專利名稱：一株纖維素降解菌株lcd51的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種纖維素降解微生物。
背景技術：
纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物，是一類可再生的重要資源和能源。纖維素不 溶于水，在環(huán)境中結構穩(wěn)定、難降解，并廣泛存在于農作物秸稈、城市固體廢物、畜禽養(yǎng) 殖廢棄物和造紙廢水中，是難降解污染物之一。目前，從環(huán)境中分離和選育纖維素酶高產 菌株，挖掘纖維素酶產生菌的資源，利用微生物的酶解作用，解決環(huán)境污染問題，甚至轉化 為能源已成為國內外研究熱點之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株纖維素降解菌株LCD51，它能去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的纖維素。
本發(fā)明所提供的一株纖維素降解菌株LCD51，為水氏黃桿菌(F/avok "en'M附附fewtoz7) LCD51 CCTCC NO: M 209100，已于2009年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱 CCTCC)，保藏號CCTCC N0:M 209100。
菌株LCD51的菌落形態(tài)為菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊緣 整齊；生理特征細菌呈規(guī)則的直桿狀，單個或成對排列，常呈V形排列，革蘭氏陰性， 運動，兼性厭氧，不產生氧化酶和接觸酶；最適生長pH值6.5 7.5，最適生長溫度25 35 。C 。
所述的畜禽主要有豬、牛、羊、驢、兔、雞、鴨、鵝等。
本發(fā)明的有益效果是從畜禽養(yǎng)殖場排污口的池底污泥中(取自湖北省鄂州市市郊某種 豬養(yǎng)殖場排污口的池底污泥)篩選到一株在纖維素條件下具有一定生長能力的新菌株。一
株纖維素降解菌株LCD51有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力，該菌株能在72小時
之內去除廢水中的纖維素21-28mg/L。


圖1是纖維素降解菌株LCD51的PCR產物瓊脂糖電泳圖(1:核DNA， 2:擴增產物，3: Marker)。
圖2是纖維素降解菌株LCD51的電鏡圖片。 圖3是纖維素降解菌株LCD51的纖維素酶活數據圖。
具體實施例方式
一、 一株纖維素降解菌株LCD51的篩選方法 (一)、材料準備
1、 實驗廢水和池底污泥取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口。
2、 培養(yǎng)基
篩選培養(yǎng)基(g/L): Na2HP043.0， NH4,.8， MgS04 7H20 0. 1 ， CaCl20.1， CMC-Na 2.0， 微晶纖維素粉l.O，濾紙2.0，稻草2.0， pH值7.0 7.2。
產酶培養(yǎng)基(g/L): Na異3.0， N跳0.8， MgS04 7H20 0. 5， CaCl20.5， FeS04 7H20 0.01， MnS04 H20 0. 01， ZnS04 0.01， CMC-Na 10. 0 (或微晶纖維素粉5. 0或纖維二糖5.0)， 蛋白胨1.0，酵母提取物0.5， pH值7.0 7.2。
3LB液體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000mL， pH7.0。
LB固體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g， pH7. 0。
LB斜面培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000raL，瓊脂20g (固)，pH7. 0。 3、實驗儀器和設備 國華SHA-B恒溫振蕩器， SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，
臥式壓力蒸汽火菌器------上海醫(yī)用核子儀器廠，
光學顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH計等-----Hana有限公司，
超凈工作臺， 鼓風千燥箱，
KYKY-1000B掃描電子顯微鏡， PTC200型PCR儀， 電泳儀及電泳槽， UVP凝膠紫外觀測儀，
微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑廠，DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒購自 美國Promega公司、％《酶、dNTP、 DNAMarker、 W"ose酶均購自R本Takara公司。 (二)、菌株的篩選分離與純化
1) 、初篩①稱取1克畜禽養(yǎng)殖場排污口的池底污泥樣品(樣品為池底污泥，取自湖 北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口)，用20mL無，水水洗，8000 rpn離心5 min，棄上 清，再加20mL水，重懸土樣；重懸后再加20mL水離心(8000 rpm離心5 min)，棄上清， 重懸土樣，此步驟重復操作3次，得到泥水混合物，備用；
② 將泥水混合物轉入裝有100mL篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，3CTC恒溫靜至培養(yǎng) 至培養(yǎng)基渾濁，得到菌懸液A;
③ 取5 mL菌懸液A于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周；將 培養(yǎng)一周后的菌懸液取5mL于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周， 重復操作5-6次，最后得到的菌懸液B;
④ 將最后得到的菌懸液B中取20 于LB平板上涂布；置3(TC下恒溫培養(yǎng)1-3天， 挑取長勢良好、菌落形態(tài)各不相同的菌落，經2-5次純化后{純化用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng) 物(LB平板上的菌落)少許在平板上進行劃線；當接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基表面上往后移動 時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經培養(yǎng)，每一個細胞 長成一個菌落，即得到純化后的單菌落}，得到待鑒定的菌落，保種備用。
2) 、 二次篩選將待鑒定的菌落經前培養(yǎng)后在LB液體培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)后，點種到篩 選培養(yǎng)基平板上，30。C恒溫培養(yǎng)2~4 d，往培養(yǎng)皿中加入30mL的1 mg/mL的剛果紅溶液， 染色lh，棄去染液，加入50mL的1 mol/L的NaCl溶液，洗滌1 h，若菌落的周圍會出現淸 晰的透明圈，說明細菌產生纖維素酶，依據透明圈的直徑大小選擇直徑大的產酶菌株。
用接種針挑取直徑大的產酶菌株(在菌落特征上有明顯差異的單菌)，對挑取的產酶菌 株在LB平板上進行劃線培養(yǎng)，直至獲得單一菌株，并于LB斜面培養(yǎng)基上劃線保種，得到 一株菌株LCD51，即纖維素降解菌株LCD51。
二、纖維素降解菌株LCD51的鑒定 1、對纖維素降解菌株LCD51的鑒定對纖維素降解菌株LCD51進行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定，從分子水 平確定纖維素降解菌株的種屬。
16SrRNA序列分析主要按照以下步驟
1) 提取細菌核DM，
a) 集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基管內培養(yǎng)18小時，取其菌 懸液lmL于1.5mL的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b) 加STE緩沖液lmL洗一次，振蕩重懸細菌，8000rpm離心5min,棄上清液。
c) 加600 ^LTE緩沖液，劇烈振蕩重懸細菌，加入10%的SDS 65nL， 65。C水浴5-10min。
d) 加等體積酚氯仿抽提三次。
e) 小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc， 12000 rpm離心10min。 徹底棄上清。
f) DNA沉淀用70%乙醇洗一次，風干后溶于20pL TE緩沖液備用。
TE緩沖液:lO醒ol /L Tris-Cl (pH8. 0); l隱ol /L EDTA-Na2 (p朋.0)， STE緩沖液0. lmol/L NaCl 10咖ol/L Tris-C丄(pH8.0) l咖ol/L EDTA (p亂0)，
2) 16S rRNA基因的PCR擴增， PCR擴增引物參照Weisburg等人的方法合成。
Pl:正向引物5， AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，
P2:反向引物5' GGTTACCTTGTTACGACTT3， 在50|aL反應體積中，加入lpL模板DNA (0. l叫)，0. 5|aL Pl和P2 (終濃度為0. 5一)， lpLdNTP (每種NTPO. 2 raM)， 0. 5jxLTaq聚合酶(2 U)和5 IOXPCR緩沖液。PCR擴增 條件為94 。C預變性5 min;在94 。C變性30s， 61-65 。C退火30s， 72 。C延伸lmin， 循環(huán)30次；最后72 °C終延伸10 min。
3) PCR產物的回收
將PCR產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放 入1. 5mL離心管中加2倍體積TE， 65'C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取 上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提次，收集上清加0. 1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍 體積無水乙醇沉淀，離心，用70°/。乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水。
4) 16S rDNA的全序列測定和分析
PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。 P-f: CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC; P-r: GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC 。 加入i(aL模板 A (<0.1嗎)，PCR擴增30個循環(huán)(94 °C 1 min， 55 °C 30s， 72 。C 2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應。然后，在Applied Biosystcm 373 A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數據庫比較分析，
最終從分子水平上確定該菌的種屬。 2、 16S rRNA序列測定 本發(fā)明采用對16SrRNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑒定。以細菌的 核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度 為1421bp的擴增帶(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1所示。PCR產物經純化后，測定 其仝序列。
<110>中國地質大學(武漢) <120>—株纖維素降解菌株LCD51 <160>1421 5<210>1
<211>1421bp
<212>腿
<213>水氏黃桿菌(F/avoZ)(2"m',) <400>1
AGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGGACGGGATCCATCGGTAGCTTGCTACCGATGGT60
GAGAGTGGCGCACGGGTGCGTMCGCGTGAGCMCCTACCCATATCAGGGGGATAGCCCG120
AAGAAATTCGGATTAACACCGCATGACACTGCTTTCCGGCATCGGGAGGTGGTC嵐TAT180
TCATAGGATATGGATGGGCTCGCGTGACGTTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCM240
GGCGACGATGTCTAGGGGCTCTGAGAGGAGMTCCCCCACACTGGTACTGAGACAGGMC300
CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGTCMTGGGGGCAACCCTGAACCAA360
CCATGCCGCGTGCAGGACGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGTTAGGGAATAAA420
CCCCGCTACGTGTAGCGGGCTGAATGTACCT嵐GAATMGGATCGGCTAACTCCGTGCC480
AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTG540
CGTAGGCGGCACTTTAAGTCAGGGGTGAAATACGGCAGCTCMCTGTCGCAGTGCCCTTG600
ATACTGAAGTGCTTGAATGCGGTTGAAGACGGCGGAATGAGACAAGTAGCGGTGAAATGC660
ATAGATATGTCTCAGAACACCGATTGCGAAGGCAGCTGTCTAAGCCGTTATTGACGCTGA720
TGCACGAAAGCGTGGGGATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGA780
TGATGACTCGATGTTTGCGATATACCGTAAGCGTCCMGCGAAAGCGTTAAGTCATCCAC840
CTGGGGAGTACGCCCGCMGGGTG嵐CTCAMGGMTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG■
AGGAGCATGTGGTTTMTTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAAAGTTACT960
GMGGGCGCAGAGACGCGCCCGTCCTTCGGGACAGGMACTAGGTGCTGCATGGCTGTCG1020
TCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCMCCCCTATGTTTAG1080
TTGCCAGCACGTCMGGTGGGGACTCT嵐CAGACTGCCTGCGCMGCAGAGAGGMGGC1140
TGGGACGACGTCMGTCATCATGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGCTACAATGGA1200
TGGTACAGCGGGCAGCTACACAGCMTGTGATGCCAATCTCGMAAGCCATTCACAGTTC1260
GGATCGGGGTCTGCMCTCGACCCCGTGMGTAGGATTCGCTAGTAATCGCGTATCAGCA1320
ATGACGCGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCMGCCATGAAAGCTG1380
GGGGTACCTAAAGCATGMACCGCMGGAGCGTGTTAGGGT1421
三、 菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
菌株LCD51的菌落形態(tài)為菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊 緣整齊；生理特征細菌呈規(guī)則的直桿狀，單個或成對排列，常呈V形排列，革蘭氏陰性， 運動，兼性厭氧，不產生氧化酶和接觸酶。最適生長pH值6.5 7.5，最適生長溫度25 35°C，不能在6(TC生長。同時對菌表觀也做了掃描電鏡觀察，結果見圖2。
四、 菌株LCD51為新的菌株
采用BLAST分析法對菌株LCD51的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫比較分析發(fā)現， 菌株LCD51與水氏黃桿菌(Mavo6""eWwm wfewto7)的同源性高達99. 0%。
綜合菌株的生理生化以及分于鑒定結果，菌株LCD51命名為水氏黃桿菌(尸/flwtoc欣/MW LCD51。査閱有關資料，尚水氏黃桿菌屬有關畜禽養(yǎng)殖廢水中降解纖維素能力研究 的報道。水氏黃桿菌(F/flw6a"m'ww m/zwtoz'Z) LCD51為新的菌株，已于2009年5月6日
6保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC N0:M 209100。
本發(fā)明從湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口的池底污泥(沉積底泥)中篩選分離 出這一株細菌，并發(fā)現其有較好降解纖維素養(yǎng)殖廢水的功能。這拓寬了人們對水氏黃桿菌 (F/m^Z)a"en'wm w/zMto//)在其功能方面的應用研究思路，并為降解含纖維素畜禽養(yǎng)殖廢水 提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。
五、菌株LCD51的應用
(一)、挑取水氏黃桿菌(F/awk "en'wn w/zw加7) LCD51單菌落，于LB固體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的水氏黃桿菌(F/aw6a"m'ww m/^to'0 LCD51:含纖維素廢水(如 畜禽養(yǎng)殖廠廢水)的體積比為0. 5-2: 100取水氏黃桿菌(F/aw6acten'wm /w'zwto") LCD51 接種于含纖維素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廠廢水，即實驗廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng) 殖場排污口)中，30-35。C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應48-72小時。
所述的LB固體培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g (固)，pH7. 0。
(二)、菌株LCD51產纖維素酶的能力
纖維素是大分子的聚集，由結晶區(qū)和無定形區(qū)交錯而成。將天然纖維素分解，必須依 靠內切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG)三種酶協(xié)同作用 才能完成。為了考察菌株對纖維素的降解能力，研究了在產酶培養(yǎng)基中，細菌生產三種酶 的能力。取產酶培養(yǎng)基100mL加入250ml的錐形瓶中，加入菌株LCD51的菌懸液(配制 用接種環(huán)挑取LCD51菌落于10mL LB液體培養(yǎng)基中，30'C震搖培養(yǎng)12小時)lmL，加入含 纖維素廢水(實驗廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口) 100mL (纖維素的濃 度為300-500mg/L)， 3CTC、震搖培養(yǎng)一周，檢測各種酶活(見圖3)。結果表明。該菌株在 一周內產生的內切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG)三種 酶酶活可分別達到16. 0， 4. 0， 16. 1 U/mL。
為了考察該菌株在實際處理畜禽養(yǎng)殖廢水的中降解纖維素的能力，研究了該菌株投加到 畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧反應器中，纖維素的降解效率。在長期(穩(wěn)定運行三個月以上)穩(wěn)定運 行的反應器中加入菌株LCD51的菌懸液(配制用接種環(huán)挑取LCD51菌落于10mL LB液體 培養(yǎng)基中，3(TC震搖培養(yǎng)12小時)10mL，反應器中含纖維素廢水(實驗廢水，取自湖北省 鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口)為1000mL (纖維素的濃度為300-500mg/L)， 3CTC、靜止 一周，再穩(wěn)定運行30天，在反應器穩(wěn)定運行期間定期檢測纖維素的去除效率，與未投加該 菌株的對照反應器對比，結果表明，該菌株能在72小時之內去除廢水中的纖維素 21-28mg/L;該菌株能使該反應器處理纖維素的去除效率提高7-10%(原始處理率為65_70%， 加入菌株LCD51后處理率為72-80%)。
權利要求
1.一株纖維素降解菌株LCD51，其特征在于所述的菌株為水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)LCD51 CCTCC NOM 209100。
2. 根據權利要求1所述的一株纖維素降解菌株LCD51，其特征在于水氏黃桿菌 (F/aw^"e〃'wmLCD51 CCTCC NO: M 209100的菌落形態(tài)為菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊緣整齊；生理特征細菌呈規(guī)則的直桿狀，單個或 成對排列，常呈V形排列，革蘭氏陰性，運動，兼性厭氧，不產生氧化酶和接觸酶；最適 生長pH值6.5 7.5，最適生長溫度25 35°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種纖維素降解微生物。一株纖維素降解菌株LCD51，其特征在于所述的菌株為水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NOM 209100。菌落形態(tài)為菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊緣整齊；生理特征細菌呈規(guī)則的直桿狀，單個或成對排列，常呈V形排列，革蘭氏陰性，運動，兼性厭氧，不產生氧化酶和接觸酶；最適生長pH值6.5～7.5，最適生長溫度25～35℃。本發(fā)明有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力。
文檔編號C12N1/20GK101665775SQ20091006306
公開日2010年3月10日 申請日期2009年7月6日 優(yōu)先權日2009年7月6日
發(fā)明者珩 劉, 琨 劉, 平 李, 王焰新, 王艷紅, 蕾 童 申請人:中國地質大學(武漢)