專利名稱：李氏桿菌病疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及這種疫苗的制備方法，確切講是李氏桿菌疫苗及制備方法。
背景技術(shù)：
李氏桿菌病(Listeriosis)又名旋轉(zhuǎn)病(Circlingdisease)，是由單核細(xì)胞增多 性李氏桿菌(L. monocytogenes)引起的一種重要的人畜共患傳染病。該病發(fā)病率較低，但 死亡率卻很高，各種年齡、不同種類的畜、禽和野生動(dòng)物以及人均可感染李氏桿菌而發(fā)病。 家畜主要以幼齡和妊娠母畜較易感，且發(fā)病較急，主要表現(xiàn)為腦膜腦炎、敗血癥和妊娠母畜 流產(chǎn)。家禽和嚙齒類動(dòng)物則表現(xiàn)為壞死性肝炎和心肌炎。人感染后癥狀不一，以腦膜炎為 多見。自1926年首次分離到本病病原后，李氏桿菌病現(xiàn)已呈世界性分布。
近年來，因食品污染本菌而引起的食品中毒病例頻繁發(fā)生，使李氏桿菌病作為一 種重要的食物源性傳染病在世界范圍內(nèi)對食品安全及人類健康造成極大的危害。對于李氏 桿菌病的傳播，世界各國予以高度重視并投入大量資金用于研究，以有效防控李氏桿菌病 的發(fā)生。由于李氏桿菌的血清型變種較多，而且屬胞內(nèi)菌，感染宿主后主要激發(fā)的是細(xì)胞免 疫應(yīng)答，所以至今尚未有效的疫苗應(yīng)用于實(shí)踐。因此，對本病的有效控制已成為當(dāng)務(wù)之急， 研制高效、實(shí)用、安全的李氏桿菌疫苗已迫在眉睫。 由于李氏桿菌滅活后不能產(chǎn)生溶血素等毒力因子。因此，其滅活疫苗的免疫效價(jià) 較低，免疫效果不佳。 一些研究已證明，以溶血素作為添加劑的滅活疫苗能大大提高滅活疫 苗的免疫保護(hù)效果，但溶血素本身毒性很強(qiáng)，劑量稍過高就會(huì)導(dǎo)致宿主的毒性反應(yīng)，甚至死 亡。因此，本研究以體外表達(dá)的P60蛋白作為滅活疫苗的添加劑，使甲醛滅活的李氏桿菌疫 苗的免疫保護(hù)效果大大提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種有較高免疫效價(jià)、可明顯提高李氏桿菌滅活疫苗免疫效果，并有
較大安全性的李氏桿菌病疫苗，該疫苗能有效預(yù)防動(dòng)物李氏桿菌病的感染。 本發(fā)明涉及的疫苗由P60蛋白100 i！ g， 109個(gè)李氏桿菌滅活菌及與抗原等體積的
佐劑構(gòu)成。本發(fā)明所用的P60為重組蛋白。 本發(fā)明的李氏桿菌疫苗的制備方法是 a.P60重組蛋白制備 以單核細(xì)胞增多性李氏桿菌基因組DNA為模板，以上游引物Pl和下游引物P2進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，Pl和P2的序列如下 上游引物P1:5' -ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3'; 下游引物P2 :5' -ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3' 雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-30a，然后回收目的片段和載體片段，用連接酶連接，將P60
基因定向插入pET-30a表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET-P60，將pET-P60轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)
3感受態(tài)細(xì)菌后，挑選單菌落，接種含卡那霉素(50i!g/mL)的LB培養(yǎng)基中，加IPTG(終濃度 為lmmol/L)誘導(dǎo)3 7h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心收集菌體，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲波處理后收 集上清，過鎳瓊脂糖親和柱，用含有100mmol/L咪唑的緩沖液洗脫，收集洗脫峰得到純化的 P60重組蛋白； b.單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的滅活； 取李氏桿菌菌液接入LB培養(yǎng)液中，再在菌液中加入終濃度O. 5%的甲醛滅活12小 時(shí)； c.取P60重組蛋白、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的滅活菌及佐劑進(jìn)行復(fù)配，得李氏 桿菌疫苗。 根據(jù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的疫苗對動(dòng)物有較好的安全性，同時(shí)有較高的免疫 效價(jià)和免疫保護(hù)效果。
具體實(shí)施例方式
以下為本發(fā)明的一個(gè)具體制備方法及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
通過以下實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明 本實(shí)驗(yàn)中所有相關(guān)數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例一 入侵相關(guān)蛋白P60的制備 1. P60蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增及克隆 入侵相關(guān)蛋白P60是根據(jù)GenBank中已登錄的L. monocytogenes P60蛋白基因序 列，設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2，通過RT-PCR擴(kuò)增并克隆獲得的。為下一步亞克隆的需要，分 別在上、下游引物中引入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，并加有3個(gè)保護(hù)性堿基，預(yù)期擴(kuò)增長度 為1122bp。Pl:5' -ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3';
P2:5' -ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3' 用SDS-蛋白酶K法提取單核細(xì)胞增多性李氏桿菌基因組DNA，按如下反應(yīng)體系進(jìn) 行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(50. 0 ii L)，模板2 ii L， 10XPCR buffer 5 ii L，引物Pl (50pmo1/ ii L) 、 P2 (50pmo1/ ii L)各0. 5 ii L， 2. 5mmol/L dNTP 4 ii L， DEPC處理水37. 5 ii L， TaqDNA聚 合酶0. 5 ii L (5U/ii L) 。 PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min，94。C 30s，56。C 30s，72。C 60s，共35 個(gè)循環(huán)；然后72t:再延伸10min。用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。切下目的DNA片 段，用凝膠回收試劑盒回收，置-2(TC保存?zhèn)溆谩?
2.表達(dá)載體pET-P60的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)與檢測 用EcoR I和Xho 1分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pET30a，然后回收目的片段和載體片 段，用T4DNA連接酶連接過夜，將P60基因定向插入pET30a表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體 pET-P60，并用酶切和PCR鑒定陽性克隆。將pET-P60轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌BL21(DE3)后，挑選單菌 落，接種含卡那霉素(50 ii g/mL)的LB培養(yǎng)基中，加IPTG (終濃度為lmmoL/L)誘導(dǎo)3 7h。 將表達(dá)產(chǎn)物用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測目的蛋白的表達(dá)，通過凝膠薄層掃描檢 測表達(dá)量，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，該重組蛋白可被抗L. monocytogenes 多克隆抗體識別。
3. P60重組蛋白的純化
將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心收集菌體，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲波處理后收集上清，過鎳瓊 脂糖凝膠柱，用含有100mmol/L咪唑的緩沖液洗脫，收集洗脫峰，用SDS-PAGE檢測蛋白分子 量大小和純度，測定純化蛋白的含量后放入-7(TC保存?zhèn)溆谩?
實(shí)施例二 單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的滅活 取凍存李氏桿菌菌液50iiL接入5mL LB中，37。C、230r/min振搖過夜。取過夜菌 lmL接入2000mL的LB培養(yǎng)液中，振搖培養(yǎng)2 3小時(shí)后，離心，加10ml滅菌生理鹽水混勻。 先取5 ii L液體稀釋到101Q倍，均勻涂布于40個(gè)LB平板上，過夜培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)各板的克隆形 成單位(Clony form皿it， CFU)，并求出平均值，計(jì)算出菌液的濃度；然后在剩余菌液中加 入終濃度0. 5%的甲醛滅活12小時(shí)，再依上法涂LB平板，觀察是否有菌落生長，從而確定細(xì) 菌是否滅活完全。 實(shí)施例三組合疫苗的免疫效果
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與免疫 BALA/c小鼠，體重16 18克，每組10只，雌雄各半。于第0、21、42天皮下注射 下組各配方的疫苗0. 2mL。分別在每次免疫后第21天采集鼠血液標(biāo)本，分離血清后凍存 于-20。C備用。 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫劑量及動(dòng)物只數(shù) P60組P60重組蛋白100 ii g， Montanide ISA206油佐劑，10只BALA/c小鼠。
滅活菌組109個(gè)滅活菌，Montanide ISA206油佐劑，10只BALA/c小鼠。
溶血素組重組溶血素蛋白30 ii g，Montanide ISA206油佐劑，10只BALA/c小鼠。
P60+滅活菌組:P60重組蛋白100 ii g， 109個(gè)滅活菌，Montanide ISA206油佐劑， 10只BALA/c小鼠。 P60+溶血素組P60重組蛋白100 ii g，重組溶血素蛋白30 ii g， MontanidelSA206 油佐劑，10只BALA/c小鼠。 滅活菌+溶血素組109個(gè)滅活菌，重組溶血素蛋白30ii g， Montanide ISA206油
佐劑，10只BALA/c小鼠。 對照組PBS ， 10只BALA/c小鼠。 2.免疫鼠血清抗體的檢測 將純化的P60重組蛋白用0. 02mol/L的PBS (pH 7. 2)稀釋為5 y g/mL，包被96孔 酶標(biāo)板，100yL/孔，37t:放置2小時(shí)，4t:放置過夜。次日用5%脫脂奶粉液封閉酶標(biāo)板， 200 ii L/孔，37t:孵育1小時(shí)，用PBST洗液洗板3遍，拍干。將各組小鼠血清用PBST進(jìn)行 25倍稀釋后，100 ii L孔加入酶標(biāo)板中，37t:反應(yīng)1小時(shí)，洗滌3次后加入羊抗鼠辣根過氧化 物酶標(biāo)記的二抗，37t:反應(yīng)1小時(shí)后洗滌3次，加入底物液避光顯色15分鐘，以2mol/L的 硫酸終止反應(yīng)，測定A450/650值，以平均值的2. 1倍作為Cut off值。小鼠血清從25倍開 始稀釋，倍比稀釋至3200倍。以A450/650值大于或等于Cut off值的最高血清稀釋度為 效價(jià)。各組免疫動(dòng)物血清抗P60蛋白的幾何平均滴度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1不同免疫組小鼠的血清抗體幾何平均滴度
組別劑量動(dòng)物數(shù)2免后21天3免后21天(mL/只)(只)GMTSDGMTSD
P60 (500ng/mL)0.2101873,373912.85
溶血素(150ng/mL)0,210532.52982.41
滅活菌(5xl()9/mL)0.210461.79842.34
P60 (500ng/mL) +溶 血素(150pg/mL)0.2101942.854143.12
溶血素(500|ag/mL) + 滅活菌(5xl()9/mL)0.2102122.444262.73
P60 (500ng/mL) +滅 活菌(5xl()9/mL)0.2104772.288192.68 從表1可以看出，用P60+滅活菌免疫的小鼠，第2、3次免疫后的抗體幾何平均滴 度(Geometric Mean Titer, GMT)顯著高于其它各組(P < 0. 05);溶血素+滅活菌組、P6(H 溶血素組和P60組三組小鼠比較，GMT無顯著性差異(P > 0. 05)，但與溶血素組和滅活菌組 比較，有顯著性差異(P<0.05) ;P60+滅活菌組與溶血素組和滅活菌組比較，抗體幾何平均 滴度差異極顯著(P > 0. 01)。
3.免疫保護(hù)性研究 三免采血后，每只小鼠腹腔注射2 X 106 (半數(shù)致死量)個(gè)活菌，每組隨機(jī)抽取5只 小鼠，記錄2周內(nèi)小鼠死亡時(shí)間及只數(shù)，記錄結(jié)果見表2 ;剩余的5只小鼠，48小時(shí)后，頸椎 脫臼處死，分別無菌摘取每只小鼠脾臟仔細(xì)磨碎后，用2. 5mL含1X蛋白胨的PBS(0. 02mol/ L)沖洗后收集洗脫液，取10 L沖洗液用PBS稀釋，均勻涂布于MMA李氏桿菌選擇培養(yǎng)基 平板，依照CFU法計(jì)數(shù)每份樣品的菌落數(shù)，分別計(jì)算出各組10 L沖洗液中所含菌數(shù)的平均
log(組別菌數(shù))
值，以及含菌的幾何增長率(
log(對照組)
表2攻毒后各免疫組小鼠死亡時(shí)間及只數(shù)
"00%)，結(jié)果見表3。
組 別動(dòng)物 數(shù)(只)攻毒后動(dòng)物死亡時(shí)間及數(shù)量
第l天死亡3天內(nèi)死亡數(shù)6天內(nèi)死亡2周后死亡
數(shù)(只)(只)數(shù)(只)數(shù)(只)
P60 (500嗎/mL)5只02
溶血素(150|_ig/mL)5只000
滅活菌(5xl()9/mL)5只000
P60 (500ng/mL) +溶 血素(150ng/mL)5只0015
溶血素(500pg/mL) + 滅活菌(5xl()9/mL)5只0011
P60 (500嗎/mL) +滅 活菌(5xl()9/mL)5只0025
P60 (500|ag/mL)5只0000 從表2中可以看出，攻毒后第3天，對照組開始有小鼠死亡，其它各組小鼠均健活； 攻毒后第6天，對照組小鼠全部死亡，滅活菌組、溶血素+滅活菌組、P60+溶血素組的小鼠
6開始死亡；攻毒2周后，用P60+滅活菌組合疫苗免疫小鼠在攻毒實(shí)驗(yàn)中5只小鼠全部存活， 其它各組均有不同數(shù)量的小鼠死亡，其中溶血素組、滅活菌組、溶血素+滅活菌組和對照組 全部死亡。 表3 10 ii L小鼠脾臟洗液中各組LM平均計(jì)數(shù)及其幾何增長率
組別 對照組
P60
溶血素 滅活菌
P60+溶 溶血素+ P60+滅 血素 滅活菌 活菌
動(dòng)物數(shù) (只)
(個(gè))
細(xì)菌幾何 增長率 (%)
104 ±531
100
100 ±5.2
50
848 ±13.2
73.12
1236 ±34.5
77.3
54 ±3.5
43.3
588 ±8.2
69.2
±0.56
21.13 從表3中可以看出，試驗(yàn)小鼠在攻毒(2Xl(f個(gè)活菌)48小時(shí)后，平均每只小鼠 10 y L脾臟洗液中，對照組含菌的個(gè)數(shù)為104個(gè)，以此定為LM菌在小鼠脾臟中的幾何增長率 為100%， P60+滅活組菌的幾何增長率為21. 13%，其它各組都接近或超過50%，滅活菌組 高達(dá)77.3%;對照組含菌的個(gè)數(shù)(104個(gè))遠(yuǎn)大于其它各組，是滅活菌組(1236個(gè))的8.09 倍，是P60+滅活菌組(7個(gè))的1428. 57倍；細(xì)菌含量最少的兩組比較表明，P60+溶血素組 (54個(gè))是P60+滅活菌組(7個(gè))的7. 7倍。 從以上結(jié)果可以看出，無論是攻毒后的小鼠存活率，還是細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的繁殖 率，P60+滅活菌組合疫苗的免疫效果都明顯優(yōu)于滅活菌單獨(dú)免疫組，說明重組P60蛋白加 入李氏桿菌滅活疫苗后能大大提高滅活疫苗的免疫保護(hù)效果。 研究表明，在對單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的免疫反應(yīng)中，分泌性蛋白質(zhì)是CD/和 CD8+T細(xì)胞識別的主要抗原，其中最主要的兩個(gè)保護(hù)性抗原是LLO和P60。 LLO是單核增多性 李氏桿菌分泌的主要毒素蛋白，但其毒性太強(qiáng)，在免疫非致死劑量范圍內(nèi)，很難達(dá)到理想的 保護(hù)效果。研究表明，李氏桿菌滅活疫苗保護(hù)性較低的原因是在李氏桿菌滅活后，溶血素、 P60等主要毒力因子遭到破壞，導(dǎo)致免疫原性降低，保護(hù)力減弱。P60蛋白單獨(dú)作為抗原免 疫動(dòng)物，仍然得不到滿意的保護(hù)效果，可能是其抗原表位單一，產(chǎn)生抗體類別較少，不足以 形成復(fù)雜的防御體系網(wǎng)；而P60與滅活全菌聯(lián)合免疫，可使滅活菌中遭破壞的毒力因子濃 度大大提高，而菌體因滅活不能在宿主體內(nèi)復(fù)制，從而使添加P60的滅活菌與活菌達(dá)到相 同的免疫效果，但其對動(dòng)物的安全性卻大大提高。實(shí)驗(yàn)證明，李氏桿菌滅活菌與其入侵相關(guān) 蛋白P60組合疫苗免疫動(dòng)物不僅使滅活疫苗的保護(hù)率提高到100%，而且攻毒后細(xì)菌的幾 何增長率從77%降低到21%，說明組合疫苗具有很好的免疫保護(hù)效果。因此，本發(fā)明的疫 苗是一種新型、高效的李氏桿菌疫苗。
附基因序列表
〈210>1
〈211>33
〈212>DNA 〈213>人工序列(上游引物) 〈400> accgaattca tgaaaaaagc aactatcgcg get 33 〈210>2 〈211>34 〈212>DNA 〈213>人工序列(下游引物) 〈400〉 accctcgagc taagcttttc caaggtgttt ttga 3權(quán)利要求
李氏桿菌病疫苗，其特征是疫苗由P60蛋白100μg，109個(gè)李氏桿菌滅活菌及與抗原等體積的佐劑構(gòu)成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的李氏桿菌病疫苗，其特征是P60為重組蛋白。
3. 權(quán)利要求2所述的李氏桿菌疫苗的制備方法，其特征是a. P60重組蛋白制備以單核細(xì)胞增多性李氏桿菌基因組DNA為模板，以上游引物PI和下游引物P2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，P1和P2的序列如下上游引物P1 :5' -ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3'; 下游引物P2 :5' -ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3'雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-30a，然后回收目的片段和載體片段，用連接酶連接，將P60基因 定向插入pET-30a表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET-P60，將pET_P60轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感 受態(tài)細(xì)菌后，挑選單菌落，接種含卡那霉素(50i!g/mL)的LB培養(yǎng)基中，加IPTG(終濃度為 lmmol/L)誘導(dǎo)3 7h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心收集菌體，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲波處理后收集 上清，過鎳瓊脂糖親和層析柱，用含有10Ommol/L咪唑的緩沖液洗脫，收集洗脫峰得到純化 的P60重組蛋白；b. 單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的滅活；取李氏桿菌菌液接入LB培養(yǎng)液中，再在菌液中加入終濃度0. 5%的甲醛滅活12小時(shí)；c. 取P60重組蛋白、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的滅活菌及佐劑進(jìn)行復(fù)配，得李氏桿菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗及這種疫苗的制備方法，確切講是李氏桿菌疫苗及制備方法。本發(fā)明涉及的疫苗由P60蛋白100μg，109個(gè)李氏桿菌滅活菌及與抗原等體積的佐劑構(gòu)成。本發(fā)明所用的P60為重組蛋白。
文檔編號C12N1/36GK101698100SQ20091020505
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月25日
發(fā)明者周邦信, 鞏偉, 張少華, 才學(xué)鵬, 趙松波, 駱學(xué)農(nóng) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所