專利名稱：SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的功能構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到嵌合％(^和基于嵌合kcA，fikcB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的構(gòu)建這一技術(shù)方法，以及該技術(shù)方法在工業(yè)上生產(chǎn)分泌蛋白中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌被廣泛地用來大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)具有各種應(yīng)用價值的蛋白，如藥用蛋白，工業(yè)用酶等。目前，按照發(fā)酵結(jié)束后目標(biāo)蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還是培養(yǎng)基中，可以把生產(chǎn)技術(shù)分為兩類a)以胞內(nèi)蛋白的方式生產(chǎn)目標(biāo)蛋白；b)以胞外蛋白(即分泌蛋白)的方式生產(chǎn)目標(biāo)蛋白。與前者相比，后者由于目標(biāo)蛋白位于培養(yǎng)基中，發(fā)酵結(jié)束后無須回收細(xì)胞，無須采取物理，化學(xué)或生物的方法將細(xì)胞裂解以便目標(biāo)蛋白的釋放，因此大大簡化了發(fā)酵后目標(biāo)蛋白的分離純化工作，有效控制了生產(chǎn)成本[1]。此外，以胞外蛋白的方式生產(chǎn)目標(biāo)蛋白還具有其他的優(yōu)勢，例如能夠有效減少細(xì)胞質(zhì)內(nèi)目標(biāo)蛋白的積累，從而避免包含體的形成；允許含有二硫鍵的蛋白能夠在氧化性環(huán)境下進(jìn)行正確的折疊等。因此，在工業(yè)上以分泌蛋白的方式大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)蛋白是首選方案。細(xì)菌能夠?qū)⒑行盘栯牡牡鞍?即分泌蛋白)從其翻譯地點(diǎn)即細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外培養(yǎng)基中，這一過程稱為蛋白質(zhì)分泌。在細(xì)菌中，這一功能的執(zhí)行主要依賴Sec轉(zhuǎn)位酶 (Sec translocase)來實現(xiàn)，其核心由跨膜蛋白通道kcYEG與分子馬達(dá)kcA (ATP酶)構(gòu)成，如圖5所示。攜帶信號肽的新生肽鏈需要從細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)移到Sec轉(zhuǎn)位酶的關(guān)鍵組分 kcA上，這一過程稱為靶向；隨后，在水解ATP提供能量的情況下，^cA將待分泌的新生肽鏈經(jīng)蛋白通道擠壓出細(xì)胞質(zhì)，從而進(jìn)入細(xì)胞膜外空間W]。到目前為止，如圖5所示，在細(xì)菌中已經(jīng)鑒定的介導(dǎo)靶向過程的途徑有1)信號肽識別顆粒(SRP)及其受體(SR) 介導(dǎo)的共翻譯靶向途徑，負(fù)責(zé)新生信號肽疏水性強(qiáng)的分泌蛋白的靶向，即SRP識別暴露于核糖體表面的信號肽，在翻譯的同時通過SRP與其受體SR的相互作用，將翻譯中的肽鏈轉(zhuǎn)移到％(轉(zhuǎn)位酶上[5] ；2) kcA介導(dǎo)的共翻譯/翻譯后靶向途徑，負(fù)責(zé)信號肽疏水性一般的分泌蛋白的靶向，即^cA不需要借助其他因子直接識別新生信號肽W] ；3)kcB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，協(xié)助^cA識別那些信號肽效率(即新生分泌肽鏈被分泌系統(tǒng)識別，結(jié)合并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜外側(cè)的效率，影響因素包括信號肽特性以及信號肽下游肽段特性)低下的分泌蛋白的靶向，即新生分泌肽鏈在翻譯末期或結(jié)束后與SecB結(jié)合從而維持非折疊構(gòu)像，此二元復(fù)合物進(jìn)而依賴SecB與Sec轉(zhuǎn)位酶關(guān)鍵組分SecA的高親和性(由SecB四聚體表面的“帶負(fù)電荷的區(qū)域”與SecA 二聚體羧基末端“帶正電荷的鋅結(jié)構(gòu)域”即“鋅結(jié)合基序”之間的相互作用介導(dǎo))，從而將肽鏈轉(zhuǎn)移給％(^，完成靶向過程[7，8]。對于特定的分泌蛋白來說，依賴何種靶向途徑取決于其信號肽的特性，例如信號肽疏水性[9，10]?？莶菅堪麠U菌及其親緣的芽胞桿菌以其強(qiáng)大的蛋白分泌能力而著稱，能夠?qū)⒌鞍字苯臃置诘脚囵B(yǎng)基中使之達(dá)到克每升的水平[11，12]。這一特性對于工業(yè)用酶生產(chǎn)非常有利，因此這類細(xì)菌被廣泛用于在工業(yè)上生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品[13，14]，例如在現(xiàn)有的商品化酶中，大約有60%是由屬于革蘭氏陽性細(xì)菌的芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的，其中絕大部分是天然分泌的自身蛋白，如淀粉酶和蛋白酶[2]。雖然用枯草芽胞桿菌生產(chǎn)外源分泌蛋白不乏成功實例，然而與內(nèi)源分泌蛋白相比，多數(shù)情況下枯草芽胞桿菌分泌外源蛋白的效率仍然低下，尤其是那些真核生物來源的蛋白，從這層意義上來說，這限制了其在工業(yè)中的廣泛應(yīng)用 [15，16]。研究表明，限制外源蛋白分泌效率的因素主要是靶向效率和蛋白酶降解，鑒于此， 研究人員發(fā)展了各種策略以增強(qiáng)枯草芽胞桿菌對外源蛋白的分泌能力，例如優(yōu)化信號肽， 過表達(dá)靶向因子(SRP)，過表達(dá)Sec轉(zhuǎn)位酶組分，過表達(dá)伴侶分子以及使用蛋白酶缺陷的菌株等，并且這些策略也被申請了相應(yīng)的專利[1]。
隨著細(xì)菌蛋白質(zhì)分泌機(jī)理在分子水平上的研究不斷深入，人們對其理解也在不斷深化。細(xì)菌為了更好地適應(yīng)特定的生存環(huán)境，基于Sec轉(zhuǎn)位酶的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)(簡稱％( 系統(tǒng))在進(jìn)化的過程中在不同的物種間呈現(xiàn)出一定的差異，例如信號肽特性的差異[17] 和Sec系統(tǒng)的差異[18]等。正是這些差異的存在導(dǎo)致了外源分泌蛋白無法像內(nèi)源分泌蛋白一樣在異源宿主中得到高效分泌。如果能夠克服這些差異，有望從根本上解決外源蛋白在異源宿主中分泌效率低下的問題。已發(fā)表的結(jié)果表明，與大腸桿菌相比，枯草芽胞桿菌缺失了 SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑[18]。然而，由于其信號肽比大腸桿菌信號肽疏水性更強(qiáng)和N端帶有更多的正電荷[17]，因此內(nèi)源分泌蛋白可以被SRP有效識別[19]?？紤]到革蘭氏陰性細(xì)菌和真核生物的信號肽與革蘭氏陽性細(xì)菌的信號肽差異顯著[17]，我們推測這些外源分泌蛋白在枯草芽胞桿菌中無法被SRP或kcA有效識別，致使分泌蛋白前體在細(xì)胞質(zhì)中積累和/或引發(fā)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)將其降解，導(dǎo)致這些外源蛋白的靶向效率低下， 最終導(dǎo)致分泌效率低下[20，21]。為了促使枯草芽胞桿菌在工業(yè)上廣泛用于分泌生產(chǎn)外源蛋白，必須解決靶向效率低下的問題。一個辦法是改造信號肽或篩選最優(yōu)信號肽[22-M]， 從而得到適合目的蛋白的信號肽。由于特定的目的蛋白需要特定的信號肽才能達(dá)到理想的靶向效率，該策略的一個缺點(diǎn)就是針對不同的目的蛋白，需要做特定的信號肽改造或篩選。 基于在分子水平上對蛋白質(zhì)分泌的認(rèn)識，考慮到IWecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑能夠協(xié)助 kcA識別信號肽效率低下的分泌蛋白；幻外源分泌蛋白的信號肽(如來源于革蘭氏陰性細(xì)菌和真核生物)在枯草芽胞桿菌中的效率低下，故本發(fā)明試圖在枯草芽胞桿菌中重構(gòu)SecB 介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，以期增強(qiáng)該菌對外源分泌蛋白的分泌能力，即以大腸桿菌來源的麥芽糖結(jié)合蛋白突變體(MalEll)，堿性磷酸酶(PhoA)和野生型麥芽糖結(jié)合蛋白與堿性磷酸酶的融合蛋白(MalE-PhoA)作為外源分泌蛋白，研究了 bekcA和edecB能否在枯草芽胞桿菌中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑以及該靶向途徑的存在能否增強(qiáng)宿主對外源分泌蛋白的分泌能力，由此完成了本發(fā)明。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種增加細(xì)菌分泌蛋白效率的方法，該方法包括
在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合kcA蛋白和kcB蛋白，從而在該宿主中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，由此增加該細(xì)菌分泌蛋白的效率；
其中，所述嵌合kcA蛋白的“鋅結(jié)合基序”與該蛋白的其它部分的序列異源，且所述嵌合SecA蛋白能結(jié)合所述SecB蛋白。
本發(fā)明提供一種在細(xì)菌中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的方法，該方法包括
在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合kcA蛋白和kcB蛋白，從而在該宿主中構(gòu)建kcB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑；其中，所述嵌合kcA蛋白的“鋅結(jié)合基序”與該蛋白的其它部分的序列異源，且所述嵌合SecA蛋白能結(jié)合所述SecB蛋白。本發(fā)明提供一種提高細(xì)菌蛋白質(zhì)分泌能力的方法，該方法包括在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合kcA蛋白和kcB蛋白，從而在該宿主中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，由此提高該細(xì)菌的蛋白質(zhì)分泌能力；其中，所述嵌合％(^蛋白的“鋅結(jié)合基序”與該蛋白的其它部分的序列異源，且所述嵌合SecA蛋白能結(jié)合所述SecB蛋白。在一具體實施例中，所述蛋白選自天然分泌蛋白或人工分泌蛋白，其中天然分泌蛋白優(yōu)選為外源的天然分泌蛋白。在一具體實施例中，所述蛋白選自外源的天然分泌蛋白，包括水解酶(例如蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶)、抗體、干擾素和生長因子。在一具體實施例中，所述蛋白為融合蛋白，優(yōu)選為與麥芽糖結(jié)合蛋白融合而形成的融合蛋白。在一具體實施例中，所述細(xì)菌為天然缺失secB基因的細(xì)菌，且所述細(xì)菌天然存在 seek基因。在一具體實施例中，所述細(xì)菌為選自芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬 (Corynebacterium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus) >^LIfliiM (Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)或梭菌屬 (Clostridium)的細(xì)菌。在一具體實施例中，所述細(xì)菌選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、短芽胞桿菌(Bacillus brevis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)或蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)。在一具體實施例中，所述在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合SecA蛋白和SecB蛋白包括構(gòu)建含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含secB基因的表達(dá)載體，其中，所述嵌合secA 基因為人工改造所述細(xì)菌secA基因而得，即所述細(xì)菌secA基因“鋅結(jié)合基序”的編碼序列被外源secA基因“鋅結(jié)合基序”的編碼序列所替換，從而具備結(jié)合所述SecB蛋白的能力；用所述含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含secB基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌，從而在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合kcA蛋白和kcB蛋白。在一具體實施例中，所述secB基因來自于與所述細(xì)菌不同種屬的細(xì)菌。在一具體實施例中，所述secB基因與所述secA基因的“鋅結(jié)合基序”的編碼序列來源于相同種屬的細(xì)菌。在一具體實施例中，所述的外源secA基因所編碼kcA蛋白的“鋅結(jié)合基序”為外源kcA蛋白羧基末端最后18 60個氨基酸。在一具體實施例中，所述外源secA基因為大腸桿菌secA基因或流感嗜血桿菌 seek基因。在一具體實施例中，所述外源secB基因為大腸桿菌secB基因或流感嗜血桿菌 secB基因。
6
本發(fā)明提供一種氨基酸序列，該氨基酸序列含有SEQ ID NO : 或SEQ ID NO 31 所述的氨基酸序列。
本發(fā)明提供一種核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼權(quán)本發(fā)明所述的氨基酸序列。
本發(fā)明提供一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含本發(fā)明所述的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)含有
(a)嵌合secA基因或含該嵌合secA基因的構(gòu)建物，或所述嵌合secA基因所編碼的嵌合^cA蛋白，其中，所述嵌合secA基因的“鋅結(jié)合基序”的編碼序列與該嵌合secA基因的其它部分異源，嵌合^cA蛋白具備結(jié)合所述SecB蛋白的能力；和
(b) secB基因或含該嵌合secB基因的構(gòu)建物，或所述secB基因所編碼的SecB蛋白，具備被所述嵌合SecA蛋白結(jié)合的特性。


圖 1 :pSJ3-ecSecA 質(zhì)粒示意圖。
圖 2 :pMA5-ecMalEll 質(zhì)粒示意圖。
圖 3 :pAX01-ecSecB 質(zhì)粒示意圖。
圖 4 :pOE-beSecA 質(zhì)粒示意圖。
圖5 枯草芽胞桿菌蛋白質(zhì)靶向途徑示意圖。半圓型陰影部分是本發(fā)明涉及到的基于嵌合SecA，由SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑。
圖6 =SecA蛋白羧基末端決定kcA-SecB特異性相互作用。
圖7 共表達(dá)嵌合SecA蛋白(beSecA)與SecB蛋白(ecSecB)能夠增強(qiáng)枯草芽胞桿菌分泌外源蛋白MalEll的能力。
圖8 =MalEll的高效分泌依賴kcB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑。
圖9 JecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑能夠增強(qiáng)枯草芽胞桿菌分泌外源蛋白W10A以及 MalE-PhoA融合蛋白的能力。
圖10 JecA蛋白羧基末端的“鋅結(jié)合基序”決SkcA-SecB特異性相互作用。
具體實施方式
在本申請中，所述“宿主”或“蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌”或“細(xì)菌”包括各種蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌，包括革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌。優(yōu)選的是，本發(fā)明的“宿主”或“蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌”或“細(xì)菌”主要指其野生型含有^cA蛋白但缺失kcB蛋白的細(xì)菌。更優(yōu)選地，本發(fā)明的“宿主”或“蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌”或“細(xì)菌”主要是革蘭氏陽性細(xì)菌，包括那些來自于芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus) > If lif M (Lactobacillus)、 鏈球菌屬(Str印tococcus)、梭菌屬(Clostridium)或其它屬的細(xì)菌，具體為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licbeniformis)、巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium)、短芽胞桿菌(Bacillus brevis)、角軍淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)或其他種屬的細(xì)菌。
本申請中，“外源”，是相對于內(nèi)源而言，指某組分來源于非本申請所述宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌的細(xì)菌，主要指來自不同種屬的細(xì)菌。采用本申請的方法，可改造上述細(xì)菌，使生產(chǎn)分泌蛋白尤其是外源分泌蛋白的能力和效率得到提高。可采用本申請的方法生產(chǎn)的蛋白包括但不限于天然分泌蛋白(天然含有信號肽)，即宿主菌或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌自身天然分泌的蛋白(即內(nèi)源分泌蛋白)，和該宿主菌或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌之外物種來源的天然的分泌蛋白(即外源分泌蛋白)，這些蛋白攜帶的信號肽可以是野生型，也可以是人工置換或突變野生型信號肽后所獲得的信號肽。除這些天然分泌蛋白之外，可采用本申請的方法生產(chǎn)的蛋白也可以是人工構(gòu)建的分泌蛋白，即天然的非分泌蛋白(天然無信號肽)在利用基因工程技術(shù)人工添加信號肽后獲得的“人工分泌蛋白”。非分泌蛋白既可以是宿主菌自身天然生產(chǎn)的蛋白，也可是宿主菌之外的物種生產(chǎn)的蛋白。此外，可采用本申請的方法生產(chǎn)的蛋白可以是融合蛋白。例如，所述內(nèi)源分泌蛋白、外源分泌蛋白和人工分泌蛋白可以以各種融合蛋白的形式在本發(fā)明的宿主菌或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌中表達(dá)和分泌?？赏ㄟ^構(gòu)建含有該內(nèi)源分泌蛋白、外源分泌蛋白或人工分泌蛋白與其它蛋白形成的融合蛋白的編碼序列的表達(dá)載體、然后將該載體轉(zhuǎn)入宿主菌或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌中進(jìn)行表達(dá)和分泌。在優(yōu)選的實施例中，優(yōu)選上述內(nèi)源或外源分泌蛋白、天然或人工分泌蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白形成的融合蛋白。構(gòu)建和轉(zhuǎn)化的方法都是本領(lǐng)域常規(guī)的。在優(yōu)選的實施例中，可采用本發(fā)明的方法或細(xì)菌分泌的蛋白包括各種工業(yè)用酶 (例如蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶等)和各種醫(yī)藥用蛋白(例如抗體，干擾素，生長因子等) [見文獻(xiàn)2，25，26]。這些工業(yè)用酶或醫(yī)藥用蛋白可以融合蛋白的形式(例如，與麥芽糖結(jié)合蛋白融合)由本發(fā)明的方法或細(xì)菌分泌。本發(fā)明改造細(xì)菌的方法包括但不限于構(gòu)建含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含 SecB基因的表達(dá)載體，然后用所述含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含secB基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌，從而在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合^cA蛋白和SecB蛋白。本發(fā)明中，嵌合secA基因為人工改造宿主菌secA基因而得，即所述細(xì)菌secA基因“鋅結(jié)合基序”的編碼序列被外源secA基因“鋅結(jié)合基序”的編碼序列所替換，從而具備結(jié)合所述^cB蛋白的能力。本文中，SecA蛋白“鋅結(jié)合基序”指SecA蛋白羧基(C)末端的CXCX8C(C/X)及其臨近的保守氨基酸殘基，負(fù)責(zé)介導(dǎo)與SecB蛋白的相互作用，該“鋅結(jié)合基序”一般位于kcA 蛋白羧基末端最后約40個氨基酸殘基序列中。可使用來自含SecB介導(dǎo)的靶向途徑的細(xì)菌的^cA蛋白的“鋅結(jié)合基序”替換宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌^cA蛋白的“鋅結(jié)合基序”。被替換的區(qū)域只要包括“鋅結(jié)合基序”即可，替換的區(qū)域可以只是“鋅結(jié)合基序”，也可以是更長的區(qū)域，如^cA蛋白C末端最后約60、55、50、45個氨基酸或更短。因此，在某些實施例中，用外源^cA蛋白C末端最后18 60個氨基酸(例如，最后18 40、20 35、22 35,22 32個氨基酸)替換宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌SecA蛋白C末端的相應(yīng)部分。在其它實施例中，用于替換的序列不一定從該外源^^^蛋白C末端的最后一個氨基酸起算。例如， 用于替換的序列可以是該外源^cA蛋白C末端第2 40位氨基酸、第2 35位氨基酸、 第2 32位氨基酸、第3 40位氨基酸、第3 35位氨基酸等以及這些范圍內(nèi)的任意氨基酸片段，只要所替換的序列或氨基酸片段仍然保留“鋅結(jié)合基序”的生物學(xué)功能即可。該方法構(gòu)建的嵌合Seek具備結(jié)合與其“鋅結(jié)合基序”同源的kcB蛋白的能力。例如，可使用例如圖6A所示的來自大腸桿菌、流感嗜血桿菌、A. Tumefaciens, P. fluorescens、R. etli、 A. Pleuropneumoniae等細(xì)菌kcA蛋白的“鋅結(jié)合基序”替換宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌kcA蛋白的“鋅結(jié)合基序”。在一個具體實施例中，可使用圖6A具體列出的來自大腸桿菌、流感嗜Tumefaciens、P. fluorescens、R. etli、A. Pleuropneumoniae ^Sg^W^lJ 宿主菌中kcA蛋白的“鋅結(jié)合基序”。
可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法如融合PCR進(jìn)行上述替換。例如，本申請實施例部分所述構(gòu)建攜帶外源“鋅結(jié)合基序”編碼序列的嵌合secA基因，然后再在宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌中表達(dá)該嵌合的％(^蛋白。
可采用本領(lǐng)域周知的材料(枯草芽胞桿菌表達(dá)載體)和技術(shù)(PCR和分子克隆) 構(gòu)建本發(fā)明含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含外源secB基因的表達(dá)載體。隨后采用本領(lǐng)域熟知的諸如化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將所屬表達(dá)載體引入到枯草芽胞桿菌細(xì)胞中。適用于本發(fā)明的表達(dá)載體可以是整合型表達(dá)載體和復(fù)制型表達(dá)載體，前者如pAX01，pA-spac或pDG1661等；后者如pUBllO系列衍生質(zhì)粒(pMA5或pWB980)或pBS72系列衍生質(zhì)粒(pHCMC05或pOE)等。 此外，大量可以使用的表達(dá)載體可見參考文獻(xiàn)[14]。
可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法檢測被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌是否已穩(wěn)定表達(dá)所述嵌合kcA蛋白和外源SecB蛋白。這些方法包括SDS-PAGE以及隨后的免疫印記，如實施例所述。
本文中，secB基因或其編碼蛋白與構(gòu)建嵌合secA基因所用到的“鋅結(jié)合基序”的編碼序列最好來源于但不限于同一物種或近源物種，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是所選用的SecB必須能夠與嵌合^cA在體內(nèi)進(jìn)行功能性相互作用。
在一個優(yōu)選實施方式中，較佳的是用來構(gòu)建嵌合^cA蛋白的外源“鋅結(jié)合基序” 與該外源SecB同源，即來自相同的細(xì)菌，如都來自大腸桿菌或流感嗜血桿菌。當(dāng)然，來自不同細(xì)菌的“鋅結(jié)合基序”和SecB只要能夠保證嵌合kcA與SecB能夠在體內(nèi)進(jìn)行功能性相互作用，同樣也能夠在同一宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌中起作用，提高蛋白分泌效率。
本文中，SEQ ID NO J8顯示了嵌合secA基因的核酸序列，其中第對觀 25 位為大腸桿菌secA基因的相應(yīng)部分。SEQ ID NO : 顯示了嵌合kcA的氨基酸序列。SEQ ID NO 30顯示了本發(fā)明另一嵌合secA基因的核酸序列，其中嵌合了大腸桿菌secA基因的相應(yīng)部分，SEQ ID NO 31顯示其氨基酸序列。
因此，本申請也包括一種氨基酸序列，該序列含有SEQ ID NO : 或SEQID NO 31 所示的氨基酸序列。本申請還包括一種核苷酸序列，該序列編碼本申請含SEQ ID NO : 或 SEQ ID NO :31所示的序列的氨基酸序列。本申請還包括含有本申請所述核苷酸序列的構(gòu)建物。在一優(yōu)選實施例中，所述構(gòu)建物可以是一種載體。在更優(yōu)選的實施方式中，所述構(gòu)建物可以是一種表達(dá)載體，用于在宿主或蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌中表達(dá)本申請的嵌合^^六蛋白?？刹捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段構(gòu)建含有所述核苷酸的表達(dá)載體。
本申請也包括上述氨基酸序列、核苷酸序列和構(gòu)建物的用途，例如，用于增加蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌分泌外源蛋白的效率、用于改善外源分泌蛋白的生產(chǎn)、以及用于構(gòu)建與其野生型對照相比其外源蛋白生產(chǎn)能力得到提高的蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌等。
本申請還包括一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有本文所述的嵌合secA基因和secB基因，和/ 或嵌合kcA蛋白和kcB蛋白。在一個具體實施例中，所述系統(tǒng)是一種細(xì)胞或細(xì)菌，所述嵌合secA基因中的嵌合部分(例如“鋅結(jié)合基序”的編碼序列)，與所述secB基因相對于該細(xì)胞或細(xì)菌而言都是外源的，和所述嵌合McA蛋白中的嵌合部分和McB蛋白相對于該細(xì)胞或細(xì)菌而言也都是外源的。在一個具體實施例中，所述系統(tǒng)含有SEQ ID NO 或30所述的核苷酸序列和 GenBank :M24489. 1所述大腸桿菌secB基因的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 29或31所示的氨基酸序列和GenBank :MM489. 1所編碼的氨基酸序列。在一個具體實施例中，所述系統(tǒng)為枯草芽胞桿菌。在其它實施例中，所述系統(tǒng)為地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis), 巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、短芽胞桿菌(Bacillus brevis)、解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或蘇云金芽胞桿菌 (Bacillus thuringiensis)等。以下將以具體實施例的方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)理解，這些實施例僅僅是闡述性的。此夕卜，本文中，“含有”、“包含”等術(shù)語在本文中也包括了“由……組成”、“由…… 構(gòu)成”等含義。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)操作進(jìn)行，例如參考冷泉港實驗室出版社出版的《分子克隆實驗室手冊》第三版或按照所用物品生產(chǎn)商所建議的條件。一 .材料與方法1)菌株與質(zhì)粒質(zhì)粒pSJ2，pSJ3和pSJ4(見參考文獻(xiàn)[27])，均為pET21a (Novagen)衍生質(zhì)粒，用于在大腸桿菌中重組表達(dá)SecA和SecB蛋白。質(zhì)粒pMA5，由Dartois提供[觀]，卡那霉素抗性，用于在枯草芽胞桿菌中表達(dá)外源分泌蛋白。質(zhì)粒pAXOl，由枯草桿菌菌種保藏中心(BGSC)提供，紅霉素抗性，用于在枯草芽胞桿菌中表達(dá)大腸桿菌義沙蛋白。質(zhì)粒pOE，以pMD18 (TaKaRa)為基本骨架，引入來自于pHCMC05 [29]上的枯草芽胞桿菌復(fù)制元和氯霉素抗性標(biāo)記；同時再引入PMA5上的HpaII啟動子以及大腸桿菌的trpA 終止序列組成的基因表達(dá)盒。該質(zhì)粒用于在枯草芽胞桿菌中表達(dá)^cA蛋白?？寺∷拗鞔竽c桿菌DH5 α和蛋白表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)由Novagen提供?？莶菅堪麠U菌168 (Bacillus subtilis 168)由枯草桿菌菌種保藏中心(BGSC)提 {共。2)質(zhì)粒構(gòu)建a) pSJ3-ecSecA, pSJ3_bsSecA，pSJ3-bhSecA 和 pSJ3_beSecA質(zhì)粒pSJ3-eCSeCA編碼大腸桿菌kcA蛋白，以大腸桿菌基因組為模板，引物對 Pl (SEQ ID NO 1)與 P2 (SEQ ID NO 2)擴(kuò)增 secA 基因，NdeI 與 BamHI 雙酶切后裝入 pSJ3， 得到pSJ3-ecSecA，其質(zhì)粒示意圖如圖1所示。質(zhì)粒pSJ3-bsSeCA編碼枯草芽胞桿菌SecA 蛋白，以枯草芽胞桿菌基因組為模板，引物對P3 (SEQ ID NOd)與P4(SEQ ID NO 4)擴(kuò)增 secA基因，BamHI與XhoI雙酶切后裝入pSJ3，得到pSJ3_bsSecA。質(zhì)粒pSJ3-bhSecA編碼(枯草芽胞桿菌-流感嗜血桿菌)嵌合SecA蛋白即 W^ecA，該蛋白由枯草芽胞桿菌kcA蛋白第1位至第809位氨基酸和流感嗜血桿菌SecA 蛋白第867位至第901位氨基酸融合而得。該質(zhì)粒采用大引物PCR技術(shù)構(gòu)建，過程如下以流感嗜血桿菌基因組為模板，引物對P5 (SEQ ID NO 5)與P6 (SEQ ID NO 6)擴(kuò)增流感嗜血桿菌kcA蛋白第867位至第901位氨基酸的編碼序列?；厥赵撈瑪嘧鰹榇笠?，與P3搭配，以質(zhì)粒pSJ3-bsSeCA為模板擴(kuò)增得到W^ecA蛋白的編碼序列，BamHI與HindIII雙酶切后裝入PSJ3，得到pSJ3-bhSecA。同理，質(zhì)粒pSJ3-beSeCA編碼(枯草芽胞桿菌-大腸桿菌)嵌合kcA即bekcA蛋白，該蛋白由枯草芽胞桿菌kcA蛋白第1位至第809位氨基酸和大腸桿菌^cA蛋白第870位至第901位氨基酸融合而得。以大腸桿菌基因組為模板，引物對P7(SEQ ID NO 7)與P2擴(kuò)增大腸桿菌kcA蛋白第870位至第901位氨基酸的編碼序列?；厥赵撈瑪嘧鰹榇笠?，與P3搭配，以質(zhì)粒pSJ3-bsSeCA為模板擴(kuò)增得到bekcA蛋白的編碼序列，BamHI酶切后裝入pSJ3，得到pSJ3_beSecA。
b)pSJ4-hiSecB 和 pSJ2_ecSecB
質(zhì)粒pSJ4-hiSecB的構(gòu)建見文獻(xiàn)[30]，該質(zhì)粒編碼流感嗜血桿菌kcB蛋白。質(zhì)粒 pSJ2-ecSecB編碼大腸桿菌kcB蛋白，以大腸桿菌基因組為模板，引物對P8(SEQ ID NO 8) 與P9(SEQ ID NO 9)擴(kuò)增 secB基因，BamHI 與HindIII雙切后裝入pSJ2，得到pSJ2_ecSecB。
以上a)和b)中構(gòu)建的質(zhì)粒用于在大腸桿菌中純化相應(yīng)的蛋白，這些純化的蛋白隨后用于體外結(jié)合實驗和等溫滴定實驗中。
c) pMA5-ecMalEll，pMA5_ecPhoA 禾口 pMA5_ (ecMalE-PhoA)
質(zhì)粒pMA5-eCMalEll編碼大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE)的突變體，即MalEll 蛋白，該突變體的氨基末端攜帶3個氨基酸的替換(如圖7A所示)。突變由重疊延伸PCR 技術(shù)引入，質(zhì)粒構(gòu)建過程如下以大腸桿菌基因組為模板，引物對P10(SEQ ID N0:10)與 Pll (SEQ ID NO :11)擴(kuò)增malE基因信號肽編碼區(qū)域，引物對P12 (SEQ ID NO :12)與P13 (SEQ ID N0:13)擴(kuò)增malE基因成熟肽段編碼區(qū)域。以上述兩個經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物的混合物為模板，引物對PlO與P13擴(kuò)增得到全長MalEll蛋白的編碼序列(突變分別由PlO和P12引入)，NdeI和HindIII雙酶切后裝入pMA5，得到pMA5_ecMalEll，其質(zhì)粒示意圖如圖2所示。
質(zhì)粒pMA5-eCWioA編碼大腸桿菌堿性磷酸酶(PhoA)，其構(gòu)建過程如下以大腸桿菌基因組為模板，引物對P14(SEQ ID NO 14)與P15(SEQ ID NO :15)擴(kuò)增phoA基因，NdeI 和HindIII雙酶切后裝入pMA5，得到pMA5_ecPhoA。
質(zhì)粒pMA5-(eCMalE-Ph0A)編碼大腸桿菌來源的麥芽糖結(jié)合蛋白與堿性磷酸酶的融合蛋白(MalE-PhoA)，該融合蛋白的編碼序列采用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建。質(zhì)粒構(gòu)建過程如下以大腸桿菌基因組為模板，引物對P16 (SEQ ID N0:16)與P17(SEQ ID NO :17) 擴(kuò)增不含終止密碼子的malE基因；引物對P18(SEQ ID NO :18)與P15擴(kuò)增編碼WioA成熟肽段區(qū)域的編碼序列。以上述兩個經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物的混合物為模板，引物對P16與 P15擴(kuò)增得到全長MalE-PhoA蛋白的編碼序列，NdeI和HindIII雙酶切后裝入pMA5，得到 pMA5-(ecMalE-PhoA)。
d) pAXO 1-ecSecB，ρ AX 0 1 - e c S e c B L 7 5 Q，ρ A X 0 1 - e c S e c B E 7 7 K 禾口 pAX01-ecSecBL75Q&E77K
質(zhì)粒pAXOl-ecSecB編碼大腸桿菌kcB蛋白，以大腸桿菌基因組為模板，引物對 P19(SEQ ID NO :19)與 P20 (SEQ ID NO :20)擴(kuò)增 secB 基因，BamHI 酶切后裝入 pAXOl，得到 pAXOl-ecSecB，其質(zhì)粒示意圖如圖3所示。
質(zhì)粒pAX01_ecSecBL75Q編碼大腸桿菌SecB蛋白的突變體kcBL75Q，突變由重疊延伸PCR技術(shù)引入，質(zhì)粒構(gòu)建過程如下以大腸桿菌基因組為模板，引物對P19與P21 (SEQ11ID NO 21)擴(kuò)增secB基因突變位點(diǎn)上游的片斷，引物對P22 (SEQ ID NO 22)與P20擴(kuò)增 secB基因突變位點(diǎn)下游的片斷，突變由P22引入。以上述兩個經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物的混合物為模板，引物對P19與P20擴(kuò)增得到全長kcBL75Q蛋白的編碼序列，BamHI酶切后裝入pAXO 1， 得到 pAX01-ec^ecBL75Q。以同樣的方法，P23 (SEQ ID NO :23) % P24(SEQ ID NO :24)分別用于pAX01-ec^ecBE77K和pAX01-ec^ecBL75Q&E77K的構(gòu)建，這兩個質(zhì)粒分別編碼大腸桿菌 SecB 蛋白的突變體 kcBE77K 和 kcBL75Q/E77K。e)pOE-beSecA 禾口 pOE-bsSecA。質(zhì)粒pOE-beSecA編碼(枯草芽胞桿菌-大腸桿菌)嵌合kcA即bekcA蛋白， 以質(zhì)粒pSJ3-beSecA為模板，引物對P25(SEQ ID NO :25)與P26 (SEQ ID NO :26)擴(kuò)增得到 bekcA蛋白的編碼序列，KpnI和SacII雙酶切后裝入pOE，得到pOE-beSecA，其質(zhì)粒示意圖如圖4所示。質(zhì)粒pOE-bsSecA編碼枯草芽胞桿菌kcA蛋白，以枯草芽胞桿菌基因組為模板， 引物對P25與P27 (SEQ ID NO 27)擴(kuò)增secA基因，KpnI和SacII雙酶切后裝入pOE，得到 pOE—bsSecA。3)培養(yǎng)條件如無特殊說明，均采用LB培養(yǎng)基，添加適當(dāng)?shù)目股兀?7攝氏度振蕩培養(yǎng)過夜?？股貪舛葹榘逼S青霉素100ug/ml，卡那霉素100ug/ml，氯霉素5ug/ml，紅霉素5ug/ml。4)轉(zhuǎn)化方法大腸桿菌轉(zhuǎn)化采用成熟的鈣法轉(zhuǎn)化，見《分子克隆》第三版?？莶菅堪麠U菌采用廣泛使用的無機(jī)鹽自然感受態(tài)方法進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化[31]。5) SDS-PAGE, Western Blotting等實驗參考《分子克隆》第三版。6)堿性磷酸酶酶活力測定參考文獻(xiàn)[32]。7) SecA蛋白和SecB蛋白的純化以及體外結(jié)合實驗等參考[27]二.結(jié)果與討論實施例一kcA蛋白羧基末端決定^cA-SecB特異性相互作用。在缺失secB基因的細(xì)菌中， 隨著SecA蛋白羧基末端“鋅結(jié)合基序”在進(jìn)化過程中“有害突變”的不斷積累，逐漸喪失了結(jié)合SecB蛋白的能力。將這類kcA蛋白羧基末端“鋅結(jié)合基序”替換為能夠與SecB蛋白相互作用的^cA蛋白的相應(yīng)部分，能夠使原本不能結(jié)合SecB蛋白的kcA蛋白獲得結(jié)合 SecB蛋白的能力，下面以枯草芽胞桿菌kcA為例予以說明。圖6A顯示不同生物來源的kcA蛋白“鋅結(jié)合基序”的序列比較。由此可見，在進(jìn)化過程中，雖然該基序呈現(xiàn)出高保守性，但突變也是顯著的。對于那些缺失secB基因的細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，突變可能造成其^cA蛋白喪失結(jié)合SecB蛋白的能力。圖 6B 顯示了流感嗜血桿菌 SecA (HaemophiIus influenzae SecA，簡寫為 hiSecA),大腸桿菌 SecA(Escherichia coli SecA,簡寫為 ecSecA),枯草芽胞桿菌 SecA (Bacillus subtilis SecA，簡寫為bskcA)和兩個嵌合kcA即枯草芽胞芽胞桿菌-流感嗜血桿菌嵌合簡寫為W^ecA)與枯草芽胞桿菌-大腸桿菌簡寫為beSecA) 的羧基末端氨基酸序列。箭頭所指之處表示構(gòu)建嵌合SecA時發(fā)生嵌合的位置。圖6C顯示不同的Seek與kcB體外結(jié)合情況，結(jié)果表明bdecA既不能結(jié)合流感嗜血桿菌kcB (hiSecB)，也不能結(jié)合大腸桿菌kcB (ecSecB)，見泳道1和2。這與枯草芽胞桿菌缺失secB基因的事實相一致，其^cA蛋白羧基末端“鋅結(jié)合基序”在進(jìn)化過程中“有害突變”的不斷積累，逐漸喪失了結(jié)合義沙蛋白的能力。然而，將bdecA蛋白的“鋅結(jié)合基序”替換為hikcA或edecA的相應(yīng)部分獲得的嵌合kcA即W^ecA和bekcA便獲得了至少結(jié)合與其“鋅結(jié)合基序”同源的SecB蛋白的能力，見泳道3，4和6。這一結(jié)果清楚地表明kcA蛋白羧基末端決定^cA-SecB特異性相互作用，可以通過置換kcA蛋白羧基末端 “鋅結(jié)合基序”來改變其結(jié)合SecB的特性。為了進(jìn)一步提供證據(jù)說明嵌合kcA能夠有效結(jié)合^cB蛋白，我們測定了不同的 SecA與edecB之間的解離常數(shù)。圖6D顯示，beSecA/edecB之間的解離常數(shù)與正對照 ecSecA/ecSecB之間的解離常數(shù)相當(dāng)，遠(yuǎn)低于bsSecA/edecB之間的解離常數(shù)。實施例二基于嵌合SecA能夠與外源SecB相互作用，理論上在secB基因缺失的細(xì)菌中共表達(dá)嵌合kcA蛋白和外源kcB蛋白(兩者能夠進(jìn)行相互作用)能夠重構(gòu)義沙介導(dǎo)的靶向途徑，能夠增強(qiáng)宿主分泌外源蛋白的效率。下面以在枯草芽胞桿菌中共表達(dá)bekcA和edecB 為例予以說明，選用的外源分泌蛋白是MalEll。MalEll是大腸桿菌來源MalE的突變體，該突變體的信號肽N區(qū)域只帶有1個凈正電荷(野生型為3個凈正電荷)以及緊接信號肽的成熟肽段區(qū)域也帶有1個凈正電荷(野生型凈電荷為0)，故命名為MalEll，如圖7A所示，該突變體在枯草芽胞桿菌中的分泌效率與野生型相比有所降低，故本發(fā)明中采用該突變體以突出顯示義沙介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的功能性，即增強(qiáng)宿主分泌外源蛋白的效率。將編碼bskcA或bekcA或空載體pOE，編碼edecB或空載體pAXOl和編碼 MalEll的pMA5三個質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌中，得到6株分別表達(dá)不同的SecA， ecSecB以及MalEll組合的菌株。這些株菌在添加0. 5%木糖誘導(dǎo)edecB表達(dá)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時后，取樣分析，結(jié)果如圖7B所示，單獨(dú)表達(dá)edecB，bsSecA或bekcA都無法增加宿主分泌MalEll的效率(第2，3和5組)。在共表達(dá)bdecA和edecB的情況下(第 4組)，MalEll的分泌效率有些許提高，但提高的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于共表達(dá)bekcA和edecB的情況(第6組)。在共表達(dá)bekcA和edecB的情況下，宿主分泌MalEll的效率大幅度增加，MalEll分泌量增加至少1倍以上。我們可以看到培養(yǎng)基中積累了大量的MalEll成熟蛋白，而細(xì)胞質(zhì)中僅積累少量MalEll前體蛋白。這些結(jié)果清楚地表明bekcA和edecB的共表達(dá)能夠在枯草芽胞桿菌中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，該途徑的存在能夠增加宿主分泌外源蛋白的效率。實施例三本發(fā)明提供了兩個“反面”證據(jù)，進(jìn)一步支持本發(fā)明的結(jié)論，即bekcA和edecB的共表達(dá)能夠在枯草芽胞桿菌中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，該途徑的存在能夠增加宿主分泌外源蛋白的效率。ecSecB的表達(dá)受控于木糖誘導(dǎo)的啟動子I^xyl，在本組實驗中我們通過調(diào)整誘導(dǎo)物木糖的濃度來調(diào)控edecB的表達(dá)水平，即木糖濃度依次為0. 5%，0. 1%，0. 05%和0% (圖8A從第3組到第6組)，進(jìn)而考察edecB的表達(dá)水平對MalEll分泌效率的影響。與預(yù)期一致，圖8A清楚地表明隨著edecB表達(dá)水平逐漸下降，宿主分泌MalEll的效率也逐漸遞減，呈現(xiàn)出線性關(guān)系。
更具有說服力的證據(jù)來自于edecB突變體的實驗。SecB的點(diǎn)突變L75Q和E77K 能夠破壞^cA-SecB之間特異性相互作用，但不影響SecB結(jié)合新生分泌肽鏈的活性。采用這些突變體，可以考察MalEll的高效分泌是否依賴^cA-SecB之間特異性相互作用。將編碼 ec^ecB，ecSecB L75Q,ecSecB E77K 或 eckcB L75Q&E77K 的 pAXOl 載體分別轉(zhuǎn)化到表達(dá) bekcA和MalEll的枯草芽胞桿菌中，在適當(dāng)?shù)臈l件下過夜培養(yǎng)，取樣分析，結(jié)果如圖8B所示。與野生SkcB(第3組)相比，kcB突變體(第4，5和6組)不能支持MalEll的高效分泌，說明MalEll的高效分泌依賴^cA-SecB之間特異性相互作用，這一結(jié)果與預(yù)期完全一致。
實施例四
kcB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑能夠增加宿主分泌外源蛋白的效率具有一定的通用性，下面以外源分泌蛋白即大腸桿菌來源堿性磷酸酶(PhoA)和麥芽糖結(jié)合蛋白-堿性磷酸酶融合蛋白(MalE-PhoA)為例予以說明。
類似于MalEl 1，圖9A詳細(xì)研究了不同kcA與edecB組合背景下WioA的分泌量， 培養(yǎng)基中WioA分泌量可以由WioA酶活力高低反映。在單獨(dú)表達(dá)edecB的情況下，PhoA的分泌量沒有增加O號與1號相比)。值得注意的是，無論是單獨(dú)表達(dá)bdecA，還是bekcA (3 號和5號與1號相比)，W10A分泌量均增加30%左右，這與文獻(xiàn)報道一致，即kcA單獨(dú)也能夠介導(dǎo)靶向途徑識別新生分泌肽鏈。更值得關(guān)注的是，在bekcA和edecB共表達(dá)的情況下，PhoA分泌量在增加30% (由bekcA的表達(dá)引起)的基礎(chǔ)上又進(jìn)一步增加了 WioA的分泌量，最終WioA分泌量累積增加了 60%以上。作為“反面”證據(jù)，ecSecB的L75Q突變由于破壞了 SecA-kcB之間特異性相互作用，所以bekcA和e(^eCBL75Q的共表達(dá)不能夠使 WioA分泌量累積增加達(dá)到60%以上，增加的30%源自bekcA的單獨(dú)表達(dá)(7號)。簡而言之，上述這些結(jié)果再次證明bekcA和edecB的共表達(dá)能夠在枯草芽胞桿菌中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，該途徑的存在能夠增加宿主分泌外源蛋白的效率。
免疫印跡如圖9B所示，證實bekcA和edecB的共表達(dá)增加了 WioA的分泌量。盡管其“表觀分泌效率”已經(jīng)很高，即細(xì)胞組分中未檢測到大量的WioA前體(泳道幻。發(fā)明人推測在共表達(dá)bekcA和edecB的情況下，PhoA的靶向效率大大增加，避免了部分WioA 前體在細(xì)胞質(zhì)中遭受降解，因而在SecB介導(dǎo)的靶向途徑存在的情況下，PhoA的分泌量大幅增加。
圖9C顯示bekcA和eckcB的共表達(dá)對MalE-PhoA分泌效率的影響。免疫印跡證實在bekcA和edecB共表達(dá)的情況下，MalE-PhoA的分泌效率也得到大幅度提高，培養(yǎng)基中MalE-PhoA分泌量大幅增加，相應(yīng)地其前體在細(xì)胞質(zhì)中的積累大幅減少(泳道3與4 對比1與2)。此外，培養(yǎng)基中酶活力測定證實了免疫印記的結(jié)果，即MalE-PhoA分泌量提高 70%以上。
實施例五
實施例一至實施例四中用到的嵌合bekcA蛋白的嵌合部分(最末端32個氨基酸)除了包括“鋅結(jié)合基序”(其精確邊界目前已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)還沒有報道，但已知最后22 個氨基酸含有該“鋅結(jié)合基序”，見文獻(xiàn)[33])之外，還包括其上游若干個氨基酸。理論上嵌合部分(長度可以小于22個氨基酸或大于32個氨基酸)只要包括介導(dǎo)與kcB相互作用的“鋅結(jié)合基序”，嵌合^cA就至少能夠結(jié)合與其“鋅結(jié)合基序”同源的kcB蛋白的能力， 該嵌合^cA與該SecB的共表達(dá)能夠在secB缺失的細(xì)菌中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，增強(qiáng)宿主分泌外源蛋白的效率，下面以bsSecA-R3為例予以說明。圖IOA顯示bskcA-R3與bekcA相比，僅把bskcA蛋白羧基末端最后22個氨基酸替換為edecA的相應(yīng)部分。替換所得序列如SEQ ID NO :31所示。在共表達(dá)bskCA-R3與edecB的情況下，MalEll的分泌效率要明顯高于共表達(dá) bsSecA與edecB的情況(第4組相對于第1組)，這說明bsSecA_R3與edecB能夠在宿主中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑從而增強(qiáng)宿主分泌外源蛋白的效率。三·總結(jié)本發(fā)明涉及到義沙介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的構(gòu)建及其應(yīng)用?？紤]到1)枯草芽胞桿菌在工業(yè)上廣泛用于生產(chǎn)(內(nèi)源)分泌蛋白；2)由于信號肽特性在不同生物類群間呈現(xiàn)出顯著差異，外源分泌蛋白(如來源于革蘭氏陰性細(xì)菌和真核生物的分泌蛋白)的信號肽在枯草芽胞桿菌中效率低下JWecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑能夠有效協(xié)助kcA識別信號肽效率低下的新生分泌肽鏈；4)枯草芽胞桿菌缺失義沙蛋白，故本發(fā)明試圖在枯草芽胞桿菌中重構(gòu)SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，以期增加該菌分泌外源分泌蛋白的效率，進(jìn)一步拓展該菌在工業(yè)上生產(chǎn)分泌蛋白中的應(yīng)用。由于枯草芽胞桿菌^^六蛋白(bsSecA， UniProtKB :P28366)不能夠與大腸桿菌 kcB 蛋白(ecSecB，UniProtKB :P0AG86)進(jìn)行有效相互作用，基于^cA-SecB相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，本發(fā)明構(gòu)建了 bekcA，即bdecA蛋白羧基末端最后32個氨基酸殘基被置換為edecA蛋白的相應(yīng)部分，該部分包含介導(dǎo)kcA-SecB 相互作用的“鋅結(jié)合基序”，從而獲得有效結(jié)合edecB的能力。免疫印跡和/或酶活測定表明，在枯草芽胞桿菌中共表達(dá)bekcA和edecB蛋白，能夠重構(gòu)原本不存在的kcB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，該途徑的存在能夠有效增加枯草芽胞桿菌分泌外源蛋白即芽糖結(jié)合蛋白突變體(MalEll)，堿性磷酸酶(PhoA)和麥芽糖結(jié)合蛋白與堿性磷酸酶的融合蛋白 (MalE-PhoA)的效率，培養(yǎng)基中這些蛋白的分泌量分別增加100%，60%和70%以上。此外，平行設(shè)置的對照實驗進(jìn)一步驗證了 ^cB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的功能性。這些結(jié)果清楚表明，基于嵌合SecA,即bekcA蛋白，我們在枯草芽胞桿菌中成功重構(gòu)了 SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，該途徑能夠增加宿主分泌外源蛋白的效率。另外，本發(fā)明提供的技術(shù)方法也可以用于其它缺失義沙介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的細(xì)菌，如芽胞桿菌屬細(xì)菌地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis),巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium),短芽胞桿菌 (Bacillus brevis)和蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)等等，這些細(xì)菌在工業(yè)生產(chǎn)蛋白領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用[25]。此外，細(xì)胞質(zhì)蛋白在人工添加信號肽后(即人工分泌蛋白)也可以被細(xì)菌分泌系統(tǒng)識別，進(jìn)而將其分泌到培養(yǎng)基中[26，34]。由于構(gòu)建的人工分泌蛋白往往沒有經(jīng)過信號肽優(yōu)化，因而此類蛋白在枯草芽胞桿菌中信號肽效率往往也較低。 理論上，本發(fā)明涉及到的SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑也能夠增加宿主分泌人工分泌蛋白的效率。因此，本發(fā)明顯示出廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1. Nijland, R. and 0. P. Kuipers, Optimization of protein secretion by Bacillus subtil is. Recent Pat Biotechnol,2008. 2(2) :p.79-87.2. Westers, L. , H. Westers, and W. J. Quax, Bacillus subtilis as cell factoryfor pharmaceutical proteins :a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim Biophys Acta，2004. 1694(1—3) :p. 299—310.
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權(quán)利要求
1.一種在細(xì)菌中構(gòu)建^cB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的方法，其特征在于，該方法包括在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合^cA蛋白和kcB蛋白，從而在該宿主中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑；其中，所述嵌合^cA蛋白的“鋅結(jié)合基序”與該蛋白的其它部分的序列異源，且所述嵌合SecA蛋白能結(jié)合所述SecB蛋白。
2.一種增加細(xì)菌分泌蛋白效率的方法，其特征在于，該方法包括在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合^cA蛋白和kcB蛋白，從而在該宿主中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，由此增加該細(xì)菌分泌蛋白的效率；其中，所述嵌合^cA蛋白的“鋅結(jié)合基序”與該蛋白的其它部分的序列異源，且所述嵌合SecA蛋白能結(jié)合所述SecB蛋白。
3.一種提高細(xì)菌蛋白質(zhì)分泌能力的方法，其特征在于，該方法包括在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合^cA蛋白和kcB蛋白，從而在該宿主中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑，由此提高該細(xì)菌的蛋白質(zhì)分泌能力；其中，所述嵌合^cA蛋白的“鋅結(jié)合基序”與該蛋白的其它部分的序列異源，且所述嵌合SecA蛋白能結(jié)合所述SecB蛋白。
4.如權(quán)利要求2 3中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白選自天然分泌蛋白或人工分泌蛋白，其中天然分泌蛋白優(yōu)選為外源的天然分泌蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述外源的天然分泌蛋白選自水解酶或醫(yī)藥用蛋白，優(yōu)選為蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、抗體、干擾素、生長因子。
6.如權(quán)利要求4 5中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白為融合蛋白，優(yōu)選為與麥芽糖結(jié)合蛋白融合而形成的融合蛋白。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌為天然缺失secB基因的細(xì)菌，且所述細(xì)菌天然存在secA基因。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌為選自芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)或梭菌屬(Clostridium)的細(xì)菌。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium)、短芽胞桿菌(Bacillus brevis)、角軍淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)0
10.如權(quán)利要求1 9中任一項所述的方法，其特征在于，所述在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合 SecA蛋白和SecB蛋白包括構(gòu)建含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含secB基因的表達(dá)載體，其中，所述嵌合secA基因為人工改造所述細(xì)菌secA基因而得，即所述細(xì)菌secA基因“鋅結(jié)合基序”的編碼序列被外源secA基因“鋅結(jié)合基序”的編碼序列所替換，從而具備結(jié)合所述SecB蛋白的能力；用所述含嵌合secA基因的表達(dá)載體和含secB基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌，從而在該細(xì)菌中共表達(dá)嵌合SecA蛋白和SecB蛋白。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述secB基因來自于與所述細(xì)菌不同種屬的細(xì)菌。
12.如權(quán)利要求10 11中任一項所述的方法，其特征在于，所述secB基因與所述secA 基因的“鋅結(jié)合基序”的編碼序列來源于相同種屬的細(xì)菌。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項所述的方法，其特征在于，所述的外源secA基因的 “鋅結(jié)合基序”為外源SecA蛋白羧基末端最后18 60個氨基酸。
14.如權(quán)利要求10 13中任一項所述的方法，其特征在于，所述外源secA基因為大腸桿菌seek基因或流感嗜血桿菌seek基因。
15.如權(quán)利要求10 14中任一項所述的方法，其特征在于，所述外源secB基因為大腸桿菌secB基因或流感嗜血桿菌secB基因。
16.一種氨基酸序列，其特征在于，該氨基酸序列含有SEQ ID NO : 或SEQ ID NO 31 所述的氨基酸序列。
17.一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列編碼權(quán)利要求16所述的氨基酸序列。
18.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物含有權(quán)利要求17所述的核苷酸序列。
19.一種系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)含有(a)嵌合secA基因或含該嵌合secA基因的構(gòu)建物，或所述嵌合secA基因所編碼的嵌合％(^蛋白，其中，所述嵌合secA基因的“鋅結(jié)合基序”的編碼序列與該嵌合secA基因的其它部分異源，嵌合^cA蛋白具備結(jié)合所述SecB蛋白的能力；和(b)secB基因或含該嵌合secB基因的構(gòu)建物，或所述secB基因所編碼的SecB蛋白，具備被所述嵌合Seek蛋白結(jié)合的特性。
全文摘要
本發(fā)明涉及SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的功能構(gòu)建及其應(yīng)用。具體而言，本申請涉及構(gòu)建嵌合SecA蛋白、在細(xì)菌中共表達(dá)該嵌合SecA蛋白和SecB蛋白而增加secB基因缺失細(xì)菌分泌蛋白效率的方法、在secB基因缺失細(xì)菌中構(gòu)建SecB介導(dǎo)的翻譯后靶向途徑的方法以及提高secB基因缺失細(xì)菌蛋白質(zhì)分泌能力的方法。此外，本申請還涉及相關(guān)的氨基酸序列和核苷酸序列，表達(dá)載體，以及含有所述氨基酸序列、核苷酸序列和/或表達(dá)載體的系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/31GK102533627SQ20111045820
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者刁劉洋, 周佳海, 楊晟, 羅蘭·佛洛德爾 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院