專利名稱：：一種豬胃蛋白酶的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豬胃蛋白酶的提取方法。
背景技術(shù)：
：胃蛋白酶(p印sin)屬于天冬氨酸蛋白水解酶，是胃消化蛋白水解酶類，其前體物質(zhì)是胃蛋白酶原。胃蛋白酶原合成于脊椎動(dòng)物的胃基底部粘膜，在胃液的酸性條件下轉(zhuǎn)化成胃蛋白酶。目前，國內(nèi)外市場(chǎng)上的胃蛋白酶主要提取于豬胃粘膜，豬胃蛋白酶(EC3.4.23.1)的分子量為3136ku。我國對(duì)豬胃蛋白酶的提取方法主要是應(yīng)用傳統(tǒng)的酸法提取配合有機(jī)溶劑分離，粗酶液再經(jīng)乙醚脫脂、濃縮干燥，得到的產(chǎn)品酶活力僅為1948.5U，而且此法生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)不宜把握，得到的豬胃蛋白酶活力低且不穩(wěn)定。國外對(duì)豬胃蛋白酶的提取是將酸法制備的粗提液通過有機(jī)溶劑和鹽析沉淀，最終得到了商業(yè)結(jié)晶胃蛋白酶。但此工藝耗時(shí)較長(zhǎng)，提取率也相對(duì)較低。
發(fā)明內(nèi)容為了解決
背景技術(shù)：
中的問題，本發(fā)明目的是提供一種豬胃蛋白酶的提取方法，該超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶的最高比活力達(dá)5.82U/mg，傳統(tǒng)的酸法浸提比活力僅為3.5U/mg，超聲輔助酸提法較酸法提取豬胃蛋白酶的比活力提高近70%，浸提時(shí)間減少1.5h左右，超聲波輔助酸法提取豬胃蛋白酶優(yōu)于傳統(tǒng)的酸法浸提。本發(fā)明的技術(shù)方案是該豬胃蛋白酶的提取方法包括下列步驟選擇成年豬胃，剝?nèi)∝i胃基底部粘膜厚約23mm，絞碎，在絞碎的粘膜內(nèi)加入1:24(質(zhì)量與體積比)倍的pH2.5的鹽酸浸提液，加入濃度為5mg/mL15mg/mL的吐溫-80，之后將上述混合液放在超聲波藥品處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理，超聲波功率為220±20W320±20W，超聲波頻率為23kHz43kHz，超聲波處理時(shí)間為90s150s，然后立即轉(zhuǎn)移到45'C的水浴中浸提58min,離心取上清液即得到蛋白酶。上述的絞肉機(jī)絞碎至0.20.3腿；超聲波功率為220W、超聲頻率為27kHz、超聲時(shí)間為llls、粘膜與鹽酸浸提液的質(zhì)量體積比為1:3.5、吐溫-80的添加濃度為11mg/mL。。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明采用超聲波作為一種輔助提取手段，超聲波不僅能通過空化作用產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物細(xì)胞壁破裂，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散及溶解，而且能夠使酶分子的構(gòu)象發(fā)生正向轉(zhuǎn)化，從而提高酶的活性。由于豬胃蛋白酶是在胃基底細(xì)胞內(nèi)合成并在細(xì)胞內(nèi)行使功能的，一旦脫離其原來的生存環(huán)境，其分子構(gòu)象、反應(yīng)活性就與在細(xì)胞內(nèi)時(shí)不完全相同。因此，本實(shí)驗(yàn)將現(xiàn)代超聲技術(shù)應(yīng)用到豬胃蛋白酶的提取工藝中，并與傳統(tǒng)的酸法及堿法浸提進(jìn)行比較對(duì)照，超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶的最高比活力達(dá)5.82U/mg，傳統(tǒng)的酸法浸提比活力僅為3.5U/mg，超聲輔助酸提法較酸法提取豬胃蛋白酶的比活力提高近70%，浸提時(shí)間減少1.5h左右，超聲波輔助酸法提取豬胃蛋白酶優(yōu)于傳統(tǒng)的酸法浸提。附圖1是牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；附圖2是酪氨酸濃度變化標(biāo)準(zhǔn)曲線；附圖3是超聲頻率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響關(guān)系曲線；附圖4是超聲輔助浸提時(shí)間對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響曲線；附圖5是不同料液比對(duì)超聲輔助比活力的影響曲線；附圖6是不同吐溫-80添加量對(duì)超聲輔助浸提豬胃蛋白酶比活力的影響曲線；附圖7是超聲輔助與酸提法豬胃蛋白酶比活力的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)驗(yàn)材料豬胃粘膜.試劑-實(shí)驗(yàn)中主要試劑見表l。主要試劑表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)中所用儀器設(shè)備見表2所示。主要儀器設(shè)備表2<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>試劑的配制lmoL/L鹽酸溶液的配制量取8.6mL的濃鹽酸，加蒸餾水定容至100mL，即為lmoL/L鹽酸溶液。0.4moL/L三氯醋酸溶液的配制稱取三氯醋酸65.4g，用蒸餾水定容至1000mL，即為0.4moL/L三氯醋酸溶液。0.4moL/L碳酸鈉溶液的配制稱取無水碳酸鈉42.4g，定容至1000mL，即為0.4moL/L碳酸鈉溶液的配制。0.05moL/LpH2.5乳酸-乳酸鈉緩沖溶液的配制A液稱取10.6g80%90%的乳酸加蒸餾水定容至1000mL，即為A液。B液稱取16.0g70%的乳酸鈉加蒸餾水定容至1000mL，即為B液。取A液16mL，B液lmL稀釋1倍即成0.05moL/LpH2.5乳酸-乳酸鈉緩沖溶液。2%的酪蛋白底物的配制準(zhǔn)確稱取酪蛋白2.000g，加23滴乳酸潤濕，用玻璃棒碾碎。再加入90mL乳酸緩沖溶液，磁力加熱攪拌直至完全溶解。調(diào)節(jié)pH至2.5，加乳酸緩沖溶液定容至100mL，即為2%的酪蛋白底物。儲(chǔ)存在4'C冰箱內(nèi)，有效期3d。福林-酚試劑乙的配制100gNa2W042H20，25gNa2Mo042H20，700mL水，加50mL85X的磷酸，100mL濃鹽酸加熱回流10h，再加150g硫酸鋰，待其溶解后，加水50mL并帶有數(shù)滴溴水，開水煮沸15min，冷卻后加水定容至1000mL，即為福林-酚試劑乙，在4。C下可保存一年。考馬斯亮藍(lán)染色液的配制準(zhǔn)確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100mg溶于50mL95%的乙醇，加入100mL85呢的磷酸，用蒸餾水定容至1000mL，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)的H3P04。0.15moL/LNaCl溶液的配制準(zhǔn)確稱取NaCl8.85g，用蒸餾水定容至1000mL，即0.15moL/LNaCl溶液。標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液的配制純的牛血清蛋白，預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白含氮量，根據(jù)其純度，準(zhǔn)確稱取0.100g的牛血清蛋白，用0.15moL/LNaCl配成100Pg/mL蛋白溶液100Pg/mL的酪氨酸溶液的配制精確稱取預(yù)先于105。C干燥23h的酪氨酸0.100g，逐步加入lmoL/LHCl6mL溶解，用0.2moL/L的鹽酸定容至100mL，即得lmg/mL的酪氨酸溶液。取此濃溶液10mL，用0.2mol/L的鹽酸定容至100mL，即成10(^g/mL的酪氨酸溶液，此溶液配成后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存(保質(zhì)期為3天)。pH2.5的鹽酸溶液的配制量取4.0mL的濃鹽酸，緩慢加入到100mL去離子水中，攪拌均勻，用酸度計(jì)測(cè)定其pH，并使用去離子水調(diào)pH至2.5。檢測(cè)方法pH值的測(cè)定用PB-10型酸度計(jì)直接測(cè)定。(一)、蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)G-250是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中含有磺酸基的藍(lán)色染料，在465nm處有最大吸收值?？捡R斯亮藍(lán)G-250能與蛋白質(zhì)通過范德華力相互作用形成蛋白質(zhì)——考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，引起該染料的最大吸收波長(zhǎng)的位置發(fā)生紅移，在595nm處有最大吸收值。由于蛋白質(zhì)——考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在595nm處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)在465nm處的光吸收，因此，可大大的提高蛋白質(zhì)的測(cè)定靈敏度。蛋白質(zhì)——考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。利用溶液的顏色差異進(jìn)行比色測(cè)定，適合于蛋白質(zhì)類的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質(zhì)的微量分析。考馬斯亮藍(lán)G-250試劑呈色反應(yīng)顏色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測(cè)試蛋白質(zhì)量在lyg作用。(1)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取21支試管分成三組編號(hào)(即三組平行樣)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備表3依次加入各管中，再按照空白標(biāo)準(zhǔn)操作法操作。分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為100ugml/1)。用0.15moL/LNaCl補(bǔ)足至1.0mL，然后每支試管加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，立即混勻，lh內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595nm處比色。取三組平行樣的平均值。以吸光光度值(0D)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量分析的依據(jù)。按照上述"蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制"方法測(cè)得的數(shù)據(jù)如表3。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表3名稱123456了BSA/ng.m1/10102030405060吸光光度值(OD)100.0750.1810.2620.3030.3940.423吸光光度值(OD)200.0750.1800.2640.3020.3900.424吸光光度值(OD)300.0750.1820.2660.3040.3890.425由表3可得擬合后牛血清白蛋白的回歸方程y=135.88x-1.7775，R值為0.9818，所做曲線相關(guān)性良好，以蛋白含量為縱坐標(biāo)，0D值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線見圖1。將樣品的0D值(方法同標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定)即x代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出y，即得到樣品中的蛋白含量，此曲線作為豬胃蛋白酶定量分析的依據(jù)。(2)、蛋白含量的測(cè)定與計(jì)算取一定量的樣品，用0.15moL/LNaCl配成100mL樣品溶液。取四支試管，其中一支加入0.15moL/LNaCl溶液lmL(空白對(duì)照)，另三支中加入樣品lmL，然后每支試管加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，立即混勻，lh內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595nm處比色，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定蛋白含量。(二)、豬胃蛋白酶活力測(cè)定采用酸性蛋白酶的測(cè)定方法，用干酪素作為底物。測(cè)定原理是蛋白酶在一定溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸等)。在堿性條件下，含有酚基的氨基酸可以將福林試劑還原，生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，用分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酪氨酸的產(chǎn)生量和酶活力。此法用于監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品的粗測(cè)、研究提取和分離情況。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取7支試管編號(hào)，按表4分別吸取不同濃度的酪氨酸lmL，各加入0.4moL/L的碳酸鈉5mL，再加入稀的福林試劑lmL。搖勻置于水浴鍋中4CTC保溫發(fā)色20min，應(yīng)用722-型分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)660nm處測(cè)定0D值，用0.2moL/L鹽酸調(diào)整零點(diǎn)。按照"豬胃蛋白酶活性測(cè)定"方法測(cè)得的數(shù)據(jù)如表4。不同濃度酪氨酸OD值結(jié)果表表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表4可得擬合后酪氨酸濃度的回歸方程y=97.853x-0.558，R值為0.9991，所做曲線相關(guān)性良好，以蛋白含量為縱坐標(biāo)，0D值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。測(cè)定樣品的0D值(方法同豬胃蛋白酶活性測(cè)定)即x代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出y，即得到樣品的活性，此曲線作為豬胃蛋白酶定量分析的依據(jù)。(三)、比活力計(jì)算通過豬胃蛋白酶的活力和蛋白酶含量，計(jì)算比活力；計(jì)算公式如下豬胃蛋白酶比活力/仏^—、豬胃蛋白酶的活力/蛋白含量(四)、超聲輔助酸提法與傳統(tǒng)酸法、堿法浸提對(duì)照試驗(yàn)(1)原料的預(yù)處理選擇成年豬胃，剝?nèi)∝i胃基底部粘膜厚約23mm，絞碎冷凍備用o(2)超聲輔助酸提法準(zhǔn)確稱取處理后的豬胃粘膜500g，加入1750mLpH2.5的鹽酸浸提液，將其中一組樣品在超聲波下處理，超聲波處理在冰浴-4'C-0。C中進(jìn)行，聲強(qiáng)為220W、超聲功率為33kHz、超聲處理時(shí)間為120s、吐溫-80的添加量為11mg/mL，每1mL上述粗提液加入llmg吐溫_80，然后立即轉(zhuǎn)移到45。C的水浴中浸提,分別在30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min測(cè)定上清液酶活、蛋白含量，計(jì)算比活力。(3)酸法浸提準(zhǔn)確稱取處理后的豬胃粘膜500g，加入1750mLpH2.5的鹽酸浸提液，于45。C的水浴中浸提，分別在30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min、135min、150min、160min測(cè)定上清液酶活、蛋白含量，計(jì)算比活力。(4)堿法浸提豬胃蛋白酶的前體是豬胃蛋白酶原，存在于豬胃基底主細(xì)胞中。采用O.5mol/LpH7.3磷酸鹽堿性緩沖溶液對(duì)處理后的豬胃粘膜勻漿，低溫浸提12h，過濾，將濾餅再次用1/4體積的0.5mol/LpH7.3的磷酸鹽緩沖溶液二次浸提4h，過濾合并濾液，用鹽酸溶液調(diào)pH2.5左右將豬胃蛋白酶原激活(在此pH條件下，酶原自動(dòng)轉(zhuǎn)化成豬胃蛋白酶)，測(cè)定其比活力。將超聲輔助酸提法與酸法、堿法浸提得到的豬胃蛋白酶比活力進(jìn)行對(duì)比，選擇比活力最高的作為豬胃蛋白酶的最佳提取方法。(五)、超聲輔助酸提法的單因素試驗(yàn)影響超聲輔助酸提法效果的主要因素有超聲輸出功率、超聲頻率、超聲處理時(shí)間、料液比、保護(hù)劑吐溫-80的添加量。故試驗(yàn)中以豬胃蛋白酶比活力為指標(biāo)，選取這五個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行樣，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way-ANOVA單因素方差分析以及Duncan分析。(1)不同超聲波輸出功率對(duì)豬胃蛋白酶比活力影響的單因素試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取兩組處理后的豬胃基底部粘膜各500g,加入pH2.5左右鹽酸溶液，將超聲波輸出功率分別設(shè)定在強(qiáng)(320士20W)、弱(220士20W)兩個(gè)水平，頻率設(shè)定在30kHz，超聲處理時(shí)間為120s，料液比為1:2，吐溫-80的添加量為10mg/mL，測(cè)定提取液的豬胃蛋白酶活力及蛋白含量，計(jì)算比活力，研究不同超聲波輸出功率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響，確定超聲波輸出功率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的范圍。不同超聲功率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響結(jié)果超聲功率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響結(jié)果見表5。在超聲波輸出功率為220W左右時(shí)，豬胃蛋白酶的比活力普遍高于超聲波輸出功率為320W時(shí)的比活力。一般情況，較低強(qiáng)度的超聲作用可以產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)空化作用，這種空化作用較為緩和且有規(guī)律，形成的空化泡能夠使其周圍的酶分子受到微流產(chǎn)生的切力的作用，這也許對(duì)疏通酶內(nèi)外擴(kuò)散的傳質(zhì)通道有利；而較高強(qiáng)度的超聲則會(huì)產(chǎn)生瞬態(tài)空化作用，瞬態(tài)空化作用激烈而短暫，當(dāng)瞬態(tài)空化產(chǎn)生的空化泡崩裂時(shí)，會(huì)產(chǎn)生5000"C以上的高溫和50000kPa的高壓，導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生，同時(shí)在均相液體介質(zhì)中伴有強(qiáng)大的沖擊波，在非均相介質(zhì)中伴有射流。高能量的自由基將直接攻擊酶分子，使酶分子內(nèi)部化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致酶分子活性下降甚至失活。而酶分子在強(qiáng)大的沖擊波或射流的作用下，分子結(jié)構(gòu)容易被破壞甚至被剪切成小碎片而表現(xiàn)出活力下降甚至失活。超聲波輸出功率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響表5功率yiy2y3320±201.9872.0201.994220±203.1723.1235.098當(dāng)處于低超聲波輸出功率時(shí)，不斷溶出的豬胃蛋白酶分子的構(gòu)象發(fā)生正向轉(zhuǎn)化，加速酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，從而提高了酶的活性；當(dāng)超聲功率增大時(shí)，過高的空化作用，會(huì)產(chǎn)生局部高溫，使酶分子失活，不利提取，故本實(shí)驗(yàn)確定將超聲波輸出功率220土20W作為固定化因素，進(jìn)行下一步工藝條件的優(yōu)化。(2)不同超聲頻率對(duì)豬胃蛋白酶比活力影響的單因素試驗(yàn)-準(zhǔn)確稱取六組處理后的豬胃基底部粘膜500g，加入pH2.5左右鹽酸溶液，將超聲波頻率分別設(shè)定在23kHz、33kHz、43kHz、53kHz、63kHz等5個(gè)水平，超聲功率為220土20W,超聲處理120s，料液比為1:2，吐溫-80的添加量為10mg/mL，測(cè)定提取液的豬胃蛋白酶比活力及蛋白含量，計(jì)算比活力，研究不同超聲頻率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響，確定超聲頻率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的范圍。超聲頻率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響結(jié)果對(duì)超聲波影響豬胃蛋白酶比活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析見表6，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出比活力與超聲頻率的關(guān)系曲線圖3。不同超聲波處理頻率的方差分析及Duncan多重比較結(jié)果表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表6可以看出，在0kHz63kHz超聲頻率的三次重復(fù)因素分析中，F(xiàn)值為674.9，P值小于0.0001，相關(guān)系數(shù)為0.9965，說明不同超聲波處理頻率對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響有顯著差異。在OkHz33kHz超聲處理?xiàng)l件下，豬胃蛋白酶的比活力不斷上升，在33kHz時(shí)豬胃蛋白酶的比活力最高，當(dāng)超過33kHz時(shí)豬胃蛋白酶比活力開始呈下降趨勢(shì)。低強(qiáng)度的超聲波可以提高酶的活性，促進(jìn)酶的催化反應(yīng)。而高強(qiáng)度的超聲波會(huì)抑制酶的活性，甚至使酶失活。據(jù)此可以認(rèn)為超聲波頻率對(duì)酶的影響主要是由于空化作用或溫度作用引起的。超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶時(shí)，當(dāng)超聲波的頻率大于33kHz時(shí)，酶活下降較快，這因?yàn)轶w系熱效應(yīng)增加，空化作用加強(qiáng)，使酶失活，而在相對(duì)較低的超聲功率下會(huì)促進(jìn)酶促反應(yīng)的正向轉(zhuǎn)化，故將超聲波處理頻率的范圍確定在23kHz、33kHz、43kHz三個(gè)水平作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的范圍值。(3)、不同超聲波處理時(shí)間對(duì)豬胃蛋白酶比活力影響的單因素試準(zhǔn)確稱取六組處理后的豬胃基底部粘膜各500g，加入pH2.5左右鹽酸溶液，分別用超聲波處理Os、30s、60s、90s、120s、150s、180s，超聲功率設(shè)定為220士20W，超聲頻率為33kHz，料液比為1:2，吐溫-80的添加量為10mg/mL，測(cè)定超聲提取液的豬胃蛋白酶活力及蛋白含量，計(jì)算比活力，研究不同超聲輔助浸提時(shí)間對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響，確定超聲波處理時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的范圍。不同超聲處理時(shí)間對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響結(jié)果對(duì)不同超聲處理時(shí)間影響豬胃蛋白酶比活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析見表7，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出比活力與超聲處理時(shí)間的關(guān)系曲線見圖4。不同超聲波處理時(shí)間的方差分析及Duncan多重比較標(biāo)記結(jié)果表7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表7可以看出，在不同超聲浸提時(shí)間0s180s的重復(fù)因素分析中，F(xiàn)值為307.4，P值小于0.0001，相關(guān)系數(shù)為0.9925，說明不同超聲波處理時(shí)間對(duì)豬胃蛋白酶比活力有顯著差異。在0s120s豬胃蛋白酶的比活力不斷上升，在120s時(shí)豬胃蛋白酶的比活力最高，當(dāng)超過120s時(shí)豬胃蛋白酶比活力開始呈下降趨勢(shì)。超聲預(yù)處理可能縮短酶被激活所需的時(shí)間，并使其充分激活，加速酶反應(yīng)。其作用機(jī)制是由于超聲處理一方面促進(jìn)了活性中心的打開，減少了酶分子被激活所需的時(shí)間，另一方面超聲預(yù)處理過程能夠疏通酶分子內(nèi)擴(kuò)散的傳質(zhì)通道，有助于底物與活性位點(diǎn)的結(jié)合。當(dāng)超聲波法提取豬胃蛋白酶時(shí)，酶分子在120s作用的處理時(shí)間內(nèi)，酶促反應(yīng)發(fā)生了正向轉(zhuǎn)化，活性中心暴露，而長(zhǎng)時(shí)間暴露會(huì)由于空化作用和過熱失活，故將超聲波處理時(shí)間的范圍確定在90s、120s、150s三個(gè)水平作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)范圍值。(4)不同液料比對(duì)超聲波輔助浸提豬胃蛋白酶比活力影響的單因素試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取六組處理后的豬胃基底部粘膜各500g，分別加入pH2.5左右鹽酸溶液，使其料液比為l:l、1:2、1:3、1:4、1:5，超聲功率為220土20W，超聲頻率為33kHz，吐溫-80的添加量為10mg/mL，超聲輔助浸提時(shí)間為120s，測(cè)定超聲提取液的豬胃蛋白酶活力及蛋白含量，計(jì)算比活力，研究不同料液比對(duì)超聲輔助浸提豬胃蛋白酶比活力的影響，確定料液比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的范圍。超聲處理時(shí)不同料液比對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響結(jié)果不同料液比影響超聲輔助提取豬胃蛋白酶比活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行One-Way-AN0VA分析以及Duncan分析見表8，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出比活力與超聲處理時(shí)間的關(guān)系曲線圖，見圖5。不同超聲波處理料液比的方差分析及Duncan多重比較標(biāo)記結(jié)果表8料液比yiy2平均值;r變異來源SourceSSdfMSF值Pr>F5%水平115.2745.1975.2895.25處理間0.505940.126557.07<0.0001C125.5875.6225.6143處理內(nèi)0.0222100.0022B135.5855.6745.6575.608總變異0.528114B145.6885.7295.7935.639A155.7085.8225.7745.7375.786A由表8可以看出，在不同料液比超聲處理的三次重復(fù)試驗(yàn)因素分析中，F(xiàn)值為57.07，P值小于0.0001，相關(guān)系數(shù)為0.9580，說明不同料液比超聲波處理時(shí)對(duì)豬胃蛋白酶比活力有顯著差異。在料液比為[1:1，l:5]的范圍內(nèi)豬胃蛋白酶的比活力不斷上升，說明隨著溶劑的量的增加，豬胃蛋白酶的溶出效果很好，但較高的料液比會(huì)影響后續(xù)純化工藝，故選擇在粘度適中，且比活力較高的料液比(1:2、1:3、1:4)作為正交實(shí)驗(yàn)范圍值。(5)、不同吐溫-80濃度對(duì)超聲輔助提取豬胃蛋白酶比活力影響的單因素試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取六組處理后的豬胃基底部粘膜各500g，加入pH2.5左右鹽酸浸提液，并加入不同濃度的吐溫-80(0mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL)，超聲功率為220±20W，超聲頻率為33kHz,料液比為1:2，超聲輔助浸提時(shí)間為120s，測(cè)定超聲提取液的豬胃蛋白酶活力及蛋白含量，計(jì)算比活力。研究不同吐溫-80濃度對(duì)超聲輔助浸提豬胃蛋白酶比活力的影響，確定吐溫-80優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的范圍。超聲處理時(shí)不同吐溫-80濃度對(duì)豬胃蛋白酶比活力的影響結(jié)果超聲處理時(shí)，不同吐溫-80濃度對(duì)豬胃蛋白酶比活力的One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析見表9，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出比活力與吐溫-80濃度的關(guān)系曲線見圖6。不同吐溫-80濃度的方差分析及Duncan多重比較標(biāo)記結(jié)果表9<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表9可以看出，在添加不同吐溫-80濃度的超聲輔助浸提的因素分析中，F(xiàn)值為1868.8，P值小于0.0001，相關(guān)系數(shù)為0.9987，說明添加不同吐溫80對(duì)超聲輔助浸提豬胃蛋白酶比活力有顯著差異。隨著吐溫-80濃度不斷增加，豬胃蛋白酶的比活力也不斷上升，即吐溫-80用量的增加與酶比活力的提高成正比趨勢(shì)，但過量的吐溫-80并不能無限提高酶的比活力，因?yàn)楫?dāng)表面活性劑濃度超過其臨界膠束濃度后，再增加表面活性劑濃度，只能增加液相主體內(nèi)膠束的濃度，而界面吸附量并無多大改變，此時(shí)已達(dá)到最佳乳化效果，故再增加吐溫-80對(duì)提高酶的活性無明顯作用。此外，表面活性劑濃度過大時(shí)會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，因此選擇吐溫-80添加量為5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL作為正交試驗(yàn)的范圍。本研究也曾采用其他自由基清除劑進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，如甘露醇、己醇等，但所得豬胃蛋白酶粗提液的比活力相對(duì)較低，這一點(diǎn)也說明吐溫-80有效的抑制了超聲空化作用。吐溫-80對(duì)胃蛋白酶活有明顯保護(hù)作用。超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶技術(shù)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果在上述單因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)行二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合試驗(yàn)，以豬胃蛋白酶比活力為指標(biāo)，確定超聲輔助提取豬胃蛋白酶的最佳工藝條件。根據(jù)單因素試驗(yàn)所確定的水平范圍，以SASSystem8.2為輔助設(shè)計(jì)手段，做四因素五水平的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見表10、表11。試驗(yàn)因素水平對(duì)照表表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果和二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)方法分析進(jìn)行編程，y=—14.136115+0.283814*X,+0.172433*X2+3.603645*Jf3+0.020431*義4-0.0062880.000917*W0.000764*W0.012967*%3*X,-0.014236*W0.198399*%3*X3+0.000691*X4*《+0.001904*X4*X2—0.025847*W0.007253*JT4*X4并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析得回歸方程如下?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析及回歸方程的方差分析見表12?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析表表12<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表12說明二次回歸模型的F值為26.84，P<0.0001，大于在0.01水平上的F值，決定系數(shù)為0.9471，而失擬項(xiàng)的F值為2.28，小于在0.05水平的F值，說明該模型擬合良好。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的F值均大于0.01水平上的F值，說明各因素和各因素之間的交互作用都對(duì)豬胃蛋白酶比活力都有顯著的影響，各因素影響程度從大到小的依次順序?yàn)槌晻r(shí)間、超聲頻率、料液比、吐溫-80添加量。最優(yōu)提取條件見表13。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以500g豬胃粘膜通過超聲法浸提時(shí)，酶活力最高的超聲條件為超聲功率27kHz、超聲時(shí)間llls、料液比為1:3.5、吐溫_80的添加量為11mg/niL。該條件下得到的最高比活力為5.73U/mg。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照優(yōu)化的超聲波法提取豬胃蛋白酶的提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取絞碎的豬胃粘膜500g，加入pH2.5的鹽酸溶液1750mL，220土20W、27kHz條件下超聲處理llls，45。C水浴58min，離心取上清液測(cè)酶活及蛋白酶含量，計(jì)算比活力，將統(tǒng)計(jì)分析處理得到的預(yù)測(cè)值與之比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表14。采用優(yōu)化的超聲法提取豬胃蛋白酶的比活力可以達(dá)到5.82U/rag?；盍Ρ?4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>超聲輔助酸提法與酸法、堿法浸提對(duì)豬胃蛋白酶比活力影響的對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果超聲輔助酸提法與酸法浸提豬胃蛋白酶對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果見圖7。在30min120min之間超聲輔助效果較酸法浸提比活力高，超聲輔助后在60min左右時(shí)，浸提液比活力出現(xiàn)最高峰，而未經(jīng)超聲輔助浸提的對(duì)照組在150min左右時(shí)，上清液比活力才出現(xiàn)極值，但明顯低于超聲輔助浸提液的比活力，說明超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶優(yōu)于酸法浸提。合適的超聲條件可以使豬胃蛋白酶分子的構(gòu)象發(fā)生正向轉(zhuǎn)化，從而提高酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶的最高比活力達(dá)5.82U/mg，傳統(tǒng)的酸法浸提比活力僅為3.5U/mg，超聲輔助酸提法較酸法提取豬胃蛋白酶的比活力提高近70%，浸提時(shí)間減少1.5h左右，超聲波輔助酸法提取豬胃蛋白酶優(yōu)于傳統(tǒng)的酸法浸提。超聲輔助酸提法與堿法浸提豬胃蛋白酶的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表15。超聲輔助酸法提取較堿法浸提的比活力提高36.4%，浸提時(shí)間縮短近15h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明堿法浸提較酸法浸提得到的豬胃蛋白酶比活力要高，但浸提時(shí)間較長(zhǎng)，采用超聲輔助酸提法有效的提高了酸法浸提豬胃蛋白酶的比活力，而且大大的縮短了浸提時(shí)間。超聲輔助浸提與堿性緩沖溶液浸提的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表表15<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)驗(yàn)通過對(duì)超聲輔助酸法與酸法、堿法提取豬胃蛋白酶的對(duì)照試驗(yàn)，最終選用了超聲輔助酸提法作為提取豬胃蛋白酶的最佳方法。通過比較分析可知(1)堿法浸提較酸法浸提獲得的豬胃蛋白酶比活力高，但浸提時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)PH值的升高使豬胃粘膜中的堿性雜蛋白溶解，為后續(xù)分離帶來不便，所以堿法不利于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)超聲輔助酸提法能夠最大限度的保留豬胃蛋白酶活性，超聲功率、超聲頻率對(duì)豬胃蛋白酶活力的影響都可以用空化作用或溫度作用來解釋；超聲處理時(shí)間對(duì)豬胃蛋白酶活力的影響是由于超聲波處理促進(jìn)了活性中心的打開，減少了酶分子被激活的時(shí)間；而超聲處理時(shí)料液比對(duì)豬胃蛋白酶活力的影響較小，這一點(diǎn)不同種類的酶的研究結(jié)果差異很大。實(shí)驗(yàn)主要通過對(duì)豬胃蛋白酶不同提取方法比較分析，確定了超聲輔助酸提法為豬胃蛋白酶的最佳提取工藝。實(shí)驗(yàn)以豬胃基底部粘膜為原料，豬胃蛋白酶的比活力為指標(biāo)，對(duì)影響超聲輔助浸提的主要因素——超聲輸出功率、超聲頻率、超聲時(shí)間、料液比、乳化劑吐溫-80添加量等條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出(1)超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶較傳統(tǒng)堿法浸提豬胃蛋白酶時(shí)間縮短近15倍，比活力提高36.4%，較酸法浸提豬胃蛋白酶浸提時(shí)間縮短1.5h，比活力提高近70%。(2)超聲輔助提取豬胃蛋白酶的最佳工藝參數(shù)為超聲輸出功率220W士20W、超聲頻率27kHz、超聲處理時(shí)間llls、料液比1:3.5、吐溫-80的濃度11mg/mL，在此工藝條件下，可制得豬胃蛋白酶的比活力5.82U/mg，高于酸法、堿法提取得到的豬胃蛋白酶的比活力。權(quán)利要求1、一種豬胃蛋白酶的提取方法，包括下列步驟選擇成年豬胃，剝?nèi)∝i胃基底部粘膜厚約2～3mm，絞碎，在絞碎的粘膜內(nèi)加入1∶2～4(質(zhì)量與體積比)倍的pH2.5的鹽酸浸提液，加入濃度為5mg/mL～15mg/mL的吐溫-80，之后將上述混合液放在超聲波藥品處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理，超聲波功率為220±20W～320±20W，超聲波頻率為23kHz～43kHz，超聲波處理時(shí)間為90s～150s，然后立即轉(zhuǎn)移到45℃的水浴中浸提58min，離心取上清液即得到蛋白酶。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胃蛋白酶的提取方法，其特征在于絞肉機(jī)絞碎至0.20.3mm。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胃蛋白酶的提取方法，其特征在于超聲波功率為220W、超聲頻率為27kHz、超聲時(shí)間為llls、粘膜與鹽酸浸提液的質(zhì)量體積比為1:3.5、吐溫-80的添加濃度為11mg/mL。全文摘要本發(fā)明涉及一種豬胃蛋白酶的提取方法。該方法包括下列步驟選擇成年豬胃，剝?nèi)∝i胃基底部粘膜厚約2～3mm，絞碎，在絞碎的粘膜內(nèi)加入1∶2～4倍的pH2.5的鹽酸浸提液，加入濃度為5mg/mL～15mg/mL的吐溫-80，之后將上述混合液放在超聲波藥品處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理，超聲波功率為220±20W～320±20W，超聲波頻率為23kHz～43kHz，超聲波處理時(shí)間為90s～150s，然后立即轉(zhuǎn)移到45℃的水浴中浸提58min，離心取上清液即得到蛋白酶。該超聲輔助酸法提取豬胃蛋白酶的最高比活力達(dá)5.82U/mg，傳統(tǒng)的酸法浸提比活力僅為3.5U/mg，浸提時(shí)間減少1.5h左右。文檔編號(hào)C12N9/64GK101624585SQ200910071988公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者劉妍妍,崔素萍,張麗萍,曹榮安,李良玉,李艷青,楠楊,瑩王,建賈,魏文毅申請(qǐng)人:張麗萍