專利名稱：一種促進體細胞增殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細胞工程和組織工程領(lǐng)域，具體地是涉及一種促進體細胞增殖的方法。
背景技術(shù)：
隨著分裂次數(shù)的不斷增多，細胞的增殖能力逐漸減弱，最終停止增殖，這是細胞從干細 胞經(jīng)過短暫擴增細胞到終末細胞的老化過程，此過程受諸多因素影響，有些因素可以減緩甚 至逆轉(zhuǎn)這一老化過程，使細胞重新獲得分化、增殖的能力。
目前，在體外使終末分化的成熟細胞重新獲得分化、增殖能力主要策略包括核移植(Wihmxt I, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385:810-813)、 細胞融合(Tada M， et al. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrids cells. EMBO J， 1997, 16: 6510-6520; Tada M, et al. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells. Dev Dyn, 2003, 227:504-510; Tada M， et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol, 2001， 11:1553-1558)、利用細胞裂解液(Taranger C K, et al. Induction of dedifferentiation, genomewide transcriptional programming, and epigenetic reprogramming by extract of carcinoma and embryonic stem cells. Mol Bio Cell, 2005， 16: 5719-35)或者特殊成分的培養(yǎng)液(Chen S， et al. Dedifferentiated of lineage-committed cells by a small molecule. J Am Chem Soc, 2004, 126: 410-411; Shannon J， et al. Dedifferentiation of mammalian myotubes induced by Msxl. Cell, 2000,103: 1099-1109; Kondo T & Raff M. Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells. Science, 2000, 289: 1754-1757)誘導(dǎo)、多個轉(zhuǎn)錄因子組合 轉(zhuǎn)染(Takahashi K & Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126:663-676; Okita K, et al. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448:313-7; Wernig M, et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature, 2007， 448:318-24; Maherali N, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell, 2007， 1:55-70)，病毒或端粒酶轉(zhuǎn)染(Robertson, D. M.,et al. Characterization of growth and differentiation telomerase陽immortalized human corneal epithelial cell line. Investig Ophthalmol Vis Sci,2005,46: 470-478; Araki-Sasaki, K,， et al. An SV40
3immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995,36: 614-21; Kahn， C.R., et al. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993,34: 3429-41.)等。
(1)核移植核移植是最極端的例子，成年動物的體細胞能夠通過與成熟卵子融合即體細胞核
移植(Somatic cell unclear transplantation, SCNT)的方法實現(xiàn)發(fā)育過程的重演。該過程依賴于卵 子的參與，因此存在倫理上的爭議；雖然目前已經(jīng)獲得了許多種類的克隆動物，但是其效率 非常低，而且核移植產(chǎn)生的個體在發(fā)育中可能出現(xiàn)異常，因此限制了該方法的應(yīng)用。
(2) 細胞融合不同細胞間的融合是研究分化細胞可塑性的常用手段，在大多數(shù)"雜交"細胞中， 參與融合的分化程度較低的細胞處于支配地位，而分化程度高的細胞失去了原有的細胞特性 轉(zhuǎn)而表達分化程度較低的細胞的特性，如將體細胞與胚胎配子細胞(Embryonic germ， EG)或者 胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells, ES)以一定的比例混合培養(yǎng)后篩選出融合的細胞，這些融 合產(chǎn)生的"雜交"細胞的表型呈現(xiàn)EG或者ES細胞的特征。同樣，利用細胞融合進行分化細胞的 效率非常低，大約為萬分之一，而且在這個過程中會產(chǎn)生異倍體。
(3) 特殊成分培養(yǎng)液誘導(dǎo)終末分化的鼠肌源性定向譜系成肌細胞C2C12可以在2， 6位取代嘌 呤的誘導(dǎo)下或者額外表達Msxl基因的條件下再程序化為間充質(zhì)前體細胞，隨后增殖再分化為 骨和脂肪細胞。少突前體細胞(Oligodendrocyte Precursor Cells， OPCs)依次經(jīng)胎牛血清血清或 者骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenic proteins, BMPs)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)處理后能夠再程序化形成多能的CNS干細胞。但是這些化合物或者因子 的應(yīng)用只局限于特定種類的細胞，通用性差。
(4) 轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)錄因子組合誘導(dǎo)成纖維細胞或者皮膚細胞發(fā)生再程序化是目前最熱門 的研究領(lǐng)域之一，常用的轉(zhuǎn)錄因子組合主要包括Oct-4、 Sox-2、 c-myc和Kl傳，而導(dǎo)入基因的 主要方式則是通過腺病毒或者慢病毒載體。經(jīng)過這種方法獲得的細胞的特性與ES細胞類似因 此被稱為誘導(dǎo)的全能性干細胞(inducedpluripotent stem cells, iPS)。但是，對這些雜核后代的研 究發(fā)現(xiàn)，這些細胞具有致瘤性，可能是由于利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體以及轉(zhuǎn)入原癌基因c-myc 帶來的潛在危險，除此之外制備iPS的效率非常低，不是所有的iPS都具有發(fā)育的全能性；iPS 向特定細胞誘導(dǎo)分化的效率低，分化的細胞中含有不等量的雜細胞。
(5) 全能性細胞細胞裂解液全能性細胞—胚胎癌細胞(Embryonic Carcinoma, EC)和ES細胞的 細胞核和胞漿提取液(ES細胞或EC細胞用裂解液(lOmM HEPES， pH8.2, 50mM NaCl， 5 mM MgCl2, lraM二硫蘇糖醇，蛋白酶抑制劑)處理后經(jīng)反復(fù)凍融，超聲波裂解后，離心或過濾后除去不溶性的細胞成分后使用，因其中己經(jīng)不含有完整的細胞，在有些文獻中這些提取液也 被稱為cell free extracts,但是這種提取液的本質(zhì)還是將細胞裂解后提取的可溶性的產(chǎn)物，和 本發(fā)明所述培養(yǎng)培養(yǎng)上清是有本質(zhì)區(qū)別的，本發(fā)明所述培養(yǎng)培養(yǎng)上清是完全不含細胞的，就 是細胞分泌的生長因子等成分)可以使人成纖維細胞發(fā)生再程序化，而表達ES或EC細胞的部 分特性和功能。但是該方法具有一定局限性蛋白進入細胞內(nèi)需要使用鏈球菌溶血素(SLO) 在細胞膜上可逆性的打孔，對細胞有一定的毒性，并且需要的蛋白量也比較大(20-30mg/mL)， 操作過程復(fù)雜，效率低；細胞只能被誘導(dǎo)成類ES細胞，可控性差，具有致瘤性，向特定終末 分化細胞分化的效率低。 (6)病毒或端粒酶轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染SV40及勞氏肉瘤病毒基因或者端粒酶催化亞單位(hTERT) 后可以實現(xiàn)"永生化"。但是細胞在轉(zhuǎn)染癌基因之后，部分細胞的表型容易發(fā)生改變，少數(shù) 細胞系甚至有潛在的致瘤性，培養(yǎng)過程中部分細胞有病毒顆粒的釋放。而端粒酶轉(zhuǎn)染后的細 胞在體外長期生長后，形態(tài)學(xué)，基因型，核型和分子水平都發(fā)生了改變
組織工程對所需的種子細胞的最基本要求就是擴增快，效率高。上述列出的前五種方法 存在一個共同點，即這些處理在增強細胞活性的同時卻改變了原有細胞的特性，而且效率低，
需要重新誘導(dǎo)為需要的靶細胞，才能夠應(yīng)用。并且獲得的類ES細胞或者iPS可能存在致瘤性 而限制了其臨床應(yīng)用。而通過轉(zhuǎn)染方法獲得的細胞，雖然可以增殖，但是由于轉(zhuǎn)染過程使用 的多是病毒載體，或者本身轉(zhuǎn)染的就是病毒，也存在潛在的安全性問題，而本身這種轉(zhuǎn)基因 操作可能會將外源基因轉(zhuǎn)入受體的基因組而干擾其原有DNA的序列。因此如何在保持原有 細胞特性的基礎(chǔ)上實現(xiàn)種子細胞的快速高效擴增已經(jīng)成為組織工程亟待解決的重大課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進體細胞增殖的方法，該方法在保持細胞原有特性的基礎(chǔ) 上能有效地增強體細胞增殖能力，延緩體細胞衰老。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
一種促進細胞增殖的方法，所述方法為利用來自商品的人或動物的胚胎干細胞培養(yǎng)后的 上清液培養(yǎng)體細胞或干細胞與體細胞共培養(yǎng)。
所述胚胎干細胞為同種和/或異種干細胞，所述胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液為原液、稀釋 液、濃縮液或干粉。
所述的體細胞包括但不僅限于人、動物的角膜上皮細胞、結(jié)膜細胞、角膜內(nèi)皮細胞、皮 膚細胞、肝細胞及心肌細胞等在體外擴增困難的細胞。所述共培養(yǎng)為同種和/或異種的胚胎干細胞與細胞直接接觸培養(yǎng)或同種和/或異種的胚胎 干細胞與細胞通過液體交換的介質(zhì)間接接觸培養(yǎng)。
上述將體細胞與胚胎干細胞直接接觸共培養(yǎng)的方法包括將兩種細胞混和后培養(yǎng)，以及將一
種細胞種植后再接種另一種細胞。
共培養(yǎng)中的干細胞和體細胞中的一種是經(jīng)過熒光染料標記的細胞。上述共培養(yǎng)的細胞可以 通過傳代過程而進行分離(增殖受到抑制的細胞隨傳代而逐漸消失)，也可以通過利用熒光染 料的特性進行分離(將熒光陽性和熒光陰性細胞分離)，還可以根據(jù)細胞特性不同而得到分離。 共培養(yǎng)中的胚胎干細胞是經(jīng)過物理和/或化學(xué)方法抑制增殖的細胞。所述抑制干細胞增殖 的方法為用2 mM絲裂霉素C處理0.5-5小時，或用Y射線照射0.5-5小時，或用1%的多聚 甲醛處理0.5-5小時。
本發(fā)明是一種利用胚胎干細胞微環(huán)境延緩體細胞衰老過程、促進體細胞增殖的方法。在 實際應(yīng)用中，以往研究者或者是將體細胞和干細胞共培養(yǎng)以誘導(dǎo)干細胞發(fā)生定向分化(Wang, Z, C, et al. Preliminary experimental study on commitment differentiation of embryonic stem cells induced by corneal limbal stoma in vitro. Eye Science 1999,15(4), 195-198; Wang, Z. C., et al Differentiation of embryonic stem Cells into corneal epithelium. Science In China Ser. C Life Sciences 2005, 48(5)， 471-480.)，或者是在細胞可塑性的研究中，利用細胞間自然發(fā)生的融合作用，使分化程度高 的細胞獲得分化程度低的細胞(一般為干細胞，原癌細胞，配子細胞等)的特性(TadaM,et al.1997; 2001; 2003)，卻并未有人報道在不改變原有細胞特性的基礎(chǔ)上利用胚胎干細胞微環(huán) 境來促進細胞的增殖，這也是本發(fā)明的最大創(chuàng)新。本發(fā)明的最大創(chuàng)新在于在保持細胞原有生 物學(xué)特性的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了細胞的快速，高效擴增，使從小塊組織擴增細胞成為可能，將為組 織工程研究提供充足的種子細胞。本發(fā)明促進體細胞增殖的方法簡單實用，效率高，純度高。 經(jīng)過處理的體細胞，在增殖活性提高的同時保持了原有的體細胞特性，用于體內(nèi)移植或者體 外組織工程化器官的構(gòu)建時沒有異源排斥問題。


圖1是干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的人角膜上皮細胞的部分生物學(xué)特性； 圖2是干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的兔角膜上皮細胞的部分生物學(xué)特性； 圖3是干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的兔結(jié)膜上皮細胞的部分生物學(xué)特性； 圖4是干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的貓角膜內(nèi)皮細胞的形態(tài)；
6圖5是干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的兔皮膚細胞的形態(tài)； 圖6是與干細胞直接接觸培養(yǎng)對人角膜上皮細胞增殖的影響； 圖7是與干細胞間接接觸培養(yǎng)對人角膜上皮細胞增殖的影響； 圖8是細胞的功能恢復(fù)情況。
具體實施例方式
本發(fā)明胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液的應(yīng)用方式包括在體外添加到培養(yǎng)液中促進體細胞生 長、增殖、快速擴增、建系、為組織工程器官構(gòu)建提供種子細胞；以適當?shù)臐舛戎瞥伤幤泛?注射到體內(nèi)細胞受損部位，滴加到身體表面細胞受損部位及將其制成化妝品延緩及抵抗皮膚衷老。
胚胎干細胞與體細胞共培養(yǎng)的方式包括直接接觸培養(yǎng)，或者通過可以發(fā)生液體交換的介 質(zhì)進行培養(yǎng)。
本發(fā)明從體細胞的生物學(xué)特性、安全性等方面進行了系統(tǒng)研究，進行了促進人和兔的角 膜上皮細胞、兔結(jié)膜上皮細胞、兔內(nèi)皮細胞衰老過程的實驗，以及制成滴眼液治療干眼的實 驗。結(jié)果都顯示本發(fā)明方法能夠延緩體細胞的衰老過程，促進體細胞增殖。
以下通過具體實施例來進一步闡述本發(fā)明。
小鼠E14胚胎干細胞(美國模式菌種收集中心，ATCC CRL-1821)， GFP標記的小鼠胚胎 干細胞(OriCellTMC57BL/6小鼠胚胎干細胞/GFP， Cyagen Biosciences),人胚胎干細胞 (OriCeirM人胚胎干細胞，Cyagen Biosciences),人GFP標記的胚胎干細胞(OriCeirw人 胚胎干細胞/GFP， Cyagen Biosciences)。
以下實施例中所用的ES細胞培養(yǎng)液為高糖Knockout DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)或者高 糖DMEM培養(yǎng)基(GibcoBRL)，添加5-15% (體積比)胎牛血清(Hyclone) 、 100U/mL青鏈霉素 (Sigma) 、 1% (體積比)谷氨酰胺替代物(Glutamax-I' Invitrogen)、 100umol/L 2-巰基 乙醇(Sigma)、白血病抑制因子(LIF) 1X106IU/L (Mill印ore)、 1% (體積比)非必需氨 基酸(Gibco BRL)
以下實施例中所用的干細胞培養(yǎng)后的上清液的制備方法以IX 104-IX 105個/1^細胞密 度接種小鼠E14胚胎干細胞(美國模式菌種收集中心，ATCCCRL-1821)于0. 1%明膠(Sigma) 包被的培養(yǎng)瓶(BD)中，置5^C02、 37'C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日半量換液，2-3天傳代。培養(yǎng) 每24h后取上清，1500r/min離心后用0. 22 n m微孔濾膜過濾除菌，即為胚胎干細胞培養(yǎng)上 清。實施例1:利用胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液促進角膜上皮細胞增殖 取材并用角膜上皮細胞培養(yǎng)液(高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco BRL)，添加10-15%% (體 積比)胎牛血清、5ug/mL胰島素(Gibco BRL)、 5ug/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(Simga)、 10ug/raL表 皮生長因子(EGF) (Gibco BRL)、 100U/raL青鏈霉素(Simga)、 1% (體積比)Gluta腿x-1、 400 ng/mL氫化可的松(Gibco BRL)、 1% (體積比)非必需氨基酸(Gibco BRL)培養(yǎng)人和 兔角膜上皮細胞，從PI代細胞開始在角膜上皮培養(yǎng)液中添加10-50%(體積比)的小鼠胚胎干 細胞培養(yǎng)后的上清液(原液)，進行連續(xù)培養(yǎng)。
測定利用胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的角膜上皮細胞的生物學(xué)特性。結(jié)果顯 示(1)在倒置相差顯微鏡下，干細胞培養(yǎng)后的上清液培養(yǎng)的Pl人角膜上皮細胞增殖更快， 形態(tài)更典型，細胞仍然表達角膜特異性標記物CK3/CK12，處于S期的細胞更多(圖l)。 (2) 研究結(jié)果顯示經(jīng)過ES上清液處理的細胞增殖能力明顯增強，在體外可以連續(xù)傳代，形態(tài) 規(guī)則，大小均一，并表達特異性的標記物(圖2)。
圖1為胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的人角膜上皮細胞的部分生物學(xué)特性。 A:倒置相差顯微鏡下常規(guī)角膜上皮培養(yǎng)液培養(yǎng)的人角膜上皮細胞的形態(tài)(Pl，培養(yǎng)IO
天)；
B:倒置相差顯微鏡下干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的人角膜上皮細胞的形態(tài)(PI, 培養(yǎng)10天)；
C: MTT法測定的PI細胞的生長曲線；
D:干細胞培養(yǎng)后的上清液培養(yǎng)的人角膜上皮細胞CK3/CK12 (角膜特異性細胞表面標 記物)呈陽性表達；
E:干細胞培養(yǎng)后的上清液培養(yǎng)的人角膜上皮細胞CK19 (增殖相關(guān)的細胞表面標記物) 呈陽性表達；
F:常規(guī)角膜上皮培養(yǎng)液培養(yǎng)的人角膜上皮細胞(P5)的細胞周期分析；
G:干細胞培養(yǎng)后的上清液培養(yǎng)的人角膜上皮細胞(P5)的細胞周期分析。
圖2為干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的兔角膜上皮細胞的部分生物學(xué)特性。對照組
為常規(guī)角膜培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞，處理組為干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的細胞。
A-I:倒置相差顯微鏡下培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞的形態(tài)，A-F為P1細胞，G-I分別為處
理組PIO、 P20、 P40細胞，％為添加的干細胞培養(yǎng)后的上清液濃度。
J: PI細胞表面標記物(CK3， CK12， P63， ABCG2) mRNA表達的RT-PCR分析，持家基因GAPDH作為陽性對照
K: MTT法測定的細胞的生長曲線 L:細胞的克隆形成能力分析。 M:克隆的形態(tài)
N:細胞表面標記物(CK3/CK12, P63， ABCG2)表達的免疫熒光檢測結(jié)果。
實施例2:利用胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液促進結(jié)膜上皮細胞增殖
取材并利用常規(guī)結(jié)膜上皮細胞培養(yǎng)液(高糖DMEM: F12-3: 1基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibc。)，添加 5-15% (體積比)胎牛血清、lOixg/mL表皮生長因子(EGF) (Gibco BRL)、 lOOU/mL青鏈霉 素(Simga)，從P1代細胞開始添加用常規(guī)結(jié)膜上皮細胞培養(yǎng)液稀釋的小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)后 的上清液(稀釋為10%-50%，體積比)，進行連續(xù)培養(yǎng)。
結(jié)果顯示干細胞培養(yǎng)后的上清液能夠促進結(jié)膜上皮增殖，在形態(tài)上，ES上清液處理的 細胞呈典型的多邊形，細胞形態(tài)規(guī)則(圖3)。
圖3為干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的兔結(jié)膜上皮細胞的部分生物學(xué)特性，其中， A:常規(guī)結(jié)膜培養(yǎng)液培養(yǎng)的P2結(jié)膜細胞的形態(tài) B:干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的P2結(jié)膜細胞的形態(tài) C: MTT法測定的細胞的生長曲線(P2) D:結(jié)膜細胞表面標記物的表達的免疫熒光檢測結(jié)果
實施例3:利用干細胞培養(yǎng)后的上清液促進角膜內(nèi)皮細胞增殖
將收集的小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液分裝后利用真空冷凍凍干機完全凍干，_2(TC 保存?zhèn)溆谩?br> 取材并用常規(guī)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液高糖DMEM: F12=3: 1基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)，添加5-15% (體積比)FBS,硫酸軟骨素(lug/ml) ，bFGF(lng/ml)， EGF(10ug/roL), NGF(5ng/ml), 100U/raL 青鏈霉素(Siraga)、 1°/。(體積比)Glutamax-1、 1% (體積比)非必需氨基酸(Gibco BRL)培 養(yǎng)貓角膜內(nèi)皮細胞(在體外幾乎沒有增殖活性的細胞)，從P1代細胞開始在100mL常規(guī)內(nèi)皮 細胞培養(yǎng)液中添加1-lOOmg凍干的小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液干粉，進行連續(xù)培養(yǎng)(6 代)。
結(jié)果顯示干細胞培養(yǎng)后的上清液能夠促進貓內(nèi)皮細胞增殖，在形態(tài)上，干細胞培養(yǎng)后
9的上清液處理的細胞呈典型的多邊形，細胞形態(tài)更規(guī)則(圖4)。經(jīng)過6代體外培養(yǎng)，干細胞 培養(yǎng)后的上清液處理的細胞擴增了約100倍，而常規(guī)培養(yǎng)的細胞僅擴增了大約30倍。
圖4為干細胞培養(yǎng)后的上淸液連續(xù)培養(yǎng)后的貓角膜內(nèi)皮細胞的形態(tài)，其中， A:常規(guī)角膜內(nèi)皮培養(yǎng)液培養(yǎng)的P3內(nèi)皮細胞的形態(tài) B:干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的P3內(nèi)皮細胞的形態(tài)。 實施例4:利用千細胞培養(yǎng)后的上清液促進皮膚細胞增殖
將收集的小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清液分裝后利用真空冷凍凍干機凍干1-2倍，-20 'C保存?zhèn)溆谩?br> 取材并用角質(zhì)細胞培養(yǎng)液K-SFM (Gibco)培養(yǎng)兔皮膚細胞(在體外幾乎沒有增殖活性的 細胞)，從Pl代細胞開始在K-SFM中添加2. 5%-25%(體積比)的小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)后的上清 液(濃縮液〉，進行連續(xù)培養(yǎng)。
結(jié)果顯示干細胞培養(yǎng)后的上清液能夠促進兔皮膚細胞增殖，在形態(tài)上，干細胞培養(yǎng)后 的上清液處理的細胞形態(tài)更規(guī)則，更典型(圖5)。
圖5干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的兔皮膚細胞的形態(tài)，其中， A: K-SFM培養(yǎng)液培養(yǎng)的P2皮膚細胞的形態(tài)； B:干細胞培養(yǎng)后的上清液連續(xù)培養(yǎng)后的P2皮膚細胞的形態(tài)。
實施例5:利用與千細胞直接接觸培養(yǎng)的方法促進角膜上皮細胞增殖(注本實施例所 用的胚胎干細胞可以是同種和/或異種干細胞，體細胞可以為任何代數(shù)，效果與以下相同)
取材并培養(yǎng)人角膜上皮細胞，將人角膜上皮細胞與綠色熒光蛋白(GFP)標記的ES細胞 (GFP-ES)直接接接觸培養(yǎng)，培養(yǎng)1代后，利用流式細胞儀分離熒光陰性細胞。
結(jié)果顯示；與胚胎干細胞直接接觸共培養(yǎng)的人角膜上皮細胞體積變小，核漿比變大，形 態(tài)也變得比較規(guī)則，更接近原代從角膜緣萌出的細胞。流式細胞儀分選前熒光陰性率為4. 2%， 分選后陰性率為92.2% (圖6)。
圖6為與干細胞直接接觸培養(yǎng)對人角膜上皮細胞增殖的影響，其中， A:倒置相差顯微鏡下觀察的人P3角膜上皮細胞與綠色熒光蛋白標記的干細胞直接接觸后的 形態(tài)；
B:熒光顯微鏡下干細胞克隆；
C:流式細胞儀分選前熒光陰性細胞比例(4.2%);
D:流式細胞儀分選后熒光陰性細胞比例(92.2%)。
10實施例6:利用與經(jīng)過物理和/或化學(xué)方法抑制增殖后的干細胞共培養(yǎng)的方法促進角膜上皮細 胞增殖(注本實施例所用的胚胎干細胞可以是同種和/或異種干細胞，體細胞可以為任何代 數(shù)，效果以下相同)
1. 按常規(guī)方法取材并培養(yǎng)兔角膜上皮細胞；
2. 按常規(guī)方法培養(yǎng)小鼠ES細胞達到80%融合后，用2mM絲裂霉素C抑制細胞增殖 0.5-5小時后，用無菌PBS充分洗滌5 — 6次；(也可以用Y射線照射0.5-5小時后； 或者用1%多聚甲醛抑制細胞增殖0.5-5小時后)，用PBS充分洗滌；
3. 將角膜上皮細胞種植在經(jīng)過處理的ES細胞上繼續(xù)培養(yǎng)至80%細胞融合；
4. 根據(jù)細胞擴增情況和生長狀態(tài)決定是否繼續(xù)將角膜上皮細胞種植在經(jīng)過處理的ES 細胞上；
5. 由于經(jīng)過處理的ES細胞失去了繼續(xù)增殖能力，最終可以通過連續(xù)傳代的方法將ES 細胞逐漸除掉。
雖然ES細胞經(jīng)過處理后失去了連續(xù)增殖能力，但是仍然能夠其分泌的生長因子影響與 其共培養(yǎng)的細胞，而不會發(fā)生細胞融合。
實施例7:利用與千細胞間接接觸培養(yǎng)的方法促進角膜上皮細胞增殖
1. 按常規(guī)方法取材并培養(yǎng)人角膜上皮細胞；
2. 將小鼠ES細胞種植在六孔板底部或者下表面；鋪上1-5層細胞外基質(zhì)成分(包括但 不僅限于I型膠原，IV型膠原，層粘聯(lián)蛋白，絲粘聯(lián)蛋白)，將P1代角膜上皮細胞 種植在Tmnswell膜上(BD)(使用角膜上皮完全培養(yǎng)液)，將Transwell膜置于六孔 板中，繼續(xù)培養(yǎng)2-6天。ES細胞種植于培養(yǎng)板底部，而角膜上皮細胞種植在Transwell 膜上，由于ES細胞和角膜上皮細胞之間隔了一層Transwell膜，兩種細胞不能相互 直接接觸而避免了細胞融合，但可以通過分泌的生長因子相互影響。而兩種細胞之 間的介質(zhì)包括但不僅僅限于Transwell膜，也可以使用熱敏膜，羊膜等可以發(fā)生液體 交換的介質(zhì)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn):與干細胞間接接觸培養(yǎng)的人角膜上皮細胞增殖速度更快，形態(tài)也更典型(圖7)。
圖7為與干細胞間接接觸培養(yǎng)對人角膜上皮細胞增殖的影響，其中， A:與干細胞間接接觸培養(yǎng)的人角膜上皮的形態(tài)，人角膜上皮細胞種植于Transwell膜上， ES細胞種植于6孔板上，100x。
11B:正常培養(yǎng)的人角膜上皮細胞的形態(tài)，100x。 實施例8:細胞的功能恢復(fù)和安全性檢驗
通過本發(fā)明所處理的兔角膜上皮細胞，在體外氣一液界面刺激下可以形成復(fù)層上皮，注 射到Balb/c裸鼠皮下不致瘤。證實本發(fā)明不但可以維持細胞正常的功能，還具有安全性。
功能恢復(fù)試驗-
以實施例1方法獲得的P20代兔角膜上皮細胞，以3.5xl()S個/ral的密度接種到脫細胞豬 角膜基質(zhì)上，細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當細胞融合后，利用氣-液界面培養(yǎng)3周后，HE染色 可見細胞能夠形成2-3層的復(fù)層，下層細胞比較圓，上層細胞逐漸變得扁平。掃描電鏡下可 見細胞呈重疊的多層結(jié)構(gòu)，細胞表面有豐富的微絨毛和偽足(圖8)。
圖8為細胞的功能恢復(fù)情況，其中
A:接種于Transwell培養(yǎng)池48h后角膜上皮細胞形成單層。標尺100um B:氣-液界面培養(yǎng)IO天后角膜上皮細胞的形態(tài)。標尺100um
C:復(fù)層上皮表面的掃描電鏡分析。標尺10umD:接種于豬脫細胞角膜基質(zhì)上的角膜上
皮細胞形成的復(fù)層上皮的HE染色結(jié)果
E:形成的復(fù)層上皮呈CK3/CK12陽性表達。標尺20um F:形成的復(fù)層上皮呈P63陰性表達。標尺20um G:形成的復(fù)層上皮呈ABCG2陰性表達。標尺20咖。
安全性檢驗
以實施例1方法獲得的P20代兔角膜上皮細胞，以5><106個/[111的密度接種到Balb/c裸 鼠腹股溝皮下。接種后，未見有明顯不良反應(yīng)。飼養(yǎng)80天后，頸背部皮下組織未見有腫瘤生 長。處死裸鼠后，經(jīng)大體解剖未見接種部位皮下組織有結(jié)節(jié)和腫塊，肝臟，肺臟，腎臟和脾 臟未見明顯病理性改變。
權(quán)利要求
1. 一種促進體細胞增殖的方法，其特征在于所述方法為將來自商品的人和/或動物的胚胎干細胞培養(yǎng)的上清液培養(yǎng)體細胞；或所述方法為不改變原有細胞的特性的情況下將來自商品的人和/或動物的胚胎干細胞與體細胞共培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進體細胞增殖的方法，其特征在于所述胚胎干細胞為同種和/ 或異種胚胎千細胞，所述干細胞培養(yǎng)后的上清液為原液、稀釋液、濃縮液或干粉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進體細胞增殖的方法，其特征在于共培養(yǎng)中的胚胎干細胞和 體細胞中的一種是經(jīng)過熒光染料標記的細胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進體細胞增殖的方法，其特征在于共培養(yǎng)中的胚胎干細胞是 經(jīng)過物理和/或化學(xué)方法抑制增殖的細胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進體細胞增殖的方法，其特征在于所述抑制胚胎干細胞增殖 的方法為用絲裂霉素C處理0.5-5小時，或用Y射線照射0.5-5小時，或用多聚甲醛處理 0.5-5小時。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進體細胞增殖的方法，其特征在于所述體細胞選自但不限于 角膜細胞、結(jié)膜細胞、內(nèi)皮細胞、皮膚細胞、肝細胞或心肌細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進體細胞增殖的方法，所述方法為利用干細胞培養(yǎng)后的上清液培養(yǎng)體細胞或干細胞與體細胞共培養(yǎng)。該方法簡單實用，效率高，純度高。經(jīng)過處理的體細胞，在增殖活性提高的同時保持了原有的體細胞特性，用于體內(nèi)移植或者體外組織工程化器官的構(gòu)建時沒有異源排斥問題。
文檔編號C12N5/08GK101497874SQ200910037590
公開日2009年8月5日 申請日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者穎 劉, 王智崇, 冬 陳 申請人:中山大學(xué)中山眼科中心