專利名稱：Hgfr的高親和力結(jié)合位點(diǎn)和鑒定其拮抗劑的方法
HGFR的高親和力結(jié)合位點(diǎn)和鑒定其拮抗劑的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)蛋白質(zhì)的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及鑒 定HGFR與其配體即肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的高親和力結(jié)合位點(diǎn)以及鑒定以HGFR的高 親和力結(jié)合位點(diǎn)為靶的HGFR拮抗劑的方法。發(fā)明背景肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(還已知為Met)是一種酪氨酸激酶，并是c-met原癌基因的產(chǎn) 物。它由一個(gè)50kDa的a亞基和一個(gè)145kDa的p亞基組成，它們由一個(gè)二硫鍵連接，a 亞基完全在細(xì)胞外，而P亞基包括(從N端至C端)一個(gè)胞外區(qū)、 一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞質(zhì) 酪氨酸激酶區(qū)。成熟的a/p雜二聚受體是由170kDa的單鏈前體通過(guò)蛋白水解加工和末端 糖基化而生成的。HGF，還被稱為擴(kuò)散(Scatter)因子，它是具有廣鐠生物活性包括細(xì)胞增殖、游動(dòng)、 存活和形態(tài)形成的肝素結(jié)合糖蛋白。它以無(wú)活性的單鏈前體(原-HGF)形式合成和分泌， 由于其與蛋白聚糖具有高親和力而儲(chǔ)存在細(xì)胞外基質(zhì)中。原-HGF經(jīng)過(guò)在殘基R494-V495 的蛋白裂解得到生物活性形式即二硫鍵連接的a/|3雜二聚體，其中a鏈由N端區(qū)域和隨 后的四個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域組成，p鏈與絲氨酸蛋白酶的糜蛋白酶家族具有結(jié)構(gòu)同源性。但 是，由于形成絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)特征的三個(gè)關(guān)鍵殘基中的兩個(gè)在HGF中是非保守 的，因此p鏈缺乏蛋白水解活性。盡管其不能產(chǎn)生信號(hào)，但是原-HGF仍以高親和力與 Met結(jié)合并且取代了活性HGF。近來(lái)，許多結(jié)構(gòu)-功能方面的研究已經(jīng)顯示HGF和Met的細(xì)胞外部分間具有相互作用。Met胞外區(qū)具有模塊化結(jié)構(gòu)，包含三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域跨越蛋白質(zhì)N端的前500個(gè)殘 基并且具有一個(gè)七面的p螺旋槳結(jié)構(gòu)的Sema結(jié)構(gòu)域(還在信號(hào)素和plexins中出現(xiàn))、覆 蓋大約50個(gè)殘基并且含有四個(gè)保守的二硫鍵的PSI結(jié)構(gòu)域(還在Plexins、信號(hào)素和整聯(lián) 蛋白中出現(xiàn))、和連接PSI結(jié)構(gòu)域和跨膜螺旋并且被四個(gè)IPT結(jié)構(gòu)域(在Plexins和轉(zhuǎn)錄因 子中出現(xiàn)的免疫球蛋白相關(guān)區(qū))占據(jù)的其它400個(gè)殘基。HGF是二價(jià)配體，在a鏈含有一個(gè)Met的高親和力結(jié)合位點(diǎn)和在|3鏈含有一個(gè)低親和力結(jié)合位點(diǎn)。HGF的生物活性需要a和p鏈之間的共同作用；而a鏈，更精確的說(shuō) N端結(jié)構(gòu)域和第一個(gè)kringle，對(duì)于Met的結(jié)合是足夠的，|3鏈對(duì)于Met活化是必需的。Met的SEMA和PSI結(jié)構(gòu)域與HGF的p鏈的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的解析(參見(jiàn)例如 WO-A-2005/108424)揭示了 HGF的低親和力結(jié)合位點(diǎn)位于卩螺旋槳的面2-3,并且HGF-(3 與Met結(jié)合的部分正是絲氨酸蛋白酶用來(lái)與其底物或抑制劑結(jié)合的相同區(qū)域。重要的是， 2.53 A解析度的HGF p鏈晶體結(jié)構(gòu)的確定和特異的突變分析揭示了與Met和HGF |3鏈 活性口袋結(jié)合有關(guān)的殘基僅在原-HGF的蛋白水解轉(zhuǎn)變后暴露出來(lái)，從而解釋了為何原 -HGF以高親和力與Met結(jié)合而不激活它。盡管從結(jié)構(gòu)上和功能上明確了 HGF的卩鏈和 Met的Sema結(jié)構(gòu)域之間的低親和力的相互作用，但是此時(shí)還不清楚Met的哪個(gè)區(qū)域與 HGF的a鏈以高親和力結(jié)合。因此，HGF活化Met的主要機(jī)制還沒(méi)有被充分了解?？紤] 到此途徑極大的生物學(xué)和治療學(xué)重要性，還是讓人驚訝的。HGF-Met信號(hào)傳導(dǎo)在胚胎發(fā)生和成人生命中的組織再生中是十分重要的。重要的 是，解除管制的HGF-Met的信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。不同機(jī)制包括自 分泌HGF刺激、受體過(guò)表達(dá)、基因擴(kuò)增和點(diǎn)突變導(dǎo)致的不適當(dāng)?shù)腗et活化在多種人惡性 肺瘤中出現(xiàn)并且與預(yù)后不良有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)HGF-Met信號(hào)途徑作為癌癥治療靶 點(diǎn)的興趣不斷增長(zhǎng)，從而導(dǎo)致了多種Met/HGF抑制劑的開(kāi)發(fā)。包括以Met激酶活性為靶、 中和抗Met或抗HGF抗體、誘餅受體和HGF衍生因子的小分子化合物。但是，這些分 子是否以與HGF的高親和力結(jié)合位點(diǎn)為靶和在HGF與Met以高親和力結(jié)合基礎(chǔ)上的精 確分子機(jī)制是什么都還不清楚。這可能阻礙了分離出更有選擇性、敏感性增強(qiáng)和更少副 作用的治療藥物。Met和HGF的高親和力結(jié)合位點(diǎn)的精確知識(shí)一定會(huì)有助于設(shè)計(jì)出高度 特異性的Met拮抗劑。發(fā)明內(nèi)容因此需要摸索能夠鑒定具有敏感性增強(qiáng)和較少副作用的Met拮抗劑的改良方法來(lái)開(kāi) 發(fā)治療癌癥的更有效治療策略。本發(fā)明的目的是提供這種改良的方法。由于該技術(shù)方案具有在隨后權(quán)利要求中特定的特征而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。權(quán)利要 求形成了本文中提供的與本發(fā)明有關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)的整體。因此，本發(fā)明的目的是鑒定對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)具有HGF高親和力的結(jié) 合位點(diǎn)，即HGFR的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供鑒定HGFR 拮抗劑的方法，所述的拮抗劑靶向?qū)GF具有高親和力的HGFR結(jié)合位點(diǎn)以開(kāi)發(fā)治療癌 癥的新治療策略。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含或編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體胞外至少 IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的多肽或多核苷酸用來(lái)篩選和/或開(kāi)發(fā)在癌癥特別是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 受體活性失調(diào)的癌癥治療中有用的藥理學(xué)上有效的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥理學(xué)上有效的藥物是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抑制劑和/或拮抗 劑，并且可以選自小分子抑制劑、適體、反義核苷酸、基于RNA的抑制劑、siRNAs、 抗體、肽、顯性負(fù)性因子。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)待測(cè)藥物作為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的拮抗劑 /抑制劑在癌癥優(yōu)選肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體活性失調(diào)的癌癥治療中有效的能力的方法，包含 以下步驟(a) 將待測(cè)藥物與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的至少胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域或至少表達(dá) 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞接觸，(b) 檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的活性、功能、穩(wěn)定性和/或表達(dá)，和(c) 選擇能降低肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體活性、功能、穩(wěn)定性和/或表達(dá)的藥物。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域作為治療癌癥的藥物的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明將在一些相關(guān)優(yōu)選實(shí)施方案中通過(guò)非限制性的實(shí)施例參考附圖詳細(xì)描述，其中

圖1顯示了 Met和HGF子域的基因工程和純化。(A) ^9f究中使用的基因工程蛋白 質(zhì)的圖示。左圖基因工程受體。W.T.MET,野生型Met; EXTRA,胞外部分；INTRA, 胞內(nèi)部分；SP，信號(hào)肽；SEMA,信號(hào)素同源結(jié)構(gòu)域；PSI, plexin-信號(hào)素-整聯(lián)蛋白同源 結(jié)構(gòu)域；IPT1-4,免疫球蛋白-plexin-轉(zhuǎn)錄因子同源結(jié)構(gòu)域l-4; TM,跨膜區(qū)；JM,近膜 區(qū)；KD,激酶結(jié)構(gòu)域；CT, C末端尾部；E, FLAG或MYC表位；H，多組氨酸標(biāo)簽。5紅色三角表示在a和p鏈之間的蛋白裂解位點(diǎn)。右圖基因工程配體。W.T. HGF,野生 型HGF; ND, N端結(jié)構(gòu)域；K 1-4， kringle 1-4; PLD，類蛋白水解酶結(jié)構(gòu)域；UNCL. HGF, 不可斷裂的HGF。星號(hào)表示在蛋白水解位點(diǎn)的R494Q氨基酸置換。(B)親和純化的受體 和配體的考馬斯亮藍(lán)染色。每個(gè)蛋白質(zhì)組(Sema、 Sema-PSI、誘斜Met; PSI-IPT、 IPT; HGF-a、不可斷裂的HGF、 HGF; HGFNK1、 HGF-(3)都在非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE 分離并且根據(jù)牛血清清蛋白(BSA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量。MW，分子量標(biāo)記；kDa,千道爾 頓。圖2顯示了 HGF-Met相互作用的ELISA分析。(A) Met子域和活性HGF的結(jié)合。 基因工程受體固定至固相上且與液相中增加濃度的活性HGF接觸。使用抗HGF抗體來(lái) 顯示結(jié)合。非特異性結(jié)合通過(guò)在固相上使用BSA代替純化的受體來(lái)檢測(cè)。(B、 C、 D)誘 餅Met、 Sema-PSI和IPT與不同形式的HGF的結(jié)合?；蚬こ淌荏w固定至固相上且與液 相中增加濃度的MYC標(biāo)記的活性HGF、原-HGF、 HGF-a或HGF NK1接觸。使用抗 MYC抗體來(lái)顯示結(jié)合。非特異性結(jié)合通過(guò)在液相中使用MYC標(biāo)記的人血管抑素 (angiostatin) (AS)來(lái)檢測(cè)。圖3顯示了 IPT結(jié)構(gòu)域3和4與HGF-a以高親和力充分結(jié)合。(A)缺失IPT變異體 的圖示。顏色代碼和圖例同圖1A。 (B) IPT變異體和HGF-a之間相互作用的ELISA分析。 基因工程IPTs固定至固相上且與液相中增加濃度的HGF-a接觸。使用抗HGF抗體來(lái)顯 示結(jié)合。圖4顯示了在活細(xì)胞中IPT結(jié)構(gòu)域3和4與HGF的充分結(jié)合。(A)缺失MetA25-741 受體的圖示。顏色代碼和圖例同圖1A。 (B)表面生物素化分析。使用靶向于Met C末端 部分的抗體免疫沉淀(IP)細(xì)胞蛋白質(zhì)且通過(guò)使用辣根過(guò)氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素(SA) 的蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)來(lái)分析。相同的點(diǎn)用抗Met抗體再次探測(cè)。W.T.，野生型；A549， A549人肺癌細(xì)胞；MDA, MDA-MB-435人黑色素瘤細(xì)胞；TOV, TOV-112D人卵巢癌 細(xì)胞；Empty V.，空載體。P170條帶對(duì)應(yīng)于未加工的Met; p145是受體的成熟形式。(C) 化學(xué)交聯(lián)分析。表達(dá)MetA25.741 (Met A25-741)的TOV-112D細(xì)胞和野生型TOV-112D細(xì)胞 (W.T. TOV)與HGF —起培養(yǎng)，然后進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。使用抗Met抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物 并且通過(guò)使用抗HGF抗體的蛋白質(zhì)免疫印跡法分析。箭頭指示HGF-MetA25.741復(fù)合物。 (D) Met磷酸化分析。表達(dá)MetA25-74i的TOV-112D細(xì)胞用作為陰性對(duì)照的1%FBS和用相同量的HGF、原-HGF、 HGF NK1或NK1-NK1進(jìn)行刺激。受體磷酸化通過(guò)使用抗Met 抗體的免疫沉淀和使用抗磷酸酪氨酸(抗pTyr)的抗體的蛋白質(zhì)免疫印跡法來(lái)確定。湘同 的點(diǎn)使用抗Met抗體再次探測(cè)。箭頭指示對(duì)應(yīng)于MetA25.741或免疫球蛋白(Ig)的條帶。(E) NK1-NK1的圖示。從N至C末端SP,信號(hào)肽；ND, N端結(jié)構(gòu)域；Kl, kringle 1; H， 多組氨酸標(biāo)簽。圖5顯示了可溶性IPT在體外抑制HGF誘導(dǎo)的侵襲性生長(zhǎng)。(A)慢病毒栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)的 MDA-MB-435細(xì)胞用重組HGF刺激且Met磷酸化通過(guò)使用抗磷酸酪氨酸抗體的免疫印 跡法來(lái)確定(上圖)。相同的點(diǎn)使用抗Met抗體再次探測(cè)(下圖)。Empty V.,空載體。(B)分 支形態(tài)發(fā)生檢測(cè)。預(yù)制備的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435細(xì)胞的球狀體埋入膠原蛋白 中然后用重組HGF刺激以形成分支小管。膠原蛋白侵襲通過(guò)從每個(gè)球狀體中芽殖的小管 的平均數(shù)計(jì)數(shù)來(lái)定量。EV,空載體；DM,誘餅Met; SP, Sema-PSI。 (C)B中描述的實(shí) 驗(yàn)獲得代表圖。放大倍數(shù)200X。圖6顯示了可溶性IPT在小鼠中顯示出抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性。CD-1 nu-A小鼠皮下注 射慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435細(xì)胞，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。(A)腫瘤潛伏期的 Kaplan-Meiler樣曲線(X軸，以天為單位的時(shí)間；Y軸，無(wú)腫瘤動(dòng)物的百分?jǐn)?shù))。Emptyv., 空載體。(B)隨時(shí)間變化的平均肺瘤體積。(C)腫瘤切片使用抗FLAG抗體的免疫組織 化學(xué)分析。放大倍數(shù)400X。 (D)肺瘤血管分析。腫瘤切片用抗Von Willebrand因子抗 體染色。腫瘤切片的每平方毫米的血管的數(shù)量通過(guò)顯微鏡檢查來(lái)確定。EV，空載體；DM, 誘餅Met; SP, Sema-PSI。 (E)轉(zhuǎn)移發(fā)生率分析。尸檢后，通過(guò)顯微鏡檢查來(lái)分析連續(xù)肺 切片以確定微小轉(zhuǎn)移的存在。轉(zhuǎn)移發(fā)生率-即總數(shù)中具有轉(zhuǎn)移的小鼠的數(shù)量-以百分?jǐn)?shù)(條) 和分?jǐn)?shù)(條末端)兩種方式顯示。(F)空載體組中獲得微小轉(zhuǎn)移的的代表圖。肺切片用蘇木 精和伊紅染色。虛線區(qū)分了血管壁(vs)。轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(mc)可以在血管內(nèi)作為栓子或在薄壁 組織中發(fā)現(xiàn)。放大倍數(shù)400X。本發(fā)明中公布的數(shù)據(jù)說(shuō)明HGF的a鏈以高親和力結(jié)合于Met的IPT區(qū)域，并且這與 配體的蛋白水解過(guò)程無(wú)關(guān)。它們還說(shuō)明雖然配體的無(wú)活性和活性形式之間沒(méi)有區(qū)別，但 是與缺少Sema結(jié)構(gòu)域的Met跨膜IPT結(jié)合的HGF足以將激活受體的信號(hào)來(lái)傳遞至胞質(zhì) 激酶結(jié)構(gòu)域。最后，它們提供了來(lái)源于Met的IPT區(qū)域和Sema結(jié)構(gòu)域的基因工程蛋白 質(zhì)能夠在體外和體內(nèi)均中和HGF的原侵襲(pro - invasive)活性的證據(jù)。7人們?cè)缇椭繦GF是二價(jià)因子。早期蛋白質(zhì)基因工程研究鑒定了 HGF的N端結(jié)構(gòu) 域和第一個(gè)kringle上的一個(gè)高親和力Met結(jié)合位點(diǎn)。隨后，生物化學(xué)和生物分析結(jié)合說(shuō) 明HGF絲氨酸蛋白水解酶樣結(jié)構(gòu)域(p鏈)，雖然對(duì)于結(jié)合不是必需的，但是在介導(dǎo)受體 激活上起關(guān)鍵作用。最近，詳細(xì)的結(jié)晶和突變數(shù)據(jù)充分在結(jié)構(gòu)上和功能上確定了 HGF (3 鏈上的低親和力Met結(jié)合位點(diǎn)以及其與Met的Sema結(jié)構(gòu)域的相互作用。HGF的a鏈和 Met間的接觸面仍是未知的。小角度X射線散射和低溫電子顯微鏡研究顯示了 HGF的N 末端和第一個(gè)kringle區(qū)域和Met的Sema結(jié)構(gòu)域之間的接觸的存在。但是，等離子共振 分析揭示這一相互作用具有非常低的親和力(大約比HGF-卩和Sema間低2倍，比HGF-a 和完整受體間低100倍)。由于這種弱相互作用本身不能說(shuō)明HGF和Met之間的緊密結(jié) 合，因此Met上的高親和力HGF結(jié)合位點(diǎn)仍需要鑒定。這里出現(xiàn)的結(jié)果有助于彌補(bǔ)這個(gè)缺口并且說(shuō)明這一漫長(zhǎng)搜索的HGF結(jié)合位點(diǎn)位于 Met的IPT區(qū)域并且更精確的說(shuō)在接近細(xì)胞膜的最后兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域中。本發(fā) 明中提供的幾個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)證據(jù)說(shuō)明了這一事實(shí)。首先， 一個(gè)只含有四個(gè)IPT結(jié)構(gòu)域(IPT) 的可溶性的缺失Met受體以基本上與Met的全部胞外部分相同的親和力與HGF結(jié)合。相 反，Sema顯示了對(duì)HGF非常低的親和力。第二， IPT以不變的強(qiáng)度與活性HGF、原-HGF 或HGF-a結(jié)合。第三，缺失IPT1和IPT2不影響IPT與任何形式的HGF的親和力。第 四，在對(duì)應(yīng)于Sema結(jié)構(gòu)域、PSI模塊和前兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的外功能區(qū)上具有的 大量缺失的基因工程Met受體(MetA2w41)保持與HGF結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶激活的信號(hào)至細(xì)胞 內(nèi)部的能力，盡管其不能區(qū)別活性HGF和原-HGF。最后，已知二聚形式的HGFNK1含 有HGF-a的最小Met結(jié)合區(qū)，雖然不比HGF更有效，但它能夠以同樣效率引發(fā) MetA25-741的活化，，因此鑒定出IPT 3-4是HGF NK1結(jié)合位點(diǎn)。雖然這些數(shù)據(jù)指出了 IPT在HGF結(jié)合中的關(guān)鍵作用，但值得注意的是兩個(gè)在Met 的胞外部分的前期結(jié)構(gòu)/功能研究未能鑒定出在這一區(qū)域的任何配體結(jié)合位點(diǎn)。Met外功 能區(qū)圖譜的第一個(gè)圖說(shuō)明根據(jù)ELISA檢測(cè)Sema結(jié)構(gòu)域?qū)τ贖GF結(jié)合是必需且足夠的。 第二個(gè)研究分析了 Sema結(jié)構(gòu)域在受體二聚體形成中的作用，并且說(shuō)明在Sema結(jié)構(gòu)域中 含有缺失的Met胞外部分的基因工程形式不能共沉淀HGF。本發(fā)明還證明當(dāng)Met的胞外部分用作生物技術(shù)工具來(lái)抑制HGF誘導(dǎo)的侵襲性生長(zhǎng)時(shí) 也觀測(cè)到了 Sema和IPT間的協(xié)同作用。在體外分析和小鼠移植中，IPT和Sema-PSI可溶性蛋白質(zhì)均顯示了顯著抑制作用。但是，它們均不能達(dá)到包含低親和力和高親和力HGF 結(jié)合位點(diǎn)的全長(zhǎng)Met外功能區(qū)所顯示的強(qiáng)大抑制作用。這暗示這兩種相互作用均有助于 調(diào)控Met活性。雖然已確定HGF-p-Sema接觸為治療靶點(diǎn)，這里出現(xiàn)的結(jié)果揭示了 一個(gè) 提供藥物干預(yù)機(jī)會(huì)的第二接觸面。代替真正的HGF結(jié)合于IPT區(qū)域的重組蛋白質(zhì)或抗體 具有作為Met的高度竟?fàn)幮砸种苿┯脕?lái)治療HGF/Met依賴的癌癥的用途。材料和方法蛋白質(zhì)基因工程本工作中描述的可溶性或跨膜受體和基因工程配體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR和基因工程技術(shù)獲 得。所有因子在N末端保留其親代蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列。可溶性Met蛋白質(zhì)的M酸(aa) 序歹寸(基因庫(kù)編號(hào)X54559)對(duì)應(yīng)aa 1-24 (信號(hào)肽)力口誘餅Met, aa 25-932; Sema， aa 25-515; Sema-PSI， aa 25-562; PSIIPT， aa 516-932; IPT, aa 563-932; IPTA1, aa 657-932; IPTA1-2, aa 742-932; IPT-3， aa 742-838; IPT-4， aa 839-932。在每個(gè)分子的C末端加上 一個(gè)雙FLAG(SDYKDDDDK — SEQ ID No.: 19)或單MYC(EQKLISEEDLN — SEQ ID No.: 20)表位序列和一個(gè)多組氨酸標(biāo)簽(HHHHHHH - SEQ ID No.: 21)來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)和純 化?？缒せ蚬こ蘉etA25-741除了缺失區(qū)域(aa25-741)外與野生型Met是相同的。基因 工程HGF蛋白質(zhì)的氨基^列(基因庫(kù)編號(hào)M73239)對(duì)應(yīng)aa 1-31 (信號(hào)肽)加HGF, aa 32-728; HGF-a， aa 32-473; HGFNK1, aa 32-205; HGF-卩，aa 495-728。在C末端加入 以上MYC或FLAG表位和多組氨酸標(biāo)簽。不可斷裂的HGF之前已有描述(Mazzone, M. 等人(2004) J Clin Invest 114(10), 1418-1432)。 NK1-NK1是HGF NK1的二聚體形式，由 相同的HGF N末端區(qū)域串聯(lián)重復(fù)組成(aa 1 -205直接與aa 32-205連接沒(méi)有間隔區(qū))。編碼 所有基因工程蛋白質(zhì)的 cDNAs 亞克隆至慢病毒轉(zhuǎn)移載體 pRRLsin.PPT.CMV.eGFP.Wpre(SEQ ID No.: l)以代替Follenzi, A.等人(2000) Nat Genet. 25(2)， 217-222所公開(kāi)的g& cDNA。 GFP編碼序列被以下cDNAs代替誘飾met FLAG, his (SEQ ID No.: 2)、 Sema FLAG, his (SEQ ID No.: 3)、 Sema-PSI FLAG, his (SEQ ID No.: 4)、 PSI-IPT FLAG his (SEQ ID No.: 5)、 IPT FLAG, his (SEQ ID No.: 6)、 IPT M FLAG, his (SEQ ID No.: 7)、 IPT △ 1-2 FLAG, his (SEQ ID No.: 8)、 IPT 3 FLAG, his (SEQ ID No.: 9)、 IPT 4 FLAG, his (SEQ ID No.: 10)、 Met A25-741 (SEQ ID No.: 11)、 HGF MYC his (SEQ ID No.:12)、 HGF-a MYC his (SEQ ID No.: 13)、 HGF-NK1 MYC his (SEQ ID No.: 14)、 HGF-|3 MYC his (SEQ ID No.: 15)、不可斷裂的HGF MYC his (SEQ ID No.: 16)、 NKl陽(yáng)NKl his (SEQ ID No.: 17)、血管抑素MYC his (SEQ ID No.: 18)。 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)從無(wú)血清的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435人黑色素瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中收集 所有基因工程受體和因子。因子純化通過(guò)固定化金屬親和層析進(jìn)行，如前描述于Michieli P.等人(2002) Nat Biotechnol. 20(5)， 488-495。原-HGF轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訦GF通過(guò)用2-10% FBS(Sigma, St. Louis, Missouri)在37。C培養(yǎng)純化的原-HGF (最大濃度100 ng4U)24小時(shí)來(lái) 進(jìn)行。因子轉(zhuǎn)變通過(guò)使用抗HGF抗體(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)的蛋白質(zhì)免 疫印跡法來(lái)分析。用FBS進(jìn)行同樣培養(yǎng)的不可斷裂的HGF在所有檢測(cè)中用作原-HGF, 以比較活性HGF和未加工的HGF?；蚬こ膛潴w與可溶性受體的結(jié)合通過(guò)在固相中使用 FLAG-標(biāo)記的可溶性受體和在液相中使用MYC標(biāo)記的基因工程配體的ELISA來(lái)檢測(cè)。 固定濃度的純化的可溶性受體(IOO ng/孑L)吸附至96孔ELISA平板上。蛋白質(zhì)包被的平板 用增加濃度的基因工程配體孵育，用生物素化的抗HGF抗體(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)或4元MYC 4元體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)顯示結(jié)合。用 Prism軟件(Graph Pad Software, San Diego, California)分析和擬合結(jié)合數(shù)據(jù)。細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB-435人黑色素瘤細(xì)胞購(gòu)自Georgetown University Tissue Culture Shared Resource(Washington， District of Columbia)。細(xì)胞在補(bǔ)充10% FBS(Sigma)的DMEM中培 養(yǎng)。TOV-112D人卯巢癌細(xì)胞獲得自ATCC(Rockville， Maryland; ATCCN.CRL-11731),使 用補(bǔ)充15% FBS的MCDB 105培養(yǎng)基和199培養(yǎng)基的1:1混合物(都來(lái)自Sigma)培養(yǎng)。 A549人肺癌細(xì)胞也獲得自ATCC(ATCCN. CCL-185),使用補(bǔ)充10% FBS的RPMI培養(yǎng)。慢病毒載體如前描述于Follenzi， A.等人(2000) Nat Genet. 25 (2), 217-222中的方法通過(guò)293T細(xì) 胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)制備栽體儲(chǔ)存液。筒言之，用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA混合物如下制備ENV 質(zhì)粒(VSV-G), 9嗎；包裝(PACKAGING )質(zhì)粒pMDLg/pRRE 16.2嗎；REV質(zhì)粒，6.25昭； TRANSFER載體(質(zhì)粒#2-18), 37.5嗎。在TE/CaCl2溶液中稀釋所述質(zhì)粒，以最大速度 渦旋時(shí)加入HBS溶液。DNA/ CaCl2/HBS混合物立即滴加至細(xì)胞平板然后37'C培養(yǎng)。14-16小時(shí)后，換新鮮的培養(yǎng)基。換培養(yǎng)液后大約36小時(shí)收集含有載體顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。 收集后，用0.2pm孔膜過(guò)濾上清液并在-80。C儲(chǔ)存。病毒p24抗原濃度通過(guò)HIV-1 p24 core profile ELISA試劑盒(NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts)根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)來(lái) 測(cè)定。細(xì)胞使用40ng/ml p24在8ng/ml聚凝胺(Sigma)存在下如Vigna, E.和NaWini, L. (2000) J Gene Med. 2(5), 308-316中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)至六孔板(2ml培養(yǎng)基中105個(gè)細(xì)胞/孔)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約 18小時(shí)后換培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)生成隨時(shí)間監(jiān)測(cè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系然后接種至15cm 平板，長(zhǎng)至蔓延到80%并在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。72小時(shí)后，收集含有重組可溶性蛋白 質(zhì)的上清液，過(guò)濾且用親和層析純化或-30'C保存。 免疫沉淀和蛋白質(zhì)免疫印跡分析細(xì)胞裂解、免疫沉淀和蛋白質(zhì)免疫印跡分析使用提取緩沖液(EB)來(lái)進(jìn)行，如Longati， P.等人(1994) Oncogene 9 (1), 49-57所描述。使用ECL系統(tǒng)(Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey)根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)來(lái)檢測(cè)信號(hào)。用于免疫沉淀的抗Met抗體已在 Ruco， L.P.等人(1996) J Pathol. 180 (3), 266-270中描述且購(gòu)自UBI(Lake Placid, New York)。用于蛋白質(zhì)免疫印跡的抗Met抗體購(gòu)自Santa Cruz?？笷LAG抗體獲得自Sigma。 慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435細(xì)胞的Met磷酸化分析如前描述于Michieli, P.等人 (2004) Cancer Cell 6 (1)， 61-73進(jìn)行。HGF交聯(lián)和Met活化分析表達(dá)MetA25.7M的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的TOV-112D細(xì)胞使用ECL頂表面生物素化模塊試 劑盒(Amersham Biosciences)根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行表面生物素化分析。化學(xué)交聯(lián)如前描述 于Mazzone, M.等人(2004) J Clin Invest. 114 (10)， 1418-1432進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，除去細(xì)胞中 的血清生長(zhǎng)因子需要3天，然后用1 nM HGF孵育3小時(shí)。細(xì)胞裂解物使用靶向于Met C 末端部分的抗體進(jìn)行免疫沉淀，如Ruco， L.P.等人(1996) J Pathol. 180 (3), 266-270中所 述，用3-10%聚丙烯酰胺梯度SDS-PAGE分離和用抗HGF抗體(R&D)進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印 跡分析。為了進(jìn)行受體激活分析，表達(dá)MetA25_741的TOV-112D細(xì)胞用3天除去血清生長(zhǎng) 因子，然后用lnMHGF、不可斷裂的HGF、 HGF NK1或NK1-NK1刺激10分鐘。使用 EB裂解細(xì)胞，如Longati， P.等人(1994) Oncogene 9 (1), 49-57所述。細(xì)胞蛋白質(zhì)用如上 所述抗Met抗體進(jìn)行免疫沉淀且用抗磷酸酪氨酸抗體(UBI)進(jìn)行免疫印跡分析。相同的點(diǎn) 用抗Met抗體再次探測(cè)(Ruco, L.P.等人(1996) J Pathol. 180 (3), 266-270)。生物學(xué)鑒定使用預(yù)先制備的球狀體來(lái)進(jìn)行使用MDA-MB-435細(xì)胞的膠原蛋白侵襲檢測(cè)，如 Michieli, P.等人(2004) Cancer Cell 6 (1), 61-73所述。簡(jiǎn)言之，球狀體通過(guò)在非粘附的96 孔平板(Greiner， Frickenhausen， Germany)上在0.24g/ml曱基纖維素(Sigma)存在下培養(yǎng)細(xì) 胞過(guò)夜(700個(gè)細(xì)胞/孔)來(lái)得到。使用96孔平板(40球狀體/孔)將球狀體埋入含有1.3mg/ml 來(lái)自大鼠尾部的I型膠原蛋白(BD Biosciences, Bedford, Massachusetts)和10% FBS的膠原 蛋白基質(zhì)中。埋入的球狀體在37。C下培養(yǎng)24小時(shí)，然后用30ng/mlHGF(R&D)或沒(méi)有因 子另外刺激24小時(shí)。從每個(gè)球狀體芽殖的小管的數(shù)量用顯微鏡計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)至少分 析12個(gè)球狀體。肺瘤發(fā)生檢測(cè)在0.2ml DMEM中的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞(3*106個(gè)細(xì)胞/小鼠) 皮下注射至Swiss CD-I背景的六周大免疫缺陷的皿-/-雌性小鼠(Charles River Laboratories, Calco， Italy)的右后側(cè)腹。使用測(cè)徑器每2天檢測(cè)胂瘤大小。使用公式 V=4/3;tx2y/2計(jì)算腫瘤體積，其中x是腫瘤的短軸而y是腫瘤的長(zhǎng)軸。15mm3的質(zhì)量-大約相當(dāng)于注射的細(xì)胞最初占據(jù)的體積-被選為腫瘤陽(yáng)性閾值。腫瘤低于這個(gè)閾值的小 鼠認(rèn)為是無(wú)腫瘤的。大約4周后，小鼠被處以安樂(lè)死，并取出腫瘤進(jìn)行分析。對(duì)動(dòng)物進(jìn) 行尸檢。腫瘤和肺埋入石蠟中進(jìn)行組織學(xué)處理。對(duì)蘇木精和伊紅染色的連續(xù)肺切片用顯 微鏡檢查進(jìn)行微小轉(zhuǎn)移分析。腫瘤切片用蘇木精和伊紅染色并且由獨(dú)立的病理學(xué)家在不 告知樣品身份下進(jìn)行分析。使用抗FLAG抗體(Sigma)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析 以確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)。切片用Meyer蘇木精(Sigma)復(fù)染。使用抗Von Willebrand因子抗體 (DAKO, Glostrup, Denmark)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以分析腫瘤血管發(fā)生。切片如上復(fù)染。 血管密度用顯微鏡檢查來(lái)評(píng)價(jià)。每個(gè)動(dòng)物分析至少12塊。所有動(dòng)物操作由意大利Turin 大學(xué)倫理委員會(huì)和意大利衛(wèi)生部批準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)分析使用雙尾同方差學(xué)生T檢驗(yàn)(列1，對(duì)照組；列2,實(shí)驗(yàn)組)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對(duì)所 有分析的數(shù)據(jù)，假定顯著性閾值p0.05。在所有圖中，值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著性由單(p〈0.05)或雙(p〈0.01)星號(hào)表示。結(jié)果HGF/Met功能結(jié)構(gòu)域的基因工程Met和HGF中含有的功能結(jié)構(gòu)域的圖示在圖1A中顯示。Met的胞外部分包括一個(gè) Sema結(jié)構(gòu)域、 一個(gè)PSI絞鏈區(qū)和四個(gè)IPT模塊(左圖)。HGF在成熟的蛋白質(zhì)中由一個(gè)a 鏈和一個(gè)p鏈通過(guò)一個(gè)二石危4建橋連接組成。a鏈依次包含一個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域和四個(gè) kringle(右圖)。為了分析Met和HGF間的相互作用，本發(fā)明者表達(dá)了所有這些功能結(jié)構(gòu) 域的單獨(dú)、可溶性蛋白質(zhì)。將功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因工程以在其N末端含有親代蛋白質(zhì)的 信號(hào)肽，因此它們可以適當(dāng)?shù)胤置?。在C末端，加入了一個(gè)用于抗體識(shí)別的外源表位 (FLAG或MYC)和一個(gè)用于蛋白質(zhì)純化的多組氨酸標(biāo)簽。所有編碼基因工程因子的 cDNAs亞克隆至慢病毒載體pRRLsin.PPT.CMV.Wpre上，重組慢病毒顆粒如材料和方法 中描述的制備。從慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435人黑色素瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中收集 重組蛋白質(zhì)并通過(guò)親和層析同種純化。純化的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)定量(圖IB)。Met-HGF相互作用的的ELISA分析Met外功能區(qū)與HGF相互作用的能力通過(guò)ELISA結(jié)合檢測(cè)法才企測(cè)?？扇苄允荏w(誘 餅Met、 Sema-PSI、 Sema、 PSI-IPT、 IPT)固定至固相上且與增加濃度的活性HGF接觸。 使用生物素化的抗HGF抗體顯示結(jié)合。非特異性HGF結(jié)合用牛血清清蛋白(BSA)在固相 上代替可溶性Met結(jié)構(gòu)域來(lái)確定。結(jié)合親和力通過(guò)如材料和方法中所描述的非線性回歸 分析來(lái)確定。在這些條件下，誘餅Met以大約0.2-0.3nM的Kd與HGF結(jié)合。與前述測(cè) 量一致，Sema-PSI和Sema以與誘餅Met相比至少低一個(gè)對(duì)數(shù)的親和力與HGF結(jié)合。令 人驚訝的是，PSI-IPT和IPT均與HGF高效結(jié)合，與誘斜Met具有幾乎相同的親和力(圖 2A)。 PSI結(jié)構(gòu)域的存在與否不影響Sema或IPT任一與HGF的結(jié)合親和力。由于目前自 然界中發(fā)現(xiàn)的幾乎所有Sema結(jié)構(gòu)域在其C末端都具有一個(gè)PSI模塊，因此本發(fā)明人使 用誘何Met、 Sema-PSI和IPT繼續(xù)進(jìn)行結(jié)合分析。為了確定每個(gè)Met模塊與原-HGF 、 HGF-a、 HGF NKl和HGF-卩的親和力以及與其 與活性HGF的親和力比較，基因工程受體固定于固相上且與增加濃度的MYC標(biāo)記的配 體接觸。使用抗MYC抗體顯示結(jié)合。在液相中使用含有kringle的蛋白質(zhì)血管抑素(AS)-還用MYC表位標(biāo)記-來(lái)確定非特異性結(jié)合。原-HGF、 HGF a鏈和代表HGF a鏈最小 Met結(jié)合模塊的HGF NKl分別以與活性HGF相比降低3、 4和10倍親和力與誘餅Met 結(jié)合(圖2B)。 HGF-p與誘餅Met(或任何其它Met結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合太低以致于無(wú)法以此種檢測(cè)方法檢測(cè)。Sema-PSI僅與活性HGF以顯著的親和力結(jié)合，而與pro-HGF、 HGF-a 或HGFNK1的結(jié)合則無(wú)法與非特異性結(jié)合區(qū)分(圖2C)。相反，IPT以相同高親和力與活 性HGF、 pro-HGF和HGF-a結(jié)合(圖2D)。 HGF NK1與IPT結(jié)合緊密程度比活性HGF低 10倍，即具有與誘何Met結(jié)合時(shí)相同的親和力。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Met的IPT區(qū)域與HGF 的a鏈的高親和力結(jié)合與配體的蛋白水解過(guò)程無(wú)關(guān)。 HGF的a鏈與IPT結(jié)構(gòu)域3和4以高親和力結(jié)合Met的IPT區(qū)域延伸大約400個(gè)氨基酸且含有四個(gè)IPT結(jié)構(gòu)域。為了更精確地定位 IPT-HGF接觸面，構(gòu)建一系列缺失一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的IPT變異體(圖3A)。 IPT Al和IPT △1-2是兩個(gè)分別缺少前一個(gè)或前兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的IPT的N末端缺失形式。 IPT-3和IPT-4對(duì)應(yīng)兩個(gè)表達(dá)為單個(gè)蛋白質(zhì)的C末端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)制備和 純化如上所述進(jìn)行?；蚬こ蘄PTs與HGF a鏈相互作用的能力用全長(zhǎng)IPT區(qū)域作為對(duì)照 通過(guò)ELISA結(jié)合檢測(cè)法來(lái)研究。IPT、 IPTAl、 IPTM-2、 IPT-3和IPT-4固定在固相上且 與增加濃度的HGF-a接觸。使用抗HGF抗體顯示結(jié)合。使用BSA如上測(cè)量非特異性結(jié) 合。如圖3B所示，前兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的缺失基本上不影響HGF結(jié)合。事實(shí)上，IPTA1-2,它是對(duì)應(yīng)Met最后兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，它與HGF 的a鏈以如果不比IPT更高也是相同的力量結(jié)合。但是第三個(gè)或第四個(gè)免疫球蛋白樣結(jié) 構(gòu)域任一的進(jìn)一步缺失幾乎全部損失HGF-a結(jié)合。使用活性HGF或pro-HGF代替HGF-a 得到類似結(jié)果。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Met的最后兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，位于接近真正的Met 的跨膜螺旋，足以與HGF的a鏈以高親和力結(jié)合。IPT結(jié)構(gòu)域3和4足以在活細(xì)胞中與HGF結(jié)合為了確定HGF是否可以與位于膜錨定受體中的IPT 3和4結(jié)合，構(gòu)建了 一個(gè)在胞外 區(qū)帶有大量缺失的Met蛋白質(zhì)。對(duì)應(yīng)于Sema結(jié)構(gòu)域(aa25-515)、 PSI結(jié)構(gòu)域(aa 516-562) 和前兩個(gè)IPT結(jié)構(gòu)域(IPT 1和2, aa 563-741)的氨基酸25-741缺失，生成含有IPT結(jié)構(gòu)域 3和4、跨膜螺旋和全長(zhǎng)胞質(zhì)區(qū)的重組受體(圖4A)。編碼基因工程受體MetA25.741的cDNA 亞克隆至上述的相同的慢病毒載體上。重組慢病毒顆粒用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞系 TOV-112D，通過(guò)RT-PCR分析確定它缺少內(nèi)源性Met表達(dá)(Michieli, P.，等人(2004) Cancer Cell 6 (1)， 61-73)。表面生物素化分析顯示MetA25.741被適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)且顯露在TOV-112D細(xì) 胞膜上(圖4B)。為了檢查MetA25.741是否可以與HGF結(jié)合，慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在重組HGF存在 或不存在下培養(yǎng)，隨后用交聯(lián)劑BS3處理它們。細(xì)胞裂解物用靶向Met的C末端部分的 抗體免疫沉淀，SDS-PAGE分離且使用抗HGF生物素化抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡法分析。 作為對(duì)照，在野生型TOV-112D細(xì)胞上進(jìn)行同樣的分析。免疫印跡顯示一個(gè)分子量大約 180 kD的明顯條帶在對(duì)應(yīng)于用HGF處理的表達(dá)MetA25.川的細(xì)胞的泳道中出現(xiàn)而沒(méi)有出 現(xiàn)在對(duì)應(yīng)于無(wú)HGF處理的相同細(xì)胞或野生型TOV-112D細(xì)胞的泳道中，無(wú)論有無(wú)配體存 在(圖4C)?？紤]到MetA25.741和HGF均具有大約90 kDa的分子量，免疫沉淀的交聯(lián)蛋白 質(zhì)與HGF加MetA25.74i形成的復(fù)合物是一致的。
與IPT結(jié)構(gòu)域3和4結(jié)合的HGF引起活細(xì)胞中Met的激活
本發(fā)明者接下來(lái)檢測(cè)了與MetA25.741結(jié)合的HGF是否可以誘導(dǎo)Met激酶的激活。為 了這個(gè)目的，慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的TOV-112D細(xì)胞用原-HGF或活性HGF進(jìn)行刺激，細(xì)胞 裂解物用抗Met抗體如上免疫沉淀。受體激活通過(guò)使用抗磷酸酪氨酸抗體的蛋白質(zhì)免疫 印跡分析來(lái)確定。相同的點(diǎn)用抗Met抗體再次探測(cè)以標(biāo)準(zhǔn)化免疫沉淀的受體的數(shù)量。值 得注意的是，原-HGF和活性HGF均能夠誘導(dǎo)MeU25.74!的強(qiáng)磷酸化(圖4D)。由于與全長(zhǎng) Met結(jié)合的原-HGF不能誘導(dǎo)激酶激活，這說(shuō)明Sema結(jié)構(gòu)域以某種方式發(fā)揮了對(duì)Met催 化活性的自身抑制作用， 一旦與活性HGF結(jié)合就會(huì)產(chǎn)生Met催化活性。還使用HGF NK1 和一種由兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)的NK1片段組成的基因工程二聚配體(NK1-NK1;圖4E)進(jìn)行受體 刺激。如圖4D所示，慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的TOV-112D細(xì)胞的NK1-NK1刺激引起了 MetA25.741 的有效磷酸化，而單體NK1刺激沒(méi)有效果。這些結(jié)果說(shuō)明Met的兩個(gè)C末端IPT結(jié)構(gòu)域 (IPT 3和4)足以與HGF(更精確地說(shuō)是代表HGF的a鏈上的最小Met結(jié)合模塊的HGF NK1)結(jié)合和傳遞受體激活的信號(hào)至胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，可能隨后進(jìn)行配體誘導(dǎo)的受體的二 聚化。但是，它們還說(shuō)明單獨(dú)IPT 3和4不足以區(qū)分HGF的生物活性形式和其無(wú)活性前 體原-HGF。
可溶性IPT在體外抑制HGF誘導(dǎo)的侵襲性生長(zhǎng)
在以前的研究中，已說(shuō)明表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)(誘餅Met)的Met的胞外部分在體外和 小鼠癌癥模型中均抑制HGF誘導(dǎo)的侵襲性生長(zhǎng)(Michieli R等人(2004) Cancer Cell 6 (1), 61-73)。還顯示重組可溶性Sema-PSI能抑制配體依賴的和配體非依賴的Met磷酸化 (Kong-Beltran M.等人(2004) Cancer Cell 6 (1), 75-84)。基于這些結(jié)果，已檢測(cè)了可溶性IPT是否在活細(xì)胞中顯示了 HGF/Met拮抗活性。MDA-MB-435人黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)Met 且是已確定的分析HGF介導(dǎo)的侵襲性生長(zhǎng)的模型系統(tǒng)，用編碼可溶性誘餅Met、Sema-PSI 或IPT的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。用空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作對(duì)照。分泌可比較水平的可溶性因 子(大約50pmol/l()S個(gè)細(xì)胞/24小時(shí))的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞除去血清幾天，允許重組因 子在培養(yǎng)基中蓄積，然后用重組HGF刺激。Met酪氨酸磷酸化通過(guò)使用抗磷酸酪氨酸抗 體的免疫印跡如上述確定。如圖5A所示，IPT和Sema-PSI兩者均部分抑制了 HGF誘導(dǎo) 的Met磷酸化，而誘餅Met完全中和了 HGF誘導(dǎo)Met激活的能力。相同的點(diǎn)用把向于 Met C末端尾部的抗體再次探測(cè)顯示在免疫沉淀蛋白質(zhì)數(shù)量上沒(méi)有本質(zhì)差別。
為了檢測(cè)Met外功能區(qū)在更多生物學(xué)背景下的抑制作用，相同的細(xì)胞用來(lái)進(jìn)行HGF 依賴的分支形態(tài)形成檢測(cè)。預(yù)先制備的細(xì)胞球狀體接種至三維膠原蛋白基質(zhì)中，然后用 重組HGF刺激以形成小管結(jié)構(gòu)。分支通過(guò)計(jì)數(shù)每個(gè)集落芽殖的小管的平均數(shù)來(lái)定量。如 圖5B所示，可溶性IPT和Sema-PSI均抑制HGF誘導(dǎo)的集落分支(空載體，17.5個(gè)小管 集落；IPT, 4.0個(gè)小管/集落;Sema-PSI, 6.7個(gè)小管/集落)。但是，與獲得自磷酸化實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果一致，誘餅Met是比它的任一亞結(jié)構(gòu)域更有效的HGF抑制劑(2.5個(gè)小管/集落)。 圖5C顯示了集落形態(tài)的代表圖。
可溶性IPT在小鼠中顯示了抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性
以上結(jié)果提示了本發(fā)明者探索可溶性IPT在小鼠癌癥模型中的治療潛力。慢病毒載 體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-435黑色素瘤細(xì)胞皮下注射至CD-I nu-A小鼠，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。 大約三周后，取出胖瘤分析，對(duì)小鼠進(jìn)行尸檢。在Kaplan-Meier-like分析中，其中無(wú)腫 瘤動(dòng)物的百分比對(duì)時(shí)間作圖而腫瘤潛伏期以天計(jì)算平均數(shù)來(lái)定量，所有基因工程的可溶 性受體顯示了實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的出現(xiàn)。但是，IPT比Sema-PSI稍有效而誘餅Met比IPT或 Sema-PSI均更有效(圖6A)。隨時(shí)間的腫瘤質(zhì)量的分析顯示IPT僅比誘飾Met效果稍弱， 而Sema-PSI僅在實(shí)驗(yàn)的非常早期抑制瘤生長(zhǎng)(圖6B)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析顯 示誘餅Met、 Sema-PSI和IPT在胂瘤中達(dá)到相似水平和分布(圖6C)。
因?yàn)镠GF是有效的前血管生成因子，已確定在腫瘤中抑制HGF/Met是否導(dǎo)致血管 生成的減少。腫瘤切片通過(guò)使用針對(duì)Von Willebrand因子的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)來(lái)分 析，血管密度用顯微鏡檢查來(lái)評(píng)價(jià)(圖6D)。 IPT減少腫瘤血管密度1.5倍，而誘餅Met 達(dá)到更強(qiáng)的抑制(大約4倍)；Sema-PSI沒(méi)有顯著影響腫瘤血管發(fā)生。根據(jù)尸檢，取出上述小鼠的肺并且進(jìn)行組織學(xué)處理。連續(xù)肺切片用蘇木精和伊紅染色，用顯微鏡分析以確 定微小轉(zhuǎn)移的存在。圖6A顯示了結(jié)果。在對(duì)照組中，6只小鼠中的4只(67。/。)出現(xiàn)了撰t 小轉(zhuǎn)移。在IPT和Sema-PSI組，微小轉(zhuǎn)移僅在6只小鼠的1只(17%)中發(fā)現(xiàn)，而自誘何 Met組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移病灶既是實(shí)質(zhì)的(血管外的)又是內(nèi)陷的(血管內(nèi)的；參見(jiàn)
圖6F的^a表圖)。
本發(fā)明提供的HGFR上的高親和力HGF結(jié)合位點(diǎn)的鑒別允許設(shè)計(jì)導(dǎo)致更特異性 HGF和HGFR抑制劑/拮抗劑生成的新操作。以下是鑒定靶向HGFR的高親和力結(jié)合位 點(diǎn)的HGF/HGFR抑制劑/拮抗劑或使用HGFR的高親和力結(jié)合位點(diǎn)作為工具制備新抑制 劑/拮抗劑的方法的非限制性實(shí)施例。
與HGFR的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域結(jié)合避免HGF結(jié)合的單克隆抗體的開(kāi)發(fā) 由于HGF與胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的相互作用對(duì)于高親和力HGF結(jié)合是必需的， 可以制備與IPT-3和IPT-4結(jié)合并與HGF竟?fàn)嶩GFR結(jié)合的特異性單克隆抗體。這可以 通過(guò)幾個(gè)策略完成。
(A) 來(lái)源于IPT-3和IPT-4的重組蛋白質(zhì)或肽通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)或化學(xué)合成得 到。將此蛋白質(zhì)或肽注射至適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物(通常是小鼠或大鼠)中以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然后 從免疫的動(dòng)物中分離脾細(xì)胞且融合至骨髓瘤細(xì)胞系，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)選擇生產(chǎn) 抗體的雜交瘤。然后通過(guò)類似于本發(fā)明中描述的使用固相中的重組IPT-3和IPT-4和液相 中的雜交瘤制備抗體的ELISA方法篩選靶向IPT-3和IPT-4的抗體。使用可商業(yè)獲得的 抗鼠免疫球蛋白抗體來(lái)顯示結(jié)合?；蛘?，根據(jù)它們從IPT-3和IPT-4(在固相中)取待重組 HGF(在液相中)的能力，或它們免疫沉淀重組IPT-3和IPT-4蛋白質(zhì)的能力篩選抗體。
(B) 將在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)栽體中插入編碼IPT-3和IPT-4的多核苷酸序列直接注射至實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中以產(chǎn)生針對(duì)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)。然后分離和如上述篩選靶向IPT-3和IPT-4的抗 體。
(C) 將在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中插入編碼IPT-3和IPT-4的多核香酸序列轉(zhuǎn)移至不表達(dá) HGFR的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以獲得在細(xì)胞表面的IPT-3和IPT-4表達(dá)。表達(dá)IPT-3和IPT-4 的細(xì)胞然后注射至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中以產(chǎn)生免疫反應(yīng)，分離和如上述篩選靶向IPT-3和IPT-4的 抗體。
(D) 使用重組IPT-3和IPT-4蛋白質(zhì)篩選來(lái)自哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞(優(yōu)選人，例如從浸潤(rùn)
17表達(dá)HGFR的肺瘤的淋巴細(xì)胞)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)(例如通過(guò)已知為噬菌體展示的技 術(shù))生產(chǎn)的天然抗體庫(kù)。然后分離、擴(kuò)增陽(yáng)性克隆(即與IPT-3和IPT-4以高親和力結(jié)合的 那些克隆)并生物化學(xué)表征抗體。
(E)從帶有表達(dá)HGFR的腫瘤的病人的外周血中分離出人記憶B細(xì)胞，公開(kāi)在包括 Traggiai E.等人(2004) Nat Med. 10 (8), 871-875的多個(gè)研究中。 一旦建立起永生記憶B細(xì) 胞的培養(yǎng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用如以上(A)中所述的方法篩選分泌耙向于IPT-3和IPT-4 的抗體的細(xì)胞。確定了此種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞后，想要的抗體可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)和標(biāo) 準(zhǔn)基因工程操作來(lái)克隆。
與HGFR的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制HGFR活性的待測(cè)化合物的鑒定 使用不同方法，可以分離不同來(lái)源的與HGFR的高親和力HGF結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合和干擾 HGF誘導(dǎo)的HGFR激活的待測(cè)化合物。這可通過(guò)幾個(gè)策略來(lái)完成。
(A) 使用類似于本發(fā)明中描述的ELISA檢測(cè)法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以篩選化合物庫(kù) (包括但是不限于合成化學(xué)物庫(kù)、天然化合物庫(kù)、小分子庫(kù)、肽庫(kù))得到取代與IPT-3和IPT-4 相互作用的HGF的藥物。在此種檢測(cè)方法中，重組IPT-3和IPT-4蛋白質(zhì)固定至固相中 并且在液相中用固定量的HGF孵育。與庫(kù)中的化合物接觸后，HGF結(jié)合使用可商業(yè)獲得 的抗HGF抗體測(cè)量。
(B) 使用表達(dá)類似于本發(fā)明中描述的(MetA25-74!)僅含有胞外部分的IPT-3和IPT-4結(jié) 構(gòu)域的基因工程形式的HGFR的細(xì)胞系，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以篩選化合物庫(kù)(包括但是不 限于合成化學(xué)物庫(kù)、天然化合物庫(kù)、小分子庫(kù)、肽庫(kù))得到取代與IPT-3和IPT-4相互作 用的HGF或抑制HGF誘導(dǎo)的HGFR激活的藥物。這可以通過(guò)將所述基因工程細(xì)胞與庫(kù) 接觸，然后檢測(cè)HGF誘導(dǎo)的HGFR磷酸化如4^研究中所述或通過(guò)其它顯示HGFR激活 的方法實(shí)現(xiàn)，包括散射檢測(cè)、重組基質(zhì)侵襲檢測(cè)、分支形態(tài)發(fā)生檢測(cè)、細(xì)胞存活檢測(cè)或 其它體外生物學(xué)檢測(cè)方法如Michieli, P.等人(2004) Cancer Cell 6 (1), 61-73所述。
(C) 使用上述基因工程的細(xì)胞系，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以篩選基因庫(kù)(包括但是不限于 cDNA表達(dá)庫(kù)、短發(fā)夾RNA庫(kù)、反義DNA庫(kù)、隨機(jī)核苷酸庫(kù))得到取代與IPT-3和IPT-4 相互作用的HGF或抑制HGF誘導(dǎo)的HGFR激活的多核苦酸或基因產(chǎn)物。這可以通過(guò)轉(zhuǎn) 染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或任何將核苷酸庫(kù)引入所述細(xì)胞然后檢測(cè)HGF激活相同細(xì)胞表達(dá)的缺失形式的 HGFR的能力來(lái)完成。HGFR激活如(B)中所述進(jìn)行測(cè)量。檢測(cè)與HGFR的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物的生物學(xué)活性的功能檢測(cè)方 法的舉例
無(wú)論使用什么策略來(lái)制備抗IPT抗體或IPT結(jié)合化合物，最終產(chǎn)物(即靶向于IPT-3
測(cè)以確定這些藥物是否具有干擾HGFR活性的能力。這些檢測(cè)可以使用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞在體外進(jìn)行或使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在體內(nèi)進(jìn)行。
(A) 擴(kuò)散檢測(cè)。在有蓋培養(yǎng)亞中的緊密的集落中生長(zhǎng)和表達(dá)HGFR的上皮細(xì)胞通過(guò) HGF刺激誘導(dǎo)至"擴(kuò)散"。作為HGF刺激的結(jié)果，有蓋培養(yǎng)亞中的細(xì)胞出現(xiàn)更多分離和 分散。這一檢測(cè)可在幾個(gè)待測(cè)化合物存在下進(jìn)行。在待測(cè)化合物中，HGF/HGFR抑制劑/ 拮抗劑可以通過(guò)對(duì)HGF刺激的應(yīng)答中擴(kuò)散表型的缺失來(lái)鑒別。
(B) 細(xì)胞遷移檢測(cè)。表達(dá)HGFR的細(xì)胞具有朝HGF梯度遷移的能力。換言之，細(xì)胞 朝著較高濃度的HGF被趨藥性所吸引。這一能力可用來(lái)在博伊登室檢測(cè)中篩選HGF抑 制劑。細(xì)胞接種至第一個(gè)小室，HGF提供在與第一個(gè)小室通過(guò)多孔膜分開(kāi)的第二個(gè)小室 中。細(xì)胞穿過(guò)膜遷移并到達(dá)HGF更濃縮的第二個(gè)小室。抑制這一過(guò)程的藥物鑒定為 HGF/HGFR抑制劑/拮抗劑。
(C) TranswellTM遷移檢測(cè)或重組基質(zhì)侵襲檢測(cè)。這是(B)中描述的檢測(cè)法的變種，其 中多孔膜用一層膠原蛋白Matrigel ,或其它重組有機(jī)基質(zhì)覆蓋。細(xì)胞必須消化有機(jī)基質(zhì) 以遷移穿過(guò)它。這是一種測(cè)定侵襲性而不是細(xì)胞的簡(jiǎn)單遷移的更精確的檢測(cè)方法。
(D) 膠原蛋白侵襲性檢測(cè)或分支形態(tài)發(fā)生檢測(cè)。在這個(gè)檢測(cè)方法中，表達(dá)HGFR的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選上皮細(xì)胞或癌細(xì)胞)接種至一個(gè)膠原蛋白的三維層中，然后使其生長(zhǎng)至 每個(gè)形成大約1000個(gè)細(xì)胞的球狀體?；蛘?，球狀體可以在非粘附的96孔平板上在甲基 纖維素存在下過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞之前預(yù)先形成，如Michieli, P.等人(2004) Cancer Cell 6 (1), 61-73所公開(kāi)的。 一旦球狀體埋入膠原蛋白層，用HGF刺激它們且在37。C培養(yǎng)。這導(dǎo)致 了球狀體上芽殖出中空小管；每個(gè)小管由幾個(gè)細(xì)胞組成一個(gè)小管結(jié)構(gòu)形成并且極化，以 使細(xì)胞的一面看到內(nèi)腔而另一個(gè)面看到外面的培養(yǎng)基。隨著檢測(cè)進(jìn)行，小管成為分支且 形成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。此檢測(cè)對(duì)于HGF是高度特異性的。抑制這一過(guò)程的藥物具有成為高 度特異性的HGF/HGFR拮抗劑的非常高的可能性。
(E) 促有絲分裂檢測(cè)。HGF在某些表達(dá)HGFR的細(xì)胞里具有誘導(dǎo)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的能力。最敏感的細(xì)胞顯然是原發(fā)性肝細(xì)胞，通常是小鼠或大鼠的。為了檢測(cè)HGF 誘導(dǎo)的DNA復(fù)制，除去細(xì)胞中血清生長(zhǎng)因子，然后用增加濃度的HGF刺激細(xì)胞。不久 之后，加入放射性胸苷，細(xì)胞在37。C培養(yǎng)大約一天。充分洗滌和固定后，通過(guò)液體閃爍 計(jì)數(shù)或其它允許放射定量的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量進(jìn)入細(xì)胞DNA中的放射性胸苷。
(F) 存活;險(xiǎn)測(cè)。HGF具有保護(hù)表達(dá)HGFR的細(xì)胞避免細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡的 能力。這可用來(lái)在存活檢測(cè)中測(cè)量HGFR活性。細(xì)胞用HGF和待測(cè)化合物(可能的HGFR 抑制劑)預(yù)孵育，然后進(jìn)行細(xì)胞凋亡刺激例如有毒藥物、喪失附著、低氧、熱休克、輻射 或DNA損傷。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法包括TUNEL(末端脫氧核脊酰轉(zhuǎn)移酶生 物素-三磷酸去氧脲苷Nick末端標(biāo)記)、核小體、DNA梯型、胱天蛋白酶活性、活體染料 染色或任何它們的變種來(lái)測(cè)量細(xì)胞死亡。
(G) 小鼠腫瘤發(fā)生檢測(cè)。在這種檢測(cè)中，可能的HGF/HGFR抑制劑的活性直接在實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中檢測(cè)，優(yōu)選小鼠或大鼠。有幾個(gè)方法來(lái)獲得小鼠中的腫瘤。最常用的策略是進(jìn) 行移植，即移植腫瘤細(xì)胞(通常是人源的)至動(dòng)物受體(通常是免疫缺失的小鼠)中。細(xì)胞可 皮下植入(快速簡(jiǎn)便的獲得實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的方法)或常位植入，即在腫瘤細(xì)胞分離的同樣器官 (例如乳癌至乳房頰脂墊、結(jié)腸癌至腸粘膜、肝癌至肝實(shí)質(zhì)等等)。無(wú)論使用什么方法，注 射腫瘤細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得到實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤。這種帶有腫瘤的動(dòng)物現(xiàn)在可用于評(píng)價(jià)待測(cè)化合物 的抗腫瘤可能性?？笻GF/HGFR抗體或化合物可通過(guò)最適合的現(xiàn)有方法運(yùn)送至帶有 HGF/HGFR信號(hào)途徑失調(diào)的腫瘤損傷的動(dòng)物，包括靜脈注射、腹腔注射、滲透泵、口腔 內(nèi)給藥、栓劑、基因療法、局部給藥等等。 一個(gè)適合的治療階段后，該動(dòng)物處以安樂(lè)死， 取出它的腫瘤和器官進(jìn)行分析。
(H) 小鼠轉(zhuǎn)移發(fā)生檢測(cè)。在小鼠中實(shí)驗(yàn)性的轉(zhuǎn)移可通過(guò)全身注射腫瘤細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)。 它們陷入肺毛細(xì)血管中，隨后外滲產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移。這可在尸檢中通過(guò)幾個(gè)方法來(lái)檢測(cè)，包 括顯微鏡觀察、組織學(xué)分析、免疫組織化合法、全身成像。待測(cè)化合物如(G)中所述運(yùn)送。
(I) 基因療法。如果HGF/HGFR抑制劑是抗體、重組蛋白質(zhì)、肽或小干擾RNA,運(yùn) 送至帶有腫瘤的動(dòng)物可通過(guò)基因療法來(lái)完成。這包括將預(yù)計(jì)的多核苷酸引入至適合的運(yùn) 送載體中，載體可在慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、棵露DNA或任何它們 的變異體。載體樣品可才艮據(jù)腫瘤部位、載體或腫瘤組織分型全身或局部運(yùn)送至腫瘤?；?因治療的生物學(xué)作用如(G)中描述其它化合物一樣分析。序列表
〈110>梅思爾斯平移研究有限公司
<120〉 HGFR的高親和力結(jié)合位點(diǎn)和鑒定其拮抗劑的方法
<130> BEP10941-CF 〈160〉 21
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<210> 1
〈211〉 7425
<212> DNA <213>人工合成
<220〉
<223> pRRLsin. PPT. CMV. eGPF. Wpre 酸5475)
〈400〉 1
c鄉(xiāng)tggcac ttttcgggga aatgtgcgcg attcaaatat gtatccgctc atgagacaat a肪ggaageig tatgagtatt caacatttcc tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa
(eGFP編碼序列起始于核苷酸4756并終止于核苷
gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180
cgctggtgaa agt犯aagat gctgaagatc 240
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720 21ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780
cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840
agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900
tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg %0
agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020
tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatsctgtc cttctagtgt 1320
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560
犯agcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620
gaacaggsga gcgcacgsgg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920
aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 則O
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaattgi 2040atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100 tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt
acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220
gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280
cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340
tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 2400
gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg tctctctggt 2460
tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2520
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640
cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 2700
agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag 2760
cggaggctag aagg卿gag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg gg卿attag 2820
atcgcgatgg gaa犯aattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 2880
tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 2940
atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000
agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060
gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120
caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg鄰gagatatg agggacaatt 3180
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240
cca鄉(xiāng)caaa g,卿gtg gtgc卿gag犯gtaa卿gc agtgggaata ggagctttgt 3300
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600
tggaacaga/t ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 3660
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 3720
犯ttattgga att3gata犯tgggc犯gtt tgtggaattg gttt犯cata 3C3犯ttggc 3780
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 3840
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 3900
cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 3%0
agagagacag agacagatcc attcgattag tg犯cggatc tcgacggtta acttttaaaa 4020
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag ggga犯gaat agtagacata atagcaacag 4080
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ttgggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 4200
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 4260
ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 4320
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ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 4440
catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg ga/tagcggtt 4500
tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 4560
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cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac tctagaggat 4740ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 4800
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ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 6060
ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca 6120aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaa犯ggg gggactggaa gggctaattc 6180
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aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct g犯tggcgaa ,0
tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 7020
gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 7080
ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 7140
cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 7200
agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt ，0
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gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 7380
aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcc 7425<210〉 2 〈211〉 2886 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
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〈223> 誘館Met—FLAGhis的編碼序列 <400〉 2
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120
tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180
cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240
gttgctgagt ac犯gactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc eitgtcaggac 300
tgcagcagca aagcc犯ttt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360
gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420
tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 化O
atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540
ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600
ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660
gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720
ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780
ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840
ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900
acag犯aaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960
tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020
attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140
aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaa/tc atgagcactg ctttaatagg 1200
acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260
accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320
tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380
cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440
ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa cca犯atggc 1500
tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560
agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620
tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680
tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740
ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800
actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860
acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920
tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980
agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040
tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100
agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160
gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220
gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280
acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340
gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460
ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520
tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580
aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag ,0
agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2了00
ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760
ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagcta gctctgacta c犯ggacgac 2820
gatgacaaga gcgattacaa agacgatgat gataagctgc agcatcacca ccatcatcac 2880
cattga 2886
〈210〉 3 〈211〉 1590 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 Sema—FLAGhis的編碼序列 〈400〉 3
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120
tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180
cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240
gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300
tgcagcagca atagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatc犯catggctcta 360
gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420
tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480
atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600
ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660
gaaacgaaag已tggttttat gtttttg已cg gaccagtcct ac已ttgatgt tttacctgag 720
ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780
ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840
ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatgg犯a tgcctctgga gtgtattctx 900
acagaaaaga g犯aaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960
tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020
attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080
gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140
aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200
acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260
accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320
tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380
cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440
ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaettggc 1500
gctagctctg actacaagga cgacgatgac aagagcgatt acaaagacga tgatgataag 1560
ctgcagcatc accaccatca tcaccattag 1590
〈210〉 4 〈211〉 1779 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 Sema-PSI—FLAGhis的編碼序列<400〉 4
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgttteic cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120
tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180
cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240
gttgctgagt ac犯gactgg gcctgtgctg g3acacccag attgtttccc atgtcaggac 300
tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360
gttgtcgaca cctactatga tga/tcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420
tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480
atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540
ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600
ataaattctt cttatttccc agatca/tcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660
gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720
ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780
ttcttgacgg tccaaaggga犯ctctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840
ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900
acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960
tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020
attcttttcg gggtgttcgc acaaetgcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080
gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140
aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200
acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260
accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380
cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440
ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500
tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560
agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620
tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680
tgtctgggag ctagctctga ctacaaggac gacgatgaca agagcgatta caaagacgat 1740
gatgataagc tgcagcatca ccaccatcat caccattga 1779
<210〉 5 <211〉 1458 <212> DNA 〈213〉人工合成
〈220〉
<223〉 PSI-IPT_FLAGhis的編碼序列 〈400> 5
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg ggtacacact ggttatcact gggaagaaga tcacgaagat cccattgaat 120
ggcttgggct gcagacattt ccagtcctgc agtcaatgcc tctctgcccc accctttgtt 訓(xùn)
cagtgtggct ggtgccacga caaatgtgtg cgatcggagg aatgcctgag cgggacatgg 240
actcaacaga tctgtctgcc tgcaatctac aaggttttcc 'caaatagtgc accccttgaa 300
ggagggacaa ggctgaccat atgtggctgg gactttggat ttcggaggaa taataaattt 360
gatttaaaga aaactagsgt tctccttgga aatgagagct gcaccttgac tttaagtgag 420
agcacgatga atacattgaa atgcacagtt ggtcctgcca tgaataagca tttcaatatg ■
tccataatta tttcaaatgg ccacgggaca acacaataca gtacattctc ctatgtggat 540
32cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact 600
ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca 660
tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt 720
tcaactgagt ttgctgtt犯attgaaaatt gacttagcca accgagagac aagcatcttc 780
agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt 840
gggagcacaa taacaggtgt tggg犯aaac ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc 900
ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt acagtggcat gtcaaceitcg ctctaattca 960
gagataatct gttgtaccac tccttccctg caacagctga atctgcaact ccccctgaaa 1020
accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc ctttccaaat actttgatct catttatgta 1080
cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat 1140
gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac cctg犯gcag ttaaaggtga agtgttaaaa 1200
gttggaaata agagctgtga gaatatacac ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc 1260
cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag ctaaatatag agtggaagca agcaatttct 1320
tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa ccagatcaga atttcacagc tagctctgac 1380
tacaaggacg acgatgacaa gagcgattac aaagacgatg atgataagct gcagcatcac 1440
caccatcatc accattag 1458
〈210〉 6 〈211〉 1290 <212〉 腿 <213>人工合成
〈220〉
<223〉 IPT—FLAGhis的編碼序列 〈400〉 6
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagggggg cggtggatcc cctgcaatct acaaggtttt cccaaatagt 120gcaccccttg aaggagggac犯ggctgacc atatgtggct gggactttgg atttcggagg 180
aataataaat ttga/tttaaa gaaaactaga gttctccttg gaaatgagag ctgcaccttg 240
actttaagtg agagcacgat gaatacattg aaatgcacag ttggtcctgc catgaataag 300
catttcaata tgtccataat tatttcaaat ggccacggga caacacaata cagtacattc 360
tcctatgtgg atcctgtaat aacaagtatt tcgccgaaat acggtcctat ggctggtggc 420
actttactta ctttaactgg aaattaccta aacagtggga attctagaca catttcaatt 480
ggtggaaaaa catgtacttt aaaaagtgtg tcaaacagta ttcttgaatg ttatacccca 540
gcccaaacca tttcaactga gtttgctgtt aaattgaaaa ttgacttagc caaccgagag 600
acaagcatct tcagttaccg tgaagatccc attgtctatg aaattcatcc aaccaaatct 660
tttattagtg gtgggagcac aataacaggt gttgggaaaa acctgaattc agttagtgtc 720
ccgagaatgg tcataaatgt gcatgaagca ggaaggaact ttacagtggc atgtcaacat 780
cgctctaatt cagagataat ctgttgtacc actccttccc tgcaacagct gaatctgcaa 840
ctccccctga aaaxxaaagc ctttttcatg ttagatggga tcctttccaa atactttgat 900
ctcatttatg tacataatcc tgtgtttaag ccttttgaaa agccagtgat gatctcaatg 960
ggcaatgaaa atgtactgga aattaaggga aatgatattg accctgaagc agttaaaggt 1020
gaagtgttaa aagttggaaa taagagctgt gagaatatatc acttacattc tgaatgccgtt 1080
ttatgcacgg tccccaatga cctgctg幼a ttgaacagcg agctaaatat agagtggaag 1140
caagcaattt cttcaaccgt ccttggaaaa gtaatagttc aaccagatca gaatttcaca 1200
gctagctctg actacaagga cgacgatgac aagagcgatt aca犯gacga tgatgataag 1260
ctgcagcatc accaccatca tcaccattga 1290
〈210〉 7 〈211〉 1008 〈212〉 腿〈213〉人工合成 <220〉
<223〉 IPT 5 1—FLAGhis的編碼序列 〈400〉 7
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac 120
ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat 180
tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt 240
cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt 300
gacttagcca accgagagac aagcatcttc agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa 360
attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac 4之0
ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt 柳
acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca gagataatct gttgtaccac tccttccctg 540
caacagctga atctgcaact ccccctgaaa accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc 600
ctttccaaat actttgatct catttatgta cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag 660
ccELgtgeitga tctcaatggg caatgaaaat gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac 720
cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaa幼gttggaaata agagctgtga gaeitatacac 780
ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag 840
ctaaatatag agtggaagca agcaatttct tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa 900
ccagatcaga atttcacagc tagctctgac tacaaggacg acgatgacaa gagcgattac 960
aaagacgatg atgataagct gcagcattcac caccatcatc accattga 1008
〈210〉 8 <211> 753 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
35<220>
<223> IPT S 1-2—FLAGhis的編碼序列 <400> 8
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagc組g ggg鄉(xiāng)gggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa 120
tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga Eiaaacctgaa ttcagttagt 180
gtcccg卿a tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa 240
catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg 300
caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt 360
gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca 420
3tgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga 3gcagttaaa 480
ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc 540
gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg 600
aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc 660
acagctagct ctgactacaa ggacgacgat gacaagagcg attacaaaga cgatgatgat 720
aagctgcagc atcaccacca tcatcaccat tga 753
<210〉 9
<211〉 471
〈212〉 腿 <213>人工合成
〈220〉
<223〉 IPT3—FLAGhis的編碼序列 〈400〉 9
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa 120tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt 180
gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa 240
catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg 300
caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt 360
gatctcattt atgtacataa tgctagctct gactacaagg acgacgatga caagagcgat 420
tacaaagacg atgatgataa gctgcagcat caccaccatc atcaccattg a 471
〈210〉 10
〈211〉 462
〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 IPT4—FLAGhis的編碼序列 〈400〉 10
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc 鄉(xiāng)etg隱tg ggg鄉(xiāng)gggg cggtggstct atgatctcaa tgggcaatga犯atgtactg gcagttaaag gtg犯gtgtt犯aagttgga tctgaagccg ttttatgcac ggtccccaat atagagtgga agcaagcaat ttcttcaacc cagaatttca csgctagctc tgsctac^g gatgatgata agctgcagca tcaccaccat
atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
cctgtgttta agccttttga a肌gccagtg 120
gaaattaagg gaaatgatat tgaccctgaa 180
aataagagct gtgagaatat acacttacat 240
gacctgctga aattgaacag cgagctaaat 300
gtccttggaa aagtaatagt tc犯ccagat 360
gacgacgatg acaagagcga ttacaaagac 420
catcaccatt ga 462
〈210〉 11
〈211〉 2040 <212〉腿 〈213〉人工合成
<220>〈223〉 Met S 25-741的編碼序列 〈400〉 11
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60
aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa 120
tcttttatta gtggtgggag cacaat犯ca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt 180
gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa 240
catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg 300
caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaa/tacttt 360
gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca 420
atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagtt犯a 化O
ggtgaagtgt taaaagttgg aaataBgagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc 540
gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg 600
aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc 660
acaggattga ttgctggtgt tgtctcaata tcaacagcac tgttattact acttgggttt 720
ttcctgtggc tgaaaaagag aaagcaaatt aaagatctgg gcagtgaatt agttcgctac 780
gatgcaagag tacacactcc tcatttggat aggcttgtaa gtgcccgaag tgtaagccca 840
actacagaaa tggtttcaaei tgaatctgta gactaccgag ctacttttcc agaagatcag 900
tttcctaatt catctcagaa cggttcatgc cgacaagtgc agtatcctct gacagacatg 960
tcccccatcc taactagtgg ggactctgat atatccagtc cattactgca aaatactgtc 1020
cacattgacc tcagtgctct aaa/tccagag ctggtccagg cagtgcagca tgtagtgatt 1080
gggcccagta gcctgattgt gcatttcaat gaagtcatag gaagagggca ttttggttgt 1140
gtatatcatg ggactttgtt ggacaatgat ggcaagaaaa ttcactgtgc tgtgaaatcc 1200
ttgaacagaa tcactgacat aggagaagtt tcccaatttc tgaccgaggg aatcatcatg 1260
38aaagatttta gtcatcccaa tgtcctctcg ctcctgggaa tctgcctgcg aagtgaaggg 1320
tctccgctgg tggtcctacc atacatgaaa catggagatc ttcgaaattt cattcgaaat 1380
gagactcata atccaactgt aaaagatctt attggctttg gtcttcaagt agccaaaggc 1440
atgaaatatc ttgcaagcaa aaagtttgtc cacagagact tggctgcaag aaactgtatg 1500
ctggatgaaa aattcacagt caaggttgct gattttggtc ttgccagaga catgtatgat 1560
aaagaatact atagtgtaca caacaaaaca ggtgcaaagc tgccagtgaa gtggatggct 1620
ttggaaagtc tgcaaactca aaagtttacc accaagtcag atgtgtggtc ctttggcgtg 1680
ctcctctggg agctgatgac aagaggagcc ccaccttatc ctgatgtaaa cacctttgat 1740
ataactgttt acttgttgca agggagaaga ctcctacaac ccgaatactg cccagacccc 1800
ttatatgaag taatgctaaa atgctggcac cctaaagccg aaatgcgccc atccttttct 1860
gaactggtgt cccggatatc agcaatcttc tctactttca ttggggagca ctatgtccat 1920
gtgaacgcta cttatgtgaa cgtaaaatgt gtcgctccat atccttctct gttgtcatca 1980
gaagataacg ctgatgatga ggtggacaca cgaccagcct ccttctggga gacatcatag 2040
〈210〉 12
〈211〉 2259
〈212〉 腿 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 HGF—MYChis的編碼序列 〈400〉 12
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta acca已a(bǔ)aaag tgaatactgc agaccaatgt ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat
ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ggacaagigga aaagaag犯a ta^caattcat 120
atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 3ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cg3gggg犯g aagggggax:c ctggtgtttc acaagcaatc cag明gtacg ctacg犯gtc GOO
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660
ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720
caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780
cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840
gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900
gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960
tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020
cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080
gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140
ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200
ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260
gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320
cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380
tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440
gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500
acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560
ggatcattga t犯aggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg aattatggat gcac犯ttcc tgaa犯gacc ggattgatca actatgatgg cctattacga aaatgcagcc agcatc已tcg aggga^ggtg gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag caacataaaa tg已g已a(bǔ)tggt tcttggtgtc aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca ttaacEitsta aggtacceica gtcagctsgc aatggagggc tcgagcatca ccaccatcac
catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680
gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740
gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800
agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860
gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920
actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980
ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040
attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100
tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160
ga3caaaaac tc3tctcaga agaggatctg 2220
catcattga 2259
〈210〉 13
〈211〉 1494
〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 HGF- a —MYChis的編碼序列 <400〉 13
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc GO ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgst aaagcaagaa a^caatgcct ctggttcccc 300 ttc犯tagca tgtcaagtgg agtgataaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
41tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660
ggtctcatgg atc已tac已ga atcaggcaag atttgtc已gc gctgggatca tcagacacca 720
caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780
cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840
gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900
gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caa"taccatt 960
tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020
cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080
gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140
ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200
ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260
gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320
cgaaatccag atgatgacgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380
tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgataccg ctagcgaaca aaaactcatc 1440
tcagaagagg atctgaatgg agggctcgag catcaccacc atcaccatca ttga 1494
〈210〉 14
〈211〉 705
〈212〉 DNA 〈213>人工合成
〈220〉
〈223〉 HGF NKl—MYChis的編碼序列〈400> 14
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc GO
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtc已a(bǔ)gtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa gctagcgaac aaaaactcat ctcagaagag 660
gatctgaatg gagggctcga gcatcaccac catcaccatc attga 705
〈210〉 15 <211〉 903 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 HGF-0 —MYChis的編碼序列 〈400〉 15
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc GO
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat l之O
gaattcgttg taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga 180
tacagaaata aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tctt已ctgca 240
cgacagtgtt tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat 300gtccacggaa gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat 360
ggccctgaag gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat 420
tttgttagta cgattgattt acctaattat ggagccacaa ttcctgaaaa gaccagttgc 480
agtgtttatg gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca 540
catctctata taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg 600
aatg3gtctg aaatatgtgc tggggctg已3 aagattggat caggaccatg tgagggggat 660
tatggtggcc cacttgtttg tg已gcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtc已ttgtt 720
cctggtcgtg gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat 780
gcaaaatgga tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcagc tagcgaacaa 840
aaactcatct cag肌gagga tctgaatgga gggctcgagc atcaccacca tcaccatcat 900
tga 903
〈210〉 16 〈211〉 2259 〈212〉 腿 <213>人工合成
〈220〉
〈223〉不可斷裂的HGF—MYChis的編碼序列 〈400〉 16
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaa/tag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagc犯gaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagc已tgtcaagtgg agtgaaaaeta gaatttggcc atga已tttga cctctatgaa 360aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtxag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660
ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720
caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780
cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840
gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900
gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960
tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020
cctgaaaatt tcaELgtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080
gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140
ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200
ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260
gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctg犯tga gaattactgc 1320
cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380
tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440
gaccatcccg t犯tatcttg tgccaa犯cg aaac犯ctgc aggttgtaaa tgggattcca 1500
acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560
ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620
ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaas 1680
tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800
aattatggat gcacsattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860
ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920
aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg sctctgaatg agtctgaaat stgtgctggg 1980
gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040
caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100
aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160
ttaacatata aggtaccaca gtcagctagc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 2220
aatggagggc tcgagcatca ccaccatcac catcattga 2259
〈210〉 17 〈211〉 1197 〈212〉 腿 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223〉 NKl-NKl—his的編碼序列 〈400〉 17
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttc犯tagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
46agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa gctagcgaat tcaaeiaaa/tc agcaaagact 660
accctaatcs 333tagatcc agcax:tga3g at￡ia^333cca< a3333gtg33 tactgc8g3c 720
caatgtgcta atagatgtac taggaataaa ggacttccat tcacttgcaa ggcttttgtt 780
tttgataaag caagaaaaca atgcctctgg ttccccttca atagcatgtc aagtggagtg 840
aaaaaagaat ttggccatga atttgacctc tatgaaaaca aagactacat tagaaactgc 900
atcattggta aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa 960
tgtcagccct ggagttccat gataccacac gaacacagct ttttgccttc gagctatcgg 1020
ggtaaagacc tacagg犯aa ctactgtcga aatcctcgag ggg犯gaagg gggaccctgg 1080
tgtttcacaa gcaatccaga ggtacgctac gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa 1140
gttgaagcta gtgggggtgg tagtggagga gggcatcacc atcatcacca tcactga 1197
〈210〉 18 〈211> 1218 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
<220〉
〈223〉 hAS—MYC的編碼序列 〈400〉 18
atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tc幼ggagtg 60
tatctctcag agtgcaagsc tggg3atgga aagaactsca gagggeicgat gtcc犯aaca 120
aaaaatggca tcacctgtca aaaatggagt tccacttctc cccacagacc tagattctca 180
cctgctacac acccctcaga gggactggag gagaactact gcaggaatcc agacaacgat 240
ccgcaggggc cctggtgcta tactactgat ccagaaaaga gatatgacta ctgcgacatt 300
cttgagtgtg aagaggaatg tatgcattgc agtggagaaa actettgacgg caaaatttcc 360aagaccatgt ctggactgga atgccaggcc tgggactctc agagcccaca cgctcatgga 420
tacattcctt ccaaatttcc aaacaagaac ctgaagaaga attactgtcg taaccccgat 480
agggagctgc ggccttggtg tttcaccacc gaccccaaca agcgctggga actttgcgac 540
atcccccgct gcacaacacc tccaccatct tctggtccca cctaccagtg tctgaaggga 600
acaggtgaaa actatcgcgg gaatgtggct gttaccgttt ccgggcacac ctgtcsgcac GGO
tggagtgcsc agacccctca cacacataac aggacaccag aa犯cttccc ctgcaaaaat 720
ttggatgaaa actactgccg caatcctgac ggaaaaaggg ccccatggtg ccatacaacc 780
aacagccaag tgcggtggga gtactgtaag ataccgtcct gtgactcctc cccagtatcc 840
acggaacaat tggctcccac agcaccacct gagctaaccc ctgtggtcca ggactgctac 900
catggtgatg gacagagcta ccgaggcaca tcctccacca ccaccacagg aaagaagtgt %0
cagtcttggt catctatgac accacaccgg caccagaaga ccccagaaaa ctacccaaat 1020
gctggcctga caatgaacta ctgcaggaat ccagatgccg ataaaggccc ctggtgtttt 1080
accacagacc ccagcgtcag gtgggagtac tgcaacctga aaaaatgctc aggaacagaa 1140
gcggctagcg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atggagggct cgagcatcac 1200
caccatcacc atcattga
〈210〉 19
〈211〉 9
〈212〉 PRT 〈213〉人工合成
〈220〉
〈223> C末端Flag 〈400〉 19
Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
1218〈210> 20
〈211〉 11
〈212〉 PRT <213>人工合成
<220〉
〈223> C末端的單個(gè)Myc
<400> 20
Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10
〈210> 21
〈211> 7
<212> PRT 〈213〉人工合成
〈220〉
<223> 多-組氨酸標(biāo)簽
〈400〉 21
His His His His His His His 1 權(quán)利要求
1.編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的至少胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的多核苷酸用于篩選和/或開(kāi)發(fā)在癌癥治療中有用的藥理學(xué)上有效的藥物的用途。
2. 包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的至少胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的多肽用于篩選和/或開(kāi) 發(fā)在癌癥治療中有用的藥理學(xué)上有效的藥物的用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的藥理學(xué)上有效的藥物干擾肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子受體的催化活性、功能、穩(wěn)定性和/或表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的藥理學(xué)上有效的藥物下調(diào)肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子受體的催化活性、功能、穩(wěn)定性和/或表達(dá)。
5. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述的藥理學(xué)上有效的藥物是肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子受體的抑制劑和/或拮抗劑。
6. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述的藥理學(xué)上有效的藥物選自小分子 抑制劑、適體、反義核苷酸、基于RNA的抑制劑、siRNAs、抗體、肽、顯性負(fù)性因子。
7. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述的癌癥是一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 活性失調(diào)的癌癥。
8. 檢測(cè)待測(cè)藥物作為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的拮抗劑/抑制劑的用于治療癌癥的能力 的方法，所述癌癥優(yōu)選為一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體活性失調(diào)的癌癥，所述方法包括以下 步驟(a) 將待測(cè)藥物與i)編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的至少胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的多核 普酸，ii)包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的至少胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的多肽，或iii)表達(dá)肝細(xì) 胞生長(zhǎng)因子受體的至少胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞相接觸，(b) 檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的活性、功能、穩(wěn)定性和/或表達(dá)，和(c) 選擇能降低肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的活性、功能、穩(wěn)定性和/或表達(dá)的藥物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8-ll中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)中所述的檢測(cè) 包含檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖。
10. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域作為治療癌癥的藥物的用途。
11. 包含至少一個(gè)編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的胞外IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的核苷酸的載 體作為治療癌癥的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了編碼或包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體胞外至少IPT-3和IPT-4結(jié)構(gòu)域的多核苷酸或多肽用來(lái)篩選和/或開(kāi)發(fā)在癌癥治療中有用的藥理學(xué)上有效的藥物的用途，優(yōu)選肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體失調(diào)的癌癥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101619361SQ20091013673
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者保羅·卡米那提, 保羅·瑪麗亞·科莫格里奧, 保羅·米切尼, 克里斯緹娜·巴西利克 申請(qǐng)人:梅思爾斯平移研究有限公司