專利名稱：一種區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
舞毒蛾OrZ1SAar (L.)屬鱗翅目 L印idoptera 毒蛾科 Lymantriidae， 是一種雜食性農(nóng)林害蟲。根據(jù)其地理分布、生物學(xué)習(xí)性和形態(tài)特征，現(xiàn)在被分為亞洲亞種 L . dispar asia tica Vnukovski i、歐洲亞禾中 Z. dispar dispar 禾口日本亞禾中 Z . dispar japonica (Motschulsky)。此前亞洲亞種和日本亞種被統(tǒng)稱為亞洲型舞毒蛾。亞洲型舞毒蛾主要分布在亞洲和部分歐洲地區(qū)，雌成蟲能飛行，可危害500余種寄主植物。歐洲型舞毒蛾原產(chǎn)歐洲，于1869年由歐洲傳入美國，雌成蟲不能飛行，危害約250種寄主植物。由于亞洲型舞毒蛾成蟲具飛行能力且寄主范圍比歐洲型大等原因，美國有關(guān)部門認(rèn)為亞洲型舞毒蛾比歐洲型舞毒蛾對其威脅更大。為了防止亞洲型舞毒蛾傳入美國，從 1991年開始，美國在其港口及附近地區(qū)對該蟲開展監(jiān)測，并先后對來自俄羅斯遠(yuǎn)東、日本高風(fēng)險港口的船舶實(shí)施特別檢疫措施。2007年以來，北美植物保護(hù)組織(NAPPO)及其成員國先后致函中國政府，準(zhǔn)備對來自中國相關(guān)港口的船舶也實(shí)施特別檢疫措施。2009年8月，該組織正式通過了《來自亞洲舞毒蛾疫區(qū)船舶及貨物操作管理指南》(ΝΑΡΡ0植物衛(wèi)生措施區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)第33號)。為此，我國必須克服相關(guān)技術(shù)問題，盡快研究出舞毒蛾不同地理種群差異的鑒定方法，避免來源地的混淆，以適應(yīng)對外貿(mào)易的發(fā)展的需要。盡管舞毒蛾存在生物學(xué)和形態(tài)學(xué)上的差異，但至今仍沒有完全可信的形態(tài)和行為特征可以用來區(qū)分舞毒蛾不同基因型。因此，生化標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)常被用來區(qū)分舞毒蛾不同地理種群的技術(shù)手段。同功酶實(shí)驗(yàn)揭示了日本、歐洲、美國種群間的基因差異， Bogdanowicz等人報道了用線粒體DNA作為舞毒蛾來源的示蹤診斷，Pfeifer等運(yùn)用PCR內(nèi)切酶技術(shù)分析核糖體DNA，區(qū)分了亞洲和北美種群。近年來，RAPD技術(shù)和AFLP技術(shù)也被用來作為舞毒蛾不同種群的分子標(biāo)記。線粒體DNA (mitochondrial DNA，mt DNA)是核外DNA，具有母系遺傳、進(jìn)化速率快、缺少重組等特點(diǎn)，已成為群體遺傳結(jié)構(gòu)、地理變異、系統(tǒng)發(fā)育及物種特征研究等領(lǐng)域的有效分子標(biāo)記。線粒體DNA的CO I基因有顯著的遺傳分化并能為種群的鑒定提供有效信息，同時線粒體DNA的CO I基因易于擴(kuò)增和測序，是研究昆蟲地理群體及近緣種問題的有效且不可或缺的工具。目前，現(xiàn)有方法大都需要經(jīng)過繁瑣的操作步驟和大量數(shù)據(jù)分析才能區(qū)分舞毒蛾的地里種群，而且無法做到對單一個體的區(qū)分，這對口岸舞毒蛾的檢驗(yàn)檢疫工作增加了難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的檢測方法，通過世界不同地理種群舞毒蛾線粒體CO I基因堿基差異設(shè)計(jì)特異引物和MGB探針，能達(dá)到準(zhǔn)確、快速、方便區(qū)分出舞毒蛾的地理來源，以適合口岸檢疫人員操作。
本發(fā)明區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的檢測方法如下步驟 (1)提取樣品總DNA ；
(2)以所述樣品總DNA為DNA模板，以F和R為引物，MGBl和MGB2為探針，在ABI7500 實(shí)時熒光定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR;以AG序列為亞洲型陽性對照中的DNA模板， 以O(shè)G序列為歐洲型陽性對照中的DNA模板；陰性對照中以ddH20替代DNA模板； 所述引物 F 的序列為GGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCT ； 所述引物 R 的序列為TTGATGAAATACCAGCTAAGTGAAGAGAAAA ； 所述探針 MGBl 的序列為ACAGATCTACCTCTATGAGCA ； 所述探針 MGB2 的序列為AGATCTACCTCCATGAGCA ；
所述探針MGBl以綠色熒光蛋白作為熒光報告基團(tuán)，所述探針MGB2以羧基熒光素作為熒光報告基團(tuán)；
所述 AG 序列為:ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatggaggtagatctgttga tttagctattttttctcttcacttagctggtatttcatcaa ；
所述 OG 序列為:ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatagaggtagatctgttga tttagctattttttctcttcacttagctggtatttcatcaa。(3)結(jié)果分析實(shí)時熒光定量PCR完成時，ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀顯示樣品檢測結(jié)果為Allele Y值時，表明樣品406位點(diǎn)堿基為G，即該樣品為亞洲型舞毒蛾；當(dāng)樣品檢測結(jié)果顯示為Allele X值時，表明樣品406位點(diǎn)堿基為A，即樣品為歐洲型舞毒蛾。所述實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為所述樣品總DNA約50ng，2.5 μ 1的IOX 引物探針預(yù)混MIX，12.5 μ 1的2XTaq MAN緩沖液，ddH20補(bǔ)足總體積至25 μ 1 ；所述亞洲型陽性對照以AG序列替代樣品總DNA，所述歐洲型陽性對照以O(shè)G序列替代樣品總DNA， 陰性對照中以ddH20替代樣品總DNA。所述實(shí)時熒光定量PCR的具體步驟為50°C條件下2 min ；95°C條件下10 min ；40 個循環(huán)包括95°C條件下15 s，60°C條件下lmin。本發(fā)明基于MGB探針特異性強(qiáng)、結(jié)果可靠、檢測速度快等特點(diǎn)，通過大量測序找到歐洲型和亞洲型舞毒蛾的保守堿基差異位點(diǎn)后，利用MGB探針對樣品進(jìn)行基因分型檢測， 所測結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，表明該方法能夠應(yīng)用于舞毒蛾不同地理種群的區(qū)分。本方法與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記與測序方法相比，利用MGB探針標(biāo)記，從DNA抽提到獲取實(shí)時熒光PCR 圖譜，整個過程在4h內(nèi)便可完成，大大節(jié)約了檢疫工作的人力和物力成本，達(dá)到快速、準(zhǔn)確地鑒定歐洲型和亞洲型舞毒蛾的目的。


圖1是歐洲型、亞洲型舞毒蛾熒光信號基因分型散點(diǎn)圖，其中“·”表示Allele X， 即樣品為歐洲型舞毒蛾，“ ”表示Allele Y，即樣品為亞洲型舞毒蛾；“▲”表示Both，即樣品為雜合子；“·”表示NTC，即樣品為陰性對照；“X”表示Undetermined，即樣品為待定；其中，結(jié)果顯示為 的樣品是 RVOl、RFV2、RV、RNl、RN2、JAPl、JAP2、JAP3、MGl、MG2、HLJ、MG3 ； 結(jié)果顯示為眷的樣品是獻(xiàn)1、獻(xiàn)2、]\^、町1、獻(xiàn)3、1￥、？4、町2。圖2是采用本發(fā)明方法檢測具體樣品，其中“ ”表示Allele X，即樣品為歐洲型舞毒蛾；“ ”表示Allele Y，即樣品為亞洲型舞毒蛾；“▲”表示Both，即樣品為雜合子；“· ”表示NTC，即樣品為陰性對照；結(jié)果顯示為 的樣品是RVOl、NMCFl ；結(jié)果顯示為 的樣品是MA1、NJ5。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的檢測
亞洲型選用來自俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、蒙古、日本、中國的4個地理種群，歐洲型選自來自美國的地理種群，20份舞毒蛾成蟲(卵)，詳見表1。表1實(shí)驗(yàn)用蟲樣信息
權(quán)利要求
1.一種區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的方法(1)提取樣品總DNA;(2)以所述樣品總DNA為DNA模板，以F和R為引物，MGBl和MGB2為探針，在ABI7500 實(shí)時熒光定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR;以AG序列為亞洲型陽性對照中的DNA模板， 以O(shè)G序列為歐洲型陽性對照中的DNA模板；陰性對照中以ddH20替代DNA模板；所述引物 F 的序列為GGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCT ；所述引物 R 的序列為TTGATGAAATACCAGCTAAGTGAAGAGAAAA ；所述探針 MGBl 的序列為ACAGATCTACCTCTATGAGCA ；所述探針 MGB2 的序列為AGATCTACCTCCATGAGCA ；所述探針MGBl以綠色熒光蛋白作為熒光報告基團(tuán)，所述探針MGB2以羧基熒光素作為熒光報告基團(tuán)；所述AG序列為ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatggaggtagatctgttgatttagctatttttt ctcttcacttagctggtatttcatcaa ；所述OG序列為ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatagaggtagatctgttgatttagctatttttt ctcttcacttagctggtatttcatcaa ；(3)結(jié)果分析實(shí)時熒光定量PCR完成時，ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀顯示樣品檢測結(jié)果為Allele Y值時，表明樣品406位點(diǎn)堿基為G，即該樣品為亞洲型舞毒蛾；當(dāng)樣品檢測結(jié)果顯示為Allele X值時，表明樣品406位點(diǎn)堿基為A，即樣品為歐洲型舞毒蛾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的方法，其特征在于所述實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為所述樣品總DNA約50ng，2. 5 μ 1的10 X引物探針預(yù)混MIX，12.5 μ 1的2XTaq MAN緩沖液，ddH20補(bǔ)足總體積至25 μ 1的；所述亞洲型陽性對照以AG序列替代樣品總DNA，所述歐洲型陽性對照以O(shè)G序列替代樣品總DNA，陰性對照中以ddH20替代樣品總DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的方法，其特征在于所述熒光實(shí)時定量PCR的具體步驟為50°C條件下2 min ；95°C條件下10 min ；40個循環(huán)包括95°C條件下 15 s，60°C條件下 lmin。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種區(qū)分歐洲型或亞洲型舞毒蛾的方法，設(shè)計(jì)了引物對和探針序列，以所述樣品總DNA為DNA模板，實(shí)時熒光定量PCR完成時，ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀顯示樣品檢測結(jié)果為AlleleY值時，表明樣品406位點(diǎn)堿基為G，即該樣品為亞洲型舞毒蛾；當(dāng)樣品檢測結(jié)果顯示為AlleleX值時，表明樣品406位點(diǎn)堿基為A，即樣品為歐洲型舞毒蛾。檢測快速，準(zhǔn)確地鑒定歐洲型和亞洲型舞毒蛾，適用于口岸對進(jìn)口木材的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102533995SQ20111045831
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者安榆林, 徐梅, 朱宏斌, 楊曉軍, 汪瀟琳, 鄭斯竹, 錢路 申請人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心