T細(xì)胞表位肽p12及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽及其應(yīng)用。所述表位肽的氨基酸序列為AVMAGIVRAAK，該表位肽與HLA-A*1101分子親和力高，能活化CD8+T細(xì)胞、誘導(dǎo)其增殖和分泌IFN-γ。本發(fā)明表位肽的確定，為結(jié)核病疫苗、診斷試劑和治療藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和新的解決方案，對(duì)結(jié)核病的防治具有重大意義。
【專利說(shuō)明】結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽P12及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽及 其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染后誘發(fā)、全球感染率最高的傳染病，病死率僅次于 艾滋病。僅2012年，全球新發(fā)結(jié)核病患者達(dá)860萬(wàn)，死亡130萬(wàn)。結(jié)核病疫情的新特點(diǎn)在 于：耐藥結(jié)核病例出現(xiàn)并呈蔓延之勢(shì)；結(jié)核與艾滋病共感染情況愈演愈烈。針對(duì)這兩類患 者，目前并無(wú)有效的防治措施。中國(guó)是世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家之一，研發(fā)適合中國(guó)人 群的結(jié)核病疫苗和治療藥物已時(shí)不我待。
[0003] 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是胞內(nèi)寄生菌，對(duì)其有效控 制主要依賴于細(xì)胞免疫，尤其是T細(xì)胞免疫。人體內(nèi)T細(xì)胞主要分為CD4+T(Th)細(xì)胞和 CD8+T(CTL)細(xì)胞兩大亞群，大量研究已經(jīng)證明，這兩種T細(xì)胞亞群對(duì)于控制結(jié)核菌感染都具 有重要作用，其中⑶8+CTL更是清除結(jié)核菌的主力軍。
[0004]T細(xì)胞無(wú)法識(shí)別完整的結(jié)核菌和蛋白抗原，而是識(shí)別經(jīng)過(guò)抗原遞呈細(xì)胞攝取和加 工后釋放出的結(jié)核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫應(yīng)答的核心部份，也稱為抗原決定簇， 它與抗原遞呈細(xì)胞表面的HLA分子結(jié)合形成肽-HLA復(fù)合物并被遞送和表達(dá)在抗原遞呈細(xì) 胞表面，進(jìn)而活化T細(xì)胞，誘發(fā)T細(xì)胞免疫反應(yīng)。CD4+T細(xì)胞識(shí)別HLAII類分子遞呈的表位 肽，而CD8+T細(xì)胞識(shí)別HLAI類分子遞呈的表位肽。T細(xì)胞對(duì)表位肽的識(shí)別及其活化要求表 位肽與抗原遞呈細(xì)胞表面HLA分子穩(wěn)定結(jié)合，而肽與HLA分子的親和力是形成肽-HLA復(fù)合 物的關(guān)鍵，因此制備誘發(fā)T細(xì)胞免疫的治療藥物和疫苗，首要步驟是篩選出高親和力的肽， 進(jìn)而鑒定出具有免疫活性的表位肽。
[0005] 表位肽可以完全通過(guò)人工合成獲得，研發(fā)周期短；由于剔除了表位肽以外病原體 其他有害成分，安全性良好；還可以將多個(gè)表位肽串聯(lián)使用，加強(qiáng)免疫效果和減少免疫逃 逸。目前已知的結(jié)核菌CTL表位肽主要是在歐美人群中鑒定，多為HLA-A*0201限制性， 而對(duì)于結(jié)核病流行最嚴(yán)重的非洲和東南亞人群，并沒有合適的表位肽可使用。在中國(guó)， HLA-A*1101是人群中基因頻率最高的HLA分子，鑒定HLA-A*1101限制性CTL表位對(duì)于研發(fā) 適合中國(guó)人群的表位肽疫苗具有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供該結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽在制備結(jié)核 病疫苗、診斷試劑和治療藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供了與HLA-A*1101分子親和力高，能活化⑶8+T細(xì)胞、誘導(dǎo)其增殖和 分泌IFN-y的結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列為： AVMAGIVRAAK(SEQIDN0.12)WP:Ala-Val-Met-Ala-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Ala-Lys)。
[0010] 本發(fā)明結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法和紫外誘導(dǎo)肽置換實(shí)驗(yàn)，利用結(jié)核分枝桿菌自身 的抗原篩選出具有抗結(jié)核活性的表位肽，高效準(zhǔn)確地檢測(cè)出表位肽AVMAGIVRAAK(SEQID NO. 12)與HLA-A*1101分子之間的親和力。這是新的、未被報(bào)道過(guò)的HLA-A*1101限制性結(jié) 核分枝桿菌表位肽，被結(jié)核病人CD8+T細(xì)胞廣泛識(shí)別。由于HLA-A*1101基因型是中國(guó)人中 最廣泛攜帶的基因型，目前并未發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌特異的HLA-A*1101限制性CTL表位肽， 本發(fā)明表位肽的確定，為結(jié)核病疫苗、診斷試劑和治療藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和新的 解決方案，對(duì)結(jié)核病的防治具有重大意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為候選表位肽與HLA-A*1101分子親和力示意圖。
[0012] 圖2為22條高親和力的表位肽誘導(dǎo)結(jié)核患者T細(xì)胞活化并分泌IFN-Y的示意圖。
[0013] 圖3為ELISP0T檢測(cè)P12誘導(dǎo)結(jié)核患者T細(xì)胞分泌IFN-Y的示意圖。
[0014] 圖4為P12的質(zhì)譜分析圖。
[0015] 圖5為CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P12誘導(dǎo)結(jié)核患者⑶8+T細(xì)胞增殖的 結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用CBS數(shù)據(jù)庫(kù)中的 NetMHCcons表位預(yù)測(cè)軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的HLA-A*1101限制性CTL表位肽進(jìn)行 了預(yù)測(cè)分析，然后采用紫外誘導(dǎo)肽置換實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)候選肽與HLA-A*1101分子結(jié)合的親和力 和穩(wěn)定性，篩選獲得表位肽，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)鑒定，CTL表位肽P12可誘導(dǎo)⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈 的細(xì)胞免疫應(yīng)答，分泌高水平IFN-Y，并誘導(dǎo)⑶8+T細(xì)胞發(fā)生顯著增殖。
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0018] 應(yīng)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)HLA-A*1101限制性表位肽：
[0019]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選取94個(gè)有較強(qiáng)免疫原性的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白（如表1所 示），從GeneBank獲得各個(gè)抗原蛋白的氨基酸序列。
[0020] 表1候選結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列為： AVMAGIVRAAK (SEQ ID NO. 12)。
2. 權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽P12在制備結(jié)核病診斷試 劑及治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌特異性CD8+T細(xì)胞表位肽P12在制備結(jié)核病預(yù)防性 疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/04GK104387450SQ201410598638
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】馬驪, 劉蘇東, 羅微 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)