專利名稱：檢測黃病毒屬病毒的基因芯片探針及基因芯片檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組可檢測黃病毒屬病毒的基因芯片探針及一種通用的黃病毒屬病
毒基因芯片檢測方法。
背景技術(shù)：
目前針對病毒性病原體的檢測，檢測方法仍然局限于傳統(tǒng)的免疫熒光檢測、ELISA 及PCR檢測，盡管具有較好的特異性，但僅能同時檢測一種或幾種病原體，耗時且費力?；?因芯片技術(shù)具有快速、高通量的特點，可設(shè)計多種病毒的檢測探針，點在同一張芯片上，用 來檢測多種病原體。與傳統(tǒng)方法相比，可大大提高檢測效率。 目前對黃病毒屬中登革病毒、乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒等的檢測，有直接免疫 熒光方法、間接免疫熒光的方法，實時定量PCR方法，RT-PCR檢測方法等(1'2'3'4)。這些方法 均可僅檢測一種或幾種黃病毒屬病毒。采用基因芯片方法檢測黃病毒屬中的病原體，國外 文獻中有設(shè)計人類全部致病病毒的檢測探針的報道(5，6)，即廣譜型基因芯片。該種基因芯 片覆蓋面廣，可用于幾乎全部人類致病的病毒性病原體的初步篩查和檢測，但該芯片并未 對黃病毒屬中病毒探針特異性的實驗驗證及用于臨床樣品的檢測報道。
用基因芯片方法檢測病原體，目前常見的問題是檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性或假陰 性的問題。原因在于病毒基因的擴增方法，目前常用隨機PCR擴增方法，由于病毒具有細胞 內(nèi)寄生的特性，提取RNA過程中不可避免地會提取到宿主細胞的DNA及RNA，真核生物的基 因組通常比病毒基因組大數(shù)十倍，隨后的隨機擴增過程中，含量高的基因?qū)⒌玫絻?yōu)勢擴增， 干擾了病毒基因組的有效擴增，從而造成檢測結(jié)果的假陽性或假陰性。
參考文獻 1 :Niedrig M， Kiirsteiner 0， Herzog C， Sonnenberg K. Evaluation of an indirectimm皿ofluorescence assay for detection of immunoglobulin M(IgM)and IgGantibodies against yellow fever virus. Clin Vaccine Immunol. 2008Feb ; 15(2): 177-81. Epub 2007Nov 28. 2 :Lanciotti RS. Molecular amplification assays for the detection offlaviviruses. Adv Virus Res. 2003 ;61 :67—99. 3 :Holzmann H. Diagnosis of tick-borne encephalitis. Vaccine. 2003Apr 1; 21Suppl 1 :S36-40. 4:Koraka P， Zeller H， Niedrig M， 0sterhaus AD， Groen J. Reactivity of serumsamples from patients with a flavivirus infection measured by imm皿ofluorescenceassay and ELISA. Microbes Infect. 20020ct ;4 (12) :1209-15.
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一組檢測黃病毒屬病毒的基因芯片探針及一種通用的基因芯片檢測方法。使用該探針檢測黃病毒屬病毒，能提高檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性，而且可同時檢測多種病原體。 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是設(shè)計一組可檢測黃病毒屬多種病毒的檢測探針，并采用一種通用的病毒基因處理與擴增方法，進行黃病毒屬病毒的基因芯片檢測。包括黃病毒屬中的森林腦炎病毒、乙型腦炎病毒、登革病毒。黃病毒屬森林腦炎病毒(Tick borneenc印halitis)探針、登革病毒(Dengue virus)探針、乙型腦炎病毒(Japaneseenc印halitis)探針序列如下森林腦炎病毒(Tick borne enc印halitis)探針序列包括5條，分別如SEQ IDNo. 1至SEQ ID No. 5所述；登革病毒(Dengue virus)探針序列包括5條，分別如SEQ IDNo. 6至SEQ ID No. 10所述；乙型腦炎病毒(J即anese enc印halitis)探針序列包括5條，分別如SEQ ID No. 11至SEQ ID No. 15所述。
所述的基因芯片探針的制備方法，包括以下步驟 1)設(shè)計病原體特異性探針從Genbank中搜索權(quán)利要求1所述的全基因序列，對
每種病毒序列分別進行比對分析，設(shè)計病毒屬特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，進而確定種內(nèi)保守序
列，針對保守序列設(shè)計檢測探針，從中挑選出權(quán)利要求1所述的的森林腦炎病毒、登革病
毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒探針序列； 2)合成探針；探針由上海生工公司合成。 所述的病毒屬特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，其序列為SEQ ID No. 16所述。 —種所述檢測黃病毒屬病毒基因芯片探針的使用方法，包括以下步驟 1)基因芯片的制備將合成后的探針溶于3XSSC溶液內(nèi)，用點樣儀在醛基化玻片
上進行點樣，同時將丙肝病毒的一段寡核苷酸探針(5'-cctcccgggagagccatagtggtctgcgga
accggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcct-3，)點在玻片上作為陽性對照探針，點樣完
成后用紫外交聯(lián)儀照射30秒，照射能量為65焦耳，以固定探針。 2)病原體RNA提取及合成cDNA :將待測樣本用RNA提取試劑盒處理獲得病原體RNA，同時提取BHK細胞的RNA作為陰性對照，然后利用權(quán)利要求3中所述的反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得病原體cDNA待用； 3)病原體基因組的擴增以病原體和BHK細胞的基因組雙鏈cDNA為模板擴增病毒基因組，采用含有aa-dUTP的dNTP混合物，以將aa-dUTP摻入到擴增產(chǎn)物中，擴增反應(yīng)條件為 94。C變性5min，然后94。C變性30sec，40。C退火30sec，50。C退火30sec，72。C延伸lmin，反應(yīng)40個循環(huán)； 4)染料標(biāo)記將病原體PCR產(chǎn)物純化標(biāo)記CY3染料，用CY5標(biāo)記BHK細胞基因組作為陰性對照，室溫下避光反應(yīng)lh，間隔15min振蕩混勻一次，然后加入4. 5ul羥胺(4M)，避光反應(yīng)15min，使反應(yīng)體系中未與DNA結(jié)合的染料淬滅。然后用PCR純化試劑盒對標(biāo)記產(chǎn)物進行純化，以洗掉多余的染料。 5)預(yù)雜交先將所述的芯片點上50iil預(yù)雜交液(5XSSC，0. 1%SDS，0. 1%BSA)，蓋上蓋玻片，置42t:水浴鍋中預(yù)雜交1-1. 5h。然后用水洗滌兩次，用離心機甩干芯片。
6)雜交向純化后的熒光染料標(biāo)記的基因中加入35iU雜交液(50%去離子甲酰胺，5XSSC，0. 1% SDS，O. 5ii g/ii 1鮭魚精DNA)，置PCR儀中95。C變性5min，取40ii 1加于芯片上，蓋上蓋片。置雜交盒中42t:雜交2 4h。取出雜交后的芯片，輕輕除去蓋片。芯片分別于洗液1(2XSSC，0. 1% SDS)、洗液II (0. 2XSSC，0. 1% SDS)、洗液III (0. 2XSSC)中洗滌5min，最后用無水乙醇漂洗2min，用離心機甩干芯片。 7)芯片掃描取出雜交后的芯片用芯片掃描儀進行掃描，CY3熒光染料用532nm波長，CY5熒光染料用635nm波長。然后判斷結(jié)果。
本發(fā)明的具有如下優(yōu)點 本發(fā)明設(shè)計了可用于檢測多種黃病毒屬病毒如乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒、登革病毒等的基因芯片探針，將此3種病毒探針與其它多種病毒的探針共同點在同一張基因芯片上，可同時檢測多種病原體，與傳統(tǒng)的免疫熒光、RT-PCR等方法相比，可簡化實驗流程，縮短實驗時間。并且，本發(fā)明設(shè)計了可特異性反轉(zhuǎn)錄黃病毒屬病毒的通用引物序列，提出了半特異的病毒基因擴增方法，可特異性擴增病毒基因，降低宿主基因的干擾，提高了檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。該方法可用于黃病毒屬所有病毒的基因擴增和基因芯片檢測。


圖1為乙型腦炎病毒的芯片檢測圖； 圖2為乙型腦炎病毒的基因芯片檢測分析結(jié)果圖； 圖3為登革病毒的檢測圖； 圖4為登革病毒的芯片雜交分析結(jié)果圖； 圖5為森林腦炎病毒的芯片檢測圖； 圖6為森林腦炎病毒的芯片雜交分析結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
實施例1 :檢測黃病毒屬病毒的基因芯片的制備 1、設(shè)計病原體特異性探針從Genbank中搜索多種病毒的基因序列，包括森林腦炎病毒(Tick borne enc印halitis)、登革病毒(Dengue virus)、乙型腦炎病毒(Japaneseenc印halitis)的全基因序列。用Clustal. 83對每種病毒序列分別進行比對分析，設(shè)計病毒屬特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，該反轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表SEQ ID No. 16所述。進而確定種內(nèi)保守序列，針對保守序列用Array designer 4. 0軟件設(shè)計檢測探針，通過在Genbank中對探針進行序列比對分析，挑選出特異性較強的探針序列。每種病毒確定探針數(shù)量5條，長度約50bp。所述的探針序列如序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 15所述。
2、合成探針探針序列由華大基因公司合成。 3、基因芯片的制備將包括森林腦炎病毒、登革病毒、乙型腦炎病毒等的共計18種病毒的檢測探針合成后溶于3 X SSC溶液內(nèi)，用點樣儀在醛基化玻片上進行點樣。同時將
丙肝病毒的一段寡核苷酸探針(5'_CCtCCCggg￡lg￡lgCC￡lt￡lgtggtctgCgg￡l￡lCCggtg￡lgt￡lC￡lCCgg
aattgccaggacgaccgggtcct-3')點在玻片上作為陽性對照探針。點樣完成后用紫外交聯(lián)儀照射30秒，照射能量為65焦耳，以固定探針。 實施例2 :用實施例1制備的基因芯片檢測黃病毒屬病毒
1 、病毒核酸提取及合成cDNA 病毒的RNA提取，操作步驟按RNA提取試劑盒(QIAGENE公司產(chǎn)品)說明書進行，同時提取BHK細胞(購自ATCC)的RNA作為陰性對照。病毒RNA在DNase I作用下37°C 20min降解其中的DNA分子。然后利用黃病毒屬特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄，引物序列如SEQ IDNo. 21所述，即5' -3， GTTTCCCAGTAGGTCTCTTCCCATCATGTT， AMV反轉(zhuǎn)錄酶是Fermentase公司產(chǎn)品。42t:反應(yīng)lh。然后在Klenow酶(Fermentase公司產(chǎn)品)的作用下利用隨機引物5' -GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN-3'合成第二鏈，BHK細胞RNA的反轉(zhuǎn)錄及第二條鏈的合成均在隨機引物的引導(dǎo)下合成。
2 、病毒基因組的隨機擴增 以病毒和BHK 細胞的基因組雙鏈cDNA 為模板，禾U用引物(5， -GTTTCCCAGTAGGTCTC-3')擴增病毒基因組，采用含有aa-dUTP的dNTP混合物(Sigma公司產(chǎn)品)，以將aa-dUTP摻入到擴增產(chǎn)物中。反應(yīng)條件為94t:變性5min，然后94。C變性30sec， 40。C退火30sec， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin，反應(yīng)40個循環(huán)。
3、染料標(biāo)記 將病毒PCR產(chǎn)物純化標(biāo)記CY3染料，室溫下避光反應(yīng)lh，間隔15min振蕩混勻一次。然后加入4. 5ul羥胺(4M)，避光反應(yīng)15min，使反應(yīng)體系中未與DNA結(jié)合的染料淬滅。同時用CY5標(biāo)記BHK細胞基因組作為陰性對照。然后用PCR純化試劑盒對標(biāo)記產(chǎn)物進行純化，以洗掉多余的染料。 4、預(yù)雜交先將所述的芯片點上50ii1預(yù)雜交液(5XSSC，0. 1% SDS，O. 1% BSA)，蓋上蓋玻片，置42t:水浴鍋中預(yù)雜交1-1. 5h。然后用水洗滌兩次，用離心機甩干芯片。
5、雜交向純化后的熒光染料標(biāo)記的基因中加入35iU雜交液(50%去離子甲酰胺，5 X SSC， 0. 1 % SDS， 0. 5 ii g/ ii 1鮭魚精DNA)，置PCR儀中95。C變性5min，取40 ii 1加于芯片上，蓋上蓋片。置雜交盒中42。C雜交2 4h。
6、芯片掃描 取出雜交后的芯片，輕輕除去蓋片。芯片分別于洗液I(2XSSC，0. 1% SDS)、洗液II (0. 2XSSC，0. 1% SDS)、洗液III (0. 2XSSC)中洗滌5min，最后用無水乙醇漂洗2min，用離心機甩干后，進行芯片掃描，CY3熒光染料用532nm波長，CY5熒光染料用635nm波長。
雜交掃描后用Gen印ix軟件進行分析，將CY3熒光信號值從高到低排列，取熒光信號CY3/CY5 > 2且CY3 > 500的點作為陽性信號，每種病毒的5條檢測探針若有2條以上出現(xiàn)陽性信號，則該病毒檢測結(jié)果判定為陽性，熒光信號值越強，說明待測樣本基因與探針序列互補匹配性越好，為該探針?biāo)聿《镜目赡苄栽酱蟆ＨN病毒的檢測結(jié)果如圖1至圖6所示。 乙型腦炎病毒的芯片檢測結(jié)果中，出現(xiàn)了 3條乙型腦炎病毒檢測探針的陽性信號，登革病毒和森林腦炎病毒分別出現(xiàn)了 2條和3條特異性檢測探針陽性信號，未出現(xiàn)其他病毒的特異性信號。說明本發(fā)明人所設(shè)計的乙型腦炎病毒、登革病毒和森林腦炎病毒檢測
探針具有較好的特異性和靈敏性，本發(fā)明人所設(shè)計的黃病毒屬保守區(qū)引物，可特異性引導(dǎo)
病毒基因的合成和擴增。 核苷酸序列表 〈110>(申請人) 〈120〉檢測黃病毒屬病毒的基因芯片及基因芯片檢測方法 〈160>16 〈210>1 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林腦炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400〉 1 CTCCATACCG CCCAGAGGTG ATAGAAGCAC TACACAGATT TCAACTGCGG 50 〈210>2 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林腦炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>2 GATTCTTGGA GTGATGGGAC TGTGGACGCT ATCAGAAATG ATGAGATCGG 50 〈210>3 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林腦炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>3 CAGACTGTCA TTCTTGAGCT TGATAAGACT CTGGAACACC TTCCGACGGC 50 〈210>4 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林腦炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>4 GGGACTTATG TGCTGGTGGT GTCTCTCTTC ACTCCATACA TCATCCACCA 50 〈210>5 〈211>50 〈212>DNA 〈213>森林腦炎病毒(Tick bo潔enc印halitis virus) 〈400>5 CGAGAGATGG TGACAATCTA CTTCCTCTTG TTGGTCTTGG AGCTAGGGTT 50 〈210>6 〈211>50
7
〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>6 CACTCTATGG AGCAATGGAG TCCTGGAAAG TGAGATGATA ATCCCAAAGA 50 〈210>7 〈211>50 〈212>DNA 〈213〉登革病毒(Dengue virus) 〈400>7 TCCCCAAGAT AACCAATTAA CTTATGTTGT CATAGCCATC CTCACAGTGG 50 〈210>8 〈211>50 〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>8 GCCACAACAG TAATAACACC AATGCTGAGA CATACCATAG AGAATTCCAC 50 〈210>9 〈211>50 〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>9 TAGAGTGATA GACCCTAGAA GATGCCTCAA GCCAGTTATC CTACCAGATG 50 〈210>10 〈211>50 〈212>DNA 〈213>登革病毒(Dengue virus) 〈400>10 GCTGGACAAC TACTCTTGAT GAGAACAACA TGGGCTTTCT GTGAAGTCTT 50 〈210>11 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型腦炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400〉 11 CACTACAGGA GTCTACCGAA TTATGGCTAG AGGGATTCTT GGCACTTACC 50 〈210>12 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型腦炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>12
GAGGGCTCTA TACCTAGACA CTTACAGAAT CATCCTCCTC GTCATAGGGA 50 〈210>13 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型腦炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>13 ACTTATTGTT GCCATTACTG TGATGACAGG AGGATTCTTC CTACTAATGA 50 〈210>14 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型腦炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>14 GCAGAACAAG AGCCGTGGGA AAGGGAGAAG TCCATAGCAA TCAGGAGAAA 50 〈210>15 〈211>50 〈212>DNA 〈213>乙型腦炎病毒(Japanese enc印halitis virus) 〈400>15 TGACAGTAAC CTAGCCCATT GGACAGAGGC AAAGATCATG TTAGACAACA 50 〈210>16 〈211>30 〈212>DNA 〈213>黃病毒屬 〈400>16 GTTTCCCAGT AGGTCTCTTC CCATCATGTT 30
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權(quán)利要求
一組可采用基因芯片的方法檢測黃病毒屬多種病毒的探針，其特征在于它包括森林腦炎病毒(Tick borne encephalitis)探針、登革病毒(Dengue virus)探針、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis)探針，所述探針序列如下森林腦炎病毒(Tick borne encephalitis)探針序列包括5條，分別如SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所述；登革病毒(Dengue virus)探針序列包括5條，分別如SEQ ID No.6至SEQ ID No.10所述；乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis)探針序列包括5條，分別如SEQ ID No.11至SEQ ID No.15所述。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片探針的制備方法，其特征在于包括以下步驟1) 設(shè)計病原體特異性探針從Genbank中搜索權(quán)利要求1所述的全基因序列，對每種病毒序列分別進行比對分析，設(shè)計病毒屬特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，進而確定種內(nèi)保守序列，針對保守序列設(shè)計檢測探針，從中挑選出權(quán)利要求1所述的的森林腦炎病毒、登革病毒、乙型腦炎病毒探針序列；2) 合成探針。
3. —條可特異性引導(dǎo)黃病毒病毒基因反轉(zhuǎn)錄合成的引物，其特征于所述的病毒屬特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，其序列為SEQ ID No. 16所述。
4. 一種如權(quán)利要求1所述檢測黃病毒屬病毒的基因芯片探針的使用方法，其特征在于包括以下步驟1) 基因芯片的制備將權(quán)利要求1所述的探針溶于3XSSC溶液內(nèi)，用點樣儀在醛基化玻片上按預(yù)先設(shè)定好的順序進行點樣，同時將丙肝病毒的一段寡核苷酸探針點在玻片上作為陽性對照探針，點樣完成后用紫外交聯(lián)儀照射，以固定探針；2) 病原體RNA提取及合成cDNA :將待測樣本用RNA提取試劑盒處理獲得病原體RNA，同時提取BHK細胞的RNA作為陰性對照，然后利用權(quán)利要求3中所述的反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得病原體cDNA待用；3) 病原體基因組的擴增以病原體和BHK細胞的基因組雙鏈cDNA為模板擴增病毒基因組，采用含有aa-dUTP的dNTP混合物，以將aa-dUTP摻入到擴增產(chǎn)物中，擴增反應(yīng)條件為94。C變性5min，然后94。C變性30sec，40。C退火30sec，50。C退火30sec，72。C延伸lmin，反應(yīng)40個循環(huán)；4) 染料標(biāo)記將病原體PCR產(chǎn)物純化標(biāo)記CY3染料，用CY5標(biāo)記BHK細胞基因組作為陰性對照5) 預(yù)雜交先將所述的芯片點上預(yù)雜交液，置42t:水浴鍋中預(yù)雜交1-1. 5h，然后洗滌，并甩干芯片；6) 雜交向純化后的熒光染料標(biāo)記的基因中加入雜交液，置PCR儀中95t:變性5min，取出加于芯片上，置雜交盒中42t:雜交2 4h，取出雜交后的芯片，將芯片放入洗液中洗滌，然后用無水乙醇漂洗，并甩干芯片；7) 芯片掃描取出雜交后的芯片用芯片掃描儀進行掃描，CY3熒光染料用532nm波長，CY5熒光染料用635nm波長，然后判斷結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供一組檢測黃病毒屬病毒的基因芯片探針及一種通用的檢測方法。包括森林腦炎病毒(Tick borne encephalitis)探針、登革病毒(Denguo virus)探針和乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis)探針，并設(shè)計了可特異性反轉(zhuǎn)錄黃病毒屬病毒的通用引物序列，利用該病毒屬特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄，以引導(dǎo)病毒基因組的合成，從而盡可能地減少宿主細胞基因成分的干擾，提高了檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明可用于黃病毒屬所有病毒的基因擴增和森林腦炎病毒、登革病毒和乙型腦炎病毒的基因芯片檢測。
文檔編號C12N15/10GK101781687SQ200910077169
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者劉洪 , 孫慶歌, 康曉平, 李永強, 楊銀輝, 祝慶余 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所