專(zhuān)利名稱(chēng)：一株生物轉(zhuǎn)化l-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的釀酒酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一株新分離的釀酒酵母及其用于生物轉(zhuǎn) 化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法。
背景技術(shù)：
2-苯乙醇，又名β-苯乙醇，英文名為2-phenylethanol，分子式為C8H100，常溫下 是無(wú)色透明的液體，天然存在于一些花和植物比如玫瑰、茉莉等的精油中。2-苯乙醇具有的 玫瑰香味深受人們歡迎，是所有玫瑰香型香氣的基本組分，其在食品、化妝品、日用品、煙草 和藥品中有廣泛的應(yīng)用。2-苯乙醇的生產(chǎn)方法可分為生物合成法、直接從植物中提取法和化學(xué)合成法三 種。研究發(fā)現(xiàn)酵母菌可以從頭開(kāi)始合成，也可以通過(guò)氨基酸分解途徑轉(zhuǎn)化L-苯丙氨 酸生成2-苯乙醇。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)禾口釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾口 異常漢遜酵母(Hansenula anomala)等在生長(zhǎng)過(guò)程中從頭合成一定量的2_苯乙醇。1907年Ehrlich發(fā)現(xiàn)在一些酵母 細(xì)胞中，L-苯丙氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成苯丙酮酸、再脫羧形成苯乙醛，苯乙醛經(jīng)氧化脫氫酶 作用生成2-苯乙醇，這條途徑后來(lái)以Ehrlich的名字命名。利用這條途徑通過(guò)生物轉(zhuǎn)化 L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇是目前生物合成法制備2-苯乙醇的主要方法。Albertazzi 等人用異常漢遜酵母(Hansenula anomala CBS 110)在含 2 克 / 升 L-苯丙氨酸而不含其他氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)得到1.7克/升2-苯乙醇，相同條件下 使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae NCYC 739)得到 1. 5 克 / 升 2_ 苯乙醇(1994)。 Huang等人用發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans L-5)轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸16天后可得到453 毫克/升的2-苯乙醇(2000)。Stark等人采用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)為出發(fā)菌株，在含有6克/升L-苯丙氨酸的培養(yǎng)集中轉(zhuǎn)化48小時(shí)候得到2. 35克/ 升2-苯乙醇。鑒于2-苯乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的毒害作用，使2-苯乙醇的產(chǎn)量停留在一個(gè)較低 的水平，研究人員采用了原位產(chǎn)物分離技術(shù)來(lái)提高2-苯乙醇的產(chǎn)率。Stark等人以油醇作 為萃取劑，采用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)進(jìn)行兩相補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化， 最終2-苯乙醇濃度可達(dá)到12. 6克/升。采用這種方法雖然2-苯乙醇產(chǎn)量得到了較大提 高，但同時(shí)給產(chǎn)物的分離提取帶來(lái)了很多困難，也增加了生產(chǎn)成本。從植物中提取2-苯乙醇的方法因原料來(lái)源有限，且原料中比如玫瑰中2-苯乙醇 的含量很低，提取成本太高，以此方法得到的產(chǎn)品目前僅應(yīng)用于高檔香料中；化學(xué)合成法 普遍存在較嚴(yán) 峻的環(huán)保問(wèn)題，反應(yīng)條件一般較劇烈，對(duì)設(shè)備要求較高，且產(chǎn)品不是天然的； 生物合成法具有產(chǎn)品綠色天然、成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等等突出優(yōu)點(diǎn)，是將來(lái) 2-苯乙醇制備研究的方向，有極好的發(fā)展前景。但從自然界中篩選2-苯乙醇生產(chǎn)菌株是一 項(xiàng)十分艱巨的工作，篩選到的野生菌株產(chǎn)量和產(chǎn)率往往非常低，對(duì)產(chǎn)物2-苯乙醇的耐受性 低，所以國(guó)際上用生物合成法生產(chǎn)2-苯乙醇的技術(shù)尚未成熟，目前還沒(méi)有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前市場(chǎng)對(duì)天然綠色產(chǎn)品的需要，以及生物法生產(chǎn)2-苯乙 醇產(chǎn)物濃度低、沒(méi)有好的生產(chǎn)菌株等問(wèn)題，提供一株新分離的生產(chǎn)2-苯乙醇的釀酒酵母， 并提供用此菌株生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法。本發(fā)明涉及的釀酒酵母名為Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 209035。
上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株的生理生化特征如表 1所示。表1 菌株 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 的生理生化特征 上述Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株的 18S rDNA 序列與 其它多株釀酒酵母的18S rDNA序列有99%的相似性。上述Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株，用于生物轉(zhuǎn)化 L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法以MPK培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇，所用的 MPK培養(yǎng)基配方為糖蜜20 50克/升，L-苯丙氨酸5 12克/升，磷酸二氫鉀0. 5克/ 升，調(diào)節(jié)PH至7.0。115°C滅菌20分鐘。轉(zhuǎn)化溫度為35°C，在500毫升的錐形瓶中裝75毫 升MPK培養(yǎng)基，置于搖床上以180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)40小時(shí)，可得到成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn) 化液。本發(fā)明提供的Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株可以用于微 生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-苯乙醇。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-苯乙醇具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品綠色天 然、成本較低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例一步驟1 =Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株的篩選取花園和氨基酸廠周?chē)耐寥?，稱(chēng)取5克溶于100毫升生理鹽水，充分混勻后取10 毫升加入50毫升MPK培養(yǎng)基中，在35°C條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后，以6% 的接種量(體積/體積)轉(zhuǎn)接新鮮的MPK培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)這一過(guò)程3 5次。將 培養(yǎng)的菌液稀釋1，000, 000倍涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在35°C條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)。 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方為蛋白胨10克/升，牛肉膏3克/升，氯化鈉5克/升，瓊脂18克/ 升。培養(yǎng)基的初始PH值為7.2，115°C滅菌20分鐘。選取長(zhǎng)出的單菌落接種50毫升的MPK 培養(yǎng)基中，35°C條件下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)篩選能夠轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的菌株 并測(cè)定2-苯乙醇含量，最終獲得一株轉(zhuǎn)化能力較好、能積累較高濃度2-苯乙醇的菌株，即 Saccharomyces cerevisiaeP_30由生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)得到的菌株形態(tài)為橢圓形或卵圓形，直 徑5 10微米，菌落顏色為淺黃色，可利用葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，不能利用 乳糖和纖維二糖，可分解脂肪和明膠，不能利用檸檬酸鹽、硝酸鹽、重氮基藍(lán)B和尿素，可在 不含維生素和含質(zhì)量百分比為10%的NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其18S rDNA序列與其它多株釀 酒酵母的18S rDNA序列有99%的相似性。該菌株命名為Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1日保藏于中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 209035。步驟2 制備上述 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株的細(xì)胞 液體培養(yǎng)物挑取用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M209035菌株一環(huán)，接種在裝有已滅菌的50毫升營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶中，于 35°C、180 轉(zhuǎn) / 分鐘在搖床上培養(yǎng) 24 小時(shí)，即制得 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備方法相同，只是不加入瓊脂。步驟3 利用上述 Saccharomyces cerevisiae P-3 CCTCC M 2O9O35 菌株，以含 2O 克/升糖蜜的MPK培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液將通過(guò)上述步驟1、2 的方法獲得的 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M209035菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，以體積百分比為6%的接種量接種到裝有已滅菌的75毫升MPK培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶中，于35°C、180轉(zhuǎn)/分鐘在搖床上培養(yǎng)。在第40小時(shí)2-苯 乙醇的濃度達(dá)到2. 7克/升，即得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液。上述含20克/升糖蜜的MPK培養(yǎng)基配方為糖蜜20克/升，L-苯丙氨酸7克/ 升，磷酸二氫鉀0. 5克/升，調(diào)節(jié)pH至7. 0。115°C滅菌20分鐘。實(shí)施例二利用上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株，以含 30克/升糖蜜的MPK培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液與上述實(shí)施例一的步驟相同，所不同的只是MPK培養(yǎng)基的配方中糖蜜濃度為30克 /升。在第40小時(shí)得到成熟的轉(zhuǎn)化液，其中2-苯乙醇的濃度達(dá)到3. 4克/升。實(shí)施例三利用上述Saccharomycescerevisiae P-3 CCTCC M 2O9O35菌株，以含 40克/升糖蜜的MPK培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液與上述實(shí)施例一的步驟相同，所不同的只是MPK培養(yǎng)基的配方中糖蜜濃度為40克 /升。在第40小時(shí)得到成熟的轉(zhuǎn)化液，其中2-苯乙醇的濃度達(dá)到3. 8克/升。實(shí)施例四利用上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株，以含 50克/升糖蜜的MPK培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液與上述實(shí)施例一的步驟相同，所不同的只是MPK培養(yǎng)基的配方中糖蜜濃度為50克 /升。在第40小時(shí)得到成熟的轉(zhuǎn)化液，其中2-苯乙醇的濃度達(dá)到4. 1克/升。實(shí)施例五利用上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株，以含 30克/升糖蜜和5克/升L-苯丙氨酸的MPK培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液與上述實(shí)施例一的步驟相同，所不同的只是MPK培養(yǎng)基的配方中L-苯丙氨酸濃度 為5克/升，糖蜜濃度為30克/升。在第40小時(shí)得到成熟的轉(zhuǎn)化液，其中2-苯乙醇的濃 度達(dá)到3.3克/升。實(shí)施例六利用上述Saccharomycescerevisiae P-3 CCTCC M 2O9O35菌株，以含 30克/升糖蜜和12克/升L-苯丙氨酸的MPK培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液與上述實(shí)施例一的步驟相 同，所不同的只是MPK培養(yǎng)基的配方中L-苯丙氨酸濃度 為12克/升，糖蜜濃度為30克/升。在第40小時(shí)得到成熟的轉(zhuǎn)化液，其中2-苯乙醇的濃 度達(dá)到3.6克/升。
權(quán)利要求
一株釀酒酵母，其特征在于該釀酒酵母的菌株名為Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M209035，該Saccharomyces cerevisiae P-3 CCTCC M 209035菌株的特征是形狀為橢圓形或卵圓形，直徑5～10微米，菌落顏色為淺黃色，可利用葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，可分解脂肪和明膠，在不含維生素和含質(zhì)量百分比為10％的NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所述Saccharomyces cerevisiae P-3 CCTCC M 209035菌株的18S rDNA序列與其它多株釀酒酵母的18S rDNA序列有99％的相似性。
2.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母用于生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其 特征在于所述Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株以MPK培養(yǎng)基生物 轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇。
3.如權(quán)利要求2所述的釀酒酵母用于生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，其 特征在于所述MPK培養(yǎng)基配方為糖蜜20 50克/升，L-苯丙氨酸5 12克/升，磷酸 二氫鉀0. 5克/升。
4.如權(quán)利要求2或3所述的釀酒酵母用于生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的方 法,其特征在于用所述 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株以 MPK 培養(yǎng) 基生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇，轉(zhuǎn)化溫度為35°C，在500毫升的錐形瓶中裝75毫 升MPK培養(yǎng)基，以180轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)40小時(shí)，可得到成熟的2-苯乙醇轉(zhuǎn)化液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸制備2-苯乙醇的釀酒酵母，名為Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC M 209035；該菌株是從土壤中分離獲得的，菌株形態(tài)為橢圓形或卵圓形，直徑5～10微米，菌落顏色為淺黃色；該菌株具有典型的釀酒酵母生理生化特征；該菌株的18S rDNA序列與其它多株釀酒酵母的18S rDNA序列有99％的相似性?？梢岳迷摼赀M(jìn)行生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)天然2-苯乙醇。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-苯乙醇具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品綠色天然、成本較低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/22GK101857844SQ200910049170
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者華棟梁, 張兆斌, 杜毅, 甘霖, 許平, 魏中浩 申請(qǐng)人:上海凱信生物科技有限公司