專利名稱：一種單核細胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能表達綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的prfA 基因缺失重組單核細胞增生性李斯特菌(LM)，特別是提供了能夠預防李氏桿菌病，而且可以表達外源性抗原來預防胞內(nèi)感染的病原微生物引起的疫病的活載體，屬于人畜共患病分子標記疫苗技術領域。
背景技術：
單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種能引起人和動物李斯特菌病的人獸共患病原菌。在家畜上，LM可引起腦膜腦炎、流產(chǎn)和急性敗血??；在家禽上，LM可導致敗血癥和心肌壞死的發(fā)生，每年該病都對我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。同時，作為一種重要的食源性細菌，該菌能污染肉、奶、蛋等動物性食品而引起食品中毒，并能導致孕婦、新生兒及免疫力低下的成年人發(fā)病，對人類的健康也構成極大的威脅， 被列為是四大食源性病原菌之一。1999年底，美國發(fā)生了歷史上因食用帶有李斯特菌的食品而引發(fā)的最嚴重的食物中毒事件。據(jù)美國疾病控制和防治中心資料顯示，在美國密歇根州有14人因食用被該菌污染的“熱狗”和熟肉而死亡，在另外22個州97人患此病，6名婦女流產(chǎn)。1992-1995年法國出產(chǎn)的奶酪及豬肉中發(fā)現(xiàn)LM。近年來，我國質檢部門多次從國內(nèi)和國外動物性食品加工廠生產(chǎn)的食品中檢測出單核細胞增生性李斯特菌。因此，為了確保人們的身體健康，應該積極開展單核細胞增生性李斯特菌減毒活載體疫苗的研制工作。
參與LM感染和擴散的多種毒力因子都集中在其基因組一個9 Kb的致病島 (Listeria pathogenicity island 1，LIPI_1)內(nèi)。這個區(qū)域的DNA分別編碼正調(diào)節(jié)因子 (prfA)、磷脂酶Ca (plcA)、溶血素(LL0)、依賴鋅的金屬蛋白酶(mlp)、肌動蛋白聚合蛋白 (actA)和磷脂酰肌醇特異性卵磷脂酶(plcB) 6個毒力因子。
由于LM具有較強的毒力，在將開發(fā)為活疫苗載體之前需要對其毒力基因進行分子改造，使之毒力減弱。近年來，隨著對LM毒力基因研究的不斷深入，國外學者開展了 LIPI-I致病島毒力基因的改造研究。Angelakopoulos等(2002)對actA和plcB毒力基因進行了雙重刪除，獲得的菌株在志愿者身上進行試驗，結果大部分志愿者未發(fā)現(xiàn)不良反應，僅少數(shù)有輕微反應，經(jīng)過14天的免疫監(jiān)測，志愿者體內(nèi)產(chǎn)生了堅強的體液免疫和細胞免疫。在對LM LIPI-I致病島毒力基因進行改造的同時，一些學者還將外源性基因插入 LIPI-I致病島編碼基因中，獲得的重組LM不但毒力減弱，而且表達的外源蛋白可有效地刺激機體產(chǎn)生細胞免疫應答。
目前，國內(nèi)開展LIPI-I致病島毒力基因改造的研究工作剛剛起步，在動物試驗中獲得了預期的結果，顯示出良好的應用前景，但是到目前為止國內(nèi)外還沒有重組LM疫苗進入人臨床試驗的報告，也沒有關于動物李氏桿菌商品化弱毒疫苗研制成功的報道，這與LM 重組菌本身的毒力仍然較強有關。
因此，要想將LM開發(fā)成表達外源基因的活疫苗載體和弱毒疫苗，必須對LM的毒力基因進行進一步的致弱改造。隨著對LM毒力因子表達調(diào)控分子機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)prfA 基因的編碼蛋白作為一種轉錄活化因子能調(diào)控LM LIPI-I致病島中大多數(shù)毒力因子和內(nèi)化素的表達，而這些分子在LM入侵、擴散和致病力中起重要作用。因此，如果對該基因進行改造，就很有希望得到毒力進一步降低的重組LM，從而開發(fā)出具有使用價值的李氏桿菌活疫苗載體，不但可以有效地預防李氏桿菌病，而且可以表達外源性抗原來預防胞內(nèi)感染的病原微生物引起的疫病。鑒于此，本項目以高致病性LM LIPI-I致病島中的關鍵分子prfA基因為研究對象，擬采用分子生物學手段對其進行基因改造致弱，構建能表達GFP的LM prfA 基因重組菌，并開展重組菌生長特性、毒力、感染動力學、遺傳穩(wěn)定性和免疫原性研究，旨在為李氏桿菌病得有效防治提供一種安全、可靠、高效的疫苗。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用以高致病性LM LIPI-I致病島中的關鍵分子 prfA基因為研究對象，采用分子生物學手段對其進行基因改造致弱，構建能表達GFP的安全性高，穩(wěn)定性強，免疫效果好的LM prfA基因缺失菌，為進一步開展缺失菌生長特性、毒力、感染動力學、遺傳穩(wěn)定性和免疫原性研究奠定基礎。
本發(fā)明公開了一種單核細胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的構建方法，其特征在于主要包括以下步驟(一)、選擇單核細胞增生性李斯特菌prfA及同源臂基因、gfp基因序列，根據(jù)選擇的 PrfA基因和gfp基因的靶序列分別進行引物的設計，其中Pl和P2引物擴增prfA及同源臂基因片段，擴增長度為1519 bp;P3和P4引物擴增gfp基因片段，擴增長度為720bp，引物序列為Pl <210> 3，其酶切位點為Kpn I ； P2 <210> 4，其酶切位點為)(ba I ； P3 <210> 5，其酶切位點為EcoR I ； P4 <210> 6，其酶切位點為BamH I ；(二)、克隆載體pMD-T-Δ prfA-gfp的構建(1)提取單核細胞增生性李斯特菌基因組DNA；(2)擴增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，提取單核細胞增生性李斯特菌基因組 DNA 2 L和pGFP-Nl質粒0. 5 L作為模板；(3)克隆載體pMD19-T-prfA、pMD19-T-gfp的構建將上述PCR產(chǎn)物與pMD19_T載體連接；(4)pMD19-T- Δ prfA-gfp 載體的構建用 EcoR I、BamH I 分別將 pMD19_T_prfA 和 pMD19-T-gfp進行同步雙酶切后將gfp連入pMD19-T- Δ prfA中；(三)、重組穿梭載體PKSV7-Δ prfA-gfp的構建用Kpn I和Xba I將穿梭載體pKSV7和pMD19_T_ Δ prfA-gfp進行同步雙酶切后將 Δ prfA-gfp 連入 pKSV7 中；(四)、將穿梭載體PKSV7-Δ prfA-gfp電轉化進入LM感受態(tài)細胞 (I)LM感受態(tài)細胞的制備；(a)接種活化LM轉接入5 IOml BHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；(b)于第二日按1 50 1 100稀釋轉接入新鮮BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5h-3h, 至 0D600 為 0. 4-0. 5 ；(c)加入濃度為4 5μg/ml的Penicillin G，繼續(xù)搖至0D6000. 8 1.0 ；(d)3. 5 4. 50C，4500 5500rpm,離心 10 12min,收集細菌；(e)用預冷的10 12ml蔗糖甘油緩沖溶液吹打重懸，8000 IOOOOrpm,3. 5 4. 5°C， 10 12min ；(f)沉淀用體積比1/50 1/100超純水溶解；(g)感受態(tài)每100μ L 200 μ L分裝一管，現(xiàn)做現(xiàn)用； (2)電轉化在2. 45 2. 55kv、180 220 Ω和23 27 μ F電轉參數(shù)下，用構建好的基因敲除質粒 PKSV7- Δ prfA-gfp電轉化感受態(tài)細菌，電轉結束后將細菌涂布于含40 60 μ g/ml青霉素的BHI平板，36. 9 37. 1°C培養(yǎng)46 50h，挑取所有的單菌落，用引物P1/P2進行單菌落 PCR鑒定；(五)、重組菌LM-Δ prfA-gfp的構建將含有基因敲除質粒的陽性克隆在BHI液體培養(yǎng)基中36. 9 37. 1°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后涂布于9 11 μ g/ml氯霉素固體培養(yǎng)基上，41. 9 42. 1°C條件下連續(xù)培養(yǎng) 48-7池，質粒載體與細菌DNA整合，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組；從細菌菌落數(shù)最少的平板上挑取單菌落，36. 9 37. 1°C液體傳代培養(yǎng)，傳代時使用無抗生素BHI培養(yǎng)基，每傳一次保一次菌，至傳代30代確定質粒完全丟失后開始提取基因組DNA，用外圍引物對P5:<210> 7 /P6 <210> 8進行PCR鑒定，直至出現(xiàn)基因組中插入gfp的重組菌；(六)、經(jīng)過一定條件下連續(xù)傳代，獲得穩(wěn)定遺傳的重組菌將上述PCR產(chǎn)物進行電泳，若電泳后，PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片段大小約為觀00 bp，說明樣品基因組中含有gfp插入基因；如果僅出現(xiàn)2200 bp大小的核酸片段，則表明樣品中基因組DNA中并沒有插入gfp，即沒有發(fā)生同源重組。
上述步驟(二)中擴增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，其PCR反應條件的確定最好采用相同的50 L PCR反應體系，PCR反應體系的組成為10XPCR緩沖液5 L， 25mmol/L MgCl2 4 ？ L,2. 5mmol/L dNTP 4 ？ L，P1、P2 或 P3、P4 (25 pmol/ L)各 1 L， 提取單核細胞增生性李斯特菌基因組DNA 2 L和pGFP-Nl質粒0. 5 L作為模板，Taq DNA 聚合酶(1. 5U/ L)1 L，補加去離子水至50 L ；prfA及同源臂基因最佳循環(huán)參數(shù)為95°C， 150 s ；94°C,40 s ；59°C,40 s ;72°C，120s，最后 72°C延伸 IOmin ;gfp 基因最佳循環(huán)參數(shù)為 95°C, 150 s;94°C，30 s;55°C，40 s ;72°C，60s，最后 72°C延伸 IOmin0
上述步驟(一)中引物設計具體的要求最好為G+C含量為45 65%，引物長度 18 22nt，其不含保護性堿基和酶切位點， ιι值55 70°C，擴增產(chǎn)物長度1500 2000 bp。
單核細胞增生性李斯特菌prfA基因及上下游同源臂、gfp基因的克隆從GenBank (DQ309883. 2、AF303131. 1)中下載已經(jīng)公布的單核細胞增生性李斯特菌基因及gfp基因序列。其中PrfA基因及上下游同源臂序列中第260位一第973位是prfA基因；從第879位一第949位缺失后插入gfp基因。
說明兩段粗黑字符之間(第260位一第973堿基)的序列為完整的prfA基因，下劃線的粗黑字符為缺失的基因片段(第879位一第949位堿基)；然后在這個部位插入完整的gfp基因。
prfA基因及上下游同源臂擴增的靶序列為1 AAAGTTTACG CATGTTGTTC GCACCCAGTT CTTTCAGGTC CTGCTATGAA ACGTATTGAA 61 GAATCGCCAA TCGAAAAATT AGTTGTTACA AACTCCATCG CTCTTCCAGA AGAAAAATGG121ATTGACAAAATGGAACAATTATCTGTTGCAGCTCTTCTTGGCGAAGCAATCGTTCGCGTT181CATGAAAATGCTTCTGTAAGTTCTTTATTCGAATAAAATATAAAACAGGATGCCTCATTG241AGACATCCTGTTTTTTGATTTAATTTAATTTTCCCCAAGTAGCAGGACATGCTAAATAAA301ACCATTCATCTAATTTAGGAGCATATCTTTTGAGATAATCAAGATTTTGTACATAAAAGC361ATGAATTTTTATACACGATAACTTTCTCTTGCTTTAATTTAGAAATAATTCTGCTAACAG421CTGAGCTATGTGCGATACCGCTTGAATAGCCTAACTCCTGCATTGTTAAATTATCCAGTG481TAATCTTGATGCCATCAGGAGTTTCTTTACCATACACATAGGTCAGGATTAAAAGTTGAC541CGCAAATAGAGCCGAGCTTCCCGTTAATCGAAAAATCATTAAATTTGGCTAGGCTGTATG601AAACTTGTTTTTGTAGGGTTTGGAAAACATAGAAAAAGTGCGTAAGATTCTTGCTCAGTA661GTTCTTTTAGTTCGTTTATTTTGATAACGTATGCGGTAGCCTGTTCGCTAATGACTTCTA721AATTATAATAGCCAACCGATGTTTCTGTATCGATAAAGCCAGACATTATAACGAAAGCAC781CTTTATAGTATTGTAAATTCATGATGGTCCCGTTCTCGCTAATACTTGTAAGCTTTGTAA841TACCATCATATAGGAAAATACAATATTCTTGTGGATCCCATTGGTTAAAAATAAGTTCTT901TTTTATGAAATTGTTTTGGTTTTATCCCGTTAGTTTCTAAATATTTTTTGAATTCTTCTG961 CTTGAGCGTT CATGTCTCAT CCCCCAATCG TTTTTTATCG CCCTTTTTTA AAATACCCTA1021AAAACATTAGGCAGTAACAACAATTGTTAGCTGTTGAAAGAAAGTCACGCTAAATAATAT1081TTTTTACATATAGGATTTTATTATACAAATTTTGATTTCGCAAAAGAAATGCATACATAT1141TTAAAAACGGATTTATTTAGATGTTAAAATTGAAATAGGGTTAGTATATGGTTCCGATGG1201TTGCTCGGAGATATACTAACCCTTTTTTTGTAGGAATAATATATGTTAGTTGAATTTATT1261GTTTTTTATGATGTTTTTGATAGTTTGTTTTTCGGGGAAGTCCATGATTAGAATGCCTAA1321TCCTCGAACTTTTTCCGATGTTAAGTTGAGTACGAACTGCTCTACTTTGTTGTTTAATGC1381TGCAGCATACTGACGAGGTGTGAATGTTAATGAAGTGGCACTAATATGGTTAAGAAACAG1441TTTGTTGTCCGCTTTAGAAGCTTGATAAGCAGTCTGGACAATCTCTTTGAATTTTGTTTT1501CACACTCGGACCATTGTAG本發(fā)明與常規(guī)的檢測技術相比具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明建立的表達GFP-Δ prfA基因重組菌，安全性高，穩(wěn)定性強，免疫效果好。2、本發(fā)明另一個優(yōu)點是將調(diào)控LM毒力基因表達的調(diào)控基因prfA缺失部分基因后插入 gfp，從而使各毒力基因的表達受到一定程度的抑制達到顯著降低毒力的同時又不使免疫原性發(fā)生變化；可以用于防治李氏桿菌病，也可以進一步改造成活載體疫苗達到一苗防多病的效果。


圖1為樣品中單核細胞增生性李斯特菌未發(fā)生重組，M :D, L-5000, S :Sample。
圖 2 為樣品為重組菌 LM- Δ prfA-gfp, M :D, L-5000, S =Sample0
圖3為樣品中不含單核細胞增生性李斯特菌，M :D, L-5000, S :Sample。
圖4為電轉化穿梭載體pKSV7-AprfA-gfp后進行的菌落PCR鑒定結果，Μ: D, L-5000(5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，100) ；1，2，3，4 為電轉陽性菌落(2168bp); 7, 8，9為未電轉入質粒的菌落(1448bp)。
圖5為確認穿梭質粒丟失以后提取細菌DNA進行的PCR檢測結果，鑒定是否發(fā)生重組，M D, L-5000 (5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，100) ； 1 為 LM 標準株； 2，3，4，6，7，9，10 為 LM- Δ prfA-gfp 重組菌。
圖6為重組菌LM- Δ prfA-gfp的構建PCR鑒定反應條件數(shù)據(jù)表格。
具體實施方式
實施例1參照圖1一圖6，本實施例分以下步驟操作1 選擇單核細胞增生性李斯特菌PrfA及同源臂基因、gfp基因序列，用primer premier 6. 0軟件分別設計特異性引物擴增目的片段；1.1單核細胞增生性李斯特菌PrfA及同源臂基因、gfp基因序列的選擇從GenBank中下載已經(jīng)公布的單核細胞增生性李斯特菌prfA及同源臂基因、gfp基因序列(GenBank 登錄號DQ309883. 2 和 AF303131. 1)。
1.2特異性引物的設計及合成將選擇的PrfA及同源臂基因、gfp基因的靶序列分別輸入primer premier 6. 0軟件程序中，分別設計兩種基因的特異性引物。PrfA基因引物設計具體的要求為G+C含量為 45 65%，引物長度18 22nt (不含保護性堿基和酶切位點)，Tm值55 70°C，擴增產(chǎn)物長度1500 2000 bp。gfp基因引物要求與prfA基因大致相同。送上海生工生物工程技術服務有限公司進行引物的合成。
2 克隆載體pMD- Δ prfA-gfp的構建；2.1單核細胞增生性李斯特菌基因組DNA的提取用液體培養(yǎng)基對標準的單核細胞增生性李斯特菌進行細菌培養(yǎng)，然后取1. 5mL培養(yǎng)物 12000rpm離心2min，在沉淀中加入200 ？ L的TE (pH8. 0)緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入100 L 10%SDS和15 L的蛋白酶K(20mg/mL)，混勻，于37°C溫育30min。然后再加入100 L 5mol/L NaCl,充分混勻，再加入80 L CTAB/NaCl溶液，混勻后再65°C溫育 IOmin0再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，12000r/min離心5min，轉入一只新管中， 加入2體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。沉淀用ImL的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇.在干燥的沉淀中加入適量的TE溶液溶解基因組DNA。
2.2擴增prfA及同源臂基因、gfp基因PCR反應條件的確定采用相同的50 L PCR反應體系。PCR反應體系的組成為10XPCR緩沖液5 L， 25mmol/L MgCl2 4 ？ L,2. 5mmol/L dNTP 4 ？ L，P1、P2 或 P3、P4 (25 pmol/ L)各 1 L， 提取單核細胞增生性李斯特菌基因組DNA 2 L和pGFP-Nl質粒0. 5 L作為模板，Taq DNA 聚合酶(1. 5U/ L)1 L，補加去離子水至50 L。prfA及同源臂基因最佳循環(huán)參數(shù)為95°C， 150 s ；94°C,40 s ；59°C,40 s ;72°C，120s，最后 72°C延伸 IOmin ;gfp 基因最佳循環(huán)參數(shù)為 95°C, 150 s;94°C，30 s;55°C，40 s ;72°C，60s，最后 72°C延伸 IOmin2. 3 克隆載體 pMD19-T-prfA、pMD19_T-gfp 的構建； PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，其反應體系如下10μ L 連接體系prfA 及其同源臂 PCR 回收產(chǎn)物3，pMD19-T :0. 5，Sollution I :5， ddH20 :1.5。
IOyL連接體系如下gfp PCR回收產(chǎn)物4，pMD19_T: 0.5，Sollution I :5，ddH20 :0· 5。2. 4 pMD19-T- Δ prfA-gfp 載體的構建用EcoR I ,BamH I分別將pMD19_T-prfA和pMD19_T-gfp進行同步雙酶切后將gfp連入pMD19-T- Δ prfA中。其酶切和連接反應如下10μ L 酶切體系pMD19-T-prfA / pMD19_T_gfp 5, IOXK buffer 1, EcoR I 和 BamH I 各 0. 5，dd H20 :3。
IOyL 連接體系pMD19-T-Δ prfA :3，gfp 酶切產(chǎn)物4，10XT4 連接酶 1，dd H20 :2。
3 重組穿梭載體pKSV7- Δ prfA-gfp的構建；用Kpn I和Xba I將穿梭載體pKSV7和pMD19_T_ Δ prfA-gfp進行同步雙酶切后將 Δ prfA-gfp連入pKSV7中。其酶切和連接反應如下10 μ L 酶切體系:pMD19-T- Δ prfA-gfp / pKSV7 :4，Kpn I 禾口 Xba I 各 0. 5，IOXM buffer :1, dd H20 :4。
10 μ L 連接體系pMD19-T- Δ prfA-gfp 酶切產(chǎn)物3. 5，pKSV7 酶切產(chǎn)物1， 10XT4 連接酶1，dd H20 4.5。
4將穿梭載體pKSV7- Δ prfA-gfp電轉化進入LM感受態(tài)細胞 4.1 LM感受態(tài)細胞的制備(1)接種活化LM轉接入5mlBHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；(2)于第二日按1:50稀釋轉接入新鮮BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2.5h至0D600約0. 4 ；(3)加入PenicillinG (至終濃度為5 μ g/ml)繼續(xù)搖至0D600為0. 8 ；(4)4°C 5000rpm,離心 IOmin,收集細菌；(5)用預冷的IOml蔗糖甘油緩沖溶液吹打重懸，8000rpm，4°C,IOmin ；(6)沉淀用1/100超純水溶解；(7)感受態(tài)每IOOyL分裝一管，現(xiàn)做現(xiàn)用。
4.2電轉化在2. 5kv、200Q和25 μ F電轉參數(shù)下，用構建好的基因敲除質粒pKSV7-Δ prfA-gfp電轉化感受態(tài)細菌，電轉結束后將細菌涂布于BHI平板(含50 μ g/ml青霉素)，37°C培養(yǎng)48h， 挑取所有的單菌落，用引物P1/P2進行單菌落PCR鑒定。
5 重組菌 LM- Δ prfA-gfp 的構建將含有基因敲除質粒的陽性克隆即上述獲得的陽性菌落在BHI液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后涂布于10 μ g/ml氯霉素固體培養(yǎng)基上，42°C條件下連續(xù)培養(yǎng)48h， 質粒載體與細菌DNA整合，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組；從細菌菌落數(shù)最少的平板上挑取單菌落，37°C液體傳代培養(yǎng)，傳代時使用無抗生素BHI培養(yǎng)基，每傳一次保一9次菌。至傳代30代確定質粒完全丟失后開始提取基因組DNA，用外圍引物對P5/P6進行 PCR 鑒定，所述 P5: <210> 7; P6: <210> 8，PCR 反應條件95°C 4min; 30 X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0參照圖6，直至出現(xiàn)基因組中插入gfp的重組菌。
6、重組菌LM- Δ prfA-gfp的分子生物學鑒定取10 L PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上，120V電泳30分鐘，用溴化乙錠染色，然后在紫外光透射儀下觀察拍照，以標準DNA marker (D，L-5000)作參考。若電泳后，瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)片段大小約為觀00 bp，說明樣品基因組中含有gfp插入基因(圖1);如果僅出現(xiàn)2200 bp大小的核酸片段(圖2)，則表明樣品中基因組DNA中并沒有插入gfp，即沒有發(fā)生同源重組。
實施例2 參照圖1 一圖6，本實施例與實施例1不同地方在于將穿梭載體pKSV7- Δ prfA-gfp 電轉化進入LM感受態(tài)細胞。
所述LM感受態(tài)細胞的制備中(1)接種活化LM轉接入8mlBHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；(2)于第二日按1:80稀釋轉接入新鮮BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2.8h至0D600約0. 5 ；(3)加入PenicillinG (至終濃度為4 μ g/ml)繼續(xù)搖至0D600為0. 9 ；(4)3. 50C 4500rpm,離心 llmin,收集細菌；(5)用預冷的Ilml蔗糖甘油緩沖溶液吹打重懸，9000rpm，3.5°C, llmin ；(6)沉淀用1/50超純水溶解；(7)感受態(tài)每200μ L分裝一管，現(xiàn)做現(xiàn)用。
所述電轉化中在2. 45kv、180 Ω和23 μ F電轉參數(shù)下，用構建好的基因敲除質粒pKSV7_ Δ prfA-gfp 電轉化感受態(tài)細菌，電轉結束后將細菌涂布于BHI平板(含40 μ g/ml青霉素)，37°C培養(yǎng) 50h，挑取所有的單菌落，用引物P1/P2進行單菌落PCR鑒定。
所述重組菌LM- Δ prfA-gfp的構建將含有基因敲除質粒的陽性克隆即上述獲得的陽性菌落在BHI液體培養(yǎng)基中37. I0C 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后涂布于9 μ g/ml氯霉素固體培養(yǎng)基上，42°C條件下連續(xù)培養(yǎng) 55h，質粒載體與細菌DNA整合，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組；從細菌菌落數(shù)最少的平板上挑取單菌落，36. 9°C液體傳代培養(yǎng)，傳代時使用無抗生素BHI培養(yǎng)基，每傳一次保一次菌。至傳代30代確定質粒完全丟失后開始提取基因組DNA，用外圍引物對P5/P6 進行 PCR 鑒定，所述 P5: <210> 7 ； P6: <210> 8，PCR 反應條件95°C 4min; 30X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0參照圖6，直至出現(xiàn)基因組中插入gfp的重組菌。
實施例3 參照圖1 一圖6，本實施例與實施例1不同地方在于將穿梭載體pKSV7- Δ prfA-gfp 電轉化進入LM感受態(tài)細胞。
所述LM感受態(tài)細胞的制備中(1)接種活化LM轉接入IOmlBHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；(2)于第二日按1:100稀釋轉接入新鮮BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2.9h至0D600約0. 5 ；(3)加入PenicillinG (至終濃度為4 μ g/ml)繼續(xù)搖至0D600為1. 0 ；(4)4. 50C 5500rpm,離心 12min,收集細菌；(5)用預冷的12ml蔗糖甘油緩沖溶液吹打重懸，IOOOOrpm,4. 5°C,12min ；(6)沉淀用1/80超純水溶解；(7)感受態(tài)每200μ L分裝一管，現(xiàn)做現(xiàn)用。
所述電轉化中在2. 55kv、220 Ω和27 μ F電轉參數(shù)下，用構建好的基因敲除質粒pKSV7_ Δ prfA-gfp 電轉化感受態(tài)細菌，電轉結束后將細菌涂布于BHI平板(含60 μ g/ml青霉素)，37. 1°C培養(yǎng) 46h，挑取所有的單菌落，用引物P1/P2進行單菌落PCR鑒定。
所述重組菌LM- Δ prfA-gfp的構建將含有基因敲除質粒的陽性克隆即上述獲得的陽性菌落在BHI液體培養(yǎng)基中36.9°C 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后涂布于11 μ g/ml氯霉素固體培養(yǎng)基上，42. 1°C條件下連續(xù)培養(yǎng) 65h，質粒載體與細菌DNA整合，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組；從細菌菌落數(shù)最少的平板上挑取單菌落，37. 1°C液體傳代培養(yǎng)，傳代時使用無抗生素BHI培養(yǎng)基，每傳一次保一次菌。至傳代30代確定質粒完全丟失后開始提取基因組DNA，用外圍引物對P5/P6 進行 PCR 鑒定，所述 P5: <210> 7 ； P6: <210> 8，PCR 反應條件95°C 4min; 30X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0參照圖6，直至出現(xiàn)基因組中插入gfp的重組菌。
實施例4 參照圖1 一圖6，本實施例與實施例1不同地方在于將穿梭載體pKSV7- Δ prfA-gfp 電轉化進入LM感受態(tài)細胞。
所述LM感受態(tài)細胞的制備中(1)接種活化LM轉接入5mlBHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；(2)于第二日按1 50稀釋轉接入新鮮BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)池至0D600約0. 5 ；(3)加入PenicillinG (至終濃度為5 μ g/ml)繼續(xù)搖至0D600為0· 8 ；(4)4°C5000rpm,離心 IOmin,收集細菌；(5)用預冷的IOml蔗糖甘油緩沖溶液吹打重懸，IOOOOrpm,4. 5°C,12min ；(6)沉淀用1/100超純水溶解；(7)感受態(tài)每100μ L分裝一管，現(xiàn)做現(xiàn)用。
所述電轉化中在2. 5kv、220Q和25 μ F電轉參數(shù)下，用構建好的基因敲除質粒pKSV7-Δ prfA-gfp電轉化感受態(tài)細菌，電轉結束后將細菌涂布于BHI平板(含65 μ g/ml青霉素)，37°C培養(yǎng)48h， 挑取所有的單菌落，用引物P1/P2進行單菌落PCR鑒定。
所述重組菌LM- Δ prfA-gfp的構建將含有基因敲除質粒的陽性克隆即上述獲得的陽性菌落在BHI液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后涂布于10 μ g/ml氯霉素固體培養(yǎng)基上，42°C條件下連續(xù)培養(yǎng)72h，11質粒載體與細菌DNA整合，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組；從細菌菌落數(shù)最少的平板上挑取單菌落，37°C液體傳代培養(yǎng)，傳代時使用無抗生素BHI培養(yǎng)基，每傳一次保一次菌。至傳代30代確定質粒完全丟失后開始提取基因組DNA，用外圍引物對P5/P6進行 PCR 鑒定，所述 P5: <210> 7; P6: <210> 8，PCR 反應條件95°C 4min; 30 X (94°C 45s, 60°C 40s, 72°C 2min30s), 72°C IOmin0參照圖6，直至出現(xiàn)基因組中插入gfp的重組菌。
權利要求
1. 一種單核細胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的構建方法，其特征在于主要包括以下步驟(一)、選擇單核細胞增生性李斯特菌PrfA及同源臂基因、gfp基因序列，根據(jù)選擇的 PrfA基因和gf/7基因的靶序列分別進行引物的設計，其中Pl和P2引物擴增/TTi^及同源臂基因片段，擴增長度為1519 bp;P3和P4引物擴增基因片段，擴增長度為720bp，引物序列為Pl <210> 3，其酶切位點為幻W I ；P2 <210> 4，其酶切位點為損a I ；P3 <210> 5，其酶切位點為I ；P4 <210> 6，其酶切位點為I ；(二)、克隆載體pMD-T-Δ prfA-gfp的構建(1)提取單核細胞增生性李斯特菌基因組DNA；(2)擴增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，提取單核細胞增生性李斯特菌基因組 DNA 2 μ L禾口 pGFP-m質粒0. 5 μ L作為模板；(3)克隆載體pMD19-T-prfA、pMD19-T-gfp的構建將上述PCR產(chǎn)物與pMD19_T載體連接；(4)pMD19-T- Δ prfA-gfp 載體的構建用 EcoR I、BamH I 分別將 pMD19_T_prfA 和 pMD19-T-gfp進行同步雙酶切后將gfp連入pMD19-T- Δ prfA中；(三)、重組穿梭載體PKSV7-Δ prfA-gfp的構建用Kpn I和損a I將穿梭載體pKSV7和pMD19_T_ Δ prfA-gfp進行同步雙酶切后將 Δ prfA-gfp 連入 pKSV7 中；(四)、將穿梭載體PKSV7-Δ prfA-gfp電轉化進入LM感受態(tài)細胞(1)LM感受態(tài)細胞的制備；(a)接種活化LM轉接入5 IOmlBHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；(b)于第二日按1 50 1 100稀釋轉接入新鮮BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5h-3h, 至 OD600 為 0. 4-0. 5 ；(c)加入濃度為4 5μg/ml的Penicillin G，繼續(xù)搖至OD600O. 8 1. 0 ；(d)3. 5 4. 50C，4500 5500rpm,離心 10 12min,收集細菌；(e)用預冷的10 12ml蔗糖甘油緩沖溶液吹打重懸，8000 IOOOOrpm,3. 5 4. 5°C， 10 12min ；(f)沉淀用體積比1/50 1/100超純水溶解；(g)感受態(tài)每100μ L 200 μ L分裝一管，現(xiàn)做現(xiàn)用；(2)電轉化在2. 45 2. 55kv、180 220 Ω和23 27 μ F電轉參數(shù)下，用構建好的基因敲除質粒 PKSV7- Δ prfA-gfp電轉化感受態(tài)細菌，電轉結束后將細菌涂布于含40 60 μ g/ml青霉素的BHI平板，36. 9 37. 1°C培養(yǎng)46 50h，挑取所有的單菌落，用引物P1/P2進行單菌落 PCR鑒定；(五)、重組菌LM-Δ prfA-gfp的構建將含有基因敲除質粒的陽性克隆在BHI液體培養(yǎng)基中36.9 37. 1°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后涂布于9 11 μ g/ml氯霉素固體培養(yǎng)基上，41. 9 42. 1°C條件下連續(xù)培養(yǎng) 48-7池，質粒載體與細菌DNA整合，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組；從細菌菌落數(shù)最少的平板上挑取單菌落，36. 9 37. 1°C液體傳代培養(yǎng)，傳代時使用無抗生素BHI培養(yǎng)基，每傳一次保一次菌，至傳代30代確定質粒完全丟失后開始提取基因組DNA，用外圍引物對P5:<210> 7 /P6 <210> 8進行PCR鑒定，直至出現(xiàn)基因組中插入gfp的重組菌；(六)、經(jīng)過一定條件下連續(xù)傳代，獲得穩(wěn)定遺傳的重組菌將上述PCR產(chǎn)物進行電泳，若電泳后，PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片段大小約為觀00 bp，說明樣品基因組中含有gfp插入基因；如果僅出現(xiàn)2200 bp大小的核酸片段，則表明樣品中基因組DNA中并沒有插入gfp，即沒有發(fā)生同源重組。
2.如權利要求1所述的單核細胞增生性李斯特菌PrfA基因缺失菌的構建方法，其特征在于步驟(二)中擴增含有PrfA基因及同源臂片段、gfp基因，其PCR反應條件采用相同的50yL PCR反應體系，PCR反應體系的組成為10 X PCR緩沖液5 μ L，25mmol/L MgCl2 4 μ L,2. 5mmol/L dNTP 4 μ L，P1、P2 或 P3、P4 (25 pmol/μ L)各 1 μ L，提取單核細胞增生性李斯特菌基因組DNA 2 μ L和pGFP-Nl質粒0. 5 μ L作為模板，Taq DNA聚合酶(1. 5U/ μ L) lyL，補加去離子水至50yL ;prfA及同源臂基因最佳循環(huán)參數(shù)為95°C，150 s ；94°C,40 s ； 59°C,40 s ；72°C，120s，最后 72°C延伸 IOmin ；gfp 基因最佳循環(huán)參數(shù)為 95°C，150 s ；94°C, 30 s;55°C，40 s ;72°C，60s，最后 72°C延伸 IOmin0
3.如權利要求1或2所述的單核細胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的構建方法，其特征在于步驟(一)中引物設計具體的要求為G+C含量為45 65%，引物長度18 22nt， 其不含保護性堿基和酶切位點，Tm值55 70°C，擴增產(chǎn)物長度1500 2000 bp。
全文摘要
本發(fā)明為單核細胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的構建方法，主要包括以下步驟根據(jù)選擇的prfA基因和gfp基因的靶序列分別進行引物的設計；克隆載體pMD-T-△prfA-gfp的構建；重組穿梭載體pKSV7-△prfA-gfp的構建；將穿梭載體pKSV7-△prfA-gfp電轉化進入LM感受態(tài)細胞；重組菌LM-△prfA-gfp的構建；經(jīng)過一定條件下連續(xù)傳代，獲得穩(wěn)定遺傳的重組菌。本發(fā)明是將調(diào)控LM毒力基因表達的調(diào)控基因prfA缺失部分基因后插入gfp建立的表達GFP-ΔprfA基因重組菌，安全性高，穩(wěn)定性強，免疫效果好。
文檔編號C12R1/01GK102533829SQ20111045851
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者丁波, 喬軍, 孟慶玲, 張再超, 楊麗紅, 田振中, 蔡擴軍, 陳創(chuàng)夫 申請人:石河子大學