使用對受體的親和力增加的突變型light分子用于癌癥治療的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】公開了使用與靶向試劑連接、融合或綴合的LIGHT蛋白質(zhì)的具體形式靶向腫瘤細(xì)胞的方法和組合物。這些組合物與人和小鼠受體兩者結(jié)合，其親和力足以進(jìn)行臨床前和臨床試驗，并且與野生型人LIGHT蛋白質(zhì)相比較具有增加的親和力。LIGHT的具體形式對腫瘤細(xì)胞的靶向減少腫瘤生長并減少轉(zhuǎn)移。
【專利說明】使用對受體的親和力增加的突變型LIGHT分子用于癌癥治 療的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求于2011年12月15日提交的美國臨時專利申 請?zhí)?1/576, 222的優(yōu)先權(quán)利益。引用的申請中所述的公開內(nèi)容，包括如最初提交給美國專 利與商標(biāo)局的所有信息，整體通過引用并入本文作。
[0003] 序列表
[0004] 本專利申請含有已經(jīng)由EFS-Web以ASCII形式提交并在此整體引入作為參考的序 列表。所述ASCII拷貝于2012年12月5日創(chuàng)建，命名為700286_SEQ_ST25. txt并且大小 為54,899字節(jié)。

【背景技術(shù)】
[0005] 公開了使用與靶向試劑連接、融合或綴合的LIGHT蛋白質(zhì)的具體形式靶向腫瘤細(xì) 胞的方法和組合物。這些組合物與人和小鼠受體兩者結(jié)合，其親和力足以進(jìn)行臨床前和臨 床試驗，并且與野生型人LIGHT蛋白質(zhì)相比較具有增加的親和力。LIGHT的具體形式對腫瘤 細(xì)胞的靶向減少腫瘤生長并減少轉(zhuǎn)移。
[0006] 在免疫活性宿主中浸潤已建立的腫瘤的少量活化T細(xì)胞幫助解釋宿主處置腫瘤 的無能。在動物模型中的實驗以及臨床研究指示免疫系統(tǒng)可以識別并殺死個別腫瘤細(xì)胞， 但宿主一般不能根除已建立的實體瘤。存在可能是宿主有效響應(yīng)已建立的腫瘤的失敗的 幾種解釋：1)由于轉(zhuǎn)移至淋巴樣組織的腫瘤細(xì)胞（尤其是非造血起源的那些）數(shù)目的不 足夠，由于在淋巴樣組織中的弱直接或間接呈遞，缺乏早期T細(xì)胞引發(fā)（priming) ;2)由于 在腫瘤組織周圍的生物學(xué)障礙，遷移至腫瘤位點的免疫細(xì)胞的數(shù)目不足夠；3)由于儲庫有 限，耗盡或短命的活化抗原特異性T細(xì)胞未能對抗腫瘤生長；4) T細(xì)胞對腫瘤的無應(yīng)答性或 忽略；5)抑制性微環(huán)境或在腫瘤內(nèi)缺乏活化免疫系統(tǒng)的刺激。
[0007] 在臨床上，增加 T細(xì)胞對腫瘤部位的浸潤與更佳的預(yù)后緊密相關(guān)。存在預(yù)防性疫 苗接種在誘導(dǎo)接種的腫瘤細(xì)胞排斥中有效的報道。然而，在腫瘤生長已建立后，治療疫苗通 常未能排斥腫瘤。腫瘤的手術(shù)減少不增強(qiáng)對腫瘤的免疫應(yīng)答。此外，據(jù)報道即使在腫瘤細(xì) 胞上的強(qiáng)抗原的表達(dá)也不足以促進(jìn)已建立的腫瘤的排斥，盡管在淋巴樣組織中存在過量數(shù) 目的抗原特異性T細(xì)胞。引發(fā)和/或浸潤已建立的腫瘤的T細(xì)胞缺乏是針對抗原性癌癥的 天然或治療方法的主要障礙之一。另外，在腫瘤組織內(nèi)部的共刺激分子的表達(dá)不充分可能 未能活化浸潤T細(xì)胞，并且導(dǎo)致腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的無能。
[0008] 早期T細(xì)胞引發(fā)的缺乏可能由于僅少數(shù)腫瘤細(xì)胞從實體組織遷移到淋巴樣組織 用于直接呈遞。使用骨髓嵌合體的遺傳分析已揭示用于引發(fā)MHC-I限制性CD8+T細(xì)胞的兩 種抗原呈遞模式。直接引發(fā)由T細(xì)胞與合成具有抗原表位的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的接合介導(dǎo)，而 交叉引發(fā)由吸收通過其他細(xì)胞合成的抗原的宿主抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)。腫瘤特異性T細(xì)胞被 引發(fā)的機(jī)制已進(jìn)行熱烈討論，并且至今仍然沒有定論。理解腫瘤抗原如何并在哪里呈遞給 T細(xì)胞將幫助找到針對腫瘤的治療作用。
[0009] LIGHT(與淋巴毒素同源，顯示出可誘導(dǎo)的表達(dá)，并且與HSV糖蛋白D競爭皰 疹病毒進(jìn)入介質(zhì)，由T淋巴細(xì)胞表達(dá)的受體）是TNF配體超家族的II型跨膜糖蛋白。 LIGHT (TNFSF14)是與淋巴毒素 β受體（LTiiR)和皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)相互作用的腫瘤壞死 因子（TNF)家族成員，其主要分別在基質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá)。LTiiR發(fā)信號是組構(gòu)的淋巴 樣結(jié)構(gòu)形成所需的，這可以至少部分由于其誘導(dǎo)趨化因子和粘附分子表達(dá)的能力，所述趨 化因子和粘附分子吸引淋巴樣器官中的幼稚T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC)。在體內(nèi)通過LIGHT 刺激基質(zhì)細(xì)胞上的LT β R導(dǎo)致CCL21的表達(dá)，所述CCL21在不存在LTaB (LT β R的另一種配 體）的情況下吸引脾臟的T細(xì)胞區(qū)域中的幼稚T細(xì)胞。這些結(jié)果證實LIGHT能夠與LTiiR 相互作用，以調(diào)節(jié)CCL21趨化因子表達(dá)。另外，LIGHT顯示出用于T細(xì)胞引發(fā)和擴(kuò)增的有力 的CD28不依賴性共刺激活性，導(dǎo)致針對腫瘤增強(qiáng)的T細(xì)胞免疫和/或增加的自身免疫。經(jīng) 由LTiiR發(fā)信號是組構(gòu)的淋巴樣組織形成所需的。淋巴毒素 B受體（LTPR)在淋巴樣結(jié)構(gòu) 形成中起重要作用。LTiiR通過TNF家族的兩個成員：膜淋巴毒素 B和LIGHT活化。LTiiR 在淋巴結(jié)（LN)的形成以及次級淋巴樣器官中的T、B區(qū)帶的不同組構(gòu)中起關(guān)鍵作用。經(jīng)由 LT β R發(fā)信號調(diào)節(jié)次級淋巴樣器官的趨化因子和粘附分子表達(dá)。趨化因子和粘附分子控制 脾臟中DC和淋巴細(xì)胞的遷移和定位。在非淋巴樣組織中可溶性LT或TNF的過表達(dá)足以促 進(jìn)肝內(nèi)淋巴樣新生。
[0010] LIGHT也已被稱為HVEM-L和LT- γ。在新TNF命名法下，它被稱為TNFSF14。LIGHT 是240個氨基酸（aa)的蛋白質(zhì)，其含有37aa的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、22aa的跨膜區(qū)和181aa的細(xì) 胞外結(jié)構(gòu)域。類似于其他TNF配體家族成員，LIGHT預(yù)測裝配為同三聚體。LIGHT由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生，并且首先通過其與HSV糖蛋白D競爭HVEM結(jié)合的能力得到鑒定。LIGHT也已顯 示與淋巴毒素 B受體（LTPR)和誘餌受體（DcR3TR6)結(jié)合。
[0011] LIGHT在T細(xì)胞活化和淋巴樣組織形成中起獨特作用。LIGHT和LT β R之間的相 互作用恢復(fù)LT α +小鼠的脾臟中的淋巴樣結(jié)構(gòu)。另外，LIGHT的上調(diào)引起T細(xì)胞活化并遷 移到非淋巴樣組織，提供淋巴樣結(jié)構(gòu)的形成。相反，LIGHT+小鼠顯示受損的T細(xì)胞活化和 延遲的心臟排斥。因此，LIGHT是有力的共刺激分子，其也促進(jìn)淋巴樣組織的形成，以增強(qiáng) 局部免疫應(yīng)答。在引流淋巴樣組織中幼稚T細(xì)胞的有效引發(fā)的缺乏和在腫瘤內(nèi)擴(kuò)增腫瘤特 異性T細(xì)胞的無能阻止癌癥的根除。
[0012] 微小轉(zhuǎn)移灶（顯微鏡可見的癌細(xì)胞的小聚集體）可以在異質(zhì)原發(fā)性腫瘤發(fā)育中的 極早期變得建立，并且在其臨床檢測到之前種植遠(yuǎn)側(cè)組織部位。例如，當(dāng)原發(fā)性腫瘤大小極 小時，可以觀察到在乳腺癌中的可檢測轉(zhuǎn)移灶。因此，在診斷時，許多癌癥患者已經(jīng)具有微 觀轉(zhuǎn)移灶，該觀察已導(dǎo)致用于具有實體瘤的患者的手術(shù)后佐劑治療的發(fā)展。盡管這些進(jìn)展， 成功仍是有限的，并且轉(zhuǎn)移性疾病的最佳治療仍在癌癥治療中構(gòu)成顯著挑戰(zhàn)。
[0013] 多種人和鼠癌癥已證明為抗原性的，并且能夠由T細(xì)胞識別。腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞 理論上可以找出并破壞腫瘤抗原陽性癌細(xì)胞，并且放過周圍健康組織。然而，針對人中的惡 性腫瘤的天然存在的T細(xì)胞應(yīng)答通常不足以引起腫瘤，原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的消退。已報 道散發(fā)性自發(fā)性、但免疫原性腫瘤，通過誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受而避免破壞。然而，腫瘤抗原特異 性T細(xì)胞的活化可完全阻止自發(fā)性腫瘤的發(fā)展。因此，在原發(fā)性腫瘤治療時破壞耐受并生 成能夠拒絕腫瘤的此類T細(xì)胞代表清除轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的潛在方法。因為抗原喪失的變體 可以在免疫壓力下逃避，所以不依賴于特異性腫瘤抗原的了解，免疫治療應(yīng)是可應(yīng)用的。
[0014] 從免疫學(xué)角度來看，目前的臨床策略妨礙針對惡性腫瘤的免疫防御，并且進(jìn)一步 減小免疫治療的有效性。盡管腫瘤的去除可以逆轉(zhuǎn)腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制，但在免疫治療之 前原發(fā)性腫瘤的手術(shù)切除還去除抗原的主要來源，這可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL) 活化的減少，因為引發(fā)的效率與腫瘤抗原負(fù)荷關(guān)聯(lián)。另外，意欲殺死殘留腫瘤細(xì)胞的，包括 化學(xué)治療和放射治療的目前輔助治療，實際上可以通過破壞或抑制T細(xì)胞而損害抗腫瘤免 疫應(yīng)答。
[0015] 轉(zhuǎn)移性疾病是癌癥中的發(fā)病率和死亡率的主要原因。雖然手術(shù)、化學(xué)療法或輻射 通常可以控制原發(fā)性腫瘤生長，但彌散性轉(zhuǎn)移灶的成功根除仍是罕見的。一個未解決的問 題是此類應(yīng)答是否允許新來的CTL被教育，并且隨后離開腫瘤部位。另一個未解決的問題 是這些CTL隨后是否可以巡察并有效消除在周圍的自發(fā)性轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。腫瘤用LIGHT 的局部治療生成很多腫瘤特異性CTL，其離開原發(fā)性腫瘤并浸潤遠(yuǎn)側(cè)腫瘤，以完全根除先前 存在的自發(fā)性轉(zhuǎn)移灶。
[0016] 如上所述，針對人中的惡性腫瘤的天然存在的T細(xì)胞應(yīng)答通常不足以引起腫瘤、 原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移細(xì)胞的消退。免疫療法將有可能引發(fā)腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，其可以尋找并 破壞彌散性腫瘤抗原陽性癌細(xì)胞，同時放過周圍健康組織，但荷瘤宿主的主動疫苗接種僅 顯示有限的利益。大多數(shù)腫瘤中充分確定的抗原的缺乏限制主動疫苗接種或過繼轉(zhuǎn)移治 療。即使不測定特異性腫瘤抗原也有效的免疫療法將是更可應(yīng)用的以及在治療上更可行 的。然而，仍不明確何時和如何增強(qiáng)針對腫瘤組織的主動免疫應(yīng)答。
[0017] 幼稚或效應(yīng)記憶T細(xì)胞可以通過主動過程離開周圍并進(jìn)入引流淋巴結(jié)內(nèi)。尚未知 召募至原發(fā)性腫瘤的足夠數(shù)目的腫瘤特異性CTL是否可以存活并離開微環(huán)境，以巡察周圍 組織并根除彌散性轉(zhuǎn)移灶。另外，開發(fā)有效免疫治療中的挑戰(zhàn)是設(shè)計增加循環(huán)腫瘤特異性T 細(xì)胞的數(shù)目或增強(qiáng)循環(huán)腫瘤特異性T細(xì)胞的功能的方法，所述循環(huán)腫瘤特異性T細(xì)胞可以 在微觀轉(zhuǎn)移細(xì)胞變得臨床上有意義之前檢測并破壞它們。LIGHT遞送到原發(fā)性腫瘤內(nèi)可以 幫助生成CTL，所述CTL隨后可以離開局部腫瘤并且巡察周圍組織，以在轉(zhuǎn)移灶在臨床上有 意義之前根除它們。
[0018] 批準(zhǔn)的乳腺癌治療包括手術(shù)、輻射、化學(xué)療法（例如多柔比星、紫杉醇）、發(fā)信號抑 制劑（例如拉帕替尼、奈拉替尼）和單克隆抗體（例如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）。赫賽 汀（曲妥珠單抗）是批準(zhǔn)的用于乳腺癌的抗Her2抗體療法。Her2(人表皮生長因子受體 2(c-erbB2或neu)在25-30%的人乳腺癌中是擴(kuò)增的。Her2的過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。
[0019] 采用在人IgG構(gòu)架上的鼠抗原結(jié)合殘基的靶向Her2的人源化單克隆抗體在1998 年由FDA批準(zhǔn)用于單一療法?？傮w應(yīng)答率對于單一療法在11. 6-35%之間。
[0020] 然而，存在關(guān)于抗Her2抗體療法的問題。對于抗Her2/neu療法，存在低于所需的 治療成功和大量無應(yīng)答率?？笻er2/neu療法需要連同化學(xué)療法一起的延長治療才有效。大 多數(shù)患者發(fā)展抗性并且在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，并且治療可以花費超過$100, 000USD。
[0021] 幾種策略可以改善治療抗體功效：
[0022] a.細(xì)胞毒性或免疫調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞因子（IL-2、LIGHT等）；
[0023] b.藥物綴合物（化學(xué)藥物）；
[0024] c.修改Fc介導(dǎo)的效應(yīng)，例如改變抗體同種型；
[0025] 修飾親和力或改變Fc受體結(jié)合；和增加半衰期。
[0026] 對抗原-抗體結(jié)合或設(shè)計的改善可通過下述尋求：
[0027] a.更高的親和力
[0028] b.增加或降低的內(nèi)在化
[0029] c.增加的抗體穩(wěn)定性
[0030] d.雙特異性、三特異性抗體。
[0031] 在本公開內(nèi)容中，與使用野生型LIGHT的先前結(jié)果相比較，不只用野生型LIGHT還 用LIGHT的多種具體形式靶向腫瘤生成針對原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的強(qiáng)免疫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0032] 用與針對腫瘤的靶向試劑連接、融合或綴合的LIGHT的具體形式例如突變型 LIGHT蛋白質(zhì)、肽或其片段靶向腫瘤細(xì)胞減少腫瘤的生長，并且還減少轉(zhuǎn)移包括微小轉(zhuǎn)移。 靶向試劑包括抗體。進(jìn)一步地，與針對腫瘤抗原的抗體連接的細(xì)胞因子可針對微小轉(zhuǎn)移使 用。
[0033] LIGHT，TNF家族成員，是復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)的部分，并且是用作免疫細(xì)胞因子的極佳候 選物。（圖8)
[0034] LIGHT (TNFSF14)在淋巴樣組織、未成熟DC和活化T細(xì)胞上作為三聚體表達(dá)。
[0035] LIGHT結(jié)合靶細(xì)胞上的LTbR和HVEM。
[0036] LIGHT還結(jié)合由許多腫瘤分泌的在人中的可溶性誘餌受體3。
[0037] TNF家族成員的相互影響控制免疫調(diào)節(jié)。LIGHT的三管齊下活性使得其成為用作 免疫細(xì)胞因子的極佳候選物=LIGHT結(jié)合LT β R和HVEM兩者用于免疫調(diào)節(jié)；與LT β R相互 作用以增加趨化因子和粘附分子；并且吸引T細(xì)胞。它通過HVEM活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞用 于增加的免疫功能和腫瘤免疫；并且指導(dǎo)LT β R或HVEM表達(dá)腫瘤的細(xì)胞凋亡。（圖9)
[0038] 使用腺病毒方法和以融合蛋白形式的LIGHT對腫瘤的遞送在減少腫瘤大小和控 制轉(zhuǎn)移方面是有效的。（圖10,11)(表1)然而，使用LIGHT的融合構(gòu)建體的產(chǎn)生已經(jīng)是 有問題的。存在關(guān)于scFV(neu)-mLIGHT融合物的聚集和低生產(chǎn)問題。另外，在鼠模型 中難以顯示有效性，因為與野生型LIGHT或小鼠 LIGHT相比較，人LIGHT構(gòu)建體，例如抗 neu (Fab) -hLIGHT對小鼠受體具有減少的結(jié)合親和力。
[0039] 因此，改造了具有增加的穩(wěn)定性和親和力的LIGHT分子，其可以用于生成 scFV (neu) -LIGHT融合蛋白或其他融合蛋白，所述融合蛋白可以在體外和體內(nèi)在疾病的小 鼠模型和人中進(jìn)行測試。
[0040] 此外，公開了新突變型人LIGHT分子，其以比野生型人LIGHT (hLIGHT)更大的親和 力與LIGHT的小鼠受體結(jié)合，并且與野生型人LIGHT相比較，與LIGHT的人受體具有相等或 更大的結(jié)合。公開了對抗體介導(dǎo)的癌癥治療和用于癌癥治療的免疫療法的改善。如本文使 用的"野生型"指表征來源哺乳動物例如人、小鼠中的序列的氨基酸或核酸序列。
[0041] 對產(chǎn)生改善的LIGHT和改善的LIGHT靶向試劑融合構(gòu)建體的解決方案部分通過 下述步驟實現(xiàn)：人LIGHT (hLIGHT)( "野生型"）用作改造的平臺，因為它比小鼠 LIGHT更穩(wěn) 定。將hLIGHT改造為具有與鼠 LTbR和HVEM OnLTbR和mHVEM)以及人LTbR和HVEM (hLTbR 和hHVEM)相等或更大的結(jié)合，以及改善的表達(dá)和穩(wěn)定性，以易于生產(chǎn)并增加治療效果（圖 17,18)。在這個意義上，經(jīng)改造的LIGHT分子"衍生"自LIGHT。
[0042] hLIGHT進(jìn)行改造，并且鑒定了具有增加的小鼠 LT PR和小鼠 HVEM結(jié)合（圖21)以 及與人LTiiR和人HVEM的有利結(jié)合的克隆（圖23)。與小鼠和人受體的結(jié)合的證實在CHO 細(xì)胞中產(chǎn)生的scFV-LIGHT融合物中進(jìn)行（圖23)。人突變型LIGHT構(gòu)建體在體外作為融合 蛋白進(jìn)行測試。如通過細(xì)胞計數(shù)和MTS測量的，與單獨的7164抗體或單獨的人LIGHT相比 較，7164-m4-14LIGHT (其為新的與ScFV(neu)融合的更高親和力的人突變型LIGHT分子之 一）明顯更佳地減慢TUBO細(xì)胞的生長。（圖25, 26)
[0043] 人突變型LIGHT構(gòu)建體在體外和體內(nèi)在腺病毒構(gòu)建體中就其刺激宿主免疫應(yīng)答 的潛在功能進(jìn)行測試（圖29)。人LIGHT突變體m4-14細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域連同編碼抗neu抗體 片段的單鏈片段（scFv) -起遞送（ad-neu-突變型LIGHT)。與含有未經(jīng)修飾的人LIGHT細(xì) 胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體（ad-neu-人LIGHT)相比較，ad-neu-突變型LIGHT在體內(nèi)和體內(nèi)改 善針對neu的CD8+CTL應(yīng)答（圖30-32, 35)。與含有ad-neu-人LIGHT的構(gòu)建體相比較， ad-neu-突變型LIGHT也刺激增加數(shù)目的抗neu抗體的產(chǎn)生（圖33)。當(dāng)作為抗癌疫苗進(jìn)行 測試時，ad-neu-突變型LIGHT在預(yù)防腫瘤方面比僅含neu的疫苗更有效（圖34)，并且具 有增加的neu特異性細(xì)胞殺死（圖36)。LIGHT可以經(jīng)由HVEM受體刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN， 同時經(jīng)由LTbR刺激MEF以產(chǎn)生IL-6。圖37證實突變型LIGHT在Rag-I-脾細(xì)胞中誘導(dǎo)比 Wt LIGHT高得多的IFN-γ生產(chǎn)。圖38證實突變型LIGHT在MEF細(xì)胞中誘導(dǎo)比Wt人LIGHT 更高的IL-6生產(chǎn)。因此，突變型LIGHT是比Wt LIGHT更強(qiáng)的刺激物。
[0044] 在手術(shù)前經(jīng)由抗體-人-突變型LIGHT融合物、人突變型LIGHT的腺病毒遞送 或綴合組合物在腫瘤組織中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，生成足夠的引發(fā)抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞，其 離開腫瘤并根除轉(zhuǎn)移灶。對癌癥抗原特異性的抗體和對蛋白酶消化抗性的LIGHT(例如 在LIGHT的位置81-84區(qū)域中的突變型LIGHT形式）也可以分開施用。在手術(shù)切除前用 TNFSF14(LIGHT)靶向原發(fā)性腫瘤是引發(fā)用于根除自發(fā)轉(zhuǎn)移灶的更佳免疫應(yīng)答的新策略。用 人突變型LIGHT治療的處理減慢侵襲性腫瘤的生長。
[0045] 適合于癌癥治療的組合物包括與人LIGHT蛋白質(zhì)的片段連接、融合或綴合的腫瘤 特異性抗體，其中LIGHT片段對腫瘤環(huán)境中的蛋白酶消化是抗性的，并且足以誘導(dǎo)針對腫 瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
[0046] 合適的組合物包括腫瘤特異性靶向試劑和相對于人野生型序列具有突變的突變 型LIGHT氨基酸序列（圖6和7)，或與人突變型LIGHT蛋白質(zhì)的片段連接的腫瘤特異性靶 向試劑。靶向試劑和人突變型LIGHT蛋白質(zhì)的片段可以形成融合蛋白，或LIGHT蛋白質(zhì)的 片段可以與靶向試劑或靶向試劑的片段化學(xué)綴合或以其他方式連接。
[0047] 組合物包括通過合適的方法例如直接注射、腺病毒載體、微球體或納米顆粒遞送 至腫瘤的能力。
[0048] 衍生自LIGHT蛋白質(zhì)的任何肽片段包括重組肽、合成肽、重組LIGHT蛋白質(zhì)、突變 型LIGHT蛋白質(zhì)、截短的LIGHT蛋白質(zhì)、LIGHT的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、LIGHT的保守結(jié)構(gòu)域、類似 LIGHT結(jié)構(gòu)域的肽模擬物、具有經(jīng)修飾的氨基酸的LIGHT蛋白質(zhì)或其肽，通過使其與腫瘤特 異性試劑例如抗體或其片段連接、融合或綴合而適用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，條件是LIGHT片段 能夠穩(wěn)定存在于腫瘤細(xì)胞表面上，并且對于LIGHT的小鼠和人受體具有增加的親和力。 [0049] 合適的組合物包括人源化單克隆抗體或嵌合抗體或異微型抗體 (heterominibody)或單鏈抗體。
[0050] 與LIGHT結(jié)合使用的抗體片段足以識別腫瘤抗原。片段足以刺激細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞。
[0051] LIGHT的片段可以包括LIGHT的約100-150個氨基酸。
[0052] LIGHT的片段可以具有對應(yīng)于LIGHT的位置約85-240的氨基酸序列。LIGHT的片 段還可以包括LIGHT的約100-150個氨基酸。LIGHT的片段可以包括來自LIGHT的位置約 90-240的氨基酸序列。LIGHT的片段可以包括來自LIGHT的位置約84-240或83-240或 82-240的氨基酸序列。
[0053] LIGHT的片段還可以包括LIGHT的約100-150個氨基酸，條件是該片段能夠誘導(dǎo)針 對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。LIGHT的片段可以包括來自LIGHT的位置約90-235的氨基酸序 列。
[0054] LIGHT的片段誘導(dǎo)蛋白酶抗性片段。LIGHT的片段可以包括在蛋白酶識別序列 EQLI (SEQ ID NO: 1)中的突變。
[0055] 包括新型人突變型LIGHT細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的組合物適合于癌癥治療。公開了這樣的 組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列中的至少一種的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域：
[0056] QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSY HDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYICRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLG GVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID N0:2)〇
[0057] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0058] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLSGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLGERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:3)
[0059] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0060] RRSHEVNPAAHLTGANSSSTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:4)
[0061] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0062] RRSHEVNPAAHLTGANFSLTGSGGPLLWETQLGQAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDDRLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:5)
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[0078] RRSHEVNPAAHLTGANFSLTGSGGPLLWETQLGQAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDDRLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:5)
[0079] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
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[0081] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0082] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVATKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTISHGLYKRTPRYPEELELLVSLRSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:12)
[0083] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0084] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVNQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:13)
[0085] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
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[0087] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
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[0089] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0090] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGQAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLANTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRMWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:15)
[0091] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0092] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLASPITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGWHLEAGEKVWRVLDERLVRQ ⑶ G TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:16)
[0093] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0094] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTFTHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRASSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:17)
[0095] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0096] RSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCP LGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGT RSYFGAFMV(SEQ ID NO:18)
[0097] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0098] RRSHEVNPAAHLTGANSNLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVQDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:19)
[0099] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0100] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:20)
[0101] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0102] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0103] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWEPQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLTRTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATPSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLMDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:21)
[0104] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0105] RGSHEVNPAAHLTGASSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:22)
[0106] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0107] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGRASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVQDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:23)
[0108] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0109] RSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLSFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGCP LGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSSLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLMDGT RSYFGAFMV(SEQ ID NO:24)
[0110] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0111] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:20)
[0112] 公開了這樣的組合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域：
[0113] QRSHEVNPAAHLTGANSSPTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSLQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRPRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO :25)
[0114] 與人和小鼠受體結(jié)合的新型人LIGHT細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在圖6、7和28中列出。本文公 開的LIGHT突變體在其生物學(xué)特性及其功效方面是出乎意料的。如圖21中所示（"hLIGHT 突變體具有增加的與mLTbR和mHVEM的結(jié)合親和力"），這些新突變體不僅具有增加的對于 小鼠 LIGHT受體的結(jié)合親和力，與野生型人LIGHT相比較，還具有顯著增加的對于人LIGHT 受體的結(jié)合親和力。另外，與野生型人LIGHT相比較，這些突變體具有增加的穩(wěn)定性。除 了其顯著改善的交叉物種親和力之外，這些突變體在細(xì)胞殺死方面還基本上比野生型人 LIGHT更有效，如圖31和32中所示（超級LIGHT可以改善對neu的⑶8CTL應(yīng)答--體內(nèi) 殺死")。在本發(fā)明時本領(lǐng)域技術(shù)人員無法預(yù)測，可以生成會具有這些特性的LIGHT突變體。 圖6和7顯示許多突變體具有在214處突變?yōu)镋的K，這也是小鼠序列中的情況。特別有利 的是突變體m4_14、m4_7和m4_16。
[0115] 減少原發(fā)性腫瘤的生長和/或癌癥轉(zhuǎn)移的方法包括下述步驟：
[0116] 施用包含與LIGHT的具體化中的至少一種例如片段連接的腫瘤特異性抗體的藥 物組合物；和
[0117] 通過刺激針對腫瘤特異性T細(xì)胞的活化，減少原發(fā)性腫瘤的生長和/或癌癥轉(zhuǎn)移。
[0118] 該抗體識別表面腫瘤抗原，并且該抗體可以與LIGHT片段化學(xué)綴合或者與LIGHT 片段重組融合或以其他方式連接。
[0119] 包括抗體-LIGHT的藥物組合物可以通過技術(shù)人員已知或本文公開的其他方法靜 脈內(nèi)施用。
[0120] 減少原發(fā)性腫瘤的生長和/或癌癥轉(zhuǎn)移的方法包括下述步驟：
[0121] (a)施用包含與LIGHT的至少一種具體形式連接的腫瘤特異性抗體的藥物組合 物；
[0122] (b)在腫瘤部位處將編碼其LIGHT具體形式的核酸分子引入個體內(nèi)，其中LIGHT是 蛋白酶抗性的；和
[0123] (C)通過刺激針對腫瘤的腫瘤特異性T細(xì)胞的活化，減少原發(fā)性腫瘤的生長癌癥 轉(zhuǎn)移。
[0124] 核酸可以遞送至先前存在的腫瘤部位或相對于先前存在的腫瘤部位遠(yuǎn)側(cè)的部位。
[0125] 化學(xué)治療劑還可以在抗體-LIGHT治療過程中或之前或之后施用。
[0126] 放射療法還可以在LIGHT治療過程中或之前或之后施用。
[0127] 對腫瘤抗原特異性的抗體的具體形式可以選自HER2、HER4、HERB、STEAP、c-MET、 EGFR、甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、CA-125、MUC-1、上皮腫瘤抗原（ETA)、酪氨酸酶、黑 色素瘤相關(guān)抗原（MAGE)、ras或p53的異常產(chǎn)物、DcR3及任何其他抗癌抗原。
[0128] 減少原發(fā)性腫瘤的生長和/或癌癥轉(zhuǎn)移的方法包括下述步驟：
[0129] (a)施用包含腫瘤特異性抗體的藥物組合物；
[0130] (b)在腫瘤部位處引入編碼LIGHT蛋白質(zhì)或其片段的核酸分子，其中LIGHT是蛋白 酶抗性的；
[0131] (c)在腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)LIGHT蛋白質(zhì)或其片段；和
[0132] (d)通過刺激針對腫瘤的腫瘤特異性T細(xì)胞的活化，減少腫瘤的生長和/或癌癥轉(zhuǎn) 移。
[0133] 公開了包括識別腫瘤抗原的肽區(qū)域和LIGHT蛋白質(zhì)的片段的嵌合蛋白。試劑可以 是結(jié)合腫瘤表面受體的配體。
[0134] 描述了包括LIGHT蛋白質(zhì)的片段和特異性識別腫瘤細(xì)胞的試劑的組合物。
[0135] 藥物組合物包括與腫瘤特異性組分偶聯(lián)的LIGHT肽片段。腫瘤特異性組分可以包 括針對腫瘤細(xì)胞表面中的受體的配體或識別腫瘤細(xì)胞表面上的配體的受體。
[0136] 治療腫瘤（特別是實體瘤）的新型方法是通過使用突變型LIGHT分子產(chǎn)生淋巴樣 微環(huán)境，其表達(dá)引發(fā)幼稚T細(xì)胞和擴(kuò)增活化T細(xì)胞所需的趨化因子、粘附分子和共刺激分 子。生成針對腫瘤的更廣泛的T細(xì)胞。抗體-LIGHT融合物或綴合物的直接遞送針對腫瘤 和轉(zhuǎn)移灶是有效的。與用對照治療的腫瘤相比較，當(dāng)抗體-LIGHT綴合物或融合產(chǎn)物靶向腫 瘤時，腫瘤體積在體內(nèi)減少。
[0137] 在多種實施方案中，突變型人LIGHT具有在蛋白酶解位點中的氨基酸變化，所述 蛋白酶解位點包括來自天然LIGHT蛋白質(zhì)的位置81-84的氨基酸序列EQLI(SEQ ID NO: 1)。 在一個實施方案中，突變型LIGHT不具有蛋白酶解位點，來自天然LIGHT蛋白質(zhì)的位置 81-84 的氨基酸序列 EQLI (SEQ ID NO: 1)。
[0138] 在多種實施方案中，突變型人LIGHT具有在位置214處的氨基酸變化，其中在位置 214處的賴氨酸變成谷氨酸。
[0139] 公開的核酸分子編碼包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組LIGHT :
[0140] QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSY HDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGG WHLEAGEKVWRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID N0:26)。
[0141] 癌癥轉(zhuǎn)移通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的刺激和/或通過用于引發(fā)幼稚T細(xì)胞的趨化 因子、粘附分子和共刺激分子的刺激得到減少。T細(xì)胞在腫瘤部位內(nèi)活化，并且可以在血液 中循環(huán)。循環(huán)T細(xì)胞優(yōu)選是癌癥特異性的。T細(xì)胞生成可以是CD8+依賴性的。
[0142] 分離的重組核酸包括編碼蛋白酶消化抗性突變型LIGHT的核苷酸序列。核苷酸序 列的實施方案是：
[0143] ATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCACGAGG CTGGGACGAAGCCACCGGAGACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTGCTGATGGGGGC TGGGCTGGCCGTCCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAGCTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACG GACCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCACGAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGG GCCAACTCCAGCTTGACCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCT CAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCACCAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGTG TGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTCTACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTG GAGCTGTTGGTCAGCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCTGGTGGGACAGCAGCTTCCT GGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGACTGCGTG ATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA(SEQ ID NO :27),
[0144] 其中編碼蛋白酶消化位點的序列GAGCAGCTGATA(SEQ ID N0:28)是突變的。
[0145] 野生型人LIGHT DNA序列（編碼蛋白酶位點EQLI (SEQ ID NO: 1)的序列以粗體顯 示）：
[0146] ATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCACGAGG CTGGGACGAAGCCACCGGAGACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTGCTGATGGGGGC TGGGCTGGCCGTCCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAGCTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACG GACCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCACGAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGG GCCAACTCCAGCTTGACCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCT CAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCACCAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGTG TGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTCTACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTG GAGCTGTTGGTCAGCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCTGGTGGGACAGCAGCTTCCT GGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGACTGCGTG ATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA-3' （SEQ ID N0:29)。
[0147] 天然人LIGHT氨基酸序列（蛋白酶消化位點以粗體下劃線顯示）：
[0148] MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMGAGLAVOGWFLLOLHWRLGEMV TRLPDGPAGSffEOLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLffETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSK VQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDER LVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID NO :30)
[0149] 突變型人LIGHT氨基酸序列（EQLI (SEQ ID NO: 1)不存在，由點指示）的一個方 面：
[0150] MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMGAGLAVQGffFLLQLHffRLGEMV TRLPDGPAGSff. . . QERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKV QLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERL VRLRDGTRSYFGAFMV(S EQ ID N0:31)。
[0151] 以ATG開始的小鼠突變型LIGHT的密碼子最佳化的核苷酸序列以粗體突出顯示：

【權(quán)利要求】
1. 一種具有由核酸序列編碼的氨基酸序列的突變型LIGHT分子，其中所述突變型 LIGHT分子 i) 與野生型人LIGHT相比較，以增加的親和力與LIGHT的鼠受體結(jié)合，和 ii) 與野生型人LIGHT相比較，以至少相同的親和力與LIGHT的人受體結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子，其中所述突變在LIGHT的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序 列中。
3. 權(quán)利要求2的突變型LIGHT分子，其中所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域選自圖6或7中列出的氨 基酸序列（以出現(xiàn)的次序分別為 SEQ ID NO 6-8、8-10、10、4、3、5、5、11-13、12、14-17、20、 19-23、45、20 和 25)。
4. 權(quán)利要求2的突變型LIGHT分子，其具有在野生型人LIGHT蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 的位置214處的賴氨酸至谷氨酸的氨基酸置換。
5. 權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子，其選自突變型LIGHT蛋白質(zhì)、肽、蛋白質(zhì)或肽的片 段、和編碼突變型LIGHT的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。
6. 權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子，其包含衍生自人LIGHT序列的氨基酸序列。
7. -種免疫組合物，其包含權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子。
8. -種藥物組合物，其包含與權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子連接、綴合或融合的腫瘤 特異性試劑，其中所述組合物足以刺激針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述試劑與所述突變型LIGHT分子化學(xué)綴合。
10. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述試劑是人源化單克隆抗體。
11. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述試劑是嵌合抗體。
12. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述試劑是異微型抗體。
13. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述試劑是單鏈抗體。
14. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述試劑是足以識別腫瘤抗原的抗體片段。
15. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述突變型LIGHT分子包含足以刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞的 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域區(qū)段。
16. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述區(qū)段包含以人LIGHT氨基酸次序的LIGHT的約 100-150個氨基酸。
17. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述區(qū)段包含來自人LIGHT蛋白質(zhì)的位置約85-240的 氨基酸序列。
18. 權(quán)利要求8的組合物，其中突變型LIGHT包含在蛋白酶識別序列EQLI (殘基81-84) (SEQ ID NO: 1)中的突變，由此使所述蛋白酶識別序列失活。
19. 權(quán)利要求8的組合物，其中突變型LIGHT包含缺失。
20. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述突變型LIGHT包含在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的突變，所述 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含下述氨基酸序列： QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDG ALVVTKAGYYYTYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVH LEAGEKVWRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID N0:40)。
21. 突變型LIGHT細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列，其命名為m4-14、m4-7和m4-16。
22. -種藥物組合物，其包含與權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子連接、綴合或融合的腫 瘤特異性試劑，用于減少原發(fā)性腫瘤生長或用于治療癌癥轉(zhuǎn)移。
23. 人（hLIGHT)突變體分子，其如圖6和7中所示（以出現(xiàn)的次序分別為SEQ ID NO 6-8、8-10、10、4、3、5、5、11-13、12、14-17、20、19-23、45、20 和 25)。
24. -種融合蛋白，其包含權(quán)利要求23的分子和針對Her-2的抗體。
25. -種組合物，其包含與特異性識別腫瘤細(xì)胞的試劑組合的蛋白酶抗性LIGHT蛋白 質(zhì)的片段。
26. 權(quán)利要求25的組合物，其中所述試劑是針對腫瘤抗原的抗體。
27. 權(quán)利要求25的組合物，其中所述試劑是結(jié)合腫瘤表面受體的配體。
28. -種嵌合蛋白，其包含識別與LIGHT分子連接、融合或綴合的腫瘤抗原的氨基酸區(qū) 域，其中所述LIGHT分子對腫瘤環(huán)境中的蛋白酶消化是抗性的，或是突變型LIGHT分子。
29. -種將權(quán)利要求1的突變型LIGHT分子遞送至腫瘤的方法，所述方法包括：(a)具 有編碼所述分子的核酸分子的腺病毒，或；(b)納米顆粒；或（c)直接轉(zhuǎn)移。
30. -種減少原發(fā)性腫瘤的生長或癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括：(a)施用包含與 LIGHT多肽突變體或片段連接、綴合或融合的腫瘤特異性試劑的藥物組合物，其中所述組合 物足以刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生；和（b)通過刺激針對所述腫瘤的腫瘤特異性T細(xì) 胞的活化，減少原發(fā)性腫瘤的生長或癌癥轉(zhuǎn)移。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述試劑是識別表面腫瘤抗原的抗體。
32. 權(quán)利要求30的方法，其中所述試劑是對選自下述的腫瘤抗原特異的抗體：HER2、 HER4、HERB、EGFR、STEAP、c-Met、甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、CA-125、MUC-1、ras 或 P53的異常產(chǎn)物和DcR3。
33. 權(quán)利要求30的方法，其中所述試劑是與所述LIGHT片段化學(xué)綴合或與所述LIGHT 片段重組融合的抗體。
34. 權(quán)利要求30的方法，其中所述LIGHT片段包含LIGHT的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，所述細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)域包含人LIGHT蛋白質(zhì)的氨基酸85-240。
35. 權(quán)利要求30的方法，其中所述藥物組合物靜脈內(nèi)施用。
36. 權(quán)利要求30的方法，其中所述癌癥轉(zhuǎn)移通過刺激用于引發(fā)幼稚T細(xì)胞的下述中的 至少一種的產(chǎn)生得到減少：趨化因子、粘附分子和共刺激分子。
37. 權(quán)利要求30的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝 癌、白血病和皮膚癌。
38. 權(quán)利要求30的方法，其進(jìn)一步包括施用化學(xué)治療劑或放射治療。
39. -種減少腫瘤的生長和癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括：(a)施用權(quán)利要求8的組 合物；或（b)在腫瘤部位處將編碼LIGHT或其片段的核酸分子引入個體內(nèi)，其中所述LIGHT 包含在所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的突變或是蛋白酶抗性的，并且其中LIGHT穩(wěn)定存在于所述腫 瘤細(xì)胞表面上；和（c)通過刺激針對所述腫瘤的腫瘤特異性T細(xì)胞的活化，減少原發(fā)性腫瘤 的生長和癌癥轉(zhuǎn)移。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中核酸遞送至先前存在的腫瘤部位或?qū)τ谙惹按嬖诘哪[瘤 部位遠(yuǎn)側(cè)的部位。
41. 一種減少原發(fā)性腫瘤和的生長癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括：(a)施用包含腫瘤 特異性抗體的藥物組合物；(b)在腫瘤部位處引入編碼LIGHT蛋白質(zhì)的核酸分子，其中所述 LIGHT是人LIGHT蛋白質(zhì)或其突變體或片段，或是蛋白酶抗性的；（c)在腫瘤細(xì)胞的表面上 穩(wěn)定表達(dá)所述LIGHT蛋白質(zhì)或其片段；和（d)通過刺激針對所述腫瘤的腫瘤特異性T細(xì)胞 的活化，減少所述腫瘤的生長和癌癥轉(zhuǎn)移。
【文檔編號】A61K47/48GK104284680SQ201280069840
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月15日
【發(fā)明者】Y·X·傅 申請人:芝加哥大學(xué)