA(圖1)。在這一階段，病人已肝硬變。
2號(hào)病人是一名中國(guó)南方23歲女性，在1993年3月的常規(guī)化驗(yàn)中她具有稍微升高的血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，HBsAg和HBeAg陽(yáng)性，但免疫球蛋白(Ig)M和IgG抗-HBs陰性。此后在1994年元月，她繼續(xù)發(fā)展為HBV-DNA陽(yáng)性，現(xiàn)在抗-HB也是陽(yáng)性，但HBsAg、HBeAg和抗-HBs陰性(圖2)。
兩個(gè)病人都是丙型肝炎病毒(HCV)和HCV-RNA陰性。研究了相同地區(qū)的30個(gè)慢性肝臟疾病或肝細(xì)胞癌的HBsAg陽(yáng)性中國(guó)病人。血清學(xué)研究。
用商業(yè)上可獲得的酶免疫測(cè)定法(Abbott Laboratories，NorthChicago，Illinois，U.S.A)試驗(yàn)HBsAg、HBeAg、總抗-HBc、IgM抗-HBs和抗-HBs。在英國(guó)證實(shí)了HBsAg和抗-Hbs結(jié)果。單克隆抗體結(jié)合將一組已知結(jié)合到“a”決定簇的抗-HBs單克隆抗體用于確定在“a”決定族表位中更特異性的變化。用抗體RFHBS-1、RFHBs-2和RFHBs-7涂覆聚苯乙烯珠(Northumbria Biologicals，Northumberland，UK)，然后與血清樣品一起溫育，所述血清樣品是以在磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.2)中的50％新生小牛血清1∶2稀釋的。用“AusRIA II”試劑盒(Abbott Diagnostics)的125I-抗-HBs檢測(cè)結(jié)合的HBsAg。RFHBs-1和RFHBs-2結(jié)合到含有序列氨基酸124-137的環(huán)狀肽，RFHBs-7結(jié)合到HBsAg的氨基酸139-147環(huán)狀肽上。肝炎標(biāo)記用酶免疫測(cè)定法(Abbott Laboratories，North Chicago，IL)試驗(yàn)HBsAg、HBeAg、總抗-HBc、IgM抗-HBs和抗Hbs。斑點(diǎn)印跡雜交用改進(jìn)的Weller et al.J.Med.Virol 9 273-280(1982)中詳細(xì)描述的方法經(jīng)斑點(diǎn)印跡雜交測(cè)定HBV-DNA。HBV-DNA的抽提、PCR和直接測(cè)序在0.5％十二烷基硫酸鈉、25mM乙酸鈉、25mmMEDTA 1mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Lewes，UK)存在下在200μl體積中于68℃消化50μl血清2小時(shí)。在兩次苯酚-氯仿提取后進(jìn)行兩次氯仿提取，HBV-DNA用乙醇沉淀、用70％乙醇洗滌兩次后，將DNA沉淀重新懸浮到10μl水中。
將5μl抽提的HBV-DNA用作PCR擴(kuò)增的模板。一組引物(adw亞型)、PO5′(5′-TGCGGGTCACCATAT，2818-2833位)和POL3(5′-AAGGATCCAGTTGGC，1409-1395位)(表2)用于獲得包括前-S1、前-S2和S基因的1800bp片段(圖3)。另一組引物M3(5′-CTGGGAGGAGTTGGGGAGGAGATTT，1781-1755位)和3C(5′-CTAACATTGAGATTCCCGAGA，2460-2439位)用于擴(kuò)增前-C和C區(qū)。用不同組引物獨(dú)立地在中國(guó)和英國(guó)分析相同的血清樣品。
用“fmol”測(cè)序試劑盒(Promega Co，Southampton，England)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序。用25μCi32P-腺苷三磷酸酶(Amersham International，Amersham，UK)在10μl體積中用10單位的多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)于37℃未端標(biāo)記測(cè)序引物(表1)10分鐘。將1.5μl反應(yīng)混合物直接用于測(cè)序反應(yīng)中。用等體積的4mol/l乙酸鈉和α體積的異丙醇在室溫下沉淀90μl PCR產(chǎn)物10分鐘，將沉淀離心10分鐘，然后用70％乙醇洗滌兩次。在重新懸浮到20μl水中后，將9.5μl DNA和5單位的Taq酶(Promega Co.)加入到具有未端標(biāo)記的引物的反應(yīng)緩沖液中。按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行雙脫氧核苷酸終止測(cè)序。將循環(huán)測(cè)序進(jìn)行30圈。分別進(jìn)行變性、退火和抽提步驟30秒、30秒和1分鐘。S基因的克隆和測(cè)序直接測(cè)序結(jié)果表明2號(hào)病人的第一血清(1993年2月)具有野生型和突變病毒混合物的跡象。將這一血清樣品的PCR產(chǎn)物和2號(hào)病人的后續(xù)產(chǎn)物克隆到pUC19載體以證實(shí)直接測(cè)序結(jié)果。用測(cè)序酶DNA測(cè)序試劑盒(2.0型，USB，Cambridge，England)測(cè)定擴(kuò)增HBV-DNA的核苷酸序列。疏水性圖分別用Prosis軟件(Pharmacia，St.Albans，England)分析野生型和變體病毒分離物HBsAg的“a”決定簇的氨基酸122到137和122到139或140(包括插入的氨基酸)。斑點(diǎn)印跡雜交在兩種單獨(dú)的場(chǎng)合下PCR擴(kuò)增后，1號(hào)病人血清中的HBV-DNA是可檢測(cè)的。在2號(hào)病人中，1993年3月和1993年9月在10μg/50μl血清時(shí)，HBV-DNA是可以用斑點(diǎn)印跡雜交檢測(cè)的。假如1.0μgHBV-DNA相當(dāng)于2.3×106HBV基因組，則估計(jì)這一病人血清每ml含有約4.6×107個(gè)病毒粒子。HBsAg在第一個(gè)樣品中是可檢測(cè)，但在第二個(gè)樣品中是不可檢測(cè)的。在1994年元月，HBV-DNA僅可用PCR檢測(cè)，而HBsAg仍是不可檢測(cè)的。單克隆抗體結(jié)合研究以HBsAg陽(yáng)性病人為對(duì)照(adw)的1號(hào)和2號(hào)病人的結(jié)合研究表明，在2號(hào)病人中，血清中HBsAg結(jié)合到所有三種單克隆抗體上，并且可以用AusRIAII試劑盒多克隆抗-HBs檢測(cè)(表2)。前S-S基因和前C/C區(qū)的測(cè)序分離物1和分離物2中前S基因分別由687bp和690bp組成，野生型中由681bp組成。將突變體的S核苷酸和氨基酸序列與公開(kāi)的相同亞型(adw)的序列比較，也與相同地區(qū)的HBeAg陽(yáng)性攜帶者的野生型株比較(如表3所示)。
測(cè)序結(jié)果揭示出S基因中的插入(圖4)。分離物1中密碼子122和123之間的插入序列編碼兩個(gè)額外的氨基酸(Arg-Ala)，分離物2中密碼子123和124之間的插入序列編碼三個(gè)額外的氨基酸(Arg-Gly-Ala)(圖5)。這些插入剛好出現(xiàn)在HBsAg“a”決定簇之前。這種插入在公開(kāi)的已知HBV亞型的序列中還未見(jiàn)描述，它不在從中國(guó)相同地區(qū)的30個(gè)中國(guó)HBsAg陽(yáng)性病人獲得的共有序列中。
直接測(cè)序結(jié)果被克隆測(cè)序證實(shí)。在從2號(hào)病人取得的第一血清的10個(gè)克隆中，8個(gè)具有以上描述的同相插入，其中的2個(gè)是野生型，而第二和第三血清樣品中的所有15個(gè)克隆都是變體的。因此，2號(hào)病人的第一血清具有野生型和突變病毒混合的跡象，表明突變體的逐漸出現(xiàn)，所述突變體在隨后的血清中成為占優(yōu)勢(shì)的物種。以前沒(méi)有有關(guān)前-S1、前-S2基因中氨基酸缺失或取代的描述。疏水圖按照Kyte和Doolittle的方法進(jìn)行，給出下列平均疏水性指數(shù)野生型“a”決定簇的氨基酸122-137、-0.48；分離物1的氨基酸122-139，-O；分離物2的氨基酸122-140，-0.89。因此突變體“a”決定簇比野生型病毒的相同區(qū)疏水性更強(qiáng)。
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1.一種乙型肝炎表面抗原蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)顯示出HBV表面抗原的抗原性，其特征在于，所說(shuō)的蛋白質(zhì)(mHBsAg)包括抗原修飾的包膜區(qū)，在該區(qū)中至少有兩個(gè)在HBsAg序列的密碼子位置122之后插入的氨基酸。
2.如權(quán)利要求1中要求的mHBsAg，其中在密碼子位置122之后插入氨基酸殘基是降低HBV包膜區(qū)親水性的一類氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求1或2中要求的mHBsAg，其中，在普通HBsAg密碼子位置122之后插入的密碼子依次編碼精氨酸和丙氨酸。
4.如權(quán)利要求1或2中要求的mHBsAg，其中，在普通HBsAg密碼子位置122之后插入的密碼子依次編碼精氨酸、甘氨酸和丙氨酸。
5.如權(quán)利要求1到4任何一個(gè)要求的mHBsAg，除了在密碼子位置122之后有至少兩個(gè)氨基酸殘基的插入物外，它與普通HBsAgS-蛋白質(zhì)相同。
6.如權(quán)利要求1到3和5任何一個(gè)要求的mHBsAg，其中在密碼子位置122之后的插入物依次是精氨酸和丙氨酸。
7.如權(quán)利要求1、2、4和5任何一個(gè)要求的mHBsAg，其中在密碼子位置122之后的插入物依次是精氨酸、甘氨酸和丙氨酸。
8.如權(quán)利要求1-7任何一個(gè)要求的mHBsAg，其中所說(shuō)的mHBsAg包括前-S序列。
9.如權(quán)利要求1-8任何一個(gè)要求的mHBsAg，其純度大于75％。
10.一種表達(dá)載體，該載體包含編碼按照權(quán)利要求1到8的任何一種mHBsAg DNA序列。
11.用權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
12.一種疫苗組合物，該組合物包含與合適的載體或佐劑混和的有效量的權(quán)利要求9中要求的mHBsAg。
13.一種制備權(quán)利要求1到9要求的mHBsAg的方法，該方法包括以下步驟在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)按照權(quán)利要求11的宿主，將產(chǎn)生的mHBsAg純化至所需的純度。
14.按照權(quán)利要求1-9的任何一種mHBsAg在制造用于保護(hù)人體免除與HBV相關(guān)的疾病的疫苗上的用途。
15.一種用于在生物介質(zhì)中診斷性體外檢測(cè)抗mHBsAg抗體的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含(a)按照權(quán)利要求1-8的任何一種mHBsAg；和(b)適于檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的工具。
16.一種用于診斷、預(yù)防或治療人體中乙型肝炎感染的抗體制劑，該制劑包含針對(duì)權(quán)利要求1到9任何一個(gè)所限定的mHBsAg的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了表現(xiàn)出乙型肝炎病毒表面抗原抗原性的變體和所謂的“逃逸突變體”HBsAg蛋白質(zhì)或其片段，中所述的突變體蛋白質(zhì)或其片段(mHBsAg)包含修飾的“a”決定簇，在該決定簇中至少有兩個(gè)氨基酸插入到野生型HBsAg序列的下游位置(122)。本發(fā)明也提供了一種包含mHBsAg的疫苗，一種用于診斷性體外檢測(cè)抗-mHBsAg抗體的試劑盒和包含抗-mHBsAg抗體的抗體制劑。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1143373SQ9519196
公開(kāi)日1997年2月19日 申請(qǐng)日期1995年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月2日
發(fā)明者P·卡拉伊安尼斯, H·C·托馬斯 申請(qǐng)人:科技醫(yī)藥皇家學(xué)院