專利名稱：一種新型甲型流感病毒h1n1亞型雙色熒光pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本試發(fā)明涉及檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)以及甲型流感病毒各 亞型(IAV-U)mRNA的方法，特別是涉及使用雙色熒光探針定量PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光探 針法)快速準(zhǔn)確的檢測出樣品(包括咽拭子標(biāo)本、血清、分泌物及病死動物肺臟組織等標(biāo) 本)中新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型mRNA的方法。本發(fā)明進(jìn)一步 涉及用于該病毒臨床檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
新型甲型流感病毒Hmi亞型是引起豬流感(Swine Influenza, Si)的主要病原 體，該種疾病是一種急性、人畜共患呼吸道傳染性疾病。1931年分離并鑒定了第一株甲型 流感病毒Hmi亞型。1976年，經(jīng)典的甲型流感病毒Hmi亞型首次從意大利北部豬場中分 離到，這些病毒分離株與當(dāng)時流行于美國的經(jīng)典的豬流感有非常近的相關(guān)性。同年在美國 約500人感染了甲型流感病毒Hmi亞型，該病毒與當(dāng)時從豬體內(nèi)分離的病毒相同，首次證 實了在自然條件下，豬流感病毒可從豬傳播給人。國內(nèi)報道多為Hmi和H3N2導(dǎo)致豬流感。 近年來，世界各地都有人感染豬流感病毒病不同毒株特別是Hmi亞型的報道，但并沒有大 規(guī)模流行。但是2009年4月份以來墨西哥及美國等國家地區(qū)暴發(fā)了人感染甲型流感病毒的 疫情。隨后，該疫情迅速在世界范圍內(nèi)蔓延，短時間內(nèi)，墨西哥、美國、加拿大、瑞士、奧地利、 秘魯、西班牙、英國、澳大利亞、韓國等國家和地區(qū)陸續(xù)有人感染甲型流感病毒疫情發(fā)生，不 到一個月內(nèi)，全球確診病例和疑似累計幾千例，死亡幾百例，爆發(fā)之快，發(fā)展之迅速，令世人 震驚和恐懼，世界衛(wèi)生組織2009年4月29日將流感警戒級別上調(diào)至第五級，表明大流行迫 在眉捷。對此疫情，我國衛(wèi)生部和相關(guān)部門高度重視，已經(jīng)采取相應(yīng)應(yīng)對措施，包括疫情預(yù) 防控制和病原檢測。全國各大疾病預(yù)防控制中心、各省級疾病預(yù)防控制中心、醫(yī)院、各級出 入境檢驗檢疫局和各級動物疫病控制中心對此高度重視。根據(jù)世界衛(wèi)生組織研究證實，墨西哥和美國等地區(qū)發(fā)生的人感染豬流感病毒為新 型甲型流感病毒Hmi亞型毒株，該毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基 因片斷，是一種新型流感病毒。人感染后的臨床早期癥狀與流感類似，有發(fā)燒、咳嗽、疲勞、 食欲不振等，還可以出現(xiàn)腹瀉或嘔吐等癥狀。病情可迅速進(jìn)展，突然高熱、肺炎，重者可以出 現(xiàn)呼吸衰竭、多器官損傷，導(dǎo)致死亡。新型甲型流感病毒Hmi亞型屬于于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感 病毒屬(Influenza virusA)。病毒顆粒呈球狀，直徑為80nm 120nm，有囊膜。病毒由8個 分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成，病毒蛋白質(zhì)含有5種多肽，即血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)蛋白、 核蛋白和多聚酶。目前對于該種新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒的實驗室檢查主要 包括以下方面1.外周血象白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞減少，并有血小板降低；2.血清學(xué)診斷可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免 疫法等；3.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) ；3.病毒分離從患者呼吸道標(biāo)本中(咽拭 子、口腔含漱液、鼻咽或氣管吸出物、痰或肺組織等)分離并培養(yǎng)該病毒。但是確診依賴于 從呼吸道標(biāo)本或血清中分離到特定病毒；RT-PCR對上述標(biāo)本檢測，有病毒RNA存在，并要經(jīng) 過測序證實。以上主要分為兩類方法免疫學(xué)檢測方法和核酸檢測方法。免疫學(xué)方法主要 是檢測血清中是否存在新型甲型流感病毒Hmi亞型病毒的特異性抗體，具體是用ELISA的 方法進(jìn)行檢測，然而這種方法必須是建立在已經(jīng)發(fā)生病毒感染并產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)上，而且 鑒于流感病的的高度變異性以及與其他病毒血清學(xué)的交叉性，其特異性難以保證，容易出 現(xiàn)假陽性和假陰性。從標(biāo)本中分離豬流感病毒，進(jìn)行雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)可能會比較敏感， 但是這種方法需要2-3周的時間，操作程序上比較繁瑣，不宜在所有檢測實驗特別是一些 基層實驗室，比如醫(yī)院、疾病預(yù)防控制中心、檢驗檢疫中心以及動物疫病控制中心推廣。另 有普通PCR進(jìn)行新型甲型流感病毒Hmi亞型核酸檢測的方法比如反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(RT-PCR)，雖然具靈敏度比上述方法略有提高，但是這種方法僅是基于用一對核酸引物 進(jìn)行擴增，結(jié)果容易產(chǎn)生非特異性擴增，甚至?xí)驗椴僮鞯脑虺霈F(xiàn)假陽性，而且普通PCR 擴增法其結(jié)果的判斷需要對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，操作繁瑣。熒光定量PCR技術(shù)其原理是在常規(guī)PCR擴增系統(tǒng)中加入一段與靶基因特異互補的 熒光標(biāo)記探針。探針的5'端標(biāo)記有報告基團(tuán)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)， 如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不 到熒光信號。隨著PCR擴增的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針就會將探 針切斷產(chǎn)生熒光信號。用熒光檢測儀檢測熒光值的變化，即可準(zhǔn)確判定擴增產(chǎn)物的量。熒 光定量PCR方法就是根據(jù)此原理。在PCR過程中，連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的 變化。當(dāng)信號增強到某一閾值，此時的循環(huán)次數(shù)(用循環(huán)閾值Ct表示)就被記錄下來。CT 值和PCR體系中起始模板的對數(shù)之間有著嚴(yán)格的線性關(guān)系，利用各梯度陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品擴 增的Ct和定量模板數(shù)經(jīng)對數(shù)擬合作圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確 定出起始模板核酸的數(shù)量。雙色或多色熒光定量PCR技術(shù)是指在同一個熒光定量PCR擴增試驗中同時擴增兩 個或者多個目的基因，而每個目的基因采用的不用波長的熒光探針進(jìn)行檢測。熒光標(biāo)記的 探針有多種，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種熒光標(biāo)記的探針在PCR擴增過程中所產(chǎn) 生的熒光信號不同。利用該原理發(fā)明的試劑盒在同一個標(biāo)本的檢測中，不但可以檢測新型 甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-Hmi)，還可以檢測流感病毒各亞型(iav-u)，實現(xiàn)了一個標(biāo) 本中同時檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型和甲型流感病毒各亞型的功能，達(dá)到實時精確 檢測并對病毒進(jìn)行分型的目的，應(yīng)用極為方便。由于該方法引入了特異性擴增引物和熒光 探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性 不高容易漏診和誤診的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型和甲型流感病毒各亞型mRNA的方 法，特別是提供了一種使用雙色熒光定量PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光探針法)快速準(zhǔn)確的檢 測出樣品(包括咽拭子標(biāo)本、血清、分泌物及病死動物肺臟等標(biāo)本)中新型甲型流感病毒HlNl亞型或者甲型流感病毒各亞型mRNA的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于該類病毒疑似 病人臨床快速準(zhǔn)確檢測的試劑盒。目前針對該種新型甲型流感病毒Hmi亞型所致疾病實驗室檢查主要包括血清學(xué) 診斷中的間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等，核酸檢測方法如逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(RT-PCR)，.病毒分離和接種法等。但是這幾種方法有分別有靈敏度和特異性差，容易 出現(xiàn)假陽性和假陰性的不足，甚至有些檢測方法過程繁瑣耗時較長，難以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢 測的目的。為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種使用雙色熒光定量 PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光探針法)快速準(zhǔn)確的檢測出樣品(包括咽拭子標(biāo)本、血清、分泌物 及病死動物肺臟等標(biāo)本)中新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型的mRNA 的方法。該方法包括(1)采集和運送感染或疑似病人樣本(包括咽拭子標(biāo)本、血清、分泌 物及病死動物肺臟等)；(2)樣本預(yù)處理和提取RNA ； (3) 一步PCR-雙色熒光探針體外擴增 法對樣本進(jìn)行檢測合成特定引物和熒光探針，用雙色熒光定量PCR反應(yīng)技術(shù)并用新型甲 型流感病毒Hmi亞型PCR反應(yīng)液(PCR MIX)對樣本進(jìn)行擴增檢測；(4)擴增反應(yīng)結(jié)束后根 據(jù)每個擴增反應(yīng)的熒光強度對相應(yīng)樣本進(jìn)行分析，從而判斷所采集的樣本中新型甲型流感 病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型的存在并根據(jù)陽性質(zhì)控品對其標(biāo)本中的病毒進(jìn)行 定量檢測。檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型的特定寡核苷酸弓I物和熒光探針位于該型病毒 各亞型的變異區(qū)，與其他亞型基因序列沒有同源性，對Genbank上所有發(fā)表的甲型流感病 毒Hmi亞型(包括新型甲型流感病毒Hmi亞型)病毒基因序列，經(jīng)過生物新信息學(xué)分析， 甲型流感病毒的八個基因片段中血凝素(HA)的變異性最大，新型甲型流感病毒Hmi亞型 的HA基因某些區(qū)域與其它甲型流感病毒明顯不同，其中很多基因序列發(fā)生變異和重組。經(jīng) 過比對，選擇如下區(qū)域作為擴增新型甲型流感病毒Hmi亞型特異性目標(biāo)區(qū)域GGTACGGTTA TCACCATCA AAATGAGCAGG GGTCA GGATAGCAGCCGACC TGAAGAGCAC ACAGAATGCC ATTGACGAG A TTACTAAC(SEQ ID NO. 1)引物和探針序列如下(1)新型甲型流感病毒Hmi亞型上游引物5，-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3，(SEQ ID NO. 2)(2)新型甲型流感病毒Hmi亞型下游引物5，-GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3，(SEQ ID NO. 3)(3)新型甲型流感病毒Hmi亞型熒光探針5’-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 4)經(jīng)過生物信息學(xué)分析，甲型流感病毒的八個基因片段中基質(zhì)(M)基因的變異性 最小。經(jīng)過比對，選擇如下區(qū)域作為擴增甲型流感病毒各亞型也即甲型流感病毒通用型 (IAV-U)特異性目標(biāo)區(qū)域TGTGCCACTT GTGAACAGAT TGCTGATTCA CAGCATCGGTCTCACAGACA GATGGCTACT ACCACCAATC CACTAATCAG GC(SEQID NO. 5)(4)甲型流感病毒通用型上游引物5，-TGTGCCACTTGTGAACAGATTG-3，(SEQ ID N0. 6)
(5)甲型流感病毒通用型下游引物5，-GCCTGATTAGTGGATTGGTG-3，(SEQ ID NO. 7)(6)甲型流感病毒通用型熒光探針5’-VIC-TGATTCACAGCATCGGTCTCACAGAC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 8)根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說檢測病毒即為世界衛(wèi)生組織2009年4 月公布的一種引起許多國家和地區(qū)流感疫情的新型甲型流感病毒Hmi亞型。該毒株包含 有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片斷，是一種變異了的新型甲型流感病毒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的樣本來自被檢者咽拭子標(biāo)本、血清、 分泌物及病死動物肺臟等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的樣本處理過程使用的是一種病毒濃 縮液試劑并經(jīng)過高速離心從而可以獲得濃縮后的病毒顆粒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的提取RNA使用的是一種Trizol reagents RNA提取液對樣本充分處理。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的檢測新型甲型流感病毒Hmi亞 型的特異性基因為血凝素(HA)基因，檢測甲型流感病毒各亞型(甲型流感病毒通用型 (IAV-U))的特異性基因為基質(zhì)蛋白(M)基因。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的雙色熒光標(biāo)記是指檢測新型甲型流 感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)血凝素(HA)基因的探針的熒光標(biāo)記為FAM，檢測檢測甲型 流感病毒各亞型(甲型流感病毒通用型(IAV-U))基質(zhì)蛋白(M)基因的探針的熒光標(biāo)記為 VIC，淬滅基團(tuán)為TAMRA。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的新型的甲型流感病毒Hmi亞型雙 色熒光定量PCR反應(yīng)體系(PCR MIX)是由新型甲型流感病毒Hmi亞型(A-HlNl)特異性 上游和下游引物、一條特異性熒光探針(Fam熒光標(biāo)記)、甲型流感病毒通用型(IAV-U)的 特異性上游和下游引物、一條特異性熒光探針(VIC熒光標(biāo)記)、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液 (FQ-Buffer,內(nèi)含鎂離子、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體(dNTPs)、PCR擴增增強劑和去離 子水等成分構(gòu)成的反應(yīng)體系。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的的擴增過程是在一種多通道并實時 檢測熒光信號的的熒光定量擴增裝置上進(jìn)行的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于快速檢測新型的甲型流感病毒Hmi亞型 (IAV-HlNI)的試劑盒，該試劑盒包括(1)病毒核酸提取試劑；(2)逆轉(zhuǎn)錄酶系和Taq酶系； (3)新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光PCR反應(yīng)體系(PCRMIX) ； (4)新型甲型流感病毒 HlNl亞型陽性和陰性質(zhì)控品。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的新型甲型流感病毒Hmi亞型陽性 質(zhì)控品是指89bp的擴增片段經(jīng)過克隆連接到T載體上構(gòu)成的重組質(zhì)粒，經(jīng)過嚴(yán)格定量，其 濃度為107COpieS/ml。陽性質(zhì)控、新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)、甲型流感病毒 普通定性PCR的擴增結(jié)果見圖1。對陽性質(zhì)控品進(jìn)行梯度稀釋，其擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線和動力學(xué) 曲線如圖2和3。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說試劑盒由于采用的是雙色熒光探針 PCR技術(shù)，不但可以檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型，還可以對甲型流感病毒各亞型進(jìn)行檢測，即所謂的甲型流感病毒通用型(IAV-U)的檢測。也就是說本試劑盒的每份試劑一次 檢測就同時具有檢測兩種病毒的能力。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的快速實時定量檢測是通過一步 PCR-雙色熒光探針體外擴增法同時對新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNI)和甲型流感 病毒通用型(IAV-U)RNA進(jìn)行擴增并進(jìn)行定量檢測，無需專門的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，簡化了檢 測流程節(jié)省了檢測時間。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的熒光定量擴增裝置可以是ABIPRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)、ABI RISM7300/7500 (使用 8 聯(lián)管)、MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，也可以是LightCycler等使用毛 細(xì)管的儀器，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的結(jié)果判斷要滿足陽性質(zhì)控品擴增結(jié) 果的Ct值均應(yīng)小于30，且呈標(biāo)準(zhǔn)S型擴增曲線。否則，此次試驗視為無效，全部試驗應(yīng)重新 進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的結(jié)果分析時需要使用手動調(diào)整閾值 使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間， 為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗。重復(fù)試驗之后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽 性，沒有熒光值增長為陰性。為了完成本發(fā)明的方法，首先采集標(biāo)本放在離心管中，密閉送檢。然后取500μ1 樣品液加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清， 保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫 放置5min。對于血清或血漿等，取500 μ 1血清加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷 凍離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。對于肺臟等組織等，取50mg左右組織用 玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振蕩，轉(zhuǎn) 移到1. 5mL的EP管中，室溫放置5min。然后加入IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min， 4°C 13，OOOrpm離心lOmin。小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混 勻，13，OOOrpm離心IOmin0棄上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm 離心lOmin，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈， 用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。根據(jù)根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，取出新型甲型流感病毒Hmi亞型-PCR 反應(yīng)液(PCRMIX，內(nèi)含有擴增用的引物探針和離子等)、Taq酶系、逆轉(zhuǎn)錄酶系，室溫融化并 振蕩混勻后，10，OOOrpm離心10s。每個測試反應(yīng)體系配制如下表 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈0.2ml離心管中，充分混勻， 10，OOOrpm離心10s，向設(shè)定每個PCR反應(yīng)管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣品 (提取的RNA)、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品以及未知標(biāo)本，并設(shè) 置樣品名稱和標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報告基團(tuán)設(shè)置為FAM和VIC、淬滅基團(tuán)TAMRA)。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，用于擴增的條件為ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)、ABI PRISM 7300/7500 (使用 8 聯(lián)管)、 MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件42°C—20分鐘，然后93°C—2 分鐘，然后93°C 30秒一550C 45秒，檢測熒光信號，40個循環(huán)。LightCycler等使用毛細(xì)管 的儀器循環(huán)條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，然后93°C 5秒一58°C 45秒，檢測熒光 信號，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值 小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗。重復(fù)試 驗之后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。判斷結(jié) 果時要注意以下問題陰性質(zhì)控品應(yīng)為全部陰性；新型甲型流感病毒Hmi亞型-陽性質(zhì)控 品，陽性質(zhì)控品的Ct值均應(yīng)小于30，且呈標(biāo)準(zhǔn)S型擴增曲線。以上條件應(yīng)同時滿足，否則此 次試驗視為無效全部試驗應(yīng)重新進(jìn)行。 本發(fā)明的試劑盒主要用于檢測一種新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病 毒各亞型，前者是一種新的變異株病毒，它整合了豬流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒的 基因片段，是一種新的重組的病毒，它導(dǎo)致了 2009年四月世界范圍內(nèi)流感疫情的爆發(fā)。本 發(fā)明的試劑盒整個檢測過程包括提取樣品中甲型流感病毒Hmi亞型mRNA、一步法雙色熒 光定量PCR檢測病毒mRNA，以及結(jié)果的分析等步驟。為了完成這些步驟，本發(fā)明的試劑盒 又可分為病毒核酸提取試劑和雙色熒光定量PCR反應(yīng)試劑兩個部分。其中，前者主要包括 病毒濃縮液和RNA提取液等，后者主要包括PCR 10乂(14 11各引物和探針、20(^11(1^1\501111 Tris-HCl (ρΗ8· 3)、3· 5mM MgC12、50mM KCl、25mM(NH4) 2S04 等)、逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱 Taq 酶、陽 性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和DEPC處理過的水等。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復(fù)實驗驗證證實，本試劑盒具有較好的重復(fù) 性、特異性和穩(wěn)定性的性能和優(yōu)點。本發(fā)明的方法中，由于使用了針對新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病 毒各亞型核酸序列所設(shè)計的引物和雙色熒光探針擴增特異性基因片段，不但可以檢測新型 甲型流感病毒Hmi亞型，同時還可以檢測流甲型感病毒各亞型，從而實現(xiàn)了一個標(biāo)本中同 時對新型甲型流感病毒Hmi亞型和甲型流感病毒各亞型同時實時精確檢測的目的，應(yīng)用 極為方便。由于該方法引入了特異性擴增引物和雙色熒光探針，使得檢測具有更好的靈敏 度和特異性，從而避免了其他檢測方法特異性不高的問題。同時本發(fā)明引入了陽性標(biāo)準(zhǔn)品 作為實驗的對照和定量標(biāo)準(zhǔn)，對新型甲型流感病毒Hmi亞型及甲型流感病毒各亞型的RNA 進(jìn)行快速檢測并定量。另外一個方面，本發(fā)明使用了一步法熒光定量PCR擴增技術(shù)，簡化了 試驗過程提高了檢測效率。一般來說，從處理樣本到結(jié)果的判斷僅需要2小時左右。所以 與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明具還具有有操作簡單、快速方便的優(yōu)點。因此，本發(fā)明的試劑盒為 臨床標(biāo)本的快速檢測和大樣本普查提供了新的方法，并為疑似病人的篩查使用提供了可靠 的方法學(xué)依據(jù)。
四

圖1顯示常規(guī)PCR擴增特異性片段，2%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)PCR擴增后，其擴增產(chǎn)物經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下觀察，可看到與目的片段大小一致的電泳條帶，從 左到右依次是分子量Marker、陽性對照、IAV-Hmi特異性擴增片段、IAV-U特異性擴增片 段、陰性對照。圖2顯示陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板PCR擴增電泳圖，右側(cè)泳道為DNA分子量Marker ； 從0到6依次對應(yīng)=IOciUO1UO2UO3UO4UO5UO6稀釋的陽性質(zhì)控品擴增產(chǎn)物；圖3顯示陽 性質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)模板擴增動力曲線，梯度稀釋；圖4為陽性質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)曲線。
五具體實施例方式實施例1 標(biāo)本采集適用樣品類型包括咽拭子標(biāo)本、血清、分泌物及病死動物肺臟等。首先，對于咽拭 子標(biāo)本，需要采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和 兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有1 2ml保存液(維持液或生理鹽 水)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密閉送檢；對于血清，無菌條件下 取疑似病人外周靜脈血3ml，轉(zhuǎn)至5ml干燥管中，室溫靜置30min，3000g離心5min，取Iml 血清轉(zhuǎn)至1. 5ml潔凈的離心管中，密閉送檢。對于標(biāo)本的保存，標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20°C， 長期保存可置-70°C，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用0°C冰壺，采集標(biāo)本應(yīng)立即(12h 內(nèi))送達(dá)檢測。實施例2 甲型流感病毒mRNA的提取對于咽拭子等樣品，取500 μ 1樣品液加入500μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍 離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500 μ ITrizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。對于血清或血漿等，取500 μ 1血清加 入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1 左右的樣品液體，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。 對于肺臟等組織等，取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振蕩，轉(zhuǎn)移到1. 5mL的EP管中，室溫放置5min。然后加入 IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4°C 13，OOOrpm離心lOmin。小心將上層水相轉(zhuǎn)移 到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin。棄上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口 在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。實施例3 用本試劑盒檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)和甲型流感 病毒各亞型(IAV-U)取出甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光PCR MIX、Taq酶系，逆轉(zhuǎn)錄酶系，室溫融化 并振蕩混勻后，10，OOOrpm離心10s。每個測試反應(yīng)體系配制如下，PCRMIX 20μ l，Taq酶系 和逆轉(zhuǎn)錄酶各lul，計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈0. 2ml離心管中，充分混 勻，10, OOOrpm離心10s，向設(shè)定的PCR反應(yīng)管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣品 (提取RNA)或IAV-陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì) 控品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報告基團(tuán)FAM和VIC猝滅基 團(tuán) TAMRA)和循環(huán)條件ABI PRISM 7700, ABI PRISM5700, ABIGeneAmp 7000 (需要剪掉反 應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJOpticon (使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器循環(huán)條件42°C— 20分鐘，后93°C— 2分鐘，后93°C 30秒一55°C 45秒，40個循環(huán)。 LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，后93°C 5秒 —580C 45秒，共40個循環(huán)。實施例4 結(jié)果分析和判定反應(yīng)結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循 環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗。重復(fù)試驗之后，如果 Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。需要滿足陰性質(zhì)控 品應(yīng)為全部陰性；陽性質(zhì)控品的Ct值均應(yīng)小于30，且呈標(biāo)準(zhǔn)S型擴增曲線。以上條件應(yīng)同 時滿足，否則此次試驗視為無效，全部試驗應(yīng)重新進(jìn)行。實施例5 本發(fā)明方法的臨床應(yīng)用使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對600份采自廣東省珠海出入境檢驗檢疫局實驗室 的標(biāo)本進(jìn)行一步法雙色熒光定量PCR檢測，并于其他同類產(chǎn)品進(jìn)行比對實驗，最終經(jīng)測序 實驗驗證。結(jié)果顯示本發(fā)明方法的試劑盒，靈敏度為102copies，準(zhǔn)確性和特異性達(dá)100%， 重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，本試劑盒的保存條件和有效期為-20°C，12個月。本方法的發(fā)明可 為新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型mRNA的檢測和疫情的預(yù)防控制方 案的制定提供科學(xué)的、個體化的分子生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)，為病人的診斷提供可靠的分子病毒 學(xué)證據(jù)。如果病人咽拭子或者血清中出現(xiàn)甲型流感病毒Hmi亞型mRNA病毒存在，則要立 即采取相應(yīng)措施，也避免產(chǎn)生不必要的后果。本發(fā)明的試劑盒結(jié)果的判斷有如下幾種情況， 見表1 表1.新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光定量PCR檢測試劑盒結(jié)果判斷 六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奧生物技術(shù)有限公司<120> 一種新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒<130><160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>88<212>DNA0078]<213>IAV-H1N1 HA 基因0079]<400>10080]ggtacggtta tcaccatcaa aatgagcagg0081]acagaatgcc attgacgaga ttactaac0082]<210>20083]<211>220084]<212>DNA0085]<213>人工序列(引物)0086]<400>20087]ggtacggtta tcaccatcaa aa0088]<210>30089]<211>240090]<212>DNA0091]<213>人工序列(引物)0092]<400>30093]gttagtaatc tcgtcaatgg catt0094]<210>40095]<211>270096]<212>DNA0097]<213>人工序列(探針)0098]<400>40099]atatgcagcc gacctgaaga gcacaca0100]<210>50101]<211>820102]<212>DNA0103]<213>IAV-U M 基因0104]<400>50105]tgtgccactt gtgaacagat tgctgattca0106]accaccaatc cactaatcag gc0107]<210>60108]<211>220109]<212>DNA0110]<213>人工序列(引物)0111]<400>60112]tgtgccactt gtgaacagat tg0113]<210>70114]<211>200115]<212>DNA0116]<213>人工序列(引物)
ggtcaggata gcagccgacc tgaagagcac 60
88
22
24
27
cagcatcggt ctcacagaca gatggctact 60
82
<400>7gcctgattag tggattggtg20<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列(探針)<400>8tgattcacag catcggtctc acagac 2權(quán)利要求
本發(fā)明為一種新型甲型流感病毒H1N1(甲型H1N1病毒)亞型雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒，從樣品中提取新型甲型流感病毒H1N1亞型(IAV-H1N1)RNA，通過一步PCR-雙色熒光探針體外擴增法對新型甲型流感病毒H1N1亞型和甲型病毒各亞型RNA進(jìn)行擴增，達(dá)到快速實時定量檢測之目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的一種新型甲型流感病毒Hmi(甲型Hmi病毒)亞型雙色熒 光PCR檢測方法及其試劑盒，特征在于用于檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl) 的是該型病毒變異性較強的血凝素(Hemagglutinin)基因，特異性引物和熒光探針序列如 下⑴新型甲型流感病毒Hmi亞型上游引物5，-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3，；⑵新型 甲型流感病毒Hmi亞型下游引物5’ -GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3’ ； (3)新型甲型流感 病毒 Hmi 亞型熒光探針5，-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3，。用于檢測甲型流感病毒各亞型(IAV-U)的是該型病毒較保守的的基質(zhì)蛋白 (Matrix Protein)基因，特異性引物和探針序列如下(4)甲型流感病毒通用型 上游引物5，-TGTGCCACTTGTGAACAGATTG-3，； (5)甲型流感病毒通用型下游引物 5，-GCCTGATTAGTGGATTGGTG-3' ； (6)甲型流感病毒通用型熒光探針5，-VIC-TGATTCACAGCA TCGGTCTCACAGAC-TAMRA-3‘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光定量PCR檢測試劑 盒，其特征在于，按照如下方式配制反應(yīng)體系PCR反應(yīng)液(PCR MIX) 20 μ 1，Taq酶系和逆轉(zhuǎn) 錄酶各1 μ 1共22 μ 1加入一適當(dāng)體積潔凈0. 2ml離心管中，充分混勻，10，OOOrpm離心IOs, 向每管中加入處理后樣品(即提取的RNA)、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品進(jìn)行擴增檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述PCR反應(yīng)液(PCRMIX)主要為以下成分1 μ M各引物和探針、 200uMdNTP、50mM Tris-HCl (ρΗ8· 3)、5mM MgCl2、50mMKCl、25mM(NH4)2SO4組成，一步法擴增程 序為ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon 等，42°C— 20分鐘，然后93°C— 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒(檢測熒光)，40個 循環(huán)；LightCycler等擴增程序為42°C — 20分鐘，然后93°C — 2分鐘，然后93 °C 5秒 —580C 45秒(檢測熒光)，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用雙色熒光定量PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光探針法)快速準(zhǔn)確的檢測出樣品中新型甲型流感病毒H1N1亞型(IAV-H1N1)以及甲犁流感病毒各亞型(IAV-U)的mRNA的方法。該方法包括(1)采集和運送感染或疑似病人樣本；(2)樣本預(yù)處理和提取RNA；(3)一步PCR-熒光探針體外擴增法對樣本進(jìn)行檢測(4)擴增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個擴增反應(yīng)的熒光強度對相應(yīng)樣本進(jìn)行分析，從而判斷所采集的樣本中新型甲型流感病毒H1N1亞型和(或)甲型流感病毒各亞型的存在，并能夠?qū)ζ溥M(jìn)行準(zhǔn)確定量(圖3)，實現(xiàn)了對該新型甲型流感病毒H1N1亞型和甲型流感病毒各亞型實時快速精確檢測之目的。
文檔編號C12R1/93GK101886139SQ20091013663
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者史成軍, 徐貴峰, 羅寶正 申請人:北京索奧生物技術(shù)有限公司;珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心