專利名稱：一株纖維素降解菌株lcd51的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株纖維素降解菌株LCD51的基因，它為水氏黃桿菌(F/avok^erfwmm&M加Z) LCD51 CCTCCN0: M 209100的16SrDNA基因。其中，水氏黃桿菌(F/m;o6a"m'ww做'z^af!') LCD51 CCTCC NO: M 209100已于2009年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC NO: M 209100。通過(guò)經(jīng)典表型鑒定和16S rDNA核苷酸序列分析相結(jié)合的方法，對(duì)一株纖維素降解菌株LCD51進(jìn)行了生理生化和16S rDNA分子水平的鑒定，由此確定它為水氏黃桿菌。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物，是一類可再生的重要資源和能源。纖維素不溶于水，在環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難降解，并廣泛存在于農(nóng)作物秸稈、城市固體廢物、畜禽養(yǎng)殖廢棄物和造紙廢水中，是難降解污染物之一。目前，從環(huán)境中分離和選育纖維素酶高產(chǎn)菌株，挖掘纖維素酶產(chǎn)生菌的資源，利用微生物的酶解作用，解決環(huán)境污染問(wèn)題，甚至轉(zhuǎn)化為能源已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株纖維素降解菌株LCD51的基因，通過(guò)16S rDNA序列分析方法，對(duì)一株纖維素降解菌株LCD51進(jìn)行分子水平的鑒定，確定其為水氏黃桿菌。該菌株具有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力。
一株纖維素降解菌株LCD51的基因，其特征在于為水氏黃桿菌(F/"wZw"en'"mm/zwto/O LCD51 CCTCC NO: M 209100的16S r DNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下
AGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGGACGGGATCCATCGGTAGCTTGCTACCGATGGT60
GAGAGTGGCGCACGGGTGCGTMCGCGTGAGCAACCTACCCATATCAGGGGGATAGCCCG120
AAGAMTTCGGATTAACACCGCATGACACTGCTTTCCGGCATCGGGAGGTGGTCMATAT180
TCATAGGATATGGATGGGCTCGCGTGACGTTAGCTAGTTGGTGGGGTMCGGCCCACCM240
GGCGACGATGTCTAGGGGCTCTGAGAGGAGAATCCCCCACACTGGTACTGAGACAGGMC300
CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGMTATTGGTCAATGGGGGCMCCCTGMCCM360
CCATGCCGCGTGCAGGACGACTGCCCTATGGGTTGTMACTGCTTTTGTTAGGGMTMA420
CCCCGCTACGTGTAGCGGGCTGMTGTACCTAAAGMTAAGGATCGGCTAACTCCGTGCC480
AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGT窗CCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTG540
CGTAGGCGGCACTTTAAGTCAGGGGTGAMTACGGCAGCTCMCTGTCGCAGTGCCCTTG600
ATACTGAAGTGCTTGMTGCGGTTGMGACGGCGGAATGAGACMGTAGCGGTGAAATGC 、660
ATAGATATGTCTCAGAACACCGATTGCGAAGGCAGCTGTCTAAGCCGTTATTGACGCTGA720
TGCACG組GCGTGGGGATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGA780
TGATGACTCGATGTTTGCGATATACCGTMGCGTCCMGCG雄GCGTTAAGTCATCCAC840
CTGGGGAGTACGCCCGCMGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACMGCGG卯0
AGGAGCATGTGGTTTAATTC.GATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGMAGTTACT960
GAAGGGCGCAGAGACGCGCCCGTCCTTCGGGACAGGAAACTAGGTGCTGCATGGCTGTCG1020
TCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTMGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATGTTTAG1080
TTGCCAGCACGTCAAGGTGGGGACTCTAAACAGACTGCCTGCGCMGCAGAGAGGMGGC1140
TGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGCTACMTGGA■TGGTACAGCG GGCAGCTACA CAGCAATGTG ATGCCAATCT CGAAAAGCCA TTCACAGTTC 1260
GGATCGGGGT CTGCAACTCG ACCCCGTGAA GTAGGATTCG CTAGTAATCG CGTATCAGCA 1320
ATGACGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCAAGCC ATGAAAGCTG 1380
GGGGTACCTA AAGCATGAAA CCGCAAGGAG CGTGTTAGGG T 1421
上述16S r DNA序列全長(zhǎng)1421個(gè)核苷酸。所述的畜禽主要有豬、牛、羊、驢、兔、雞、鴨、鵝等。
本發(fā)明的有益效果是 一株纖維素降解菌株LCD51的基因，它為水氏黃桿菌(尸/avok/"en'Mw柳'zwto〃) LCD51 CCTCC NO. M 209100的16S r DNA基因，本發(fā)明基因序列，通過(guò)提取細(xì)菌核DNA， 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析而獲得。
從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥中(取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥)篩選到一株在纖維素條件下具有一定生長(zhǎng)能力的新菌株。 一株纖維素降解菌株LCD51有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力，該菌株能使該反應(yīng)器處理纖維素的去除效率提高7-10%;該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除廢水中的纖維素21-28mg/L。


圖1是纖維素降解菌株LCD51的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1:核DNA， 2:擴(kuò)增產(chǎn)物，3:Marker)。
圖2是纖維素降解菌株LCD51的電鏡圖片。
圖3是纖維素降解菌株LCD51的纖維素酶活數(shù)據(jù)圖。
具體實(shí)施例方式
一、 一株纖維素降解菌株LCD51的篩選方法
(一)、材料準(zhǔn)備
1、 實(shí)驗(yàn)廢水和池底污泥取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口。
2、 培養(yǎng)基
篩選培養(yǎng)基(g/L): Na2HP043. 0， NH萬(wàn)O. 8， MgS04 7H20 0. 1 ， CaCl20. 1， CMONa2.0，微晶纖維素粉l.O，濾紙2.0，稻草2.0， pH值7.0 7.2。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/U: Na2HP043. 0， NH4,. 8， MgS04 7H20 0. 5， CaCl20. 5， FeS04 7H200. 01， MnS04 H20 0. 01， ZnS04 0. 01， CMC-Na 10, 0 (或微晶纖維素粉5. 0或纖維二糖5. 0)，蛋白胨1.0，酵母提取物0.5， pH值7.0 7.2。
LB液體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水1000mL， pH7.0。
LB固體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水lOOOmL，瓊脂15g， pH7. 0。
LB斜面培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水lOOOmL，瓊脂20g (固)，pH7.0。
3、 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備國(guó)華SHA-B恒溫振蕩器，S冊(cè)150G光照生物培養(yǎng)箱，
臥式壓力蒸汽滅菌器------上海醫(yī)用核子儀器廠，
光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH計(jì)等-----Hana有限公司，
超凈工作臺(tái)，鼓風(fēng)干燥箱，
KYKY-1000B掃描電子顯微鏡，
4PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，UVP凝膠紫外觀測(cè)儀，
微量生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑廠，DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司、Ta《酶、dNTP、 DNA Marker、 酶均購(gòu)fl日本Takara公司。
(二)、菌株的篩選分離與純化
1) 、初篩①稱取1克畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥樣品(樣品為池底污泥，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口)，用20mL無(wú)菌水水洗，8000 rpm離心5 min，棄上清，再加20mL水，重懸土樣；重懸后再加20mL水離心(8000 rpm離心5 min)，棄上清，重懸土樣，此步驟重復(fù)操作3次，得到泥水混合物，備用；
② 將泥水混合物轉(zhuǎn)入裝有100mL篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30。C恒溫靜至培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁，得到菌懸液A;
③ 取5 mL菌懸液A于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶屮培養(yǎng)一周；將培養(yǎng)一周后的菌懸液取5 mL于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周，重復(fù)操作5-6次，最后得到的菌懸液B;
④ 將最后得到的菌懸液B中取20 |aL于LB平板上涂布；置30。C下恒溫培養(yǎng)1-3天，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落形態(tài)各不相同的菌落，經(jīng)2-5次純化后{純化用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物(LB平板上的菌落)少許在平板上進(jìn)行劃線；當(dāng)接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落，即得到純化后的單菌落}，得到待鑒定的菌落，保種備用。
2) 、 二次篩選將待鑒定的菌落經(jīng)前培養(yǎng)后在LB液體培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)后，點(diǎn)種到篩
選培養(yǎng)基平板上，30。C恒溫培養(yǎng)2~4 d，往培養(yǎng)皿中加入30mL的1 mg/mL的剛果紅溶液，染色lh，棄去染液，加入50mL的1 mol/L的NaCl溶液,洗滌1 h，若菌落的周圍會(huì)出現(xiàn)清晰的透明圈，說(shuō)明細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶，依據(jù)透明圈的直徑大小選擇直徑大的產(chǎn)酶菌株。
用接種針挑取直徑大的產(chǎn)酶菌株(在菌落特征上有明顯差異的單菌)，對(duì)挑取的產(chǎn)酶菌株在LB平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至獲得單一菌株，并于LB斜面培養(yǎng)基上劃線保種，得到一株菌株LCD51，即纖維素降解菌株LCD51。
二、纖維素降解菌株LCD51的鑒定1、對(duì)纖維素降解菌株LCD51的鑒定
對(duì)纖維素降解菌株LCD51進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定，從分子水
平確定纖維素降解菌株的種屬。
16SrRNA序列分析主要按照以下步驟1)提取細(xì)菌核DNA，
a) 集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)18小吋，取其菌懸液lmL于1.5mL的離心管中8000rpm離心5min， g上清液。
b) 加STE緩沖液lmL洗一次，振蕩重懸細(xì)菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c) 加600 nLTE緩沖液，劇烈振蕩重懸細(xì)菌，加入10%的SDS 65—， 65"水浴5-10min。
d) 加等體積酚氯仿抽提三次。
e) 小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc， 12000 rpm離心10min。徹底棄上清。
f) DNA沉淀用70%乙醇洗一次,風(fēng)干后溶于20nL TE緩沖液備用。
TE緩沖液lO國(guó)ol /L Tris-Cl (pH8. 0); l腿ol /L EDTA-Na2 (pH8. 0)，STE緩沖液0. lmol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl (pH8.0) l醒ol/L EDTA(pH8. 0)，2) 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，
PCR擴(kuò)增引物參照Weisburg等人的方法合成。Pl:正向引物5， AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，P2:反向引物5， GGTTACCTTGTTACGACTT3'在50nL反應(yīng)體積中，加入lpL模板DNA (0. l嗎)，0. 5pL Pl和P2 (終濃度為0. 5,)，lpLdNTP (每種NTPO. 2 mM)， 0. 5|aLTaq聚合酶(2 U)和5 IOXPCR緩沖液。PCR擴(kuò)增條件為94 。C預(yù)變性5 min;在94 。C變性30s， 61-65 。C退火30s， 72 。C延伸lmin，循環(huán)30次；最后72 °C終延伸10 min。
3) PCR產(chǎn)物的回收
將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中加2倍體積TE， 65。C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍體積的1Omol/L乙酸銨和2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，離心，用70%乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
4) 16S rDNA的全序列測(cè)定和分析
PCR測(cè)序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。P-f: CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC;P-r: GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC 。加入lpL模板DNA (<0. l嗎)，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94 °C 1 min， 55 °C 30s， 72 。C2min)。采用ABI PRISM測(cè)序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測(cè)序儀上測(cè)序。測(cè)得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析，
最終從分子水平上確定該菌的種屬。2、 16S r脂A序列測(cè)定本發(fā)明采用對(duì)16SrRNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1421bp的擴(kuò)增帶(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測(cè)定其全序列。
<110〉中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120〉一株纖維素降解菌株LCD51的基因<160>1421
<210>1
<211〉1421bp
<212〉DNA
<213〉7|<氏黃桿菌(F/aw^acfcn'wm wfzz^a/z')<400〉1
AGCGGCAGGC CTAATACATG CAAGTCGGAC GGGATCCATC GGTAGCTTGC TACCGATGGT 60GAGAGTGGCG CACGGGTGCG TAACGCGTGA GCAACCTACC CATATCAGGG GGATAGCCCG 120AAGAAATTCG GATTAACACC GCATGACACT GCTTTCCGGC ATCGGGAGGT GGTCAAATAT 180TCATAGGATA TGGATGGGCT CGCGTGACGT TAGCTAGTTG GTGGGGTAAC GGCCCACCAA 240GGCGACGATG TCTAGGGGCT CTGAGAGGAG AATCCCCCAC ACTGGTACTG AGACAGGAAC 300CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAAGGAA TATTGGTCAA TGGGGGCAAC CCTGAACCAA 360
6CCATGCCGCG CCCCGCTACG AGCAGCCGCG CGTAGGCGGC ATACTGAAGT ATAGATATGT TGCACGAAAG TGATGACTCG CTGGGGAGTA AGGAGCATGT GMGGGCGCA TCAGCTCGTG TTGCCAGCAC TGGGACGACG TGGTACAGCG GGATCGGGGT ATGACGCGGT GGGGTACCTA
TGCAGGACGA TGTAGCGGGC GTAATACGGA ACTTTMGTC GCTTGMTGC CTCAGAACAC CGTGGGGATC ATGTTTGCGA CGCCCGCAAG GGTTTAATTC GAGACGCGCC CCGTGAGGTG GTCAAGGTGG TCAAGTCATC GGCAGCTACA CTGCAACTCG GAATACGTTC AAGCATGAAA
CTGCCCTATG TGAATGTACC GGATCCGAGC AGGGGTGAAA GGTTGAAGAC CGATTGCGAA GAACAGGATT TATACCGTAA GdTGAAACTC GATGATACGC CGTCCTTCGG TTGGGTTMG GGACTCTMA ATGGCCCTTA CAGCAATGTG ACCCCGTGM CCGGGCCTTG CCGCMGGAG
GGTTGT雄C TMAGAATAA GTTATCCGGA TACGGCAGCT GGCGGMTGA GGCAGCTGTC AGATACCCTG GCGTCCAAGC AAAGGAATTG GAGGMCCTT GACAGGMAC TCCCGCMCG CAGACTGCCT CGTCCGGGGC ATGCCAATCT GTAGGATTCG TACACACCGC CGTGTTAGGG
TGCTTTTGTT GGATCGGCTA TTTATTGGGT CMCTGTCGC GACAAGTAGC TAAGCCGTTA GTAGTCCACG GAMGCGTTA ACGGGGGCCC ACCCGGGCTT TAGGTGCTGC AGCGCAACCC GCGCAAGCAG TACACACGTG CG嵐AGCCA CTAGTAATCG CCGTCAAGCC T
AGGGMTMA ACTCCGTGCC TTAMGGGTG AGTGCCCTTG GGTGAAATGC TTGACGCTGA CCCTMACGA AGTCATCCAC GCACMGCGG GAAAGTTACT ATGGCTGTCG CTATGTTTAG AGAGGAAGGC CTACAATGGA TTCACAGTTC CGTATCAGCA ATGAAAGCTG
420
480
540
600
660
720
780
840
■
960
1020
薩
1140
1200
1260
1320
1380
1421
三、 菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
菌株LCD51的菌落形態(tài)為菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊 緣整齊；生理特征細(xì)菌呈規(guī)則的直桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列，常呈V形排列，革蘭氏陰性， 運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，不產(chǎn)生氧化酶和接觸酶。最適生長(zhǎng)pH值6.5 7.5，最適生長(zhǎng)溫度25 35°C，不能在6CTC生長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)菌表觀也做了掃描電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。
四、 菌株LCD51為新的菌株
采用BLAST分析法對(duì)菌株LCD51的16S rRNA基因序列與Ge^Bank數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析發(fā)現(xiàn)， 菌株LCD51與7JC氏黃桿菌(F/aw)6acto7'ww w&wto//)的同源性高達(dá)99. 0%。
綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，菌株LCD51命名為水氏黃桿菌(i^m^acto7'Mm m/zwtoZ/) LCD51。査閱有關(guān)資料，尚水氏黃桿菌屬有關(guān)畜禽養(yǎng)殖廢水中降解纖維素能力研究 的報(bào)道。水氏黃桿菌(尸/"vo&cto7'wm LCD51為新的菌株，己于2009年5月6日
保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC),保藏號(hào)CCTCC NO:M 209100。 本發(fā)明從湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥(沉積底泥)中篩選分離 出這一株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解纖維素養(yǎng)殖廢水的功能。這拓寬了人們對(duì)水氏黃桿菌 (F/avo&flcto7'Mm mkwtoz7)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含纖維素畜禽養(yǎng)殖廢水 提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
五、菌株LCD51的應(yīng)用
(一)、挑取水氏黃桿菌(F/avo6a"m'"w柳'zwtoz ) LCD51單菌落，于LB固體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)過(guò)夜，按培養(yǎng)后的水氏黃桿菌(尸/avo6acten'腦mz'zwto'f) LCD51:含纖維素廢水(如 畜禽養(yǎng)殖廠廢水)的體積比為0.5-2: 100取水氏黃桿菌(F/flwZ)ac^v'wm tw/z"加7) LCD51 接種于含纖維素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廠廢水，即實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng) 殖場(chǎng)排污口)中，30-35'C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應(yīng)48-72小時(shí)。
所述的LB固體培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g (固)，pH7. 0。
(二)、菌株LCD51產(chǎn)纖維素酶的能力纖維素是大分子的聚集，由結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)交錯(cuò)而成。將天然纖維素分解，必須依 靠?jī)?nèi)切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG)三種酶協(xié)同作用 才能完成。為了考察菌株對(duì)纖維素的降解能力，研究了在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，細(xì)菌生產(chǎn)三種酶 的能力。取產(chǎn)酶培養(yǎng)基100mL加入250ml的錐形瓶中，加入菌株LCD51的菌懸液(菌懸液 配制用接種環(huán)挑取LCD51菌落于10mL L液體B培養(yǎng)基中，3(TC震搖培養(yǎng)12小時(shí))lmL， 加入含纖維素廢水(實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口) 100mL (纖維 素的濃度為300-500mg/L)， 3CTC、震搖培養(yǎng)一周，檢測(cè)各種酶活(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明。該 菌株在一周內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG) 三種酶酶活可分別達(dá)到16. 0， 4. 0， 16. 1 U/mL。
為了考察該菌株在實(shí)際處理畜禽養(yǎng)殖廢水的中降解纖維素的能力，研究了該菌株投加到 畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧反應(yīng)器中，纖維素的降解效率。在長(zhǎng)期(穩(wěn)定運(yùn)行三個(gè)月以上)穩(wěn)定運(yùn) 行的反應(yīng)器中加入菌株LCD51的菌懸液(菌懸液配制用接種環(huán)挑取LCD51菌落于10mL液 體LB培養(yǎng)基中，3(TC震搖培養(yǎng)12小時(shí))10mL，反應(yīng)器中含纖維素廢水(實(shí)驗(yàn)廢水，取自 湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)排污口)為1000mL (纖維素的濃度為300-500mg/L)， 3CTC、 靜止一周，再穩(wěn)定運(yùn)行30天，在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行期間定期檢測(cè)纖維素的去除效率，與未投 加該菌株的對(duì)照反應(yīng)器對(duì)比，結(jié)果表明，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除廢水中的纖維素 21-28mg/L;該菌株能使該反應(yīng)器處理纖維素的去除效率提高7-10%(原始處理率為65-70%, 加入菌株LCD51后處理率為72-80%)。
權(quán)利要求
1.一株纖維素降解菌株LCD51的基因，其特征在于為水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)LCD51 CCTCC NOM 209100的16S r DNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下AGCGGCAGGC CTAATACATG CAAGTCGGAC GGGATCCATC GGTAGCTTGC TACCGATGGT60GAGAGTGGCG CACGGGTGCG TAACGCGTGA GCAACCTACC CATATCAGGG GGATAGCCCG120AAGAAATTCG GATTAACACC GCATGACACT GCTTTCCGGC ATCGGGAGGT GGTCAAATAT180TCATAGGATA TGGATGGGCT CGCGTGACGT TAGCTAGTTG GTGGGGTAAC GGCCCACCAA240GGCGACGATG TCTAGGGGCT CTGAGAGGAG AATCCCCCAC ACTGGTACTG AGACAGGAAC300CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAAGGAA TATTGGTCAA TGGGGGCAAC CCTGAACCAA360CCATGCCGCG TGCAGGACGA CTGCCCTATG GGTTGTAAAC TGCTTTTGTT AGGGAATAAA420CCCCGCTACG TGTAGCGGGC TGAATGTACC TAAAGAATAA GGATCGGCTA ACTCCGTGCC480AGCAGCCGCG GTAATACGGA GGATCCGAGC GTTATCCGGA TTTATTGGGT TTAAAGGGTG540CGTAGGCGGC ACTTTAAGTC AGGGGTGAAA TACGGCAGCT CAACTGTCGC AGTGCCCTTG600ATACTGAAGT GCTTGAATGC GGTTGAAGAC GGCGGAATGA GACAAGTAGC GGTGAAATGC660ATAGATATGT CTCAGAACAC CGATTGCGAA GGCAGCTGTC TAAGCCGTTA TTGACGCTGA720TGCACGAAAG CGTGGGGATC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCCTAAACGA780TGATGACTCG ATGTTTGCGA TATACCGTAA GCGTCCAAGC GAAAGCGTTA AGTCATCCAC840CTGGGGAGTA CGCCCGCAAG GGTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG900AGGAGCATGT GGTTTAATTC GATGATACGC GAGGAACCTT ACCCGGGCTT GAAAGTTACT960GAAGGGCGCA GAGACGCGCC CGTCCTTCGG GACAGGAAAC TAGGTGCTGC ATGGCTGTCG1020TCAGCTCGTG CCGTGAGGTG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC CTATGTTTAG1080TTGCCAGCAC GTCAAGGTGG GGACTCTAAA CAGACTGCCT GCGCAAGCAG AGAGGAAGGC1140TGGGACGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA CGTCCGGGGC TACACACGTG CTACAATGGA1200TGGTACAGCG GGCAGCTACA CAGCAATGTG ATGCCAATCT CGAAAAGCCA TTCACAGTTC1260GGATCGGGGT CTGCAACTCG ACCCCGTGAA GTAGGATTCG CTAGTAATCG CGTATCAGCA1320ATGACGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCAAGCC ATGAAAGCTG1380GGGGTACCTA AAGCATGAAA CCGCAAGGAG CGTGTTAGGG T1421上述16S r DNA序列全長(zhǎng)1421個(gè)核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株纖維素降解菌株LCD51的基因，其特征在于采用BLAST 分析法，對(duì)水氏黃桿菌(F/aw6a"en'wm w/z咖7) LCD51 CCTCC NO: M 209100的16S rRNA 基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析發(fā)現(xiàn)，水氏黃桿菌(F/avo幻"m'ww wfew加7) LCD51 CCTCC NO: M 209100與水氏黃桿菌(i^vo6a"en'wm m/zWa//)的同源性高達(dá)99. 0%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株纖維素降解菌株LCD51的基因。一株纖維素降解菌株LCD51的基因，其特征在于它為水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NOM 209100的16S rDNA基因。本發(fā)明基因序列，通過(guò)提取細(xì)菌核DNA，16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析而獲得。本發(fā)明從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排污口的池底污泥中篩選到一株在纖維素條件下具有一定生長(zhǎng)能力的新菌株。它有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力，該菌株能使該反應(yīng)器處理纖維素的去除效率提高7-10％。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101665791SQ20091006306
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者珩 劉, 琨 劉, 平 李, 王焰新, 王艷紅, 蕾 童 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)