專利名稱：酸性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酸性蛋白酶，特別涉及一種水解效率高的酸性蛋白酶。
背景技術(shù)：
大豆中含有40%的蛋白質(zhì)，它可以提供動(dòng)物所需要的8種必需氨基酸、多種維生素和礦物質(zhì)。大豆蛋白資源十分豐富，原料成本低廉，具有乳化性、起泡性等功能特性。但同時(shí)，大豆蛋白含有一些引起過敏反應(yīng)的抗原物質(zhì)一一致敏因子，大豆蛋白引起過敏反應(yīng)的主要抗原成分為大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白。解決的主要方法就是將其酶解，大豆蛋白經(jīng)水解后其酶解物比氨基酸和蛋白質(zhì)更易于消化吸收，還能改變其溶解性、降低粘度。
水解大豆蛋白的方法有3種，酸法、堿法和酶法。酸堿法是用酸、堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子物質(zhì)。但由于堿法水解使氨基酸大多消旋，無生物利用價(jià)值，因此不宜采用；而酸法多采用鹽酸、硫酸等強(qiáng)酸在高溫下反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)烈，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，水解徹底，多生成氨基酸混合物，同時(shí)在高溫下色氨酸完全被破壞，目前漸被淘汰。酶法水解大豆蛋白的研究，最初是始于利用酶部分降解蛋白質(zhì)，增加其分子內(nèi)或分子間交聯(lián)或連接特殊功能基團(tuán)，改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，以獲得良好加工特性的研究。到了 80年代，隨著酶制劑工業(yè)和食品工業(yè)的迅猛發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，利用酶法改性，不僅反應(yīng)條件溫和，安全可靠，產(chǎn)品色淺，而且水解產(chǎn)物在營養(yǎng)、風(fēng)味、工藝等方面均優(yōu)于酸、堿水解法，因而人們的注意力集中在蛋白水解產(chǎn)物多肽上。酶法選擇性較強(qiáng)，但水解率偏低。因此，需要發(fā)明一種新的酸性蛋白酶以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的之一在于基于現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種水解率高、水解產(chǎn)物苦味小的酸性蛋白酶。
本發(fā)明提供一種酸性蛋白酶，能在酸性條件下水解蛋白質(zhì)，其特征在于，
所述酸性蛋白酶具有以下物理化學(xué)特性
a) 所述的酸性蛋白酶通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的估測分子量為35kDa;
b) 所述的酸性蛋白酶的N端序列為(T/G) (A/D)D(G/V)D(G/L)TVPV;
c) 所述的酸性蛋白酶最適作用溫度為50°C;所述的酸性蛋白酶在溫度低于45。C時(shí)有很好的熱穩(wěn)定性；
d) 所述的酸性蛋白酶最適作用pH為pH4.5，在pH4.0 ~ 7.0能保持很好的穩(wěn)定性；
e) 胃蛋白酶抑制劑(PepstatinA)對所述的酸性蛋白酶有非常顯著的抑制作用，所述的酸性蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族；
f) 所述的酸性蛋白酶在胰島素B鏈上擁有強(qiáng)弱不等的12個(gè)酶切位點(diǎn)；
g) 所述的酸性蛋白酶由雅致放射毛霉AS3.2778分離提純得到。
毛霉是我國傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品的主要生產(chǎn)菌種之一，有著悠久的應(yīng)用歷史。由于長期受到環(huán)境條件(高蛋白培養(yǎng)基)的馴化，毛霉具有分泌多種胞外蛋白酶的能力；而且，其胞外蛋白酶系對大豆蛋白有相對較強(qiáng)的適應(yīng)性，顯示出很強(qiáng)的水解能力；其水解大豆蛋白得到的產(chǎn)物主要以小肽為主，有很高的水解度，且不會(huì)產(chǎn)生苦味。本發(fā)明的酸性蛋白酶(命名為Pal)能夠解決大豆蛋白水解中的主要技術(shù)難題，水解效率高，水解產(chǎn)物沒有強(qiáng)烈的苦味。
作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的酸性蛋白酶對三種底物的水解活性為
酪蛋白(Casein) >大豆分離蛋白(soy protein isolated, SPI) >牛血清白蛋白 (BSA)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的酸性蛋白酶米氏常數(shù)Km為2.218g/L， 活化能Ea為42.33kJ。
本發(fā)明以雅致放射毛霉AS3.2778為對象，采用了多種層析操作相結(jié)合的 方法，包括離子交換、疏水層析等，從蛋白質(zhì)性質(zhì)的不同角度對毛霉酸性蛋白 酶組分進(jìn)行純化，通過這些手段得到電泳純的酸性蛋白酶Pal,然后檢測該酶 的酶學(xué)參數(shù)、水解蛋白的酶切位點(diǎn)、N端序列鑒定，及其對大豆蛋白的水解效 率等，為其蛋白水解的應(yīng)用提供具體參數(shù)。


圖1為鹽析沉淀的電泳分析圖，泳道l為蛋白質(zhì)marker,泳道2為80S蛋 白沉淀，泳道3為75S蛋白沉淀，泳道4為70S蛋白沉淀，泳道5為65S蛋白 沉淀，泳道6為60S蛋白沉淀，泳道7為50S蛋白沉淀，泳道8為45S蛋白沉 淀，泳道9為40S蛋白沉淀，泳道10為35S蛋白沉淀；
圖2為酸性組分Pal CM-Sepharose離子交換洗脫曲線圖，左起第二個(gè)峰 為Pal活性峰；
圖3為酸性組分Pal Phenyl-Sepharose疏水層析洗脫曲線圖，左起第二個(gè) 峰為Pal活性峰；
圖4為酸性蛋白酶Pal的電泳分析圖，泳道1為蛋白marker,泳道2為鹽析后酶液，泳道3為CM-Sepharose收集樣，泳道5為Phenyl-Sepharose收集樣。
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一 步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。 實(shí)施例1毛酶的發(fā)酵及粗酶的拔一耳又
1.1菌種
雅致放射毛霉AS3.2778,購于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心。
1.2種子培養(yǎng)基及種子活化
250ml三角瓶中加入麩皮10g，水10ml,用玻棒攪拌混合均勻，并搗散較 大的團(tuán)塊(盡量做到顆粒均一)。12rC滅菌30min，乘熱取出后搖散，冷卻后 備用。
滅菌好的種子培養(yǎng)基每瓶接種一環(huán)試管斜面孢子，混合均勻，并盡量使培 養(yǎng)基表面平整，培養(yǎng)基層厚度一致，然后置于28。C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
1.3孢子懸浮液制備
在無菌條件下，向活化好的三角瓶種子加入100ml無菌水，振蕩，洗脫培 養(yǎng)基表面的孢子，得到孢子懸浮液。
1.4固體發(fā)酵
滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)基接種lml孢子懸浮液，混和均勻后于設(shè)定的條件下培養(yǎng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基及條件每只250ml三角瓶裝8g麩皮，其中添加1.23%麥芽糖， 1.56%蛋白胨，0.74%KH2PO4， 0.06%FeSO4.7H2O作為輔助營養(yǎng)物，培養(yǎng)基的
6起始含水量為每克麩皮添加0.79ml水，發(fā)酵溫度24.1。C,時(shí)間48h。 1.5粗酶的提取
稱取一定量的干麩曲加入10倍重量的0.3M氯化鈉溶液，混勻后于4(TC水 浴中抽提1.5h,紗布過濾后在7000g/min， 4。C離心10min，取上清即得到粗酶 液。
鹽析結(jié)果表明目標(biāo)蛋白(即酶蛋白)主要是在45S ~ 80S這一區(qū)間析出， 毛霉內(nèi)肽酶的電泳條帶主要位于32kDa與35kDa之間的主蛋白條帶(電泳圖 見附圖1)。
1.6蛋白酶活性測定
采用改良Anson法。lml稀釋酶液與2ml 1.5%酪蛋白(溶于0.02M，pH7.0 PBS)混和后在40°C反應(yīng)10 min，加入5 ml 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置 15min后過濾，取濾液測定280nm吸光度。
酶活單位定義在測定條件下，水解酪蛋白產(chǎn)生的吸光度變化量與l昭酪 氨酸相當(dāng)時(shí)所需要的酶量為一個(gè)活力單位。
實(shí)施例2酸性蛋白酶的分離純化
2.1硫酸銨分段鹽析
取一定體積的粗酶液，在水水浴上緩慢加入固體硫酸銨到40%飽和度，充 分溶解后在4。C冰箱中靜置3h，于4°C, 12000g/min離心20min,取上清液繼 續(xù)加入固體硫S臾銨至85 %飽和度,4。C冰箱中靜置過夜，然后于4°C, 12000g/min 離心20min,蛋白沉淀用0.02M, pH7.5的Tris-HCl緩沖液溶解，并透析脫鹽。2.2 CM-Sepharose陽離子交換
用0.05M, pH5.0醋酸緩沖液平衡CM-Sepharose陽離子交換柱，取上一步 收集的濃縮酶液加樣陽離子交換柱。用平衡緩沖液充分洗柱后，用0.5M的NaCl 溶液(溶于0.05M, pH5.0醋酸緩沖液)進(jìn)行梯度洗脫。收集第一個(gè)洗脫峰(即 目標(biāo)蛋白峰)，用超濾離心管濃縮收集的酶液。
2.3 Phenyl-Sepharose疏水層析
用1.2M硫酸銨溶液(溶于0.05M, pH5.0的PBS緩沖液)平衡 Phenyl-Sepharose疏水層析柱。將上一步收集的濃縮酶液與2.4M硫酸銨溶液(溶 于O.IM， pH5.0的PBS緩沖液)等體積混和后加樣Phenyl-Sepharose疏水層析 柱，用平衡緩沖液充分沖洗疏水柱，然后進(jìn)行梯度洗脫。收集梯度洗脫的第二 個(gè)蛋白峰，即為目標(biāo)蛋白峰。用超濾離心管濃縮收集的酶液。
毛霉粗酶液經(jīng)過多次層析純化，得到了 一抹酸性蛋白酶Pal,酸性蛋白酶 的層析過程及純化倍數(shù)見表l，層析洗脫曲線圖詳見附圖2 4。 表1毛霉酸性內(nèi)肽酶組分Pal的純化步驟
純化步驟
總蛋 比酶 純化倍 總酶 得率
白活 數(shù) 柳 (％)
(mg)(u/mg) (fold)
粗酶 11030 150.04 73.51 100 1
硫酸銨鹽析 9629 78.09 123.3 87.3 1.68
CM-Sepharose陽離子交換 3276 4.61 710.7 29.70 9.67
Phenyl-Sepharose疏水層析 2427 2.87 845 22.0 11.50
2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳利用SDS-PAGE檢測純化后的蛋白酶純度，并初步確定目標(biāo)蛋白的分子量范 圍。采用14%分離膠，5%濃縮膠。
通過一系列的層析使得目標(biāo)蛋白純度達(dá)到了電泳純。電泳的結(jié)果顯示(見附 圖2), Pal分子量約為35kDa。
2.5酸性蛋白酶N端序列測定
純化后的樣品Pal以溶液的形式送上海基康生物技術(shù)有限公司，經(jīng)電泳及 轉(zhuǎn)膜后對目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行N端測序分析。
測序的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毛霉酸性內(nèi)肽酶組分Pal的N端序列為(T/G) (A/D)D(G/V)D(G/L)TVPV。
2.6串聯(lián)質(zhì)譜分析
純化的蛋白酶樣品Pal進(jìn)行SDS - PAGE電泳分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后， 分別從膠片上切取對應(yīng)的目標(biāo)蛋白條帶，置于1.5mlEP管中，送香港大學(xué)基因 研究中心做串l^t譜分析。
對串聯(lián)質(zhì)譜譜圖分析發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中找不到與Pal具有較高同源性 的蛋白(顯著性指標(biāo)C丄。/o值均極低)，這進(jìn)一步說明Pal是未曾報(bào)道的新蛋白 酶。
實(shí)施例3毛霉酸性蛋白酶Pal催化性質(zhì)的測定
3.1酸性蛋白酶的最適作用溫度
按照酶活測定方法分別于不同的溫度(30 7(TC范圍)下測定毛霉酸性蛋 白酶Pal的活性，考察溫度對毛霉酸性蛋白酶活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制溫度-活力曲線，并由此確定毛霉酸性蛋白酶的最適作用溫度。
3.2毛霉酸性蛋白酶的最適作用pH
按照酶活測定方法分別于不同pH緩沖條件下(pH 3.0-5.0, 0.05 M乙酸 緩沖鹽；pH6.0-7.0， 0.05M磷酸緩沖鹽；pH 8.0-9.0， 0.02 M Tris-HCl; pH 9.5-10.5， 0.02M glycine-NaOH )測定毛霉酸性蛋白酶的活性，考察pH對毛霉酸性蛋白 酶活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制pH-活力曲線，并由此確定毛霉酸性蛋白 酶的最適作用pH范圍。
3.3毛霉酸性蛋白酶的熱穩(wěn)定性
在酸性蛋白酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液分別于不同溫度(30 7(TC范圍) 下保溫30min,測定保溫前后酸性蛋白酶活性的變化，考察溫度對酸性蛋白酶 穩(wěn)定性的影響。以酶活殘留率對溫度作圖，繪制酸性蛋白酶的熱失活曲線。
毛霉酸性內(nèi)肽酶Pal最適作用溫度相對偏低，在50。C;在溫度低于45°C 時(shí)有很好的熱穩(wěn)定性，保溫30min幾乎沒有活性損失，當(dāng)溫度高于5(TC時(shí)會(huì) 緩慢的失活，55。C保溫30min , Pal活性損失達(dá)70%。綜合來看，毛霉酸性 內(nèi)肽酶Pal的使用溫度不宜高于50。C。
3.4 pH對酸性蛋白酶穩(wěn)定性的影響
用不同的緩沖液分別調(diào)節(jié)酶液的pH到pH3.0， 4.0， 5.0， 6.0， 7.0, 8.0, 9.0, 10.0,于室溫(25°C )放置約lh,然后酸性蛋白酶組分的最適作用pH測定酸 性蛋白酶活性，計(jì)算酶活殘留率。以酶活殘留率對pH作圖，繪制酸性蛋白酶 的pH穩(wěn)定性曲線。
酸性蛋白酶Pal最適作用pH在pH4.5。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毛霉酸性內(nèi)
10肽酶在弱酸性的環(huán)境(pH4.0~7.0)能保持很好的穩(wěn)定性，在室溫中放置lh 活性無明顯損失；但是，該內(nèi)肽酶在弱堿性的環(huán)境中極不穩(wěn)定，會(huì)迅速的變性 失活，例如，在pH8.0室溫中放置僅lh，其酶活損失高達(dá)70%左右。另外， 毛霉酸性內(nèi)肽酶在堿性條件下的變性失活速度隨著pH的升高呈現(xiàn)不斷加快的 變化趨勢。
3.5抑制劑對毛霉酸性蛋白酶Pal活性的影響
在酸性蛋白酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液與不同類型的抑制劑混和，然后在 室溫中放置約30min，測定加入抑制劑保溫后酸性蛋白酶的活性?？疾斓鞍酌?抑制劑對酸性蛋白酶活性的影響。所用抑制劑購于Roche公司，結(jié)果如表2所 示。
表2抑制劑對毛霉酸性內(nèi)肽酶Pal活性的影響
抑制劑濃度aPal相對酶活(％)
對照-100
蛋白酶抑制劑E-6410pmol/L98.1±0.8
乙二胺四乙酸(EDTA)10mmol/L100.9±1.1
苯曱基磺酰氟(PMSF)lmmol/L97.9±0.7
亮肽素(Leupeptin)lmmol/L51.3±1.7
抑肽素(PepstatinA)10(xmol/L0±0.3
二琉基蘇糖醇(DTT)10mmol/L92.4±0.8b
聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X - 100)5%47.1±0.9
十二烷基磺酸鈉(SDS)0.1%0±0.1
(a終濃度b酶活采用紫外測定法)
在所考察的四大類蛋白酶抑制劑中，僅胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin A)對毛 霉酸性內(nèi)肽酶Pal有非常顯著的抑制作用，終濃度10 ia M的Pepstatin A可以 完全抑制Pal的活性。由此可以確定，毛霉酸性內(nèi)肽酶組分Pal屬于天冬氨酸蛋白酶家族。
3.6金屬離子對酸性蛋白酶活性的影響
在酸性蛋白酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液與不同的金屬無機(jī)鹽混和，于室溫 中放置30min后測定酶活，比較各種金屬離子對酸性蛋白酶活性的影響。 常見金屬離子對毛霉酸性內(nèi)肽酶Pal活性并無顯著的促進(jìn)或抑制作用。
3.7毛霉酸性蛋白酶的底物選擇性
按照酸性蛋白酶的活性測定方法，分別以Casein (酪蛋白)、SPI (大豆分 離蛋白)和BSA (牛血清蛋白)為底物測定酸性蛋白酶的活性，考察毛霉酸性 蛋白酶對不同底物的水解活性。
以不同的天然蛋白為底物，考察了毛霉酸性內(nèi)肽酶對不同蛋白底物的水解 活性，結(jié)果如表3所示。
表3毛霉酸性內(nèi)肽酶Pal對不同蛋白底物的水解活性
Protein (1.5%, W/V) 相對酶活％
Casein 100
SPI (soy protein isolated) 60.6±0.6
BSA 12.1±0.4
毛霉酸性內(nèi)肽酶對不同蛋白底物的作用效果有很大的差異，在所選用的3 種蛋白底物中，毛霉酸性內(nèi)肽酶Pal對Casein的水解活性最高，其次為SPI， 最差的是BSA。
3.8毛霉酸性蛋白酶Pal的肽鍵選擇性
取牛胰島素氧化B鏈(Insulin Chain B Oxidized from bovine pancreas )100昭，用lml緩沖液溶解(0.02MpH5.0乙酸-乙酸銨緩沖液)，加入一定量 酶液(約30u)，混和后放置于40。C水浴酶解lh,沸水浴5min滅活。用0.1% 曱酸溶液IO倍稀釋上述水解液，然后利用質(zhì)語測定稀釋水解液中小肽片斷的 分子量，將所得的結(jié)果與胰島素B鏈隨機(jī)片斷的分子量比對，據(jù)此確定毛霉酸 性蛋白酶在胰島素B鏈上的酶切位點(diǎn)。
以牛胰島素氧化B鏈為模型底物，利用質(zhì)譜對胰島素B鏈酶解片斷進(jìn)行 了分析，并通過此方法確定了毛霉酸性內(nèi)肽酶在胰島素B鏈上的酶切位點(diǎn)，結(jié) 果如表4所示。
表4毛霉酸性蛋白酶Pal在胰島素B鏈上的切割位點(diǎn)
胰島素B鏈序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA
Pal牟夸牟寺+牟m
1牟牟
2牟 +奪"牟奪奪牟
3牟奪牟夸
4+ +寺
5牟牟奪牟牟牟奪H奪奪〗卜夸m
6夸4豐奪牟
7+牟+牟
8牟"奪奪奪
9牟奪寺奪牟
10 4
(表中箭頭指示酶切位點(diǎn)，其粗細(xì)表示水解強(qiáng)度的大小T T i 。已報(bào)道 的天冬氛酸蛋白酶]:1: Aspartic proteinase from i /n'ozo/ms AawocA歸；2:兄
c/n'wms7、 aspartic proteinase; 3: AsperaW/ws柳'加'aspartic proteinase; 4: j. aspartic proteinase ; 5: Pewc/〃Z訓(xùn) y朋^n'恥〃薩 aspartic proteinase ; 6: CV7尸/ owecton'a / aras/rica fEWc^/n'a _paraw'"ca」aspartic proteinase; 7: i / 'zowt/cor/ ,'腸fM/cor/ ,7/— aspartic proteinase; 8: human pepsin 3; 9: human pepsin 5; 10: human non-pepsin proteinase )
毛霉酸性內(nèi)肽酶組分Pal在牛胰島素B鏈上具有12個(gè)不同的酶切位點(diǎn)分 布。從酶切位點(diǎn)的分布來看，毛霉酸性內(nèi)肽酶與其它來源的天冬氨酸蛋白酶相 同，均對狀鍵15-Leu+Tyr-16、 16-Tyr+Leu-17和24-Phe+Phe-25有非常強(qiáng)的 水解活性；與其它絕大多數(shù)酸性蛋白酶不同的是，毛霉酸性內(nèi)肽酶對胰島素B 鏈上4-Gln+His-5肽鍵也有4艮強(qiáng)的水解活性，這一點(diǎn)與Pew"'〃/t/w/aw^Vie〃Mm 天冬氨酸蛋白酶相同。從酶切位點(diǎn)的特性來看，毛霉酸性內(nèi)肽酶與其它蛋白酶 相似，也是對疏水性肽鍵顯示出相對較強(qiáng)的水解活性。
實(shí)施例4毛霉酸性蛋白酶Pal動(dòng)力學(xué)特性測定 4.1米氏常數(shù)測定
配制一系列不同濃度的酪蛋白溶液0g/L、 0.5g/L、 lg/L、 2g/L、 4g/L、 6g/L、 8g/L、 10g/L、 12g/L、 16g/L、 20g/L。分別在酸性蛋白酶最適作用pH條件下， 用不同濃度酪蛋白溶液為底物測定酸性蛋白酶活性，考察底物濃度與酸性蛋白 酶活性的關(guān)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用雙倒數(shù)作圖或曲線擬合的方法確定米氏方程
中的參數(shù)(Vm和Km)。
曲線擬合法求解Pal米氏常數(shù)，可直接確定出模型參數(shù)Vm = 12.67嗎/ml.min, Km = 2.218g/L。 4.2活化能的測定
根據(jù)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論，在酶的穩(wěn)定性不受影響的前提下，溫度對酶促反 應(yīng)速度的影響符合阿累尼烏斯(Arrhenius)方程。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，毛霉酸 性蛋白酶在45°C內(nèi)有較好的熱穩(wěn)定性，在此溫度范圍內(nèi)酸性蛋白酶的失活速度很低，可以忽略，其酶促反應(yīng)速率符合Arrhenius方程。另外，在通常情況下， 酶活測定時(shí)其底物濃度Cs是遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的，Cs的微小變化對酶促反應(yīng)速率的影響 可以忽略，即反應(yīng)速度不受底物濃度Cs的影響，此時(shí)的酶促反應(yīng)遵循零級化學(xué) 反應(yīng)規(guī)律，對于反應(yīng)
S 、尸 (4-1) 則有速率方程廠=^ =允 (4-2) 根據(jù)Arrhenius方程& = Jexp(—靜) (4 — 3)
式中，A為指前因子；Ea為反應(yīng)活化能；R為氣體常數(shù)，8.31J/mol.K ; T為 絕對溫度。由此可以看出，在酶的穩(wěn)定性溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速率lnr與溫度 1/T成線性關(guān)系，其斜率為-,。
根據(jù)這一理論，分別在不同溫度(20°C、 25°C、 30°C、 35°C、 40°C、 45°C ) 下測定毛霉酸性蛋白酶的活性。然后對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行上述的線性擬合，從而可 以確定毛霉酸性蛋白酶的活化能Ea。
根據(jù)Arrhenius方程，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，根據(jù)以上沖莫型中的參數(shù) 可計(jì)算出毛霉酸性蛋白酶Pal的活化能Ea = 42.33kJ。
實(shí)施例5毛霉酸性內(nèi)肽酶Pal對大豆蛋白的水解 5.1酸性條件下的水解試驗(yàn)
用0.05MpH6.5磷酸緩沖液配制濃度為5%的大豆分離蛋白(SPI),在沸水 浴中熱處理15min。冷卻后按酶與底物比1000u/g加入蛋白酶Pal,然后置于 50。C水浴條件下酶解，測定大豆蛋白水解度的變化。 5.2 pH對大豆蛋白水解的影響
分別在pH4.5， 5.5， 6.5的條件下進(jìn)行水解試驗(yàn)，探討毛霉蛋白酶Pal在不同pH條件下對大豆蛋白的水解情況。
毛霉酸性內(nèi)肽酶在不同的pH條件下對大豆蛋白的水解顯示出 一定的差異 酸性蛋白酶Pal在pH6.5時(shí)對大豆蛋白有相對較強(qiáng)的水解活性，大豆蛋白的最 終水解度分別可以達(dá)到5.8%;在pH4.5和pH5.5時(shí)，酸性蛋白酶Pal對大豆 蛋白的水解活性相對較弱。 5.3溫度對大豆蛋白水解的影響
分別在40°C， 50°C, 60。C的條件下進(jìn)行水解試^N考察毛霉蛋白酶Pal 在不同溫度下對大豆蛋白的水解情況。
在不同的溫度下，大豆蛋白的水解度呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。在50。C的條 件下，毛霉酸性蛋白酶Pal對大豆蛋白具有相對較強(qiáng)的水解活性，水解5h后 大豆蛋白的水解度分別可以達(dá)到6%左右；在40。C的條件下，大豆蛋白水解度 的增長較平緩，顯示該條件下毛霉酸性蛋白酶的活性相對較低；在6(TC的條件 下，大豆蛋白水解度在前30min出現(xiàn)了迅速增加的趨勢，而之后幾乎是維持變 化，結(jié)果說明毛霉堿性蛋白酶在60。C也具有相當(dāng)強(qiáng)的活性，但是該溫度下毛霉 酸性蛋白酶極不穩(wěn)定，很快就失活了。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定毛霉酸性蛋白 酶水解大豆蛋白的合適溫度在5(TC左右。
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本 發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而 不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種酸性蛋白酶，能在酸性條件下水解蛋白質(zhì)，其特征在于，所述酸性蛋白酶具有以下物理化學(xué)特性a)所述的酸性蛋白酶通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的估測分子量為35kDa；b)所述的酸性蛋白酶的N端序列為(T/G)(A/D)D(G/V)D(G/L)TVPV；c)所述的酸性蛋白酶最適作用溫度為50℃；所述的酸性蛋白酶在溫度低于45℃時(shí)有很好的熱穩(wěn)定性；d)所述的酸性蛋白酶最適作用pH為pH4.5，在pH4.0～7.0能保持很好的穩(wěn)定性；e)胃蛋白酶抑制劑對所述的酸性蛋白酶有非常顯著的抑制作用，所述的酸性蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族；f)所述的酸性蛋白酶在胰島素B鏈上擁有強(qiáng)弱不等的12個(gè)酶切位點(diǎn)；g)所述的酸性蛋白酶由雅致放射毛霉AS3.2778分離提純得到。
2、 如權(quán)利要求1所述的酸性蛋白酶，其特征在于，所述的酸性蛋白酶對 三種底物的水解活性為酪蛋白〉大豆分離蛋白>牛血清白蛋白。
3、 如權(quán)利要求1所述的酸性蛋白酶，其特征在于，所述的酸性蛋白酶米 氏常數(shù)Km為2.218g/L，活化能Ea為42.33kJ。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酸性蛋白酶，所述酸性蛋白酶能在酸性條件下水解蛋白質(zhì)，具有特定的物理化學(xué)特性，其水解率高。
文檔編號C12N9/50GK101487003SQ20091003747
公開日2009年7月22日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者潘進(jìn)權(quán), 王小寧, 王菊芳, 羅曉春, 謝明權(quán) 申請人:華南理工大學(xué)