專利名稱：一株吲哚和糞臭素降解菌株lpc24的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種噴哚和糞臭素降解微生物。
背景技術(shù)：
吲哚和糞臭素是畜禽養(yǎng)殖場廢水中主要的有惡臭氣味的雜環(huán)芳香烴類化合物，它們由 色氨酸在動物體內(nèi)分解而產(chǎn)生的。這兩種化合物同樣出現(xiàn)在醫(yī)療用品、殺蟲劑、消毒劑、 農(nóng)用化工用品的生產(chǎn)廢水中。這些化學(xué)物質(zhì)的大規(guī)模的生產(chǎn)和廣泛的應(yīng)用導(dǎo)致了土壤、地 表水和地下水的污染，對人體和動物健康造成了嚴重的威脅。吲哚和糞臭素可以被人體和 動物吸收進入血液，經(jīng)生物活化后產(chǎn)生有毒的中間產(chǎn)物而影響血液中復(fù)合胺的產(chǎn)生，甚至 產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。有研究表明，動物體內(nèi)雌激素酮濃度的升高與糞臭素含量直接相關(guān)。另外， 糞臭素還是一種肺炎球菌毒素。暴露在吲哚環(huán)境下的植物組織由于蒽醌合成的影響而表現(xiàn) 出低色素沉著。吲哚和糞臭素同樣對許多微生物存在毒性效應(yīng)。它們對細菌均有相當廣泛 的生物抑制作用，同時對瘤胃纖毛微生物也有毒性作用。
由于吲哚和糞臭素的難降解性及其生物毒性，降解這類化合物的細菌很難分離。雖然 前人做過一些關(guān)于混合微生物降解的研究工作，但關(guān)于純細菌對吲哚或糞臭素的降解還很 少見到報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24，它具有良好的去除畜禽養(yǎng)殖 廢水中吲哚和糞臭素的能力。
本發(fā)明所提供一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24，為惡臭假單胞菌(i^e^附o"m.;^"必) LPC24 CCTCC NO: M 209099，已于2009年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱 CCTCC)，保藏號CCTCC N0:M 209099。
一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24的菌落形態(tài)為菌落呈米白色(老齡菌呈米黃色)、 規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，菌株生理特征呈直或微彎的 桿狀，0.7 1.1nmX2.0 4.0pm，單個或成對排列，革蘭氏陰性；主要生化特征兼性 厭氧，化能異養(yǎng)菌，能利用硝酸鹽，氧化酶陽性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶，運動，不 生孢子，最適生長溫度25 37'C。
所述的畜禽主要有豬、牛、羊、驢、兔、雞、鴨、鵝等。
本發(fā)明的有益效果是從畜禽養(yǎng)殖廢水的厭氧反應(yīng)器的活性污泥中篩選到一株在含糞 臭素和吲哚條件下具有一定生長能力的新菌株。 一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24有良好 的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中噴哚和糞臭素的能力，該菌株能使吲哚和糞臭素的去除效率提高 20-30%。


圖1是一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1:核DNA， 2:擴 增產(chǎn)物，M: Marker )。
圖2是一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24的電鏡圖片。
圖3是一株噴哚和糞臭素降解菌株LPC24在含有0. 5 niM吲哚和糞臭素的人工廢水中的 降解效率圖。
具體實施例方式
一、 一株吲哚和糞臭素降解菌的篩選方法-(一)、材料準備-
1、實驗廢水(畜禽養(yǎng)殖廢水)取自湖北省鄂州市湖北省原種豬場排污口，活性污泥取
3處理實驗室， 一臺處理畜禽養(yǎng)殖廢水的厭氧反 應(yīng)器中(厭氧反應(yīng)器中實驗廢水取自湖北省鄂州市湖北省原種豬場排污口)。 2 、 i昔養(yǎng)基
液體MSM培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2S04, 0.33; NaN03, 0.85; K2HP04, 0.79; KH2P04, 0.20; CaCl2， 0.05; MgCl2, 0.50; FeCl2, 0.01， H20 lOOOmL; pH為7.2;高壓滅菌后采用過濾除菌后 的糞臭素和吲哚，使液體MSM培養(yǎng)基中糞臭素和吲哚的濃度為1.0 mM。
固體MSM培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2S04, 0.33; NaN03, 0.85; K2HP04, 0.79; KH2P04， 0.20; CaCl2, 0,05; MgCl2, 0.50; FeCl2， 0.01, H20 lOOOmL;瓊脂15g， pH為7.2;高壓滅菌后采用 過濾除菌后的糞臭素和吲哚，使液體MSM培養(yǎng)基中糞臭素和吲哚的濃度為1.0 mM。
LB液體培養(yǎng)基為蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水lOOOmL， pH7. 0。
LB固體培養(yǎng)基為蛋白胨10. Og，酵母提取物5. Og， NaCllO. Og， 蒸熘水lOOOmL, 瓊脂15g， pH7. 0。
3、實驗儀器和設(shè)備 國華SHA-B恒溫振蕩器， S朋150G光照生物培養(yǎng)箱，
臥式壓力蒸汽滅菌器------上海醫(yī)用核子儀器廠，
WMX-1型微波密封消解COD速測儀/-----汕頭市環(huán)海工程總公司，
722S分光光度計——上海棱光技術(shù)有限公司，
光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH計等-----Hana有限公司，
超凈工作臺， 鼓風干燥箱，
JEM-100CX11透射電子顯微鏡， PTC200型PCR儀， 電泳儀及電泳槽， 凝膠紫外觀測儀， DDS-11型電導(dǎo)儀， (二)、菌株的篩選分離與純化
1) 、初篩采用直接涂布法
取穩(wěn)定運行三個月以上的厭氧反應(yīng)器中的活性污泥l(xiāng)g(反應(yīng)器中所運行的實驗廢水(畜
禽養(yǎng)殖廢水)取自于鄂州市湖北省原種豬場排污口h加入50mL無菌蒸餾水，以5000轉(zhuǎn)/ 分的速度離心，離心后去除上清液；再加入50mL無菌蒸餾水，以5000轉(zhuǎn)/分的速度離心， 如此重復(fù)操作三次，得到沉淀物；
然后將沉淀物用無菌水稀釋至100mL，得到菌懸液；然后取上述菌懸液20jaL涂布于 含有1.0mM的糞臭素和吲哚的固體MSM培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)一周，挑選平板(即涂有固體 MSM培養(yǎng)基的平皿)上不同形態(tài)的單菌落在液體MSM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進一步進行 涂布分離，經(jīng)3-5次純化、分離{純化、分離用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物(LB平板上的菌落) 少許在平板上進行劃線；當接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐 漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細胞長成一個菌落，即得到 純化后的單菌落}，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于LB液體培養(yǎng) 基中，3(TC恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液，得到初篩菌懸液；
2) 、 二次篩選取初篩菌懸液lmL， 5000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘，棄上清，用無菌水 重懸，加入100mL含有1. OmM糞臭素和吲哚的液體MSM培養(yǎng)基內(nèi)，30。C恒溫培養(yǎng)7天，檢 測培養(yǎng)基中吲哚、糞臭素的去除效率；選取去除效率大于50%的菌株的菌懸液，取復(fù)篩菌懸液20 y L涂于固體MSM培養(yǎng)基，3(TC恒溫培養(yǎng)一周天，觀察并記錄細菌生長情況以及菌落 形態(tài)；獲得一株編號為LPC24的菌株(菌株LPC24)，即一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24。
二、吲哚和糞臭素降解菌株LPC24的鑒定
1、對一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24的鑒定
對一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24進行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定， 從分子水平確定菌株LPC24的種屬。
16S rRNA序列分析主要按照以下步驟
1) 提取細菌核DNA，
a) 集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內(nèi)培養(yǎng)15小時，取其菌懸液lniL 于1. 5mL的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b) 加STE lmL洗一次，振蕩重懸細菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c) 加600 (aLTE，劇烈振蕩重懸細菌，加入10X的SDS 65pL， 65。C水浴5-10min。
d) 加等體積酚氯仿抽提三次。
e) 小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3麗aAc， 12000 rpm離心10min。 徹底棄上清。
f) DNA沉淀用70%乙醇洗一次，風干后溶于20 (iLTE備用。
TE緩沖液:lO腿ol /L Tr丄s-Cl (pH8. 0); l誦ol /L EDTA-Na2 (pH8. 0); STE緩沖液0. lmol/L NaCl;10咖ol/L Tris-Cl (pH8.0); l隱ol/L EDTA (pH8. 0);
2) 16S rRNA基因的PCR擴增，
PCR擴增引物參照Weisburg等人的方法合成。 Pl:正向引物5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' P2:反向引物5' GGTTACCTTGTTACGACTT3' 在50nL反應(yīng)體積中，加入lpL模板DNA (0. l叫)，0. 5pL Pl和P2 (纟色濃度為0. 5pM)， l(aLdNTP (每種NTPO. 2 mM)， 0. 5|aLTaq聚合酶(2 U)禾n 5 IOXPCR緩沖液。PCR擴增 條件為94 。C預(yù)變性5min;在94 。C變性30s， 61-65 °C退火30s， 72 。C延伸lmin， 循環(huán)30次；最后72 。C終延伸10 min。
3) PCR產(chǎn)物的純化回收
將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放 入1. 5mL離心管中加2倍體積TE， 65'C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取 上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍體積的1Omol/L乙酸銨和2倍 體積無水乙醇沉淀，離心，用70%乙醇洗沉淀一次，風十后溶于適量火菌雙蒸水。
4) 16S rDNA的全序列測定和分析 PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。
P-f: CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC;
P-r: GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC 。 加入lpL模板DNA (<0. l叫)，PCR擴增30個循環(huán)(94 °C 1 min， 55 °C 30s， 72 。C 2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373 A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，
最終從分子水平上確定該菌的種屬。 2、 16S rRNA序列測定 本發(fā)明采用對16SrRNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑒定。以細菌的 核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度 為1431bp的擴增帶(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定 其全序列。<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢) <120〉一株噴哚和糞臭素降解菌株LPC24 <160>1431
<210〉1
<211〉1431bp
<212>腿
<213>惡臭假單胞菌(/^e〃J咖朋as p〃^Va) <400〉1
CCGTGGTAACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATG60
GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCG120
ATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAATCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCG180
GTTTTGTGAGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAACA240
CGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGG300
TTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAAAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGG360
GTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGC420
AGCACCTGTGTCAGAATTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTC480
AAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCCAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC540
GGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACT600
TAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATT.CCAACGGCTAGTTGACATCGTTTA660
CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTG720
TCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTT780
CACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATG840
CAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCT■
TTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACA960
GAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCC1020
CTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGC1080
TGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGG1140
ACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCT1200
TGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGG1260
CCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAAC1320
GTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAA1380
GGAGCAAGCTCCCGTCATCCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCA1431
三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性-
對菌株LPC24的菌落形態(tài)進行了仔細的觀察，該菌落形態(tài)菌落呈米白色(老齡菌呈
米黃色)、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，菌株生理特征呈直 或微彎的桿狀，0.7 1.1umX2.0 4.0ym，單個或成對排列，革蘭氏陰性；主要生化特 征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，能利用硝酸鹽，氧化酶陽性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶， 運動，不生孢子，最適生長溫度25 37'C。細菌表觀見透射電鏡圖2。四、菌株LPC24為新的菌株
采用BLAST分析法對菌株LPC24的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)， 菌株LPC24與惡臭假單胞菌(尸sew/OT0/7as/wOVa)的同源性高達99.0%。
綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，菌株LPC24命名為惡臭假單胞菌(尸se"GbM^3S /wz^/a) LPC24。惡臭假單胞菌(Z^e"ob/i70朋s p"jVa) LPC24為新的菌株，已于2009年5 月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC N0:M 209099。
本發(fā)明從畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧反應(yīng)器的活性污泥中分離出這一株細菌，并發(fā)現(xiàn)其較強的 降解卩引哚和糞臭素的功能。這拓寬了人們對惡臭假單胞菌(Ae"obz 朋as ，"血)在其功 能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含吲哚和糞臭素類廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有 較強的實際應(yīng)用價值。
五、菌株LPC24的應(yīng)用
(一) 、挑取惡臭假單胞菌(P^fo附o"必.戸W") LPC2A單菌落，于液體MSM培養(yǎng)基 中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的惡臭假單胞菌(i^cfowo"做；^W") LPC24:含吲哚和糞臭素廢水
(如畜禽養(yǎng)殖廢水)的體積比為0.5-2: 100取惡臭假單胞菌(i^etfowo"as.LPC24 接種于含吲哚和糞臭素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廢水)中，30-35'C恒溫培養(yǎng)，pH值為6.0-8.0， 反應(yīng)3-5天。
所述的液體MSM培養(yǎng)基為(NH4)2S04, 0.33g;NaN03, 0.85 g; K2HP04， 0.79 g; KH2P04, 0.20 g; CaCl2, 0.05 g; MgCl2， 0.50g; FeCl2， 0.01 g; H20 lOOOmL; pH為7.2;高壓滅菌 后采用過濾除菌后的糞臭素和吲哚，使液體MSM培養(yǎng)基中糞臭素和吲哚的濃度為1.0 mM (即腿ol/L)。
(二) 、菌株LPC24對吲哚、糞臭素的降解能力
為了考察菌株對噴哚、糞臭素的降解能力，研究了在人工廢水MSM中，細菌降解吲哚、 糞臭素的能力。取人工廢水MSM(人工廢水MSM(g/L): (NH4)2S04, 0.33;NaNO3, 0.85; K2HP04, 0.79; KH2P04, 0.20; CaCl2, 0.05; MgCl2, 0.50; FeCl2, 0.01, pH為7.2;加入糞臭素和吲哚使其 終濃度為1.0 mM} lOOmL加入250mL的錐形瓶中，加入菌株LPC24的菌懸液(菌懸液配制 用接種環(huán)挑取LPC24菌落于10mL的LB液體培養(yǎng)基中，3(TC震搖培養(yǎng)12小時)lmL， 3(TC、 靜止培養(yǎng)18d，定期檢測剩余吲哚、糞臭素的量(見圖3)。結(jié)果表明。該菌株能在10天內(nèi) 將0. 5mM的吲哚降解99%以上，將0. 5mM的糞臭素在19天內(nèi)降解99%以上。
為了考察該菌株在實際處理畜禽養(yǎng)殖廢水的中吲哚和糞臭素的能力，研究了該菌株投 加到畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧反應(yīng)器中，吲哚和糞臭素的降解效率。在長期(穩(wěn)定運行三個月以 上)穩(wěn)定運行的反應(yīng)器中加入菌株LPC24的菌懸液10mL (菌懸液配制用接種環(huán)挑取LPC24 菌落于10mL的LB液體培養(yǎng)基中，3(TC震搖培養(yǎng)12小時)，反應(yīng)器中含吲哚和糞臭素廢水{實 驗廢水(畜禽養(yǎng)殖廢水)取自湖北省鄂州市湖北省原種豬場排污口}為lOOOmL (糞臭素的濃 度約為1.0mg/L，吲哚的濃度約為1.5 mg/L)， 30°C、靜止一周，再穩(wěn)定運行30天，在反 應(yīng)器穩(wěn)定運行期間定期檢測吲哚、糞臭素的去除效率，與未投加該菌株的對照反應(yīng)器對比， 結(jié)果表明，去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的糞臭素約為1.0mg/L，吲哚約為1.5mg/L;該菌株能使該 反應(yīng)器處理吲哚和糞臭素的去除效率提高20-30% (反應(yīng)器原始去除率為70-75%，加入菌株 LPC24后處理效率為96-99%)。
權(quán)利要求
1.一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24，其特征在于所述的菌株為惡臭假單胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NOM 209099。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24，其特征在于所述的惡臭假單胞菌(P"itowo"ctt'.;^"V/fl) LPC24 CCTCC N0:M 209099的菌落形態(tài)為菌落呈米白色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，菌株生理特征呈直或微彎的桿狀，0.7 1. lUfflX2.0 4.0tim，單個或成對排列，革蘭氏陰性；主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，能利用硝酸鹽，氧化酶陽性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶，運動，不生孢子，最適生長溫度25 37匸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種吲哚和糞臭素降解微生物。一株吲哚和糞臭素降解菌株LPC24，其特征在于所述的菌株為惡臭假單胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NOM 209099。菌落形態(tài)為菌落呈米白色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，菌株生理特征呈直或微彎的桿狀，0.7～1.1μm×2.0～4.0μm，單個或成對排列，革蘭氏陰性；主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，能利用硝酸鹽，氧化酶陽性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶，運動，不生孢子，最適生長溫度25～37℃。本發(fā)明具有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中吲哚和糞臭素的能力。
文檔編號C12N1/20GK101665776SQ20091006306
公開日2010年3月10日 申請日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者珩 劉, 琨 劉, 平 李, 王焰新, 王艷紅, 蕾 童 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)