亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

狗魚幼魚彈狀病毒rt-pcr檢測方法和試劑盒的制作方法

文檔序號:575567閱讀:238來源:國知局
專利名稱:狗魚幼魚彈狀病毒rt-pcr檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及病毒的檢測方法和檢測試劑盒,特別是涉及狗魚幼魚彈狀病毒RT-PCR 檢測方法和試劑盒。
背景技術(shù)
根據(jù)國際病毒學(xué)分類委員會(International comittee on taxonomy ofviruses, ICTV)第8次報告,彈狀病毒科(lihabdoviridae)分為6個屬,包括感染植物的質(zhì)型彈狀 病毒屬(Cytorhabdovirus)和核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus),以及感染脊椎動 物的水皰性口膜炎病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)、短晳熱病毒屬 (Ephemerovirus)和短外彈狀病毒屬(也稱非毒粒蛋白彈狀病毒屬)(Novirhabdovirus), 還有部分彈狀病毒尚未分類,如Sigma virus, Flanders virus等。迄今報道感染魚類的 彈狀病毒已有十幾種,包括傳染性造血器官壞死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus, IHNV)、__個生(Viralhaemorrhagic septicemia virus, VHSV) >
(Hirame rhabdovirus, HRV) >(Snakehead rhabdovirus, SHRV)、鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)、狗魚幼魚彈狀病 毒(Pike fryrhabdovirus,PFRV)、彈狀病毒 903/87 (Rhabdovirus 903/87,903/87)、鱖魚 彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)、胭脂魚彈狀病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鮭彈狀病毒沘/97 (ka trout rhabdovirus 28/97, STRV)等(Granoff and Webster, 1999 ;張奇亞和李正秋,1999 ;Zhang et al.,2000 Johansson et al.,2001, 2002)。在ICTV第6次報告上,SVCV, PFRV被列為水皰性口膜炎病毒屬暫定種(Wurmer et al.,1995)。在ICTV第7次報告中,正式把IHNV、VHSV, HRV、SHRV列為粒外彈狀病毒屬, SVCV、PFRV等仍歸為水皰性口膜炎病毒屬的暫定種(Walker et al.,2000)。其他魚類彈狀 病毒的分類地位尚未確定。隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,魚類病毒病已成為養(yǎng)殖魚類的最大病害。由于缺乏 有效的治療方法,魚類病毒性疾病的控制以預(yù)防為主,因而病毒的診斷與檢測技術(shù)研究成 了魚類病毒研究中非?;钴S的領(lǐng)域。魚類彈狀病毒有很強(qiáng)的致病性,特別是VHSV、IHNV、 HRV, SHRV和SVCV在世界各地廣泛流行,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因而這些病 毒的流行病學(xué)備受科研工作者的關(guān)注。狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)是一種與鯉春病毒血癥病毒(SVCV)同源性很高的病 毒,目前還未引起人們高度重視。PFRV主要在歐洲狗魚幼魚中流行(Wolf,1988)。1972年 該病毒在荷蘭感染狗魚幼魚,引起大規(guī)模死亡,第一株P(guān)FRV從此批患病的狗魚幼魚中分離 出來(De Kinkelin, 1973) ο PFRV與SVCV親緣關(guān)系最近,G蛋白的同源性> 70%。對PFRV、 SVCV及與它們血清學(xué)相關(guān)的魚類彈狀病毒G蛋白部分核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果 顯示它們形成4個基因型,PFRV和SVCV分別形成一個基因型,分別為基因型III和I,其他 病毒形成基因型II和IV (Stone et al. , 2003) 0 SVC主要感染鯉科魚類,被世界動物衛(wèi)生 組織列為必須申報的疾病,中國農(nóng)業(yè)部將SVC列為二級動物疫病。隨著對SVC的日益重視,對SVCV監(jiān)控力度的加大,這些與SVCV親緣關(guān)系高的病毒也將會越來越引起人們的重視。因 而尋找特異、靈敏快速的檢測方法,對于防控疾病的發(fā)生和發(fā)展十分關(guān)鍵。在中國,魚類病毒SVCV已經(jīng)引起人們高度的重視,并于每年春秋兩季對全國鯉魚 進(jìn)行SVCV監(jiān)測。但是與SVCV親緣關(guān)系很高的魚類病毒PFRV目前還沒有引起人們的重視, 沒有納入檢測的范圍。隨著與這2種病毒血清學(xué)相關(guān)的病毒相繼分離(Ahne,1975 ;Ahne et al. ,1982 ;Fijan et al. ,1984 ;Ahne and Thomsen,1986 ;Haenen and Davidse,1989 ; Jorgensen et al. ,1989;Rowley et al. ,2001 ;Stone et al. ,2003 ;Way et al. ,2003), 人們對這些病毒的關(guān)注會越來越多。因而需要建立切實(shí)可行的檢測方法。目前,鑒定PFRV及與其血清學(xué)相關(guān)的病毒一般采取先用敏感細(xì)胞分離,然后用血 清學(xué)方法鑒定的方式(De Kinkelin, 1973 ;Ahne, 1975 ;Ahne etal. , 1982 ;Fijan et al., 1984 ;Ahne and Thomsen, 1986 ;Haenen and Davidse,1989 ;Jorgensen et al. , 1989 ; Rowley et al.,2001 ;Stone et al.,2003 ;Way et al. ,2003) 采用這種檢測方式不僅周 期長,而且使用免疫學(xué)方法,如間接熒光抗體試驗(yàn)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),PFRV與SVCV之間 存在交叉反應(yīng)(J0gensen et al.,1989 ;Way,1991),檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。在除狗魚幼魚外的 其他魚種類中分離到的一些彈狀病毒與PFRV血清學(xué)同源性很高,開始被認(rèn)為是PFRV,但測 定其部分G基因核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),這些序列與PFRV相應(yīng)序列的差異足夠 大以至于可以歸類于不同的基因型(Rowley et al.,2001 ;Stone et al.,2003)。因此,迫 切需要建立分子生物學(xué)方法對PFRV進(jìn)行檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種狗魚幼魚彈狀病毒的RT-PCR檢 測方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種狗魚幼魚彈狀病毒的檢測試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)的RT-PCR檢測 方法,所述方法包括利用特異性引物對,以病毒基因組RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),所述弓I 物對為能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對,并且所述引物對選自以下 中的至少一組a 分別含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對;Seq ID No. 1 :5’ 一AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’Seq ID No. 2 5' —ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT—3’b 分別含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示序列的引物對,Seq ID No. 3 5' —GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’Seq ID No. 4。5,一GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC—3,。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述引物對選自以下中的至少一組c 具有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對;d 具有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示序列的引物對。本發(fā)明的RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄及PCR優(yōu)選在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,所述在同一反應(yīng)體 系中進(jìn)行是指將傳統(tǒng)的兩步法RT-PCR改成一次性加入試劑,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)的一步法。所述RT-PCR的反應(yīng)體系中,Mg2+終濃度優(yōu)選為1. 6mM/L 3. 6mM/L,更優(yōu)選2. ImM/ L 2. 6mM/L ;dNTP終濃度優(yōu)選為0. 2mM/L 0. 4mM/L,更優(yōu)選0. 4mM/L ;引物終濃度優(yōu)選為 0. 05mM/L 1. OmM/L,更優(yōu)選0. 25mM/L ;退火溫度優(yōu)選為50°C 65°C,更優(yōu)選55°C。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中,所述RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄30min,94°C 預(yù)變性鈿化,35個循環(huán)94°C變性50s,在所述退火溫度下退火50s,72°C延伸lmin,35個循 環(huán)后72°C延伸IOmin0本發(fā)明開公開了狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus, PFRV)的檢測試劑 盒,所述試劑盒含有能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對,所述引物對 選自以下中的至少一組a 分別含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對;Seq ID No. 1 :5’ 一AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’Seq ID No. 2 5' —ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT—3’b 分別含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示序列的引物對,Seq ID No. 3 5' —GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’Seq ID No. 4。5' —GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC—3 ‘ 優(yōu)選的,所述引物對選自以下中的至少一組c 具有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對;d 具有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示序列的引物對。由于采用了以上技術(shù)方案,使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明的檢測方法和試劑盒使用特異性引物對PFRV進(jìn)行檢測,所用的兩對引物 均具有很好的引發(fā)特性,其在比較寬的Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度和退火溫度范圍內(nèi)均 能很好的引發(fā)模板擴(kuò)增,且當(dāng)PFRV核酸模板為IO35 TCID5tlA). lmL,擴(kuò)增25個循環(huán)產(chǎn)物濃度 已經(jīng)達(dá)到檢測要求。本發(fā)明建立的RT-PCR檢測方法具有很好的特異性,檢測魚類彈狀病毒 HRV, IHNV, VHSV, SVCV和其他常見魚類病毒IPNV、VNNV的結(jié)果均為陰性;具有較高的靈敏 度,檢測病毒懸液抽提核酸的靈敏度均達(dá)102_ 5TCID5qij


圖1為Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果的電泳圖像,1 =Marker DL2000 ;2 1. 6mM/L ;3 2. ImM/L ;4 2. 6mM/L ;5 3. ImM/L ;6 3. 6mM/L ; 7 :Negative control。圖2為dNTP濃度優(yōu)化結(jié)果的電泳圖像,1 =Marker DL2000 ;2 0. 2mM/L ;3 0. 25mM/L ;4 0. 3mM/L ;5 0. 35mM/L ;6 0. 4mM/ L;7 :Negative control。圖3為引物濃度優(yōu)化結(jié)果的電泳圖像,1 =Marker DL2000 ;2 1. 0mM/L ;3 0. 75mM/L ;4 0. 5mM/L ;5 0. 25mM/L ;6 0.15mM/L;7 0.ImM/L ;8 0.05mM/L ;9 Negative control。圖4為退火溫度優(yōu)化結(jié)果的電泳圖像,2-5 :F1/R1 ;7-10 :F2/R2 ; 1,6,11 :Marker DL2000 ;2, 7 50 "C ;3,8 55 "C ;4,9 600C ;5,10 :65°C。圖5為反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果的電泳圖像,2-6 :F1/R1 ;8-12 :F2/R2 ;1,7,13 =Marker DL2000 ;2,8 25 ;3,9 30 ;4,10 35 ;5, 11 40 ;6,12 :45。圖6為引物特異性的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖像,2-10 :F2/R2 ;12-20 :F1/R1 ;1,11 :DL2000 ;2,12 =IHNV ;3,13 =IPNV ;4,14 VHS V ;5,15 =HRV ;6,16 =VNNV ;7,17 :SSS0604 ;8,18 :9701 ;9,19 =PFRV ;10,20 =Negative control ο圖7為引物靈敏度結(jié)果的電泳圖像,1 =Marker DL2000 ;2 10° ;3 10-1 ;4 :1(Γ2 ;5 :1(Γ3 ;6 :1(Γ4 ;7 =Negativecontrol
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11材料和方法1.1病毒和細(xì)胞系PFRV為F4株,由中國科學(xué)院水生生物研究所贈送,SVCV和IHNV參考株由英國 CEFAS的OIE參考實(shí)驗(yàn)室B. Hill教授惠贈;VHSV參考株由挪威國家獸醫(yī)研究所OIE參考實(shí) 驗(yàn)室Roar Gudding博士惠贈、IPNV、HRV、VNNV由本室分離。IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV 和 PFRV 分別用 EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、 FHM和BF-2細(xì)胞擴(kuò)增。SSN-I細(xì)胞購自泰國Kasetsart大學(xué)水生動物健康研究所,RTG-2 細(xì)胞由水生生物研究所贈送,BF-2細(xì)胞由檢疫研究所(布雷西亞)細(xì)胞保藏中心贈送, CHSE-214細(xì)胞、EPC細(xì)胞由英國環(huán)境、漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)研究中心贈送、FHM細(xì)胞由德國 慕尼黑大學(xué)和中國科學(xué)院水生生物研究所贈送,CO細(xì)胞由中國科學(xué)院水生生物研究所贈 送。EPC、C0、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2細(xì)胞均用含10%胎牛血清的199培養(yǎng)液培 養(yǎng),SSN-I細(xì)胞用含10% FBS的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種病毒后,用加抗生素(100IU/mL青 霉素;100 μ g/mL鏈霉素)的相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)。1. 2設(shè)備、試劑和培養(yǎng)基設(shè)備PCR儀(T3,Biometra),恒溫培養(yǎng)箱(Binder,德國產(chǎn)),凝膠成像儀(BDA TIl 型,Biometra)。試劑Taq DNA聚合酶、dNTP、EB和DEPC購于上海生物工程技術(shù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄 酶、RNA酶抑制劑和DNA Marker購于大連寶生物工程有限公司;199和L-15為Gibco公司 產(chǎn)品;其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用水均為DEPC處理水,實(shí)驗(yàn)器皿均經(jīng)過高溫滅菌2次。199培養(yǎng)液取一袋199培養(yǎng)基粉劑(GIBCO)加入900mL去離子水,充分?jǐn)嚢?,直?無不溶性物質(zhì)為止,加入IOOmL滅活的胎牛血清,將總體積調(diào)至IOOOmL,攪勻,加入NaHCO3 調(diào)節(jié)PH至7. 2-7. 8,無菌過濾,分裝,-20°C保存?zhèn)溆谩?99+HEPES 在199培養(yǎng)液中加入終濃度為10% FCSU00IU/mL青霉素、100 μ g/mL 鏈霉素、0. 02M HEPES,調(diào)節(jié)pH值至7. 6 ;細(xì)胞消化液將2. 5g 胰酶,40g NaCl,2. Og KCl,5. Og 葡萄糖,2. 9g NaHCO3,1. OgEDTA依次溶解于500mL超蒸水中,待完全溶解后,過濾除菌,分裝,_20°C保存?zhèn)溆谩-15培養(yǎng)液在配置IL劑量的L-15培養(yǎng)基粉劑加入900mL去離子水,充分?jǐn)?拌,直至無不溶性物質(zhì)為止,加入IOOmL滅活的胎牛血清,將總體積調(diào)至IOOOmL,攪勻,加入 NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7. 2-7. 8,無菌過濾,分裝,_20°C保存?zhèn)溆谩?.3引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank 中 PFRV G 基因(AJ538069)序列,使用 Primer Premier5. 0 軟件設(shè) 計(jì)2對引物。并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST驗(yàn)證引物序列特異性后,由上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。表IPFRV RT-PCR 引物
權(quán)利要求
1.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的RT-PCR檢測方法,所述方法 包括利用特異性引物對,以病毒基因組RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),其特征在于所述引物 對為能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對,并且所述引物對選自以下中 的至少一組a 分別含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對; Seq ID No. 1 :5’ 一AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’ Seq ID No. 2 :5’ 一ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT—3’ b:分別含有^^ ID No. 3和^^ ID No. 4所示序列的引物對, Seq ID No. 3 :5’ 一GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’ Seq ID No. 4。5,一GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC—3,。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于所述引物對選自以下中的至少一組c 具有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對; d:具有kq ID No. 3和^^ ID No. 4所示序列的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法,其特征在于所述RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄及PCR在 同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法,其特征在于所述RT-PCR的反應(yīng)體系中,Mg2+終濃 度為1. 6mM/L 3. 6mM/L, dNTP終濃度為0. 2mM/L 0. 4mM/L,引物終濃度為0. 05mM/L 1. OmM/L,退火溫度為50°C 65°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法,其特征在于所述RT-PCR的反應(yīng)體系中,Mg2+終 濃度為2. ImM/L 2. 6mM/L, dNTP終濃度為0. 4mM/L,引物終濃度為0. 25mM/L,退火溫度為 55 °C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測方法,其特征在于所述RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)?2°C 反轉(zhuǎn)錄30min,94°C預(yù)變性%iin,35個循環(huán)94°C變性50s,在所述退火溫度下退火50s, 72°C延伸lmin,;35個循環(huán)后72°C延伸IOmin0
7.狗魚幼魚彈狀病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的檢測試劑盒,其特征在于所 述試劑盒含有能擴(kuò)增出狗魚幼魚彈狀病毒G基因的基因片段的引物對,所述引物對選自以 下中的至少一組a 分別含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對; Seq ID No. 1 :5’ 一AGTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’ Seq ID No. 2 :5’ 一ATGTTATCTCTTCCCTTCGATTGAT—3’ b 分別含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示序列的引物對, Seq ID No. 3 :5’ 一GTTGTCGTACATCCTGTTCATTTAG—3’ Seq ID No. 4。5,一GTGCAAGCTCTCCTTTTTTCTC—3,。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒,其特征在于所述引物對選自以下中的至少一組c 具有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示序列的引物對; d:具有kq ID No. 3和^^ ID No. 4所示序列的引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)的RT-PCR檢測方法和試劑盒。本發(fā)明的檢測方法和試劑盒使用特異性引物對PFRV進(jìn)行檢測,引物具有很好的引發(fā)特性,具有較寬的Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度和退火溫度范圍,本發(fā)明建立的RT-PCR檢測方法具有很好的特異性,具有較高的靈敏度,檢測病毒懸液抽提核酸的靈敏度均達(dá)102.5TCID50。
文檔編號C12Q1/68GK102108416SQ20091018934
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者何俊強(qiáng), 蘭文升, 劉葒, 葉奕優(yōu), 陳紅蓮 申請人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
1