專利名稱：：植物病原真菌串珠鐮刀菌天然拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的具有抑制串珠鐮刀菌活性的化合物氯代擬盤多毛菌素A是從該生產(chǎn)菌株的固體發(fā)酵提取物中分離得到的，其結(jié)構(gòu)式為化(阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體)u)本發(fā)明制備的化合物氯代擬盤多毛菌素A在對串珠鐮刀菌抑制活性測試中，其ICs。值為0.090iig/ml。可見該化合物具有極強的抑制串珠鐮刀菌活性，可單獨用于制備農(nóng)用殺菌劑。因此，本發(fā)明制備的化合物氯代擬盤多毛菌素A可作為串珠鐮刀菌的天然拮抗劑使用。氯代擬盤多毛菌素A可以單獨或與其它殺菌劑組合使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，氯代擬盤多毛菌素A用于制備殺滅串珠鐮刀菌的農(nóng)用殺菌劑，在制備以本發(fā)明的氯代擬盤多毛菌素A作為有效成分的農(nóng)用殺菌劑時，可以同樣使用本領(lǐng)域已知的農(nóng)藥所通用的固相、液相即乳化分散劑等各種載體。并且能夠配制成顆粒劑、粉劑、乳化劑、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑、煙霧劑等任意的劑型。同時，在各種制劑中一般可以適當(dāng)添加一些輔助劑。本發(fā)明的農(nóng)用殺菌劑還可以與其它殺菌劑、除草劑、殺蟲劑、肥料物質(zhì)、土壤改良劑等配合使用。圖1顯示氯代擬盤多毛菌素A的^NMR光譜(1;400MHz，丙酮_d6);圖2顯示氯代擬盤多毛菌素A的13CNMR光譜(1;100MHz，丙酮_d6)。具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例1煙色擬多毛盤孢菌(P.adusta)SN17的分離煙色擬盤多毛孢菌(P.adusta)SN17，該菌株分離自海南省，于2008年9月26日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏編號為2672。分離方法采用常規(guī)內(nèi)生真菌分離方法，具體步驟如下將健康的植物枝條和葉片用水洗凈、晾干，用75%的酒精浸泡消毒60秒，用25%(1.3%有效氯)的次氯酸鈉浸泡消毒5分鐘，再用75%的酒精浸泡消毒30秒，然后用無菌水洗3次，將消毒后的組織塊剪切成邊長約5mm的小塊，放置于PDA培養(yǎng)基上，置25。C培養(yǎng)。用稀釋法作單孢純化，對不易產(chǎn)孢菌株用滅過菌的康乃馨(Dianthuscaryophyllus)葉片組織誘發(fā)產(chǎn)孢。1.形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基+康乃馨葉片上，分生孢子盤黑色，半球形或球形，埋藏于表皮下，后突破表皮。分生孢子5細(xì)胞，長梭形，直立，有的稍微彎曲，17.522.5X4.25.0iim;中間3色胞長11.514.7ym，橄欖色，中間色胞稍深；頂端無色胞錐形，短，具頂端附屬絲24根，長8.319.8iim;基部無色胞三角形，具中生式柄1根，長1.87.0ym。2.在固體培養(yǎng)基上的生長特征在固體培養(yǎng)基上生長較快，菌絲白色，茸狀。在PDA固體培養(yǎng)基上，菌落白色絮狀，菌絲生長較快，背面顏色淡橘黃色，無輪紋。子實體疏散，較少，黑色并且有光澤。3.生理生化特征平板培養(yǎng)顯淡橙色，固體發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵液呈棕色。4.碳源利用很好利用的碳源包括麥芽糖和糊精。實施例2化合物氯代擬盤多毛菌素A的分離和制備材料馬鈴薯為市售，本發(fā)明所用的其他試劑均為分析純級別，一般的生物試劑公司均有銷售。a.煙色擬盤多毛孢菌(P.adusta)SN17的活化配制PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL，制成試管斜面，挑取菌絲體接種于試管斜面上，25t:培養(yǎng)10天；b.煙色擬盤多毛孢菌SN17的固體發(fā)酵培養(yǎng)制備固體培養(yǎng)基，其制備過程為將150mL液體培養(yǎng)基(含6%糊精，2%麥芽糖，0.75%棉籽粉，0.7%蛋白胨，0.25%CaC03，0.25%MgS047H20，0.1%FeS047H20，0.001%ZnS04，調(diào)pH至6.0)和30g蛭石加入500mL三角瓶中，配制10份，浸泡過夜，121°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻待用；將制備好的菌懸液(孢子濃度為lX10e個/mL)15mL接種于上述固體培養(yǎng)基上，自然空氣狀況下，濕度20X，25。C培養(yǎng)40天；c.待發(fā)酵完畢，將150ml丁酮加入三角瓶中提取三次，減壓蒸干有機溶劑，得到3.67g粗提物；d.將粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇體系進行減壓硅膠柱層析，所用流動相為石油醚乙酸乙酯/v:v=ioo:o，90:io，so:20，70:30，50:50，70:30，io:90，o:ioo;乙酸乙酯甲醇/v:v=90:io，so:20，0:ioo，每個餾分收集800mL，減壓濃縮，共收集11個餾分；e.在活性跟蹤指導(dǎo)下，將活性組分(石油醚乙酸乙酯=70:30)通過S印hdex-LH20(購自GEHealthcareBio-SciencesAB)柱層析，使用100%甲醇作為洗脫劑，收集餾分，濃縮，分離得到氯代擬盤多毛菌素A。綜上，3.67g粗提物經(jīng)過分離純化而得到20mg純化合物氯代擬盤多毛菌素A，其純度為99%以上，收率為0.5%。實施例3氯代擬盤多毛菌素A的物化分析實施例2中步驟e得到的氯代擬盤多毛菌素A具有下述理化性質(zhì)形狀為無色片狀晶體，熔點為205-207°C;分子式C21H21C12N05;分子量:437(據(jù)ESI-MS);比旋光[a]D+5.0(c0.4，CH30H)，紫外UV(CH30H)A隨=211(e100100)，253(e17600)，296(e12200)nm。氯代擬盤多毛菌素A的質(zhì)譜和紅外光譜數(shù)據(jù)表1，氫譜和碳譜數(shù)據(jù)見表2/HNMR譜圖見圖1，13CNMR譜圖見圖2。表1.氯代擬盤多毛菌素A的物化常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2.氯代擬盤多毛菌素A的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(氖代丙酮)位置lalb:JinHz)WinHz)1173.6173.82110.2110.63)56.2156.046.38s101.86.33,s101.65164.4161.16115.2115.27148.7148.186.27,s53.26.13,s53.89119.9U9.210156.4155.111121.0120.412135.9135.813118.1118.714151.1152.2r3.02,m;3.09,m24.92.85,m;3.02,m24.82,4.60,td(6.3,1.5)123.34.48,td(5.4，1.5)123.33,131.2131.04,1.38,s25.51.36，s25.55,1.45,s17.71.41,s17.7r2.44,s18.32.45,s18.3NH7.60,s7.60，sOH-58.90,s8.80，sOH-107.88,s7.88,sOCH3-143.30,s60.94.00,s62.3s-單峰；d-雙峰；t-三重峰；m-多重峰根據(jù)核磁共振波譜、質(zhì)譜、紅外光譜和紫外光譜確定該化合物由2個立體異構(gòu)體組成，其結(jié)構(gòu)式為前述式(1)。實施例4采用AlamarBlue熒光檢測法檢測氯代擬盤多毛菌素A對于串珠鐮刀菌(F.moniliform)的抑制活性1.試驗用試劑將本發(fā)明制備的氯代擬盤多毛菌素A用二甲亞砜(DMSO)作為溶劑分別配制4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL的待測溶液；酮康唑(酮康唑片購自西安楊森制藥有限公司，是)用二甲亞砜(DMSO)作為溶劑配制成濃度為4mg/mL的儲液，然后同樣用二甲亞砜分別稀釋為4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL的待測溶液；由于目前尚沒有發(fā)現(xiàn)有效的天然的串珠鐮刀菌拮抗劑，酮康唑是本領(lǐng)域中已知的通用殺真菌劑，在本實驗中作為陽性對照；染色液為AlamarBlue,購自北京賽馳生物科技有限公司。[OO53]2.串珠鐮刀菌(F.moniliform)的培養(yǎng)將串珠鐮刀菌(F.moniliformCGMCC3.2835，該菌由中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供)接種在PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L)上，在2『C搖床培養(yǎng)2天后并在顯微鏡下計菌絲體數(shù)，調(diào)整菌絲體數(shù)目在1X104個/mL。3.試驗方法試驗條件如表3所示。表3.活性測試所需的各試劑的體積<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>按如表3所示方法，取190iiLPDB培養(yǎng)基和10iiLAlamarBlue染液加入到96孔板中配成陰性對照組；取190iiL串珠鐮刀菌培養(yǎng)液和10iiLAlamarBlue染液加入到96孔板中配成空白對照組；取190iiL串珠鐮刀菌培養(yǎng)液，10iiLAlamarBlue染液和1yL的酮康唑(濃度分別為4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL)加入到96孔板中配成陽性對照組；取1PL本實施例制備的氯代擬盤多毛菌素A溶液(濃度分別為4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005及0.002mg/mL)分別加入到96孔板中，再分別加入190L串珠鐮刀菌培養(yǎng)液，10LAlamarBlue染液，使供試樣品的最終濃度分別為20、10、5、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01iig/mL。待藥液和菌懸液混和均勻后，在2『C及黑暗條件下培養(yǎng)48小時。用酶標(biāo)儀(Tecan公司的GENiosPlus)在595nm下測試96孔板中每個測試孔的熒光吸收值(00595值)。計算抑制率1%:I%=[l-(0D測試藥液-0D空白對照)/(0D陰性對照-0D空白對照)]X100%計算IC5。值IC5。=[CL(IH_50)+CH(50_IL)]/(IH-IL)CL:低濃度值;CH:高濃度值；IH:高濃度下的1%;IL:低濃度下的I%。4.試驗結(jié)果本發(fā)明制備的化合物氯代擬盤多毛菌素A，其ICs。值為0.090iig/ml。陽性對照物酮康唑的IC5。為4.09i!g/mL?？梢娫摶衔锞哂袕姷囊种拼殓牭毒钚裕湟志钚詢?yōu)于文獻報道的人工合成殺菌劑JS399-19(EC5。值為0.16120.3136yg/mL[參見，現(xiàn)代農(nóng)藥.2006，5，14-17]，可單獨用于制備農(nóng)用殺菌劑，或與其它殺菌劑組合使用。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，對其進行各種形式和細(xì)節(jié)的變化。權(quán)利要求煙色擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisadusta)SN17CGMCCNo.2672。2.—種具有抑制串珠鐮刀菌(Fusariummoniliform)活性的化合物氯代擬盤多毛菌素A(PestalachlorideA)，其特征在于a.該活性化合物由2個立體異構(gòu)體組成，確定該化合物結(jié)構(gòu)式為下式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>lalb(阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體)(I)b.氯代擬盤多毛菌素A的物化常數(shù)為形狀無色片狀晶體；熔點205-207°C;分子式C21H21C12N05;分子量437(據(jù)ESI-MS)。3.生產(chǎn)權(quán)利要求2所述的氯代擬盤多毛菌素A的方法，所述方法包括下列步驟a)將煙色擬盤多毛孢菌(P.adusta)SN17進行固體發(fā)酵；b)在步驟a)的固體發(fā)酵以后，向培養(yǎng)產(chǎn)物中加入有機溶劑提取，得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到粗提物；禾口c)將所述粗提物進行減壓硅膠柱層析和凝膠色譜分離而得到活性化合物氯代擬盤多毛菌素A。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟b)所用的有機溶劑為丁酮。5.權(quán)利要求2所述的氯代擬盤多毛菌素A的應(yīng)用，其中氯代擬盤多毛菌素A單獨用作串珠鐮刀菌的天然拮抗劑，或與其它拮抗劑組合使用。6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中氯代擬盤多毛菌素A用于制備殺滅串珠鐮刀菌的農(nóng)用殺菌劑。7.權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其中氯代擬盤多毛菌素A針對串珠鐮刀菌的IC5。值為0.090iig/ml。8.—種農(nóng)用殺菌劑，其包含有效量的氯代擬盤多毛菌素A作為活性成分。全文摘要本發(fā)明涉及一種對串珠鐮刀菌的生長具有強抑制活性的化合物的發(fā)現(xiàn)及制備方法，屬生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。該化合物是由生產(chǎn)菌株煙色擬盤多毛孢菌SN17采用固體發(fā)酵及提取分離的方法獲得，并通過應(yīng)用質(zhì)譜、核磁共振波譜、紅外光譜等技術(shù)確定了該化合物的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及的化合物為氯代擬盤多毛菌素A(PestalachlorideA)，它能有效抑制串珠鐮刀菌的生長，可單獨用作串珠鐮刀菌的天然拮抗劑。文檔編號C12R1/645GK101775357SQ20091007695公開日2010年7月14日申請日期2009年1月14日優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日發(fā)明者劉述春,姜立花,李二偉,車永勝,郭良棟申請人:中國科學(xué)院微生物研究所