專利名稱：水稻銅轉運子基因OsCtr1和它在銅污染土壤和水體修復中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一個水稻銅轉運子基因OsCtrl的 分離克隆、功能驗證和應用。OsCtrl基因是水稻中重要的銅轉運基因。超量表達OsCtrl基 因后，水稻植株地上和地下部位內(nèi)銅含量顯著上升?？梢酝ㄟ^種植超量表達OsCtrl的水稻 材料，降低土壤和周圍水體中的銅含量，用于修復土壤和水體的銅污染。
背景技術：
銅作為一種重要的原料，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、交通等諸多領域內(nèi)有著非常廣泛的用途。 隨著經(jīng)濟的發(fā)展，對銅的需求量不斷加大。在銅的開采、冶煉和使用過程中都不可避免的造 成含銅廢物的排放和殘留，導致環(huán)境中銅的污染(廖自基，1989)。水環(huán)境的銅污染物主要 是制造業(yè)排放含銅廢水造成的。土壤中銅污染主要來源于銅污染的水，以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中含 銅殺菌劑(如波爾多殺菌劑)的長期大量使用等(Ayres，2004)。環(huán)境中銅的污染對人類和其它生物產(chǎn)生危害(Moffat，1995)。土壤中的銅污染通 過雨水的沖刷可以導致地下水和湖泊的污染。銅污染的土壤不利于植物生長(Le印，1981 ； Cao等，2000)。高銅會導致人和動物出現(xiàn)肝硬化、溶血性貧血癥、神經(jīng)中樞功能失調(diào)等諸多 病癥(Harris 和 Gitlin，1996)。銅一旦進入土壤后，由于移動性小而很難清除。人們嘗試了不同方法治理土壤的 銅污染。如施用有機肥、石灰等改良劑以降低土壤中銅的活性，使銅鹽變成難溶物，植物不 吸收銅(Garcia-Sanchez等，1999)。用化學方法治理土壤中銅污染，主要是向土壤中投入 改良劑，通過對銅的吸附、氧化還原、拮抗或沉淀作用。但這些方法成本高，而且會破壞土 壤結構以及土壤微生物區(qū)系，造成二次污染(Khan和Scullion，2000)。通過植物直接吸收 土壤中過量的重金屬，然后收獲植物是一種高效、廉價而且保護環(huán)境的土壤污染治理途徑 (Raskin等，1997)。利用植物治理土壤中的銅污染還有以下優(yōu)勢(1)植物在吸收土壤中銅 的同時，向根系周圍釋放分泌物，可以增加根系周圍土壤中的碳和氧的含量，改良土質(zhì)，使 其更適合農(nóng)作物的生長(施積炎等，2004) ； (2)可以從修復植物中回收銅，緩解對銅礦資源 日漸增加的需求(Ho，2003)；(3)銅是植物生長所必須的微量元素，部分耕地缺乏銅；富集銅的植物可以作 為銅肥生產(chǎn)的原材料；用這種植物原材料制成的銅肥更容易被植物所吸收利用(He等，
2005)。因此，利用植物修復技術能夠徹底、永久性地解決土壤中的銅污染問題，并可以使銅 資源再利用(Rocha等，2009)。目前，有報道某些種類的植物，如黑麥草(Hao等，2003)、海 州香薷(Lou等，2004)、紫花香薷(Jiang等，2004)、紫花苜蓿(Peralta-Videa等，2004)、印 度芥菜(Bennett等，2003)、玉米(Liu等，2001)、酸模(Tang等，1999)、密毛蕨(鄭潔敏等，
2006)，對高銅有較好地耐受、吸收或體內(nèi)累積能力，可用于土壤中銅污染的治理。但是這些 植物種類遠遠不能滿足在不同環(huán)境中對不同土壤銅污染治理的需求。采用植物治理土壤中的重金屬污染的基本原理是植物的根系直接將土壤中過量的金屬污染物吸收，并將其轉移到地上部的各個組織中，通過收獲植物而清除土壤中的金 屬污染物。植物體生長發(fā)育所需要的銅都來源于外界。植物從土壤中吸收銅有轉運蛋白的 調(diào)控。對模式植物擬南芥銅轉運蛋白基因AtCOPT的研究發(fā)現(xiàn)，這類基因能夠通過根部把 土壤中的銅吸收進入植株體內(nèi)，進而轉運至地上的莖和葉等組織中，使銅在植株體內(nèi)累積 (Kampfenkel 等，1995 ；Sancenon 等，2003)。水稻在全世界范圍內(nèi)廣泛種植。其根系發(fā)達，秸桿生物量豐富，可以容納大量銅。 另外，水稻割蔸后可以快速再生；當水稻生長至其生物量達到最大階段時，收割地上部分后 讓其再生繼續(xù)吸收累積土壤中的銅。分離克隆水稻銅轉運蛋白基因，并超量表達目標基因 增強其轉運銅的功能；改良的水稻不僅可以用于治理土壤中銅污染，還可以有效吸收周圍 水體中的銅。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中攜帶的一個銅轉運子基因的完整DNA片段，并 通過超量表達目標基因的功能鑒定該基因在銅吸收轉運過程中所起到的作用，為利用這 個基因進行土壤和水體中銅污染修復的技術奠定基礎。這個基因被命名為OsCtrl (Oryza sativa copper transporter 1) 0本發(fā)明涉及分離一種包含OsCtrl基因的DNA片段并鑒定其功能，該片段賦予植物 吸收轉運土壤和水體中銅。分離的OsCtrl基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示， 或者基本上相當于SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，或者其功能相當于SEQ ID N0:1所示 序列的亞片段。超量表達序列表SEQ ID NO :1所示序列可以顯著增加水稻植株體內(nèi)銅的含 量，從而降低土壤和水體中銅污染物的含量?？梢圆捎靡呀?jīng)克隆的OsCtrl基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本發(fā)明 的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)方法，也可以從基因組、 mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的OsCtrl基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一 段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含OsCtrl基因的序列或者包含一段OsCtrl基因的 序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉入植物細胞超量表達OsCtrl基因，產(chǎn)生轉基 因植物。轉基因植物可以在體內(nèi)累積銅，從而降低土壤和水體中銅含量，治理土壤和水體的 銅污染。在本發(fā)明的實施例部分，申請人闡述了 OsCtrl基因的分離、功能驗證和應用過程 以及該基因的特點。


序列表SEQ IDNO 1.是本發(fā)明分離克隆的OsCtrl基因的核苷酸序列和它編碼的 蛋白質(zhì)的氨基酸序列。圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻銅轉運子基因OsCtrl以及驗證OsCtrl基因功 能的流程圖。圖2. OsCtrl基因的結構。黑色長方形示編碼區(qū)，白色長方形示5‘和3'非翻譯 區(qū)(untranslated region, UTR)?！癆TG”和“TAG”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。數(shù)字 示每一種結構的核苷酸數(shù)目。箭頭示PCR擴增引物OsCtrlIF、0sCtrl2R和OsCtrllR的位
4置和方向。圖3.用定量RT-PCR技術分析水培水稻植株經(jīng)銅脅迫(缺銅或過量銅)處理后 OsCtrl基因的表達變化。每個樣品中OsCtrl基因的表達量是相對于未經(jīng)銅脅迫(正常銅) 處理植株的表達量。圖4.攜帶OsCtrl基因的遺傳轉化載體pU1391的結構。RB和LB代表pU1391載 體上的T-DNA右和左邊界；Pim代表玉米泛素基因啟動子；GFP代表綠色熒光蛋白基因；NOS 代表napoline合成酶多聚腺嘌呤信號；Hpt代表潮霉素磷酸轉移酶基因(篩選基因)。圖5.融合蛋白OsCtrl-GFP位于洋蔥表皮細胞的細胞膜中。圖中(A)OsCtrl-GFP 位于細胞邊界。(B)與㈧同一個視野的明場照片。(C)重疊㈧和⑶的圖像顯示 OsCtrl-GFP位于細胞膜。(D)對照GFP分布于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。標尺示100 μ m。圖6.遺傳轉化載體pU1301的結構。圖7. TO代遺傳轉化植株(D177UM)中的OsCtrl基因表達量。對照為水稻品種牡 丹江8 (遺傳轉化的受體)。
具體實施例方式以下實施例中進一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆OsCtrl基因以及驗 證OsCtr-I基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和下面的實施例，本領域技術人員可以確定 本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改 變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例1 :0sCtrl基因的序列和結構分析l.OsCtrl基因結構的預測本發(fā)明的申請人用擬南芥的銅轉運子基因AtCOPTl的一段cDNA序列(Kampfenkel 等，1995)，用 BLAST 方法(Altschul 等，1997)檢索核苷酸數(shù)據(jù)庫 GenBank(http://Ww. ncbi. nlm. nih. gov)，發(fā)現(xiàn)該cDNA序列與來自水稻品種日本晴的一條位于水稻1號染色 體、長 166421bp 序歹Ij (GenBank 注冊號:ΑΡ003106· 1)中的一段(第 104141 至 104626 處) 高度同源。在水稻基因組數(shù)據(jù)庫TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中，這段與 AtCOPTl基因同源的水稻序列被注釋為一個基因，其編號是L0C_0s01g56420。本發(fā)明的申 i青入Mti^^h—ISI^^·名為 OsCtrl (Oryza sativa copper transporter 1)。2.從水稻品種中花11中分離克隆OsCtrl基因中花11是研究中常用的一個水稻品種(Wu等，2003 ;Cao等，2007)。申請人 根據(jù)OsCtrl基因在粳稻日本晴基因組中的位置和結構(水稻基因組數(shù)據(jù)庫TIGR)，以 OsCtrl基因兩側的基因組序列為模板，設計了兩條PCR引物OsCtrllF (5 ‘ -CGGGGTA CCGCAGAGTGGCCATTATG-3 ‘)(下劃線代表KpnI限制性內(nèi)切酶消化位點)和OsCtr 1IR (5 ‘ -GCTGGATCCCCGCGAACATTATAC-3 ‘)(下劃線代表BamHI限制性內(nèi)切酶消化位點)(圖 2)，從中花11中擴增包含OsCtrl基因、長664bp的DNA片段。利用美國AppliedBiosystems 公司的測序試劑盒，以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國Applied Biosystems公司)分別從 PCR擴增片段兩端測序。序列拼接后得到一長664bp的DNA序列，它包括完整的OsCtrl基 因序列。3. OsCtrl基因結構分析
為了獲得OsCtrl基因全長cDNA序列，本發(fā)明申請人提取水稻品種中花11的總 RNA (Zhou 等，2002)。取 1 5 μ g 總 RNA 用 DNaseI (美國 Invitrogen 公司)處理 15 分 鐘以去除基因組DNA污染，然后參照Zhou等(2002)的方法，使用oligo (dT) 15寡聚引物和 M-MLV反轉錄酶(美國Promega公司)進行反轉錄成cDNA。然后利用PCR引物OsCtrllF和 OsCtrllR,以總cDNA為模板，擴增出OsCtrl基因的全長cDNA。然后將PCR產(chǎn)物與T-A克 隆載體pGEM-T (美國Promega公司)連接，將連接好的載體電轉化(電轉化儀為印pendorf 公司產(chǎn)品，本實施例所用電壓為·Υ，具體操作參考該儀器的使用說明書)進入大腸桿菌 菌株DHlOB (Sim等，2004)，通過酶切篩選陽性克隆。對陽性克隆進行測序，獲得OsCtrl基 因的cDNA序列。比較分析OsCtrl基因的基因組序列和cDNA序列，確定OsCtrl基因由664個核苷 酸組成，僅包含一個外顯子，沒有內(nèi)含子(見圖2)。OsCtrl基因的編碼區(qū)由486個核苷酸 組成(位于序列表SEQ IDNO 1的73-558bp處)，編碼162個氨基酸。OsCtrl基因的5，端 非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)由72個核苷酸組成(位于序列表SEQ IDNO 1的 l-72bp處)，3，端UTR由92個核苷酸組成(位于序列表SEQIDN0 1的559_664bp)。4. OsCtrl基因編碼產(chǎn)物分析用BLASTP (Altschul等，1997)方法分析，OsCtrl蛋白質(zhì)與擬南芥的銅轉運子蛋白 AtCOPTl (Kampfenkel等，1995)的氨基酸一致性為46%，氨基酸相似性為56%。用PSORT 軟件(http //psort. nibb. ac. ip/form, html. Naki and Kanehisa, 1991)分析顯不，OsCtrl 蛋白可能是細胞膜蛋白。實施例2 銅處理后OsCtrl基因的表達譜分析為了驗證OsCtrl基因是否參于水稻銅吸收轉運的調(diào)控，本發(fā)明申請人首先采 用定量反轉錄-PCR(quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR)技術(Qiu 等，2007)分析了 OsCtrl基因?qū)︺~處理的反應。本發(fā)明申請人采用水培方法種植水稻 (Ishimaru等，2006)。水培培養(yǎng)液采用標準配方(Ishimaru等，2006)。標準水培培養(yǎng)液中 銅鹽(硫酸銅)含量為0.2 μ M。在銅缺乏脅迫處理實驗中，培養(yǎng)液中不加銅鹽；在銅過量 脅迫處理實驗中，培養(yǎng)液中銅鹽含量為50μΜ。將水稻品種中花11水培至4葉期開始銅脅 迫處理。銅脅迫處理后在不同時間點分別取苗(shoot)和根，抽提總RNA(Zh0u等，2002)。 取1 5 μ g總RNA用DNaseI (美國Invitrogen公司)處理15分鐘以去除基因組DNA污 染，然后參照Zhou等(2002)的方法，使用0lig0(dT)15寡聚引物和M-MLV反轉錄酶(美國 Promega公司)進行反轉錄。采用實時定量PCR分析試劑盒SYBR GreenPCR Master Mix (大 連Tokara公司)，并根據(jù)試劑盒使用說明書，在ABI 7500Real-Time PCR system(美國 Applied Biosystems公司)儀器上進行實時定量PCR反應。用水稻內(nèi)源肌動蛋白(actin) 基因的表達量衡量、并均一化樣品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的OsCtrl基因 特異 PCR 引物是 OsCtrlrealF (5 ‘ -CATGGGCGCCATGAAGTC-3 ‘)和 OsCtrlrealR(5 ‘ -GTGA AGAGCACCTCCGAGTTCT-3‘)，肌動蛋白基因PCR 引物是actinF(5' -TGCTATGTACGTCGCCATC CAG-3‘)和 actinR(5' -AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3‘)。定量RT-PCR分析顯示，不管是在苗還是在根部，缺銅誘導OsCtrl基因表達增強， 而當在培養(yǎng)液中重新補加正常生理條件需求的銅后，OsCtrl基因表達逐漸恢復到起始水平
6(圖3)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中含有過量銅，在苗和根中OsCtrl基因表達水平顯著下 降。這些結果提示OsCtrl基因可能參與銅吸收的調(diào)控(圖3)。實施例3 =OsCtrl基因編碼產(chǎn)物亞細胞定位分析1.遺傳轉化載體的構建本發(fā)明所用的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化載體是pU1391(圖4)。pU1391是常用的水 稻遺傳轉化載體(Cai等，2008)。它攜帶玉米泛素(ubiquitin)基因啟動子(Pubi)和綠色 焚光蛋白基因(green fluorescenceprotein, GFP)標簽。以全長OsCtrl基因克隆為模板，采用PCR技術擴增OsCtrl基因的編碼區(qū)段DNA。 PCR引物為 OsCtrllF(見實施例 1)和0sCtrl2R(5' -CGGGGATCCCAGCAGGCCGGGTCG-3’ )(下 劃線代表BamHI限制性內(nèi)切酶消化位點)(圖2)。將PCR產(chǎn)物與T-A克隆載體pGEM_T (美 國Promega公司)連接，將連接好的載體電轉化(電轉化儀為印pendorf公司產(chǎn)品，本實施 例所用電壓為·Υ，具體操作參考該儀器的使用說明書)進入大腸桿菌菌株DHlOB (Sim 等，2004)，通過酶切篩選陽性克隆，再經(jīng)測序驗證有無堿基突變。用限制性內(nèi)切酶BamHI和 KpnI消化帶有OsCtrl基因的編碼區(qū)的陽性克隆和pU1391載體；酶切完畢，用氯仿異戊醇 (體積比為24 1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用酶切純化好的包含OsCtrl基因編碼區(qū)的DNA 片段和酶切好的載體做連接反應。通過BamHI和KpnI酶切篩選外源片段正向插入的陽性 克隆(圖4)。2. OsCtrl蛋白的亞細胞定位分析將攜帶OsCtrl-GFP融合基因的pU1391載體通過電轉化的方法轉入農(nóng)桿菌菌株 EH A 105 (Qiu等，2007)。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法(Lin和Zhang，2005)在洋蔥 表皮細胞中瞬時表達OsCtrl-GFP蛋白。具體方法是將洋蔥切成1平方厘米的小塊，撕下 內(nèi)層表皮細胞層，用滅菌水洗凈后平鋪在MS固體培養(yǎng)基上28°C暗培養(yǎng)24小時(Lin和 Zhang, 2005)；然后用攜帶上述遺傳轉化載體的農(nóng)桿菌菌株侵染洋蔥表皮細胞，浸泡半小時 后吸干洋蔥表皮細胞表面的菌液，將其轉入MS固體培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)一天(Lin和Zhang， 2005)。用萊卡共聚焦顯微鏡 Leica TCS SP2A0BS confocal microscope (德國 Leica MicrosystemsHeidelberg GmbH公司)觀察綠色熒光蛋白在洋蔥表皮細胞中的分布(Qiu 等，2007)。觀察結果顯示OsCtrl-GFP位于洋蔥表皮細胞的細胞膜上，而對照GFP分布于洋 蔥表皮細胞的細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中(圖5)。由此證實OsCtrl是細胞膜蛋白質(zhì)，它可 能在細胞膜上發(fā)揮功能。實施例4 超量表達OsCtrl基因驗證其在水稻銅吸收轉運中的功能1.超量表達遺傳轉化載體的構建本發(fā)明所用載體是pU1301 (圖6)。pU1301是常用的水稻遺傳轉化載體(Cao等， 2007)。它是攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米泛素基因啟動子的農(nóng)桿菌介導的遺傳 轉化載體。將上述包含OsCtrl基因、長664bp的DNA片段(圖2)用限制性內(nèi)切酶KpnI和 BamHI消化，滅活酶后作為外源DNA片段。同時，用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI消化攜帶玉 米泛素基因啟動子的遺傳轉化載體PU1301 ；酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24 1) 抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含OsCtrl基因的酶切片段和純化好的載體做連接反應。通過測 序驗證陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為D177U。
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2.遺傳轉化和Ttl代遺傳轉化植株分析采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法(Lin和Zhang，2005)將D177U導入水稻品種牡 丹江8。牡丹江8是常用的水稻遺傳(非產(chǎn))轉化受體材料(Sim等，2004 ;Cao等；2007; Qiu等，2007)。獲得的遺傳轉化植株被命名為D177UM(其中前面部分D177U為遺傳轉化載 體名稱，M代表水稻品種牡丹江8)。本發(fā)明共獲得獨立轉化植株16株。本發(fā)明采用RNA雜交分析方法檢測遺傳轉化植株中OsCtrl基因的表達量。將 20 yg的總RNA在含1 %甲醛的瓊脂糖凝膠中電泳，利用IOX SSC將RNA轉移到Hybond-N+ 尼龍膜上，通過紫外交聯(lián)進行固定，65°C進行預雜交和雜交，雜交液選用Church緩沖液 (0. 14M NaH2PO4,0. 36M Na2HPO4, 7 % SDS, ImMEDTA)，洗膜和 X-光片放射自顯影(Yuan 等， 2009)。結果顯示，與對照牡丹江8相比，所有陽性轉化植株體內(nèi)的OsCtrl基因的表達量都 大幅提高(圖7)。3.超量表達植株中銅含量分析為驗證遺傳轉化植株是否能夠增強對銅吸收和累積的能力，本發(fā)明申請人對在TO 代表達量顯著提高的2個遺傳轉化植株(D177UM9和D177UM12)的Tl代轉基因陽性家系進 行銅含量分析。在孕穗期取葉片和根進行銅含量測定。測定銅含量方法按照《中華人民共 和國國家標準》GB/T 5009. 13-2003，“食品中銅的測定”方法進行。樣品的準備過程如下分別稱取20克左右新鮮水稻的葉和根，用去離子水清洗兩 次，在80°C烘箱中烘1周，至恒重；用組織粉碎機將材料研磨成細粉。稱取200mg左右干 粉，加入IOml IlN HNO3，在80°C烘箱中酸消化10h，濾紙過濾。用原子吸收光譜儀(atomic absorption spectroscopy, SPECTRAA220, Palo Alto, USA)在 324. 8nm 波長下測定銅的含
fio結果顯示，超量表達OsCtrl基因的植株葉和根中銅的含量都顯著提高(表1)。與 對照牡丹江8相比，轉基因植株葉中銅含量增加了 62% -78%，根中銅含量增加了 48%。這 些結果證明超量表達OsCtrl基因可以促使水稻從外界吸收銅。在銅污染的土壤或水體中 種植超量表達OsCtrl基因的水稻可以將土壤或水體中的銅轉移進水稻體內(nèi)；通過收獲水 稻植株徹底移除土壤或水體中的多余銅，從而達到土壤或水體銅污染修復的效果。表1. Tl代遺傳轉化植株(D177UM)體內(nèi)銅含量
水稻材料葉(pg/g鮮重)根(pg/g鮮重)牡丹江8 (對照)10.73 ±0.12170.17 ± 15.32D177UM919.14 ±0.57251.29 ±6.38D177UM1217.42 ±0.63251.12± 11.98參考文獻廖自基(1989)環(huán)境中微量重金屬的污染危害與遷移轉化。北京科學出版社。施積炎，陳英旭，林琦，王遠鵬(2004)根分泌物與微生物對污染土壤重金屬活性 的影響。中國環(huán)境科學。24:316-319。鄭潔敏，樓麗萍，王世恒，唐世榮(2006) —種新發(fā)現(xiàn)的銅積累植物-密毛蕨。應用 生態(tài)學報 17 507-511. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Ζ, MillerW, Lipman DJ(1997)Gapped BLAST andPSI-BLAST :a new generation of protein database search programs. Nuc1. Acids Res. 25 :3389-3402. Ayres PG(2004)Alexis Millardet IFrance^ s forgotten mycologist. Mycologist. 18 :23_26.Bennett LE, Burkhead JL, Hale KL, Terry N， Pilon M， Pilon-Smits EA(2003)Analysis of transgenic indianmustard plants for phytoremediation of metal-contaminated mine tailings. J. Environ. Qual. 32 :432_440·Cai M, Yuan T， Duan L, Li X, Wang S (2008) Identification of potential protein regulators bound to thetissue-specific positive and negative cis-acting elements of a green tissue-specific promoter in rice. Plant Biol. 10 :771-777.Cao Y，Ding X，Cai M，Zhao J，Lin Y，Li X，Xu C，Wang S (2007)The expression pattern of a rice diseaseresistance gene Xa3/Xa26is differentially regulated by the genetic backgrounds and developmental stagesthat influence its function. Genetics 177 :523_533.Cao ZHjHu ZYiWong MH(2000)Copper contamination in paddy soils irrigated with wastewater. Chemosphere. 41 :3_6.Garcia-Sanchez A， Alastuey A， Querol X(1999)Heavy metal adsorption by different minerals !application to theremediation of polluted soils·Sci·Total Environ. 242 :179-188.Hao XZ，Zhou DM, Wang YJ，Cang L，Chen HM(2003)Effect of different amendments on ryegrass growth incopper mine tailings. Pedosphere 13:299—308·Harris ZL，Gitlin JD (1996)Genetic and molecular basis for copper toxicity. Am. J. Clin. Nutr. 63 :836S-841S. He ZL，Yang XE，Stoffella PJ(2005)Trace elements in agroecosystems and impacts on the environment. J. TraceElem. Med. Biol. 19 :124-140.Ho WS (2003) Removal and recovery of metals and other materials by supported liquid membranes with stripdispersion. Ann. N. Y. Acad. Sci. 984 :97-122.Ishimaru Y，Suzuki M，Tsukamoto T，Suzuki K，Nakazono M，Kobayashi T，Wada Y，Watanabe S，Matsuhashi S，Takahashi M，Nakanishi H，Mori S，Nishizawa NK(2006) Rice plants take up iron as anFe3+-phytosiderophore and as Fe2+· Plant J. 45 335-346.Jiang LY, Yang XE，Shi WY (2004) Copper uptake and tolerance in two contrasting ecotypes of Elsholtzia argyi. Plant Nutr. 27 :2067-2083.Kampfenkel K，Kushnir S，Babiychuk E，Inze D,Vanmontagu M(1995)Molecular characterization of a putativeArabidopsis-thaliana copper transporter and its yeast homolog. J. Biol. Chem. 270 :28479_28486.Khan M，Scullion J(2000)Effect of soil on microbial responses to metal contamination. Environ. Pollut. 110 :115_125·Leep Nff(1981)Copper effect of heavy metal pollution on plants. Londonand
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11
MetArgTyrThrHisLeuThrPhePheTrpGlyLysAsnSerGluVal
30354045
ctcttcaccatgtggCCCggcacgagggggggcatgtacgcgCtggcg255
LeuPheThrMetTrpProGlyThrArgGlyGlyMetTyrAlaLeuAla
505560
CCCatettcgtcttcgcgCtggccgtcategtcgagttcctcggcage303
ProliePheValPheAlaLeuAlaVallieValGluPheLeuGlySer
657075
CgCagggcggacgcctgcctcgccgcaCtggcgeggCgCgccCCggcg351
ArgArgAlaAspAlaCysLeuAlaAlaLeuAlaArgArgAlaProAla
808590
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AlaGlyGlyLeuAlaArgAlaAlaValHisThrValArgValGlyVal
95100105
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AlaTyrLeuLeuMetLeuAlaLeuMetSerPheAsnGlyGlyValPhe
110115120125
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160
attcggttcg gtggacgttg gtttgatgcttgcatgtgtt tgtgtaattg tgtataatgt658
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<210>2
<211>161
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<213> 水稻(Oryza sativa)
<400>2
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151015
GlyAlaAlaAlaGlnGlyGlyMetGlyAlaMetLysSerMetArgTyr
202530
ThrHisLeuThrPhePheTrpGlyLysAsnSerGluValLeuPheThr
354045
Met Trp Pro Gly Thr Arg Gly Gly Met Tyr Ala Leu Ala Pro lie Phe505560Val Phe Ala Leu Ala Val lie Val Glu Phe Leu Gly Ser Arg Arg Ala65707580Asp Ala Cys Leu Ala Ala Leu Ala Arg Arg Ala Pro Ala Ala Gly Gly859095Leu Ala Arg Ala Ala Val His Thr Val Arg Val Gly Val Ala Tyr Leu100105110Leu Met Leu Ala Leu Met Ser Phe Asn Gly Gly Val Phe Leu Val Ala115120125Val Ala Gly His Ala Ala Gly Phe Leu Ala Phe Arg Ala Gly Leu Cys130135140Gly Gly Pro Ala Gln Val Glu Glu Asp Arg Lys Asn Asp Pro Ala Cys145150155160Cys
1權利要求
增強水稻吸收和累積銅的OsCtr1基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.OsCtrl基因的編碼區(qū)，它是序列表SEQ ID NO 1中第73-558位所示的DNA序列或 者是編碼與SEQ ID NO :1編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權利要求1或2任一項所述的基因在增強水稻吸收和累積銅中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及包含水稻銅轉運子基因OsCtr1的DNA片段的分離克隆和功能驗證。OsCtr1基因編碼一種銅轉運子蛋白。它能夠增強水稻吸收和累積銅。將該片段與其外源調(diào)節(jié)序列直接轉入水稻，超量表達OsCtr1的轉基因水稻吸收和累積銅的能力顯著增強?？梢酝ㄟ^種植超量表達OsCtr1的水稻材料，降低土壤和周圍水體中的銅含量，用于修復土壤和水體的銅污染。
文檔編號C12N15/82GK101942447SQ20091006305
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月9日 優(yōu)先權日2009年7月9日
發(fā)明者王石平, 袁猛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學