專利名稱：狗魚幼魚彈狀病毒反轉錄環(huán)酶恒溫擴增檢測方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及病毒的檢測方法和檢測試劑盒，特別是涉及狗魚幼魚彈狀病毒反轉錄 環(huán)酶恒溫擴增檢測方法和試劑盒。
背景技術：
根據國際病毒學分類委員會(International comittee on taxonomy ofviruses, ICTV)第8次報告，彈狀病毒科(lihabdoviridae)分為6個屬，包括感染植物的質型彈狀 病毒屬(Cytorhabdovirus)和核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus),以及感染脊椎動 物的水皰性口膜炎病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)、短晳熱病毒屬 (Ephemerovirus)和粒外彈狀病毒屬(也稱非毒粒蛋白彈狀病毒屬)(Novirhabdovirus)， 還有部分彈狀病毒尚未分類，如Sigma virus, Flanders virus等。迄今報道感染魚類的 彈狀病毒已有十幾種，包括傳染性造血器官壞死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus, IHNV)、__個生(Viralhaemorrhagic septicemia virus, VHSV) >
(Hirame rhabdovirus, HRV) >(Snakehead rhabdovirus, SHRV)、鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)、狗魚幼魚彈狀病 毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、彈狀病毒 903/87 (Rhabdovirus 903/87，903/87)、鱖魚 彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)、胭脂魚彈狀病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鮭彈狀病毒沘/97 (ka trout rhabdovirus 28/97, STRV)等(Granoff and Webster, 1999 ；張奇亞和李正秋，1999 ；Zhang et al.，2000 Johansson et al.，2001， 2002)。在ICTV第6次報告上，SVCV, PFRV被列為水皰性口膜炎病毒屬暫定種(Wurmer et al.，1995)。在ICTV第7次報告中，正式把IHNV、VHSV, HRV、SHRV列為粒外彈狀病毒屬， SVCV、PFRV等仍歸為水皰性口膜炎病毒屬的暫定種(Walker et al.，2000)。其他魚類彈狀 病毒的分類地位尚未確定。隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，魚類病毒病已成為養(yǎng)殖魚類的最大病害。由于缺乏 有效的治療方法，魚類病毒性疾病的控制以預防為主，因而病毒的診斷與檢測技術研究成 了魚類病毒研究中非?；钴S的領域。魚類彈狀病毒有很強的致病性，特別是VHSV、IHNV、 HRV, SHRV和SVCV在世界各地廣泛流行，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經濟損失。因而這些病 毒的流行病學備受科研工作者的關注。狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)是一種與鯉春病毒血癥病毒(SVCV)同源性很高的病 毒，目前還未引起人們高度重視。PFRV主要在歐洲狗魚幼魚中流行(Wolf，1988)。1972年 該病毒在荷蘭感染狗魚幼魚，引起大規(guī)模死亡，第一株PFRV從此批患病的狗魚幼魚中分離 出來(De Kinkelin, 1973) ο PFRV與SVCV親緣關系最近，G蛋白的同源性> 70%。對PFRV、 SVCV及與它們血清學相關的魚類彈狀病毒G蛋白部分核苷酸序列進行系統(tǒng)進化分析，結果 顯示它們形成4個基因型，PFRV和SVCV分別形成一個基因型，分別為基因型III和I，其他 病毒形成基因型II和IV (Stone et al. , 2003) 0 SVC主要感染鯉科魚類，被世界動物衛(wèi)生 組織列為必須申報的疾病，中國農業(yè)部將SVC列為二級動物疫病。隨著對SVC的日益重視，對SVCV監(jiān)控力度的加大，這些與SVCV親緣關系高的病毒也將會越來越引起人們的重視。因 而尋找特異、靈敏快速的檢測方法，對于防控疾病的發(fā)生和發(fā)展十分關鍵。在中國，魚類病毒SVCV已經引起人們高度的重視，并于每年春秋兩季對全國鯉魚 進行SVCV監(jiān)測。但是與SVCV親緣關系很高的魚類病毒PFRV目前還沒有引起人們的重視， 沒有納入檢測的范圍。隨著與這2種病毒血清學相關的病毒相繼分離(Ahne，1975 ;Ahne et al. ,1982 ；Fijan et al. ,1984 ；Ahne and Thomsen,1986 ；Haenen and Davidse,1989 ； Jorgensen et al. ,1989；Rowley et al. ,2001 ；Stone et al. ,2003 ；Way et al. ,2003), 人們對這些病毒的關注會越來越多。因而需要建立切實可行的檢測方法。目前，鑒定PFRV及與其血清學相關的病毒一般采取先用敏感細胞分離，然后用血 清學方法鑒定的方式(De Kinkelin, 1973 ；Ahne, 1975 ；Ahne etal. , 1982 ；Fijan et al.， 1984 ；Ahne and Thomsen, 1986 ；Haenen and Dayidse,1989 ；Jorgensen et al. , 1989 ； Rowley et al.，2001 ；Stone et al.，2003 ；Way et al. ,2003) 采用這種檢測方式不僅周 期長，而且使用免疫學方法，如間接熒光抗體試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗，PFRV與SVCV之間 存在交叉反應(J0gensen et al.，1989 ；Way，1991)，檢測結果不準確。環(huán)媒恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 2000 年報導的一種新穎核酸擴增技術(Notomi et al.，2000)。該技術針對DNA靶序列的6個 區(qū)域設計4條特異引物，包含1對內引物和1對外引物，內引物包括前內引物FIP (Forward inner primer)和后內引物 BIP (Backward inner primer)，外引物包括 F3 和 B3，如圖 IA 所 示。FIP由2條引物組成，分別是F1C(靶基因Fl序列的互補序列)和F2(與靶序列序列 相同)，TTTT鏈接FlC和F2，同理BIP由B1C-TTTT-B2構成，TTTT作為連接核苷酸可有可 無，當形成的環(huán)不夠30個核苷酸時，增加4個核苷酸可增加環(huán)的長度。外引物B3和F3識 別區(qū)域位于內引物外側，分別與靶序列B3C、F3C互補。設計引物時還注意一個原則，擴增區(qū) 段F2-R2最好控制在200個核苷酸以內。LAMP法擴增的機制(如圖IB所示)1、引物BIP 中的B2(B2c的互補序列)與模板DNA中B2c結合，起始互補鏈的合成；2、B3(B3c的互補序 列)與B3c結合，啟動鏈置換反應；3、鏈置換反應產生1對雙鏈和1條單鏈，單鏈兩端有互 補核苷酸，形成啞鈴狀；4、引物BIP中的B2與雙鏈莖環(huán)結構DNA的環(huán)上的B2c合成一種有 缺口的過渡性莖環(huán)結構DNA ;5、在過渡性莖環(huán)結構的莖上含有1對反向互補序列，在對面的 末端，通過FIP形成1個環(huán)狀結構。在隨后的自我引物置換延伸合成過程中，在內引物作用 下，開始循環(huán)反應，莖的長度和環(huán)的個數(shù)都逐漸增加，最后的產物為不同長度的莖環(huán)DNA組 成的混合物。擴增產物可以通過3種方法來判斷1、瓊脂糖凝膠電泳；2、擴增產物中加雙鏈DNA 染料STOR Green I ；3、肉眼觀察擴增負產物焦磷酸鎂白色沉淀。LAMP法具有許多其他PCR 方法無法比擬的優(yōu)點。1、只需要保持60°C _65°C的恒定溫度就能進行擴增反應，因此無需 昂貴的設備，一般的恒溫裝置如水浴鍋或恒溫箱就能滿足擴增要求；2、針對靶序列的6個 區(qū)段設計4條引物，擴增的特異性比其他的PCR方法進一步提高；3、整個擴增在Ih左右即 可完成，且產率可達到0. 15mg/mL,擴增效率大大提高。4、進行RT-LAMP時，在增加反轉錄酶 和RNA酶抑制劑后，不需要專門設計反轉錄的時間，整個反應的時間也不需要增加，進一步 提高檢測的效率；5、在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+ 結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉淀，由于擴增效率高，產生的焦磷酸鎂沉淀多，用肉眼觀察或濁度儀檢測濁度就能夠判斷是否擴增。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種狗魚幼魚彈狀病毒的反轉錄環(huán)媒 恒溫擴增(RT-LAMP)檢測方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種狗魚幼魚彈狀病毒的檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)的反轉錄環(huán)媒恒 溫擴增檢測方法，所述方法包括利用特異性引物，以病毒基因組RNA為模板進行反轉錄環(huán) 媒恒溫擴增反應，所述特異性引物包括一對內引物和一對外引物，所述外引物分別含有Seq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列，Seq ID No. 1 :5，一CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT—3，Seq ID No. 2 5' —TTCTCGATCCAGTCTCCACG—3，。所述內引物包括前內引物FIP和后內引物BIP，所述前內引物FIP優(yōu)選含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，kq ID No. 3和kq ID No. 4之間通過0 4個堿基相連；所述后內引物BIP優(yōu)選含有kq ID No. 5和kq ID No. 6所示的序列，kq ID No. 5和kq ID No. 6之間通過0 4個堿基相連；Seq ID No. 3 5' —GAGCATTTCCATACATGGTCCC—3，Seq ID No. 4 5' —GAGGAATGCGACCAACACATC—3，Seq ID No. 5 5' —CAAGTTCCAAGATGCCTGTCG—3，Seq ID No. 6 5' —CTTGATTCCATCCATCCCAC—3，。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述外引物分別具有^^ ID No.No. 2所 示的序列，所述前內引物FIP的序列為GAGCATTTCCATACATGGTCCCGAGGAATGCGACCAACACATCSeq ID No. 3Seq ID No. 4所述后內引物BIP的序列為CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCACSeq ID No. 5Seq ID No. 6所述反轉錄環(huán)媒恒溫擴增反應的恒溫溫度優(yōu)選為59°C 65°C，更優(yōu)選63°C，反應 的時間優(yōu)選為30min-120min，更優(yōu)選60min。本發(fā)明還公開了一種狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)的檢測試 劑盒，所述試劑盒包括分別含有kq ID No. 1和％(1 ID No. 2所示序列的一對引物，Seq ID No. 1 :5，一CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT—3，Seq ID No. 2 5' TTCTCGATCCAGTCTCCACG3，。所述檢測試劑盒優(yōu)選用于反轉錄環(huán)媒恒溫擴增反應，且所述引物為外引物。所述檢測試劑盒優(yōu)選還含有一對內引物，所述內引物包括前內引物FIP和后內引 物 BIP,
所述前內引物FIP優(yōu)選含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，kq ID No. 3和kq ID No. 4之間通過0 4個堿基相連；所述后內引物BIP優(yōu)選含有kq ID No. 5和kq ID No. 6所示的序列，kq ID No. 5和kq ID No. 6之間通過0 4個堿基相連；Seq ID No. 3 5' —GAGCATTTCCATACATGGTCCC—3，Seq ID No. 4 5' —GAGGAATGCGACCAACACATC—3，Seq ID No. 5 5' —CAAGTTCCAAGATGCCTGTCG—3，Seq ID No. 6 5' CTTGATTCCATCCATCCCAC3，。上述0 4個堿基作為連接核苷酸可有可無，當形成的環(huán)不夠30個核苷酸時，所 增加的0 4個核苷酸可增加環(huán)的長度，所述0 4個堿基優(yōu)選為TTTT。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述外引物分別具有^^ ID No.No. 2所 示的序列，
所述前內引物FIP的序列為 GAGCATTTCCATACATGGTCCCGAGGAATGCGACCAACACATC Seq ID No. 3Seq ID No. 4
所述后內引物BIP的序列為 CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC
Seq ID No. 5Seq ID No. 6
由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于 本發(fā)明的反轉錄環(huán)媒恒溫擴增(RT-LAMP)檢測方法和試劑盒用于檢測PFRV時， 由于獨特的引物設計使得檢測方法擁有很好的特異性，用于檢測IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、 IPNV、HRV和PFRV時，只有PFRV的檢測結果為陽性。本發(fā)明的方法和試劑盒靈敏度高，對 病毒懸液中抽提核酸的檢測靈敏度為10°_5TCID5tl,比RT-PCR的靈敏度高100倍，比實時熒 光RT-PCR的靈敏度高10倍。本發(fā)明的方法和試劑盒檢測時間短，RT-LAMP反應時間只需 要lh，比實時熒光(1. 5h-2h)和RT-PCR( i-3h)耗時更短。應用LAMP技術需要的儀器也不 高，一般的PCR儀或恒溫設備如水浴鍋或恒溫箱就可以進行反應。


圖1為LAMP反應過程原理圖，其中A為LAMP引物位置示意圖，B為LAMP反應過 程示意圖。圖2為本發(fā)明的一種RT-LAMP引物在PFRV基因組中的位置示意圖。圖3A為本發(fā)明的RT-LAMP的溫度優(yōu)化試驗結果電泳圖像；1 :MarkerDL2000 ；2 590C ；3 :60°C ；4 :61°C ；5 :62°C ；6 :63°C ；7 :64°C ；8 :65°C。圖;3B為本發(fā)明RT-LAMP溫度優(yōu)化擴增產物在ABI7500的溶解曲線。圖4A為本發(fā)明RT-LAMP的時間優(yōu)化試驗結果電泳圖像；1 :MarkerDL2000 ； 2 30min ；3 :45min ；4 :60min ；5 :90min ；6 :120mino圖4B為本發(fā)明RT-LAMP時間優(yōu)化擴增產物在ABI7500的溶解曲線。圖5為不同RT-LAMP結果觀察方法的比較，A、凝膠電泳，B、PicoGreen染色(1為 翠綠色)，C溶解曲線。
圖6為本發(fā)明PFRV RT-LAMP檢測的特異性試驗結果電泳圖像；1 =PFRV ；2 =HRV ；3 IHNV ；4 =VHSV ；5 =SVCV ；6 JPNV ；7 =VNNV ；8 =Negativecontrol ；9 =Marker DL2000。圖7為本發(fā)明PFRV RT-LAMP靈敏度試驗結果電泳圖像；1 :MarkerDL2000, 2 :10° ； 3 10-1 ；4 :1(Γ2 ；5 :1(Γ3 ；6 :1(Γ4 ；7 :1(Γ5 ；8 :1(Γ6 ；9 =Negativecontrol 圖8為PFRV引物F2/R2RT-PCR靈敏度實驗結果電泳圖像；1 =DNAMarker ；2 10° ； 3 10-1 ；4 :1(Γ2 ；5 :1(Γ3 ；6 :1(Γ4 ；7 :1(Γ5 ；8 :1(Γ6 ；9 =Negativecontrol 圖9為PFRV實時熒光RT-PCR檢測的靈敏度實驗結果圖。
具體實施例方式實施例11材料和方法1. 1病毒及細胞PFRV為F4株，由中國科學院水生生物研究所贈送，SVCV和IHNV參考株由英國 CEFAS的OIE參考實驗室B. Hill教授惠贈；VHSV參考株由挪威國家獸醫(yī)研究所OIE參考實 驗室Roar Gudding博士惠贈、IPNV、HRV、VNNV由本室分離。IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV 和 PFRV 分別用 EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、 FHM和BF-2細胞擴增。SSN-I細胞購自泰國Kasetsart大學水生動物健康研究所，RTG-2 細胞由水生生物研究所贈送，BF-2細胞由檢疫研究所(布雷西亞)細胞保藏中心贈送， CHSE-214細胞、EPC細胞由英國環(huán)境、漁業(yè)和水產養(yǎng)殖科學研究中心贈送、FHM細胞由德國 慕尼黑大學和中國科學院水生生物研究所贈送，CO細胞由中國科學院水生生物研究所贈 送。EPC、C0、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2細胞均用含10%胎牛血清的199培養(yǎng)液培 養(yǎng)，SSN-I細胞用含10% FBS的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種病毒后，用加抗生素(100IU/mL青 霉素；100 μ g/mL鏈霉素)的相應培養(yǎng)液培養(yǎng)。1. 2設備與試劑設備ABI7500熒光定量PCR，Eppendorf PCR儀，BDA TIl型凝膠成像儀 (Biometra)。試劑MgS04、Betaine、熒光染料PicoGreen購于美國hvitrogen 公司；Bst DNA聚 合酶大片段及 10XThermoPol 反應緩沖液(100mmol/L KCl, 200mmol/L Tris-HCl, IOOmmol/ L(MM)2SO4，20mmol/L MgSO4,1% TritonX-100，pH 8. 8，25°C )購于紐英倫生物技術有限公 司(NEB)；反轉錄酶、核酸抑制劑購自大連寶生物公司；實驗所用水均為DEPC處理水；實驗 器皿均經過高溫滅菌2次。1. 3RT-LAMP 引物的設計根據Genbank 中 PFRV G 基因(AJ538069)，使用 Primer Explore V3 和 Primer Premier 5. O軟件針對其中的6個區(qū)域設計2對引物，即1對外引物，1對內引物。由上海 生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。引物在PFRV基因組中的位置及擴 增原理示意圖見圖2。表IPFRV RT-LAMP檢測弓丨物
權利要求
1.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的反轉錄環(huán)媒恒溫擴增 (RT-LAMP)檢測方法，所述方法包括利用特異性引物，以病毒基因組RNA為模板進行反轉錄 環(huán)媒恒溫擴增反應，所述特異性引物包括一對內引物和一對外引物，其特征在于所述外引 物分別含有ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列，Seq ID No. 1 :5’ -—CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT-—3， Seq ID No. 2 5' -—TTCTCGATCCAGTCTCCACG-—3，。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述內引物包括前內引物FIP和后 內引物BIP，所述前內引物FIP含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，Seq IDNo. 3和kq ID No. 4之間通過O 4個堿基相連；所述后內引物BIP含有kq ID No. 5和kq ID No. 6所示的序列，Seq IDNo. 5和kq ID No. 6之間通過O 4個堿基相連；Seq ID No. 3 :5’ -—GAGCATTTCCATACATGGTCCC-—3， Seq ID No. 4 :5’ 一GAGGAATGCGACCAACACATC—3， Seq ID No. 5 :5’ -—CAAGTTCCAAGATGCCTGTCG-—3， Seq ID No. 6 :5’ -—CTTGATTCCATCCATCCCAC-—3，。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述外引物分別具有kqID No. 1和 Seq ID No. 2所示的序列，所述前內引物FIP的序列為 GAGCATTTCCATACATGGTCCC GAGGAATGCGACCAACACATCSeq ID No. 3Seq ID No. 4所述后內引物BIP的序列為 CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC Seq ID No. 5Seq ID No. 6
4.根據權利要求1 3任意一項所述的檢測方法，其特征在于所述反轉錄環(huán)媒恒溫 擴增反應的恒溫溫度為59°C 65°C。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述反轉錄環(huán)媒恒溫擴增反應的時 間為 30min-120min。
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述反轉錄環(huán)媒恒溫擴增反應的恒 溫溫度為63°C，反應的時間為60min。
7.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的檢測試劑盒，其特征在于所 述試劑盒包括分別含有Seq ID No. 1和Seq ID No. 2所示序列的一對引物，Seq ID No. 1 :5’ -—CAATTTGGCTAACAGATCATATCCT-—3， Seq ID No. 2 :5’ -—TTCTCGATCCAGTCTCCACG-—3，。
8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒用于反轉錄環(huán)媒 恒溫擴增反應，且所述引物為外引物。
9.根據權利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒還含有一對內引 物，所述內引物包括前內引物FIP和后內引物BIP，所述前內引物FIP含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，Seq IDNo. 3和kqID No. 4之間通過0 4個堿基相連；所述后內引物BIP含有kq ID No. 5和kq ID No. 6所示的序列，Seq IDNo. 5和kq ID No. 6之間通過O 4個堿基相連；Seq ID No. 3 :5’ -—GAGCATTTCCATACATGGTCCC-—3， Seq ID No. 4 :5’ 一GAGGAATGCGACCAACACATC—3， Seq ID No. 5 :5’ -—CAAGTTCCAAGATGCCTGTCG-—3， Seq ID No. 6 :5’ -—CTTGATTCCATCCATCCCAC-—3，。
10.根據權利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于所述外引物分別具有％(1 ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列，所述前內引物FIP的序列為 GAGCATTTCCATACATGGTCCC GAGGAATGCGACCAACACATCSeq ID No. 3Seq ID No. 4所述后內引物BIP的序列為 CAAGTTCCAAGATGCCTGTCGTTTTCTTGATTCCATCCATCCCAC Seq ID No. 5Seq ID No. 全文摘要
本發(fā)明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)的反轉錄環(huán)媒恒溫擴增(RT-LAMP)檢測方法和試劑盒，其中所用的外引物分別含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列。本發(fā)明的方法和試劑盒能夠特異性地檢測出PFRV病毒；靈敏度高，對病毒懸液中抽提核酸的檢測靈敏度為100.5TCID50。
文檔編號C12Q1/70GK102108415SQ200910189340
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權日2009年12月24日
發(fā)明者何俊強, 劉葒, 盧體康, 史秀杰, 陳紅蓮 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心