專利名稱：膠體金標記Hly基因單克隆抗體測定單核細胞增生性李斯特菌試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于衛(wèi)生學(xué)檢驗及醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
李斯特菌屬L isteria分為2個群，7個種。第1群包括單核細胞增生性李斯特菌L. monocytogenes (簡稱單增李斯特菌)、伊氏李斯特菌L. ivanovii、無害李斯特菌 L. irmocua、韋氏李斯特菌L.welshm ei及塞氏李斯特菌L. seeligeri ；第2群為較少見的格氏李斯特菌L. grayi和莫氏李斯特菌L.m urrayi.其中單增李斯特菌被認為是引起動物和人類李斯特菌病的主要致病菌.單增李斯特菌(Usteria monocytogenes, Lm)是一種短小的革蘭陽性無芽胞桿菌，是一種人畜共患病的致病菌，可使人和動物患李斯特菌病。研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3種類型.單增李斯特菌能使人畜致病，造成豬、雞等多種畜禽死亡。人感染后則主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和單核細胞增多。嬰幼兒、懷孕婦女和免疫耐受病人的感染死亡率可高達20% 30%。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，人們食用的肉、奶、蛋、水產(chǎn)品、蔬菜以及冷凍食品等均有不同程度的污染，世界衛(wèi)生組織(WHO)在關(guān)于單增李斯特菌食物中毒的報告中指出4% 8%的水產(chǎn)品、5% 10%的奶及奶制品、15%以上的家禽、30%以上的肉制品及冷凍制品，均被該菌污染.食品中存在的單增李斯特菌對人類的食品安全存在較大威脅，是冷凍食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。在美國李斯特菌被列為7種主要的食源性致死病菌之一，已經(jīng)被WHO食品安全工作計劃列為重點檢測的食源性病菌之一。單增李斯特菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，可在巨噬細胞和許多非吞噬細胞(如內(nèi)皮細胞、上皮細胞和肝細胞)內(nèi)增殖。單增李斯特菌的致病性涉及多個毒力因子，如溶血素 (Listeriolysin 0，簡稱LL0)、內(nèi)化素、p60蛋白等。LLO是該菌侵染力的重要組成成分，是 LM的主要毒力因子。LLO是一種能結(jié)合膽固醇、可被巰基活化的細胞溶解素，由hly基因編碼的5 個氨基酸組成，其中有25個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列。LLO能溶解宿主細胞吞噬泡膜，逃離噬菌體，進入胞漿，逃避吞噬體中殺菌物質(zhì)的殺滅；此外還能在感染細胞內(nèi)誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)和定向免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。由于LLO所具有的獨特生物學(xué)特性，已被用于構(gòu)建各種減毒疫苗或核酸疫苗，且促進MHC-I類分子限制性免疫應(yīng)答，增強了保護性抗原的免疫作用。單增李斯特菌為需氧或兼性厭氧菌，生長溫度為1 45°C，對不利環(huán)境具有比較強的耐受能力，在4°C冰箱中也可生長繁殖，在pH5. 0 9. 0的環(huán)境中，1年后仍可檢出。這使其危害性更進一步增大。另外，單增李斯特菌病原體是定居在細胞內(nèi)的，因此應(yīng)用抗生素治療李斯特菌病的效果不太理想。由李斯特菌弓I起的疾病及其食源性感染日益弓I起世界各國的重視，對該病原進行快速、靈敏、準確的檢測是有效防治本病和保證食品衛(wèi)生安全的重要手段。本研究旨在克隆和表達單增李斯特菌的hly基因，研制基于溶血素的診斷用單克隆抗體，以對單增李斯特菌進行檢驗分析及制備基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。國內(nèi)的趙松波等人已經(jīng)原核表達出溶血素(LLO)，也建立了 LLO的間接ELISA檢測方法，但是該方法在檢測動物血清時容易出現(xiàn)假陰性。趙松波提出利用LLO單抗建立夾心ELISA可提高檢測靈敏度， 但相關(guān)工作未見報道。董慧和羅正等人已經(jīng)制備了 LLO單抗，但均未用于實際樣品檢測。早在1991年就有國外的學(xué)者用LM培養(yǎng)上清中純化的蛋白免疫小鼠制備單抗，獲得3株能抑制LLO溶血的單抗、1株能抑制LLO與紅細胞膜結(jié)合的單抗以及2株能抑制與其他細胞膜結(jié)合的單抗。1999年Erdenlig等人同樣得到了具有抑制LLO溶血作用的單克隆抗體，并用于鑒定所分離的李斯特菌是否為致病菌株。經(jīng)典的李斯特菌分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)需要1-2周時間，人力、物力花費大，不適應(yīng)實際檢驗工作的需要。目前，對產(chǎn)單核李斯特菌快速檢測方法的研究，絕大部分尚停留在實驗室的研究階段，很大程度局限于ELISA法和PCR法，而免疫膠體金層析為李斯特菌的檢測具有快速、便捷的優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)院、商檢、衛(wèi)生、安檢，也可用于家庭進行簡易的檢測。其良好的特異性，較高的靈敏度，可靠的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，為產(chǎn)單核李斯特菌檢測提供了一個更為理想的檢測方法和思路。羅利新等所用抗體為產(chǎn)單核李斯特菌抗體(0鏈抗原 I / II )，實驗只針對單一血清型李斯特菌進行了研究，而產(chǎn)單核李斯特菌根據(jù)菌體(0)抗原和鞭毛(H)抗原分成13個血清型，所以實驗針對李斯特全菌屬不夠完備。綜合以上的國內(nèi)外研究資料可發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌的檢測方法仍不夠完備，現(xiàn)有的檢測技術(shù)方法仍存在如下兩個方面的不足1標本仍需48h的增菌培養(yǎng)。2本方法仍只可對單增李斯特菌感染的標本進行陰性篩查，陽性標本的確定試驗仍為細菌培養(yǎng)及生化反應(yīng)的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種膠體金標記Hly基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒，它將標記Hly基因單克隆抗體的免疫膠體金層析法用于快速檢測單增李斯特菌，使用方便、操作簡單、結(jié)果可靠。本發(fā)明的技術(shù)方案是1引物設(shè)計L. monocytogenes Hly 蛋白基因序列AAATGT CGACGG AGAGTG AAACCC ATGAAA AAAATA ATGCTA GTTATT ACACTT ΑΤΑ 60 TTAGTT AGTCTA CCAATT GCGCAA CAAACT GAAGCA AAGGAT GCATCT GCATTC AATAAA 120 GAAAAT TTAATT TCATCC ATGGCA CCACCA GCATCT CCGGCT GCAAGT CCTAAG ACGCCA 180 ATGGAA AAGMA CACGCG GATGAA ATCGAT AAGTAT ATACAA GGATTC GATTAC AATAAA 240 AACAAT GTATTA GTATAG CACCGA GATGCA GTGACA AATGTG CCGCCA AGAAAA GGTTAT 300 AAAGAT GGAMT GAATAT ATCGTT GTGGAG AAAAAG AAGMA TCGATG MTCAA AATAAT 360 GCAGAT ATCCAA GTTGTG AATGCA ATTTCG AGCCTA AGATAT CCAGGT GCTCTC GTGAAA 420 GCGAAT TCGGAA TTAGTA GAAAAT CAACCC GATGTT GTTCTT GTCAAA CGTGAT TCATTA 480 ACACTT AGCATT GATTTG CCAGGA ATGACT AATCAA GACMT AAAATT GTTGTA AMAAT 540 GCTACT AAATCG AACGTT AACAAC GCAGTA AATACA TTAGTG GAAAGA TGGAAT GMAAA 600 TATGCT CAAGCT TATCCA AATGTA AGTGCA AAAATT GATTAT GATGAC GAAATG GCTTAC 660 AGTGAA TCACAA TTAATT GCAAAA TTTGGT ACGGCA TTTMA GCTGTA MTAAT AGCTTG 720 AATGTA AACTTC GGCGCA ATCAGT GAAGGG AAAATG CAAGAA GAAGTC ATTAGT TTTAAA 780 CAAATT TACTAT AACGTG AATGTT AATGAA CCTACA AGACCT TCCAGA TTTTTC GGCAAA 840 GCTGTT ACTMA GAGCAG TTGCAA GCGCTT GCAGTG AATGCA GAAAAT CCTCCT GCATAT 900 ATCTCA AGTGTG GCATAT GGCCGT CAAGTT TATTTG AAATTA TCAACT MTTCC CATAGT 960 ACGAAA GTAMA GCTGCT TTTGAG GCTGCG GTAAGT GGGMA TCTGTC TCAGGT GATGTA 1020 CAACTG ACAMT ATCATC AAAAAT TCTTCC TTCAAA GCGGTA ATTTAC GGTGGC TCCCCA 1080 AAAGAT GAAGTT CAAATC ATCGAC GGTAAC CTCGGA GACTTA CGAGAT ATTTTG AMAAA 1140 GGTGCT ACTTTT AAGCGG GAAACA CCAGCA GTTCCG ATTGCC TATACA ACAAAC TTCTTA 1200 AAAGAC AATGAA TTAGCT GTTATT AAAAAC AACTCA GAATAT ATTGAA ACAACT TCAAAA 1260 GCTTAT ACAGAT CGAAM ATCAAC ATCGAT CACTCT GGAGGA TACGTT GCTCAA TTCAAC 1320 ATCTCT TGGCAT GAAATA AATTAT GATCCT GAACGT AACGAA ATTGTT CAACAT AMAAC 1380 TCGAGC GAAMC AATAM AGTAAG CTAGCT CATTTC ACATCG TCCATC TATTTG CCACGT 1440 AACGCA AGAMT ATTAAT GTTTAC GCTAAA GAATGC ACTGGT TTAGCT TGGGAA TGGTGG 1500 AGAACG GTAATT GATGAC CGGAAC CTACCG CTTGTG AAAMT AGAAAT ATCTCC ATCTGG 1560 GGCACT ACACTT TATCCG AAATAT AGTAAT AGTGTA GATMT GCAATC GAATAA TTTTAA 1620 AAATTA ATAMA AAATCT AGAATA AA1646根據(jù) GenBank 中的 L. monocytogenes Hly 蛋白基因序列，應(yīng)用 Primer Premier5. 0,DNA Club和Oligo 6. 0設(shè)計特異性引物Pl和P2，預(yù)期擴增長度為1434bp。在 NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因序列中是否存在；用I^rimer primer5把序列反向互補；在應(yīng)用Oligo 6. 0引物設(shè)計時，上下游引物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基(包括酶切位點+ 保護堿基)的負數(shù)值+1下游引物位點的確定為下游引物-酶切位點-保護性堿基=A，序列全長-A+1 =下游引物位點。上游引物5 一 ‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG — 3‘；下游引物5 一 ‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT — 3‘。為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入BamH I和)(h0 I酶切位點2PCR 擴增參照TaKafci公司的TaqTM PCR試劑盒。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，擴增32個循環(huán)。預(yù)期片段大小1 600bp左右。
3瓊脂糖凝膠電泳的反應(yīng)條件用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，電壓100V，電泳30min。4切下目的DNA片段，用凝膠快速純化回收試劑盒回收。將回收純化的PCR產(chǎn)物與 PMD18-T進行連接，并pMD18-T載體16°C 12小時以上連接。制備感受態(tài)細胞應(yīng)用CaCl2致敏法制備大腸桿菌感受態(tài)，接種JM109菌種，37°C，225rpml2小時振搖培養(yǎng)后，菌液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37°C孵箱過夜培養(yǎng)，篩選單克隆。選一單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)基中，12 小時以上培養(yǎng)，培養(yǎng)物按1/100接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A6tltl達0. 45-0. 55，用CaCl2致敏大腸桿菌。具體如下將菌液冰浴IOmin后，4°C，4000rpm離心20min，收集菌體，再加入冰冷的0. IM CaCl2致敏液，懸浮菌體，冰浴lOmin，重新收集菌體后，加冰冷的0. IM CaCl2, 重懸菌體，加甘油至終濃度為15%，100 μ L/管分裝，-70°C保存，用于轉(zhuǎn)化。5應(yīng)用熱休克轉(zhuǎn)化法，將連接反應(yīng)液加入100 μ L感受狀態(tài)的細胞中，再加3 μ 1 DMSO以增加轉(zhuǎn)化效率，冰浴30min后，42°C休克45s，然后迅速冰浴5min，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇30min后，離心收集菌體，將其鋪于含篩選抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C恒溫孵箱放置IMi后觀察轉(zhuǎn)化效果。6SDS裂解法純化試劑盒制備質(zhì)粒。用BamH I和)(h0 I進行酶切鑒定及PCR鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒，命名為pGEX-6P-l-Hly。用BamH I和Bio I進行亞克隆，表達載體pGEX-6P-l和重組克隆載體pGEX-6P-l-Hly用BamH I和Xho I切處理，瓊脂糖凝膠電泳，線性表達載體用DNA快速純化回收試劑盒回收，亞克隆片段用擠膠法回收，亞克隆載體與片段用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，提取質(zhì)粒，鑒定陽性克隆。7蛋白的誘導(dǎo)表達用pGEX-6P-l重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21受體菌，選擇單克隆接種到5mL LB培養(yǎng)液里，按傳統(tǒng)方式誘導(dǎo)表達，即37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)至A600達0. 6-0. 8，加IPTG至lmmol/L，對照組不加IPTGdh后收集細菌。同時接種誘導(dǎo)菌種，提取質(zhì)粒，BamH I和Bio I酶切驗證確含目的片段后，進行測序，測序正確后進行重組蛋白的后續(xù)實驗。8SDS-PAGE 電泳將誘導(dǎo)后菌液30mL IlOOOrpm離心^iiin，棄上清，收集菌體，向菌體沉淀中加入 2 X SDS凝膠加樣緩沖液1000 μ 1，煮沸5min后進行SDS-PAGE電泳，操作過程如下12%的分離膠 15mL 水4. 9mL、30%丙烯酰胺6. OmLU. 5mol/L Tris-HCl其pH 8. 8 的3. 8mLU0% SDS 150mL、10%過硫酸銨150mL、TEMED 6mL，迅速灌注于兩層玻璃板的間隙，在膠上小心覆蓋一層蒸餾水，凝膠垂直置于室溫，聚合完全后，倒出覆蓋的水，用濾紙將水吸凈。制備8mL積層膠水5. 5mL、30%丙烯酰胺1. 3mL、l. Omo 1/L Tris-HCl其pH 6. 8 的1.0mL、10% SDS 80mL、10%過硫酸銨80mL、TEMED 8mL，直接注于分離膠上層，立即在積層膠中插入干凈的Teflon梳子，小心避免形成氣泡。積層膠聚合完全后，小心移出Teflon 梳子，將凝膠固定于電泳裝置上，加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris, 250mmol/ L甘氨酸，0. 1% SDS，上電泳樣品及蛋白質(zhì)Marker，電壓200v電泳45min，電泳結(jié)束后凝膠加入考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后，將凝膠浸泡于水中，拍照記錄。9從SDS-PAGE電泳凝膠中切下所需條帶，大約用兩天時間將其凍干，并碾成粉末。 用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定，制作蛋白標準曲線。595nm處比色。將抗原溶于生理鹽水中，配制濃度為Iyg/μ 1。免疫BALB/c小鼠。4_6周，加強免疫。
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小鼠腹水的誘導(dǎo)取10周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，每只0. 5ml，7_10天后，收集雜交瘤細胞，離心，去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度為3X IO7個/ml，每只小鼠注射lml。設(shè)陰性對照、鹽水對照。約10天后，小鼠腹部增大，開始收集腹水。用12號針頭扎入腹部，擠壓，使腹水流出，收集至離心管，并使勁晃動離心管防止腹水凝結(jié)。1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，吸取上清，注意去掉上面一層脂肪。分裝，-20°C凍存。10膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法并稍作改進制備膠體金。膠體金制備取氯金酸溶液2. 5ml加入到250ml容量瓶中，加雙蒸水至標定刻度線，使氯金酸溶液的濃
度為1%。，沸水浴lOmin，加入檸檬酸三鈉溶液6. 65ml?？焖贁嚢柚敝令伾珡氐鬃?yōu)樽霞t色，繼續(xù)沸水lOmin，取出。涼至室溫后，用雙蒸水恢復(fù)至原體積。置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。測定膠體金在515nm波長具有最大吸收峰，確定膠體金直徑大小為lOnm。膠體金探針制備取新鮮制備的膠體金溶液50ml，加入0. 2mol/L K2C03，調(diào)pH至 8. 2，置磁力攪拌器上調(diào)適量轉(zhuǎn)速，然后加入適量的已純化好的抗體。使抗體濃度恰好在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的最小量上。緩慢攪拌lOmin，加入牛血清白蛋白 BSA,使BSA的終濃度為1 %，繼續(xù)攪拌lOmin。將上述膠體金一抗體一 BSA液進行4000r/ min離心20min，收集上清。將收集的上清進行4°C、lOOOOr/min離心60min。棄上清，沉淀用含 1% BSA 的 0. Olmol/L。ρΗ7· 4PBS 懸浮。同上 4°C, 10000r/min 離心 60min 兩次，最后將沉淀用5ml PBS-T溶解。并加入少量的Na3N, 4°C冰箱保存?zhèn)溆?。層析試紙條組裝試紙條由吸水纖維、硝酸纖維膜、玻璃纖維和PVC板組成。硝酸纖維膜處理中段相隔5mm分別用羊抗鼠IgG對照線和單核李斯特菌抗體檢測線劃線，形成兩條寬約Imm的線段，干燥后用含BSA的PBS封閉過夜，37°C干燥。試紙條組裝取潔凈PVC板，將處理好的硝酸纖維膜粘在PVC板中部合適位置；將 2cm吸水纖維粘在PVC板上端并部分壓在硝酸纖維膜上，0. 8cm玻璃纖維粘在PVC板下端并部分壓在硝酸纖維膜上，切成寬5mm的條帶，即為層析試紙條；干燥劑密封冷凍保存。本發(fā)明的有益效果是1根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的L. monocytogenes Hly蛋白基因序列，應(yīng)用Primer Premier5. 0, DNA Club和Oligo 6.0自行設(shè)計出引物。2 LLO是該菌侵染力的重要組成成分，是LM的主要毒力因子，由Hly基因編碼，對單核細胞增多性李氏桿菌Hly基因進行克隆和原核表達，改進了過去針對單一菌屬單一抗原測定的局限性。3表達產(chǎn)物可溶性重組蛋白免疫動物BALB/c小鼠，制備雜交瘤細胞株，制備腹水抗體?？贵w純、效價高，同過去的方法比較，提高了敏感度和準確度。4膠體金標記單增李斯特菌抗體制備免疫層析檢測試劑板，對單增李斯特菌進行檢測，同ELISA法和PCR法比較，免疫膠體金層析對李斯特菌的檢測具有快速、便捷的優(yōu)點。


圖IHly基因PCR產(chǎn)物電泳圖M:DNA markerDL2000圖 2pGEX-6P_I-Hly 重組蛋白 SDS-PAGE 電泳M 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1 :pGEX-6P-I-Hly 重組質(zhì)粒在 BL21 (DE3)pLysS 中經(jīng) IPTG 誘導(dǎo) 6h
圖3重組蛋白的Wfesternblotting免疫蛋白印跡分析M 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1 重組蛋白的Wfesternblotting免疫蛋白印跡分析表達的相對分子量大約72ku。圖4膠體金方法檢測單增李斯特菌陰、陽性結(jié)果照片。1膠體金方法檢測單增李斯特菌陰性結(jié)果2膠體金方法檢測單增李斯特菌陽性結(jié)果C:陽性對照線T:檢測線
具體實施例方式實施例1 工藝條件第一步驟對單核細胞增多性李氏桿菌基因進行克隆和原核表達。主要器材藥品與試劑菌種及質(zhì)粒單增李斯特菌菌種(C54002株)、pMD18-T、pGEX_6P載體質(zhì)粒為TAKARA公司產(chǎn)品。感受態(tài)細胞大腸桿菌JM109、BL21受體菌為Promega公司產(chǎn)品。 酶及相關(guān)試劑Ex Taq聚合酶，限制性內(nèi)切酶BamH I ,Xho I及IPTG為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。T4 DNA Iigase為!Iomega公司產(chǎn)品。DNA快速純化回收試劑盒、凝膠快速純化回收試劑盒為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。實驗方法一.基因組DNA的制備按常規(guī)方法培養(yǎng)單核細胞增多性李氏桿菌，DNA快速純化回收試劑盒二.含L. monocytogenes Hly蛋白基因克隆載體的構(gòu)建2. 1引物設(shè)計根據(jù)GenBank中已發(fā)表的L. monocytogenes Hly蛋白基因序列，應(yīng)用Primer Premier5. O, DNAClub和Oligo 6. O設(shè)計特異性引物Pl和P2，預(yù)期擴增長度為1434bp0上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司制備。NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因序列中是否存在；用I^imer primer5把序列反向互補；在應(yīng)用Oligo 6. O引物設(shè)計時，上下游引物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基(包括酶切位點+保護堿基)的負數(shù)值+1下游引物位點的確定為下游引物-酶切位點-保護性堿基=A，序列全長-A+1 =下游引物位點。引物設(shè)計時候要考慮到序列的起始堿基和末尾堿基中是否包含起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，如果有，要考慮是否需要刪除或者保留。引物長度的選擇要考慮到CG比例，酶切位點的選擇要兼顧廉價，常用，而且要兼顧其加入后引物的GC比例變化；還要考慮到酶切位點的序列是否在PCR的全序列中出現(xiàn)，如果出現(xiàn)要選擇其它酶切位點。前面適當(dāng)加堿基調(diào)節(jié)GC比例，5’端照抄；3’端反向互補；保護性堿基和酶切位點加在引物前面。自身互補，二聚體(兩個引物之間)<6，負數(shù)值越大能量越大，退火溫度越高，錯配幾率越小。上游引物5 一 ‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG 一 3，；
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下游引物5 一 ‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT — 3，。為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入BamH I和)(h0 I酶切位點2. 2PCR 擴增參照TaKafci公司的TaqTM PCR試劑盒。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，擴增32個循環(huán)。預(yù)期片段大小1 600bp左右。2. 3瓊脂糖凝膠電泳用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，電壓100V，電泳30min。2. 4PCR 產(chǎn)物回收切下目的DNA片段，用凝膠快速純化回收試劑盒回收。2.5PCR產(chǎn)物的克隆將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進行連接，并pMD18_T載體16°C過夜連接。2. 6制備感受態(tài)細胞應(yīng)用CaCl2致敏法制備大腸桿菌感受態(tài)，接種JM109菌種，37°C，225rpm過夜振搖培養(yǎng)后，菌液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37°C孵箱過夜培養(yǎng)，篩選單克隆。選一單菌落接種于 5mLLB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物按1/100接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A6tltl達0. 45-0. 55， 用CaCl2致敏大腸桿菌。具體如下將菌液冰浴IOmin后，4°C，4000rpm離心20min，收集菌體，再加入冰冷的0. IM CaCl2致敏液，懸浮菌體，冰浴lOmin，重新收集菌體后，加冰冷的 0. IM CaCl2，重懸菌體，加甘油至終濃度為15%，IOOyL/管分裝，-70°C保存，用于轉(zhuǎn)化。2. 7 轉(zhuǎn)化應(yīng)用熱休克轉(zhuǎn)化法，將連接反應(yīng)液加入IOOyL感受狀態(tài)的細胞中，再加3μ 1 DMSO以增加轉(zhuǎn)化效率，冰浴30min后，42°C休克45s，然后迅速冰浴5min，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇30min后，離心收集菌體，將其鋪于含篩選抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C恒溫孵箱放置12 1 后觀察轉(zhuǎn)化效果。2. 8質(zhì)粒DNA SDS裂解法純化試劑盒制備質(zhì)粒。2. 9 鑒定用BamH I和Bio I進行酶切鑒定及PCR鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒，命名為 pMD18-T-Hly。2. 10pMD18-T-Hly 的序列測定將陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-Hly送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，并進行同源性比較。 三.原核表達載體pGEX-6P_Hly的構(gòu)建與重組蛋白的表達和檢測3. 1 亞克隆用BamH I和Xho I進行亞克隆，表達載體pGEX_6P和重組克隆載體pGEX-6P_Hly 用BamH I和)(h0 I切處理，瓊脂糖凝膠電泳，線性表達載體用DNA快速純化回收試劑盒回收，亞克隆片段用擠膠法回收，亞克隆載體與片段用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 JM109感受態(tài)，提取質(zhì)粒，鑒定陽性克隆。3. 2蛋白的誘導(dǎo)表達用pGEX-6P_Hly重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21受體菌，選擇單克隆接種到5mL LB培養(yǎng)液里，
11按傳統(tǒng)方式誘導(dǎo)表達，即37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)至A600達0. 6-0. 8，加IPTG至lmmol/L，對照組不加IPTGdh后收集細菌。同時接種誘導(dǎo)菌種，提取質(zhì)粒，BamH I和Bio I酶切驗證確含目的片段后，上海生工測序，測序正確后進行重組蛋白的后續(xù)實驗。3. 3重組蛋白的鑒定3. 3. 1SDS-PAGE 電泳將誘導(dǎo)后菌液2mL IlOOOrpm離心aiiin，棄上清，收集菌體，向菌體沉淀中加入 2 X SDS凝膠加樣緩沖液200 μ 1，煮沸5min后進行SDS-PAGE電泳，操作過程如下12 % 的分離膠 15mL 水 4. 9mL、30 % 丙烯酰胺 6. OmL, 1. 5mol/L Tris-HCl (pH 8. 8)3. 8mLU0% SDS 150mL、10 %過硫酸銨150mL、TEMED 6mL，迅速灌注于兩層玻璃板的間隙，在膠上小心覆蓋一層蒸餾水，凝膠垂直置于室溫，聚合完全后，倒出覆蓋的水，用濾紙將水吸凈。制備8mL積層膠水5. 5mL、30%丙烯酰胺1. 3mLU. Omol/L Tris-HCl (pH 6. 8)1. OmLUO % SDS 80mL、10 %過硫酸銨80mL、TEMED 8mL，直接注于分離膠上層，立即在積層膠中插入干凈的Teflon梳子，小心避免形成氣泡。積層膠聚合完全后，小心移出 Teflon梳子，將凝膠固定于電泳裝置上，加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液05mmol/L Tris, 250mmol/L甘氨酸，0. 1% SDS)，上電泳樣品及蛋白質(zhì)Marker，電壓200v電泳45min，電泳結(jié)束后凝膠加入考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后，將凝膠浸泡于水中，拍照記錄。見圖2。3. 3. 2ffestern blot 12% SDS-PAGE 電泳 marker 兩側(cè)對稱上樣，一半凝膠染色、 脫色，另一辦用于western blot。戴手套剪6張Whatman 3MM濾紙和1張硝酸纖維素濾膜 (Millipore HAWP)，大小略小于凝膠，切去濾膜一角作為標記。把硝酸纖維素濾膜浸入超純水中5min以上，6張3MM濾紙浸于轉(zhuǎn)移緩沖液，用蒸餾水淋洗石墨板，用濾紙揩干石墨板上的液滴，在陽極依次放3張3MM濾紙、硝酸纖維素濾膜、凝膠、3張3MM濾紙，各層精確對齊并不留氣泡，正確安裝電泳裝置，根據(jù)凝膠面積按0. 6mA/cm2接通電流，轉(zhuǎn)膜池后，凝膠染色、脫色觀察轉(zhuǎn)膜是否成功，硝酸纖維素濾膜4°C封閉過夜(封閉液為含5% [W/V]脫脂奶粉的PBS，按膜面積0. lmL/cm2的量加入)，然后向封閉液中按0. lmL/cm2的量加入第一抗體，室溫緩慢搖動孵育池，硝酸纖維素濾膜經(jīng)250mL PBS洗滌3次后(每次5min)，轉(zhuǎn)移到辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫平緩搖動2h，同上洗滌后，移至顯色液中(IOmL的PBS 中DAB 6mg, 30% H202 IOmL)，室溫觀察反應(yīng)過程，蛋白帶的顏色深度達到要求后即用清水略為漂洗，然后拍照。見圖3。第二步驟單核細胞增多性李斯特菌的雜交瘤細胞制備和單克隆抗體生產(chǎn)和純化1. 1. 1從SDS-PAGE電泳凝膠中切下所需條帶，大約用兩天時間將其凍干，并碾成粉末。1. 1. 2蛋白濃度測定(考馬斯亮藍法)制作蛋白標準曲線。595nm處比色，得吸光度，查標準曲線，得到蛋白濃度。1.2將抗原溶于生理鹽水中，配制濃度為Iyg/μ 1。免疫BALB/c小鼠。4-6周，力口強免疫。2融合實驗2. 1培養(yǎng)骨髓瘤細胞NS-I2. 2制備飼養(yǎng)細胞取塑料管備用。拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精2-3分鐘。將小鼠移入超凈工作臺上，以仰臥位固定在解刨板上，用眼科剪剪開胸部皮膚，用兩手縱向拉開皮膚，暴露腹部， 并用酒精棉球消毒腹膜。用滴管吸取HAT培養(yǎng)液注入腹腔，沖洗，吸出，注入預(yù)先準備好的塑料管中，反復(fù)做幾次，取一定量小鼠腹腔巨噬細胞。將巨噬細胞接種于96孔板。置37°C、 5% CO2條件下培養(yǎng)。2. 3脾細胞制備拉頸處死免疫小鼠，用75%酒精浸泡消毒小鼠體表。在超凈工作臺內(nèi)，無菌暴露腹腔，摘取脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，用血清培養(yǎng)液沖洗。將脾臟移入盛有無血清培養(yǎng)液的勻漿器研磨。用無血清培養(yǎng)液沖洗，收集細胞懸液，以1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄去上清液，懸浮于不完全培養(yǎng)液中，并記共多少毫升脾細胞。脾細胞計數(shù)，取1毫升脾細胞懸液，加冰醋酸(破碎紅細胞)。2. 4細胞融合實驗將骨髓瘤細胞與脾細胞1 10的比例混合在一起，在50毫升塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗一次，1100轉(zhuǎn)，離心5分鐘。棄去上清夜，用食指輕彈離心管底部，使細胞沉淀團塊稍松散。一手均勻轉(zhuǎn)動離心管，另一手用吸管邊滴邊加輕輕攪動，同時加入0. 5ml-lml, 50% PEG作用，控制1分鐘內(nèi)加完。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘，分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml。離心，1000轉(zhuǎn)，5分鐘。棄上清，用含有小牛血清的培養(yǎng)液輕輕混懸，切記不能吹打，以免融合細胞散開。根據(jù)96孔板培養(yǎng)板數(shù)量，補加培養(yǎng)液。將融合細胞懸液加入含飼養(yǎng)細胞的96孔板，IOOul/孔，37°C，5% CO2孵箱培養(yǎng)。3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)3.1 包被蛋白抗原按比例加包被液，每孔lOOul，加96孔板，4°C放置過夜。PBS洗4次。(2 毫升吐溫/ILPBS水)。封閉1% BSA(0. 01g+100mlPBS) 1小時。加陰性對照、陽性標本，每孔 lOOul。3.2PBS 250ul/孔，洗三次。封閉10%封閉液(Iml 小牛血清+9mlPBS)，250ul/每孔，封閉1小時，-20°C保存?zhèn)溆?。棄上清，PBS洗三次。一抗加陰性對照、陽性對照及需檢測克隆上清標本，編號放置1小時，棄上清，PBS洗四次。二抗酶標抗體，2ul+5ml封閉液，放置1小時。PBS洗六次。底物溶液每孔lOOul，避光放置30min。加終止液觀察，酶標液讀數(shù)。4有限稀釋法克隆雜交瘤細胞4. 1在已檢測過的96孔培養(yǎng)板內(nèi)將待克隆的孔作好標記。用吸管吹打孔內(nèi)的細胞使其散開，從孔內(nèi)吸出0. Iml細胞懸液到Iml雜交細胞培養(yǎng)液中計數(shù)。初次克隆時用HT培養(yǎng)液調(diào)整雜交瘤細胞密度到3-10個/ml。每塊96孔培養(yǎng)板為IOml (第二次或第三次克隆可改用雜交細胞培養(yǎng)液)。將調(diào)好預(yù)定密度的細胞加到含飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板，每個孔加0.1ml。將96孔培養(yǎng)板置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第四天用新培養(yǎng)液置換孔內(nèi)1/2上清液。第七天至第九天，當(dāng)孔底細胞集落在l_2mm大小時，吸出雜交瘤細胞生長孔的上清液。按抗體篩選方法檢測上清液中的抗體。計算雜交瘤細胞的陽性孔比率。 將抗體陽性的孔內(nèi)細胞移到M孔培養(yǎng)板擴大培養(yǎng)2-4d。按以上步驟，將擴大培養(yǎng)后的陽性細胞再重復(fù)克隆2-4次，直到雜交瘤細胞的陽性孔率達到100%為止?？變?nèi)的細胞即為克隆化后的雜交瘤細胞。將克隆化的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)后，以lOOOr/min離心5min。收集上清液做單克隆抗體鑒定，凍存沉淀的細胞備用。5小鼠腹水的誘導(dǎo)取10周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，每只0. 5ml. 7_10天后，收集雜交瘤細胞，離心，去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度為3X IO7個/ml，每只小鼠注射lml。設(shè)陰性對照、鹽水對照。約10天后，小鼠腹部增大，開始收集腹水。用12號針頭扎入腹部，擠壓，使腹水流出，收集至離心管，并使勁晃動離心管防止腹水凝結(jié)。1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，吸取上清，注意去掉上面一層脂肪。分裝，-20°C凍存。6小鼠腹水單抗間接ELISA亞型分型實驗1離心處理樣品，用PBS按照1000 1比例稀釋腹水樣品與陰性對照樣品(未免疫BalB/C小鼠腹水)。取IOOul稀釋腹水樣品和陰性對照分別包被到ELISA板中，每種樣品一列，每列6個孔，取PBS為空白對照；2將ELISA板置于37°C孵育一小時；3用PBST洗滌液洗滌ELISA板三次；4用PBS按照10 1比例稀釋6個抗體亞型(分別為IgA, M，Gl，2a，2b和G3) (SIGMA公司，貨號為IS0-2)，將每種亞型抗體分別加入到空白孔，陰性對照孔和腹水樣品孔中，每孔IOOul ；5室溫放置30分鐘；6用PBST洗滌液洗滌ELISA板三次；7用含0. 02% TWEEN-20的PBS按照500 1的比例稀釋HRP標記的馬抗羊二抗 (北京鼎國生物技術(shù)責(zé)任公司，貨號HD004-1)，并將其加入到18個孔中，每孔IOOul ；8室溫放置15分鐘；9用PBST洗滌液洗滌ELISA板三次；10加入顯色底物緩沖液每孔100微升(采用OPD顯色系統(tǒng)，光吸收值為490nm)；11室溫避光放置10分鐘；12 加終止液 50ul;13拍照，用酶標儀在490nm處讀數(shù)記錄。實驗結(jié)果討論1 10000稀釋后的樣品在490nm處有仍有吸收，而且樣品與陰性比較差別明顯的是 1#和 IgG3。7單克隆抗體的純化小鼠腹水可通過親和層析方法獲得所需的純化單克隆抗體.第三步驟膠體金及膠體金探針的制備1材料與方法1.1試劑與儀器氯金酸分析純，Ig裝(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；產(chǎn)單核李斯特菌抗體(0鏈抗原I / II )14 ms/mlX2ml裝(購于日本生研公司)；檢測標準產(chǎn)單核李斯特菌(34922) 樣品；硝酸纖維膜層析條帶4cmX200cm(購于德國賽多利斯公司)；吸水纖維、玻璃纖維和 PVC板(購于上海良信科技有限公司)。1. 2膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法并稍作改進制備膠體金。18 20nm膠體金制備取氯金酸溶液2. 5ml加入到250ml容量瓶中，加雙蒸水至標定刻度線，使氯金酸溶液的濃度為1%。，沸水浴lOmin，加入檸檬酸三鈉溶液6. 65ml。快速攪拌直至顏色徹底變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)沸水lOmin，取出，涼至室溫后，用雙蒸水恢復(fù)至原體積。置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。IOnm直徑大小的膠體金，在515nm波長具有最大吸收峰，通過比較各法制備的膠體金的可見光吸光度，分析其金顆粒大小和分布。膠體金探針制備取新鮮制備的膠體金溶液50ml，加入0. 2mol/L K2C03，調(diào)pH至 8. 2，置磁力攪拌器上調(diào)適量轉(zhuǎn)速，然后加入適量的已純化好的抗體。使抗體濃度恰好在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的最小量上。緩慢攪拌lOmin，加入牛血清白蛋白 (BSA)，使BSA的終濃度為1 %，繼續(xù)攪拌IOmin。將上述膠體金一抗體一 BsA液進行4000r/ min離心20min，收集上清。將收集的上清進行4°C、lOOOOr/min離心60min。棄上清，沉淀用含 1% BSA 的 0. 01mol/L。pH7. 4PBS 懸浮。同上 4°C，10000r/min 離心 60min 兩次，最后將沉淀用5ml PBS-T溶解。并加入少量的Na3N, 4°C冰箱保存?zhèn)溆?。層析試紙條組裝試紙條由吸水纖維、硝酸纖維膜、玻璃纖維和PVC板組成。硝酸纖維膜處理中段相隔5mm分別用羊抗鼠IgG(對照線)和單核李斯特菌抗體(檢測線)劃線，形成兩條寬約Imm的線段，干燥后用含BSA的PBS封閉過夜，37°C干燥。試紙條組裝取潔凈PVC板，將處理好的硝酸纖維膜粘在PVC板中部合適位置；將 2cm吸水纖維粘在PVC板上端并部分壓在硝酸纖維膜上，0. 8cm玻璃纖維粘在PVC板下端并部分壓在硝酸纖維膜上，切成寬5mm的條帶，即為層析試紙條；干燥劑密封冷凍保存。1.5 檢測取待檢樣品培養(yǎng)48h，取0. Iml加入免疫膠體金離心管混合振蕩lOmin，將層析試紙條插入離心管，可見混合液沿試紙條向上移，移行過程中與固定在硝酸纖維膜上的單核李斯特菌抗體和羊抗鼠IgG發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，并產(chǎn)生肉眼可見的紅色條帶，試驗過程需 10-20min。測定結(jié)果判斷陰性，僅對照線出現(xiàn)紅色；陽性，對照線和檢測線均出現(xiàn)紅色。本發(fā)明的試驗效果評價2. 1膠體金制備方法和條件2. 1檢測靈敏度，并進行了 10倍系列稀釋。數(shù)據(jù)均低于食物中毒所需的菌種濃度。 由此可見，對于常見的由于單增李斯特菌引起的中毒，可以通過此方法檢測出來。2. 2特異性用自制的膠體金探針分別與沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、非產(chǎn)腸毒素金葡菌以及其它菌共10株等進行檢測，單增李斯特菌膠體金探針具有很的特異性，基本上不與其它菌產(chǎn)生非特異的交叉反應(yīng)。表1膠體金試劑盒特異性的觀察
權(quán)利要求
1. 一種膠體金標記Hly基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒，其特征是 a、引物設(shè)計L. monocytogenes Hly蛋白基因序列AAATGT CGACGG AGAGTG AAACCC ATGAAA AAAATA ATGCTA GTTATT ACACTT ATA 60 TTAGTT AGTCTA CCAATT GCGCAA CAAACT GAAGCA AAGGAT GCATCT GCATTC AATAAA 120 GAAAAT TTAATT TCATCC ATGGCA CCACCA GCATCT CCGGCT GCAAGT CCTAAG ACGCCA 180 ATGGAA AAGMA CACGCG GATGAA ATCGAT AAGTAT ATACAA GGATTC GATTAC AATAAA 240 AACAAT GTATTA GTATAG CACCGA GATGCA GTGACA AATGTG CCGCCA AGAAAA GGTTAT 300 AAAGAT GGAMT GAATAT ATCGTT GTGGAG AAAAAG AAGMA TCGATG MTCAA AATAAT 360 GCAGAT ATCCAA GTTGTG AATGCA ATTTCG AGCCTA AGATAT CCAGGT GCTCTC GTGAAA 420 GCGAAT TCGGAA TTAGTA GAAAAT CAACCC GATGTT GTTCTT GTCAAA CGTGAT TCATTA 480 ACACTT AGCATT GATTTG CCAGGA ATGACT AATCAA GACMT AAAATT GTTGTA AMAAT 540 GCTACT AAATCG AACGTT AACAAC GCAGTA AATACA TTAGTG GAAAGA TGGAAT GMAAA 600 TATGCT CAAGCT TATCCA AATGTA AGTGCA AAAATT GATTAT GATGAC GAAATG GCTTAC 660 AGTGAA TCACAA TTAATT GCAAAA TTTGGT ACGGCA TTTMA GCTGTA MTAAT AGCTTG 720 AATGTA AACTTC GGCGCA ATCAGT GAAGGG AAAATG CAAGAA GAAGTC ATTAGT TTTAAA 780 CAAATT TACTAT AACGTG AATGTT AATGAA CCTACA AGACCT TCCAGA TTTTTC GGCAAA 840 GCTGTT ACTMA GAGCAG TTGCAA GCGCTT GCAGTG AATGCA GAAAAT CCTCCT GCATAT 900 ATCTCA AGTGTG GCATAT GGCCGT CAAGTT TATTTG AAATTA TCAACT MTTCC CATAGT 960 ACGAAA GTAMA GCTGCT TTTGAG GCTGCG GTAAGT GGGMA TCTGTC TCAGGT GATGTA 1020 CAACTG ACAMT ATCATC AAAAAT TCTTCC TTCAAA GCGGTA ATTTAC GGTGGC TCCCCA 1080 AAAGAT GAAGTT CAAATC ATCGAC GGTAAC CTCGGA GACTTA CGAGAT ATTTTG AMAAA 1140 GGTGCT ACTTTT AAGCGG GAAACA CCAGCA GTTCCG ATTGCC TATACA ACAAAC TTCTTA 1200 AAAGAC AATGAA TTAGCT GTTATT AAAAAC AACTCA GAATAT ATTGAA ACAACT TCAAAA 1260 GCTTAT ACAGAT CGAAM ATCAAC ATCGAT CACTCT GGAGGA TACGTT GCTCAA TTCAAC 1320 ATCTCT TGGCAT GAAATA AATTAT GATCCT GAACGT AACGAA ATTGTT CAACAT AMAAC 1380 TCGAGC GAAMC AATAM AGTAAG CTAGCT CATTTC ACATCG TCCATC TATTTG CCACGT 1440 AACGCA AGAMT ATTAAT GTTTAC GCTAAA GAATGC ACTGGT TTAGCT TGGGAA TGGTGG 1500 AGAACG GTAATT GATGAC CGGAAC CTACCG CTTGTG AAAMT AGAAAT ATCTCC ATCTGG 1560 GGCACT ACACTT TATCCG AAATAT AGTAAT AGTGTA GATMT GCAATC GAATAA TTTTAA 1620 AAATTA ATAMA AAATCT AGAATA AA1646IHig GenBank ψ W L. monocytogenes Hly Sj^^lj, jSffi Primer Premier5. 0,DNA Club和Oligo 6. 0設(shè)計特異性引物Pl和P2，預(yù)期擴增長度為1434bp ；在NCBI GENEBANK 中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因序列中是否存在；用ft~imer primerf把序列反向互補；在應(yīng)用Oligo 6. 0引物設(shè)計時，上下游引物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基的負數(shù)值+1下游引物位點的確定為下游引物-酶切位點-保護性堿基=A，序列全長-A+1 =下游引物位點； 上游引物、5 一 iAAGAggatccAGAGTGAAACCCATG 一 3'； 下游引物、5 一 ‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT — 3’ ；為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入BamH I和)(h0 I酶切位點b、PCR擴增PCR反應(yīng)條件為951預(yù)變性51^11，941變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，擴增 32個循環(huán)；預(yù)期片段大小1 600bp ；c、瓊脂糖凝膠電泳的反應(yīng)條件用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，電壓100V，電泳30min ；d、切下目的DNA片段，用凝膠快速純化回收試劑盒回收；將回收純化的PCR產(chǎn)物與 PMD18-T進行連接，并pMDIS-T載體16°C 12小時以上連接；制備感受態(tài)細胞，應(yīng)用CaCl2致敏法制備大腸桿菌感受態(tài)，接種JM109菌種，37°C，225rpml2小時振搖培養(yǎng)后，菌液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37°C孵箱過夜培養(yǎng)，篩選單克?。贿x一單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)基中，12 小時以上培養(yǎng)，培養(yǎng)物按1/100接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A6tltl達0. 45-0. 55，用CaCl2致敏大腸桿菌；e、應(yīng)用熱休克轉(zhuǎn)化法，將連接反應(yīng)液加入IOOyL感受狀態(tài)的細胞中，再加3μ1 DMSO 以增加轉(zhuǎn)化效率，冰浴30min后，42°C休克45s，然后迅速冰浴5min，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB 液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇30min后，離心收集菌體，將其鋪于含篩選抗生素的LB固體培養(yǎng)基上， 37°C恒溫孵箱放置IMi后觀察轉(zhuǎn)化效果；f> SDS裂解法純化試劑盒制備質(zhì)粒；用BamH I和)(h0 I進行酶切鑒定及PCR鑒定， 篩選出陽性重組質(zhì)粒，命名為pGEX-6P-l-Hly ；用BamH I和Bio I進行亞克隆，表達載體 PGEX-6P-1和重組克隆載體pGEX-6P-l-Hly用BamH I和Xho I切處理，瓊脂糖凝膠電泳， 線性表達載體用DNA快速純化回收試劑盒回收，亞克隆片段用擠膠法回收，亞克隆載體與片段用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，提取質(zhì)粒，鑒定陽性克隆；g、蛋白的誘導(dǎo)表達用pGEX-6P-l重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21受體菌，選擇單克隆接種到5mL LB培養(yǎng)液里，按傳統(tǒng)方式誘導(dǎo)表達，即37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)至A600達0. 6-0. 8，加IPTG至lmmol/L，對照組不加IPTGdh后收集細菌；同時接種誘導(dǎo)菌種，提取質(zhì)粒，BamH I和)(h0 I酶切驗證確含目的片段后，進行測序，測序正確后進行重組蛋白的后續(xù)實驗；h、SDS-PAGE電泳將誘導(dǎo)后菌液30mL IlOOOrpm離心anin，棄上清，收集菌體，向菌體沉淀中加入2 X SDS 凝膠加樣緩沖液1000 μ 1，煮沸5min后進行SDS-PAGE電泳；i、從SDS-PAGE電泳凝膠中切下所需條帶，大約用兩天時間將其凍干，并碾成粉末；用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定，制作蛋白標準曲線；595nm處比色；將抗原溶于生理鹽水中，配制濃度為1 μ g/μ 1 ；免疫BALB/c小鼠；4_6周，加強免疫；小鼠腹水的誘導(dǎo)取10周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，每只0. 5ml, 7-10天后，收集雜交瘤細胞，離心，去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度為3X IO7個/ml，每只小鼠注射Iml ；設(shè)陰性對照、鹽水對照；10天后，小鼠腹部增大，開始收集腹水；用12號針頭扎入腹部，擠壓，使腹水流出，收集至離心管，并使勁晃動離心管防止腹水凝結(jié)；1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，吸取上清，注意去掉上面一層脂肪；分裝，-20°C凍存；j、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法并稍作改進制備膠體金；膠體金制備，取氯金酸溶液2. 5ml加入到250ml容量瓶中，加雙蒸水至標定刻度線，使氯金酸溶液的濃度為1%。，沸水浴lOmin，加入檸檬酸三鈉溶液6. 65ml ；快速攪拌直至顏色徹底變?yōu)樽霞t色， 繼續(xù)沸水lOmin，取出；涼至室溫后，用雙蒸水恢復(fù)至原體積；置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?測定膠體金在515nm波長具有最大吸收峰，確定膠體金直徑大小為IOnm ； 膠體金探針制備，取新鮮制備的膠體金溶液50ml，加入0. 2mol/L K2C03，調(diào)pH至8. 2， 置磁力攪拌器上調(diào)適量轉(zhuǎn)速，然后加入適量的已純化好的抗體；使抗體濃度恰好在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的最小量上；緩慢攪拌lOmin，加入牛血清白蛋白BSA， 使BSA的終濃度為1 %，繼續(xù)攪拌IOmin。將上述膠體金一抗體一 BSA液進行4000r/min離心20min，收集上清；將收集的上清進行4°C、10000r/min離心60min ；棄上清，沉淀用含1 % BSA的0. 01mol/L。ρΗ7· 4PBS懸?。煌?°C，10000r/min離心60min兩次，最后將沉淀用 5ml PBS-T溶解；4°C冰箱保存?zhèn)溆?；層析試紙條組裝試紙條由吸水纖維、硝酸纖維膜、玻璃纖維和PVC板組成；硝酸纖維膜處理，中段相隔5mm分別用羊抗鼠IgG對照線和單核李斯特菌抗體檢測線劃線，形成兩條寬約Imm的線段，干燥后用含BSA的PBS封閉過夜，37°C干燥；試紙條組裝，取潔凈PVC板，將處理好的硝酸纖維膜粘在PVC板中部合適位置；將2cm 吸水纖維粘在PVC板上端并部分壓在硝酸纖維膜上，0. 8cm玻璃纖維粘在PVC板下端并部分壓在硝酸纖維膜上，切成寬5mm的條帶，即為層析試紙條；干燥劑密封冷凍保存。
全文摘要
一種膠體金標記Hly基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒，屬于衛(wèi)生學(xué)檢驗及醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域，其特征是1引物設(shè)計、2PCR擴增、3瓊脂糖凝膠電泳的反應(yīng)條件、4切下目的DNA片段、5應(yīng)用熱休克轉(zhuǎn)化法、6SDS裂解法純化試劑盒制備質(zhì)粒、7蛋白的誘導(dǎo)表達、8SDS-PAGE電泳、9從SDS-PAGE電泳凝膠中切下所需條帶、10膠體金的制備。有益效果是改進了過去針對單一菌屬單一抗原測定的局限性。抗體純、效價高，提高了敏感度和準確度。對單增李斯特菌進行檢測，同ELISA法和PCR法比較，免疫膠體金層析對李斯特菌的檢測具有快速、便捷的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/577GK102539770SQ201110449180
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者何成彥, 何鑫, 賈芙蓉, 趙麗純, 黃勝起 申請人:何成彥, 何鑫, 賈芙蓉, 趙麗純, 黃勝起