一種用于檢測單增李斯特菌的電化學(xué)免疫傳感方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于夾心法電化學(xué)免疫傳感采用計時電流法檢測單增李斯特菌，屬于生物技術(shù)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單增李斯特菌是一種重要的人畜共患病和食源性疾病的致病菌，能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，病死率高達30 %?70 %，國際上已將此菌列為九十年代的食品四大致病菌之一。FDA、WH0等組織都相繼成立了相應(yīng)的機構(gòu)或規(guī)定相應(yīng)的策略去預(yù)防和控制該菌的污染、傳播。WHO 1988年發(fā)表了“食源性李斯特菌病”勸告書，指導(dǎo)全世界各國如何預(yù)防LM污染和中毒，勸告公共衛(wèi)生機構(gòu)加強監(jiān)測。近幾年來，許多國家報道從多種食品中分離到李氏菌或因食品污染李氏菌而引起的食物中毒暴發(fā)事例。1999年底，美國密歇根州發(fā)生了一起嚴(yán)重的李斯特菌感染食品引起的食物中毒事件，21人因食用該菌污染的“熱狗”和熟肉而死亡，另外22個州97人感染，6名孕婦流產(chǎn)。2011年7月，美國香瓜受李斯特菌污染事件，造成30人死亡，一名孕婦流產(chǎn)，共有146人染病，患者分布在28個州。2001年11月以來，我國質(zhì)檢部門多次從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等二十多家肉類加工廠進口的豬腰、豬肚、豬耳、小排等三十多批近千噸豬副產(chǎn)品中檢出單增李斯特菌等致病菌。這些大量爆發(fā)和散發(fā)的流行病學(xué)案例表明，單增李斯特菌引起的食物中毒已是一個世界性的公共衛(wèi)生問題。目前美國對于食品中的單增李斯特菌持零容忍態(tài)度，加拿大的標(biāo)準(zhǔn)為100CFU / g食物。因此，建立單增李斯特菌現(xiàn)場快速的檢測技術(shù)在食品安全領(lǐng)域里意義重大。
[0003]目前單增李斯特菌的檢測方法主要是傳統(tǒng)方法、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等。在這些方法中，常規(guī)培養(yǎng)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是費時費力，得到結(jié)果常常需要5-7天；ELISA方法操作簡單，特異性強，反應(yīng)靈敏度高，但是在分析前需要進行樣品的前處理或富集；PCR分析需要DNA提取和擴增等，步驟繁瑣，且易出現(xiàn)假陽性。總之，這些方法都需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員和昂貴的花費以及較長的分析時間。最近幾年，由于快速響應(yīng)、簡單靈敏、便宜和高特異性，電化學(xué)免疫傳感器受到了人們的重視。電化學(xué)傳感檢測方法通過引入電活性物質(zhì)的方法，將電極表面敏感元件對目標(biāo)物的識別與吸附，轉(zhuǎn)變成一種電信號，具有快速靈敏、對樣品無損的優(yōu)勢。由于其對于樣品的濁度無要求，故很容易應(yīng)用與實際樣品中的檢測。電極上抗原抗體的固定方法對于檢測信號的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和靈敏度有著非常重要的影響。目前常用的固定方法有LB膜、聚合膜、蛋白A修飾、金納米顆粒和自組裝單分子層等。自組裝單分子層制備簡單、易形成超薄有序的單分子層。通過在電化學(xué)免疫傳感器電極表面自組裝單分子膜固定抗體，捕獲目標(biāo)物，引入酶催化電化學(xué)信號方法，其關(guān)鍵步驟是免疫傳感器的制備和檢測方法的確定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于夾心法的電化學(xué)免疫傳感方法用于檢測單增李斯特菌。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種在電化學(xué)傳感器的工作電極表面制備免疫傳感器的方法，具體步驟如下:
[0007](I)將金電極通過打磨拋光處理后，再用硫酸溶液進行循環(huán)伏安清洗，然后在0.05MH2S04溶液中進行活化(電壓范圍-0.2V?1.6V，掃描速率50mV / s)，直至在0.94V左右得到一平滑的還原峰，超純水洗，氮氣吹干；此為處理好的裸金電極。
[0008](2)將處理好的金電極置于1% 3-巰基丙酸的乙醇溶液中自組裝，室溫過夜，乙醇洗，超純水洗，氮氣吹干；此為自組裝電極。
[0009](3)將組裝好的電極在室溫活化30min，超純水洗，氮氣吹干；此為活化電極。
[0010](4)在活化好的電極表面滴加單增李斯特菌單抗溶液，37°C孵育lh，PBS洗，氮氣吹干；此為結(jié)合了單抗的電極。
[0011](5)將結(jié)合了單抗的電極37°C封閉40min，PBS洗，氮氣吹干；儲于4°C，懸于PBS上方，備用。此為制備好的免疫傳感器。上述各步驟處理完成后都采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜進行表征。
[0012]表征溶液為1mL 2.5mM Fe(CN)廣 / Fe(CN)廣(I:1)的含有 0.1M KCl 的 0.0lMPBS溶液。
[0013]表征體系為三電極體系，金電極為工作電極，鉬片電極為對電極，Ag / AgCl (3MKCl溶液)電極為參比電極。
[0014]一種基于酶放大的夾心法電化學(xué)免疫傳感器檢測單增李斯特菌的方法，具體步驟如下:
[0015](I)配制系列濃度的單增李斯特菌溶液，分別與制備的免疫傳感器在37°C下孵育lh，然后再與HRP標(biāo)記的多抗進行反應(yīng)，37-°C孵育30min，最后在電化學(xué)傳感器上用計時電流法進行檢測；以PBS為對照，在相同的條件下進行檢測，得到的電流響應(yīng)值即為陰性值，經(jīng)計算得到電流響應(yīng)的差值，繪制LM濃度與電流響應(yīng)差值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算方法線性范圍及最低檢測限。
[0016](2)用0.1M的甘氨酸-HCl (pH2.0)的水溶液再生5min，除去結(jié)合的單增李斯特菌菌體抗原，以此循環(huán)檢測同一濃度的LM溶液，驗證制備的免疫傳感器的再生性能。
[0017](3)將電化學(xué)傳感器得到的結(jié)果與平板計數(shù)的結(jié)果相比較，驗證傳感器的可靠性。
[0018](4)將此方法應(yīng)用于檢測牛奶樣品加標(biāo)實驗，最終確定方法線性范圍:13-1O6CFU / ml，最低檢測限:102CFU / ml。
[0019]底物溶液:1mL含有0.24mM硫堇溶液和6mM過氧化氫溶液的0.1M KCl的PBS溶液(0.01M, ρΗ7.0);氮吹 5min 除氧。
[0020]計時電流法參數(shù)設(shè)置:電壓恒定在-0.3V，電流持續(xù)時間200S。
【附圖說明】
[0021]圖1電化學(xué)免疫傳感器和檢測系統(tǒng)示意圖
[0022]圖2金電極活化圖
[0023]圖3電化學(xué)免疫傳感器循環(huán)伏安和電化學(xué)阻抗譜表征圖
[0024]圖4電化學(xué)響應(yīng)信號與單增李斯特菌濃度繪制的響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0025]圖5電化學(xué)響應(yīng)信號與牛奶中加標(biāo)實驗的曲線
【具體實施方式】
[0026]實施方式一:電化學(xué)傳感器電極表面制備免疫傳感器
[0027](I)將金電極在2000目、3000目、5000目砂紙上畫圈打磨或者在Piranha溶液(H2O2 / H2SO4,1:3，V / V)中浸泡 5min，超純水洗，然后依次將 1.0μπι、0.3μπι、0.05μπιAl2O3粉末調(diào)成懸浮液在麂皮上拋光，超純水洗；將潔凈的金電極在0.1M H2SO4溶液中進行循環(huán)伏安掃描(電壓范圍-0.2V?1.2V，掃描速率50mV / s)清洗，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖；然后在0.05M H2SO4溶液中進行活化(電壓范圍-0.2V?1.6V，掃描速率50mV /s)，直至在0.94V左右得到一平滑的還原峰，超純水洗，氮氣吹干；
[0028](2)將處理好的金電極置于2mL 1% 3_巰基丙酸的乙醇溶液中自組裝，室溫過夜，乙醇洗，超純水洗，氮氣吹干；
[0029](3)將組裝好的電極置于2mL0.4M EDC-0.1M NHS的水溶液中室溫活化30min，超純水洗，氮氣吹干；
[0030](4)在活化好的電極表面滴加1yL稀釋度為1: 1000的單增李斯特菌單抗溶液，37°C孵育Ih，PBS洗，氮氣吹干；
[0031](5)將結(jié)合了單抗的電極置于ImLl % OVA的PBS溶液，37°C封閉40min，PBS洗，氮氣吹干；儲于4°C,懸于PBS上方,備用。
[0032]實施方式二:基于酶放大的夾心法電化學(xué)免疫傳感器檢測單增李斯特菌
[0033](I)將制備好的免疫傳感器與空白溶液PBS在37°C下反應(yīng)，然后再與HRP標(biāo)記的多抗在37°C下反應(yīng)30min，最后在用計時電流法進行檢測，得到的值為陰性值；
[0034](2)配制系列濃度的單增李斯特菌溶液(17CFU / mlUO6CFU / ml……11CFU /ml)，分別與制備的免疫傳感器在37°C下孵育lh，然后再與HRP標(biāo)記的多抗進行反應(yīng)，37°C孵育30min，最后在電化學(xué)傳感器上用計時電流法進行檢測得到電流響應(yīng)值，用0.0lM甘氨酸-HCl溶液再生5min，除去結(jié)合的LM，以此循環(huán)對11CFU / ml_107CFU / ml濃度范圍內(nèi)的LM進行檢測。
[0035](3)經(jīng)計算得到電流響應(yīng)的差值，LM濃度的對數(shù)值與電流響應(yīng)差值的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=548.0x-727.2，R2=0.9883，線性范圍為 12CFU / ml-1 O6CFU / ml。
[0036](4)同時以同一濃度的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌為對照，在相同條件下進行電化學(xué)檢測，結(jié)果顯示制備的電化學(xué)免疫傳感器具有較好的特異性。
【主權(quán)項】
1.一種在電化學(xué)傳感器工作電極表面制備免疫傳感器的方法，其特征由以下步驟組成: (1)將金電極在2000目、3000目、5000目砂紙上打磨，超純水洗，然后依次用Ι.Ομπκ0.3 μ m、0.05 μ m Al2O3粉末在麂皮上拋光，超純水洗； (2)將潔凈的金電極在0.1M H2SO4溶液中進行循環(huán)伏安掃描(電壓范圍-0.2V?1.2V,掃描速率50mV / s)清洗，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖；然后在0.05M H2SO4溶液中進行活化(電壓范圍-0.2V?1.6V，掃描速率50mV / s)，直至在0.94V左右得到一平滑的還原峰，超純水洗，氮氣吹干； (3)將處理好的金電極置于2mL1% 3-巰基丙酸的乙醇溶液中自組裝，室溫過夜，乙醇洗，超純水洗，氮氣吹干； (4)將組裝好的電極置于0.4M EDC-0.1M NHS的水溶液中室溫活化30min，超純水洗，氮氣吹干； (5)在活化好的電極表面滴加10μ L單增李斯特菌單抗溶液，37°C孵育lh，PBS洗，氮氣吹干； (6)將結(jié)合了單抗的電極置于ImLl% OVA的PBS溶液，37°C封閉40min，PBS洗，氮氣吹干；儲于4°C備用。
2.一種基于自組裝單分子膜的電化學(xué)免疫傳感器檢測單增李斯特菌的方法，其特征由以下步驟組成: (1)將制備的免疫傳感器置于單增李斯特菌菌體抗原溶液中，37°C孵育lh，PBS洗；然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的單增李斯特菌多抗反應(yīng)，37°C孵育30min，PBS洗，氮氣吹干； (2)配置1mL的底物溶液:含有0.24mM硫堇溶液和6mM過氧化氫溶液的0.1M KCl的PBS 溶液(0.01M, ρΗ7.0);氮吹 5min 除氧； (3)以PBS代替單增李斯特菌抗原溶液作為對照值，采用計時電流法檢測電流信號的響應(yīng)值，電壓恒定在-0.3V，持續(xù)時間200S。用0.0lM的甘氨酸-HCl (pH2.0)的水溶液再生5min，除去結(jié)合的單增李斯特菌菌體抗原，以此循環(huán)進行不同濃度菌體的檢測； (4)利用測得的電流信號與對應(yīng)的單增李斯特菌濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對無菌牛奶樣品進行加標(biāo)實驗，最終確定方法線性范圍=13-1O6CFU / ml，最低檢測限:12CFU / ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測單增李斯特菌的方法，屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明首先利用電化學(xué)活化金電極的表面，再浸入1％3-巰基丙酸的乙醇溶液中自組裝形成單分子膜，經(jīng)活化后，將捕獲抗體結(jié)合到電極表面，采用夾心法引入酶放大信號，通過酶催化電活性物質(zhì)的氧化還原得到電流響應(yīng)信號，建立了一種以三電極為體系的電化學(xué)免疫傳感器檢測單增李斯特菌的方法，該方法具有良好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。由于檢測體系小，節(jié)省試劑，顯著降低了檢測成本，且由于不受樣品濁度的影響，在應(yīng)用與實際樣品的檢測中具有很大的潛力。
【IPC分類】G01N27-416, G01N33-569, G01N33-531
【公開號】CN104634847
【申請?zhí)枴緾N201310581188
【發(fā)明人】高志賢, 彭媛, 程超男, 寧保安, 白家磊
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月14日