專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞增殖方法以及用于組織修復(fù)及再生的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及上述方法，其中，在含有血清的培養(yǎng)基中使細(xì)胞增殖。
另外，本發(fā)明涉及上述方法，其中，在與作為細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物為同種的動(dòng)物個(gè)體血清的培養(yǎng)基中增殖細(xì)胞。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及上述方法，其中，在含有自體血清的培養(yǎng)基中使細(xì)胞增殖。
另外，本發(fā)明涉及上述方法，其中，培養(yǎng)基中的血清含量為1～20容積％。
本發(fā)明涉及上述方法，其中，增殖的是干細(xì)胞。
另外，本發(fā)明涉及上述方法，其中，增殖的是間充質(zhì)干細(xì)胞。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及上述方法，其中，增殖的是人的細(xì)胞。
本發(fā)明涉及上述方法，其中，干細(xì)胞是在未分化的狀態(tài)下增殖。
本發(fā)明還涉及上述方法，其中，在培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為5,500個(gè)/cm2以上的時(shí)點(diǎn)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及上述方法，其中，每周至少更換一次培養(yǎng)基。
本發(fā)明涉及上述方法，其中，反復(fù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞的總數(shù)達(dá)到100,000,000個(gè)以上。
本發(fā)明涉及一種離體培養(yǎng)的人細(xì)胞，所述細(xì)胞是利用上述任一種方法培養(yǎng)的細(xì)胞，其特征在于，CD24不表達(dá)。
本發(fā)明還涉及一種離體培養(yǎng)的人細(xì)胞，所述細(xì)胞是利用上述任一種方法培養(yǎng)的細(xì)胞，其特征在于，表1記載的陽(yáng)性CD抗原組中的至少90％表達(dá)，并且陰性CD抗原組的至少90％不表達(dá)。
上述細(xì)胞進(jìn)一步的特征在于人中其表達(dá)不受歡迎的各種癌相關(guān)基因，例如EWI-FLI-1、FUS-CHOP、EWS-ATF1、SYT-SSX1、PDGFA、FLI-1、FEV、ATF-1、WT1、NR4A3、CHOP/DDIT3、FUS/TLS、BBF2H7、CHOP、MDM2、CDK4、HGFR、c-met、PDGFα、HGF、GFRA1、FASN、HMGCR、RGS2、PPARγ、YAP、BIRC2、lumican、鈣調(diào)結(jié)合蛋白、ALCAM、Jam-2、Jam-3、鈣粘蛋白II、DKK1、Wnt、核干細(xì)胞因子、神經(jīng)纖維瘤蛋白、RB、CDK4、p16、MYCN、端粒、hTERT、ALT、Ras、TK-R、CD90、CD105、CD133、VEGFR2、CD99、ets、ERG、ETV1、FEV、ETV4、MYC、EAT-2、MMP-3、FRINGE、ID2、CCND1、TGFBR2、CDKNIA、p57、p19、p16、p53、IGF-1、c-myc、p21、細(xì)胞周期蛋白D1、p21中的任一種基因均不異常表達(dá)。需要說(shuō)明的是，異常表達(dá)是指相對(duì)于健全人的表達(dá)量有顯著的高表達(dá)。
本發(fā)明涉及一種利用上述細(xì)胞制造組織修復(fù)·再生用藥物的方法。
另外，本發(fā)明涉及一種含有上述細(xì)胞的組織修復(fù)·再生用藥物。
本發(fā)明涉及用于幫助修復(fù)的上述藥物，所述藥物幫助損傷部位的修復(fù)，或者幫助因年齡增長(zhǎng)而導(dǎo)致的老化部位的修復(fù)，其中，細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，所述藥物經(jīng)靜脈內(nèi)施予、腰椎穿刺施予、腦內(nèi)施予、腦室內(nèi)施予、局部施予或動(dòng)脈內(nèi)施予。組織沒(méi)有特別限定，例如可以舉出包括腦和脊髓的神經(jīng)系統(tǒng)組織、腎臟、胰臟、肝臟、腸、胃、消化器官、肺臟、心臟、脾臟、血管、血液、皮膚、骨、軟骨、牙齒及前列腺等。細(xì)胞優(yōu)選自己的細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組織修復(fù)·再生用藥物在疾病或障礙的亞急性期以后施予，通過(guò)細(xì)胞因子的分泌、血管新生及/或神經(jīng)再生來(lái)幫助損傷部位的修復(fù)。
在實(shí)施方式之一中，上述損傷部位為腎臟，上述藥物通過(guò)改善BUN值及/或肌酸酐值來(lái)促進(jìn)損傷部位的修復(fù)。
在實(shí)施方式之一中，上述損傷部位為胰臟，上述藥物通過(guò)改善血糖值、血中Glu A1濃度及/或血中HbA1C的濃度來(lái)促進(jìn)損傷部位的修復(fù)。
在實(shí)施方式之一中，上述損傷部位為心臟，上述藥物通過(guò)改善血中前列腺素D合酶濃度及/或血中高半胱氨酸濃度來(lái)促進(jìn)損傷部位的修復(fù)。
在實(shí)施方式之一中，上述損傷部位為肝臟，上述藥物通過(guò)改善GOT值、GPT值及/或γ-GTP值來(lái)促進(jìn)損傷部位的修復(fù)。
在實(shí)施方式之一中，上述損傷部位為腦，上述藥物促進(jìn)改善作為失語(yǔ)癥指標(biāo)的SLTA值、作為智力恢復(fù)指標(biāo)的WAIS-R值，可以治療失語(yǔ)癥和癡呆。
在實(shí)施方式之一中，上述損傷部位為前列腺，上述藥物通過(guò)改善PSA值來(lái)促進(jìn)損傷部位的修復(fù)。
作為成為本發(fā)明的組織修復(fù)·再生用藥物對(duì)象的疾病和障礙，具體而言可以舉出腎障礙、肝障礙、包括糖尿病的胰臟障礙、前列腺增生、高脂血癥、包括失語(yǔ)癥及癡呆的高級(jí)腦功能障礙、復(fù)蘇后腦病、心臟疾病、脊髓損傷等，但不限定于此。
本發(fā)明還涉及用于調(diào)制本發(fā)明的細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括填充了培養(yǎng)基的容器，所述培養(yǎng)基的特征在于抗凝劑小于0.5U/mL。上述試劑盒也可以包括用于調(diào)整細(xì)胞所需的其他試劑、器具和原料，例如，在此試劑盒中，如果使用抗凝劑，可以使用肝素。
進(jìn)而，本發(fā)明還涉及用于組織修復(fù)·再生的細(xì)胞療法，所述細(xì)胞療法包括下述步驟利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)從受試者分離的細(xì)胞的步驟；對(duì)上述步驟中得到的細(xì)胞檢查癌相關(guān)基因的表達(dá)的步驟；將在上述檢查中確認(rèn)了安全性的細(xì)胞施予上述受試者的步驟。此處，作為檢查對(duì)象的癌相關(guān)基因，可以舉出上述基因?yàn)槔?br> 在理想情況下，上述細(xì)胞療法是用于治療缺血性神經(jīng)疾病的細(xì)胞療法，其中，組織為神經(jīng)系統(tǒng)組織，細(xì)胞為自體間充質(zhì)干細(xì)胞，將其經(jīng)靜脈內(nèi)施予、腰椎穿刺施予、腦內(nèi)施予、腦室內(nèi)施予或動(dòng)脈內(nèi)施予。
本發(fā)明通過(guò)以微量添加目前細(xì)胞增殖中必須或有用的抗凝劑，或者實(shí)質(zhì)上不添加抗凝劑來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，即便在使用同種血清(例如采集細(xì)胞的受試者自身的血清)代替異種血清(FBS)的情況下，也產(chǎn)生由現(xiàn)有常識(shí)完全無(wú)法預(yù)測(cè)的驚奇效果，所述效果包括完成顯著的增殖率的改善，而且可以得到具有優(yōu)異的增殖效率的(增殖快)細(xì)胞。不含有自體血清的培養(yǎng)方法與不使用FBS的現(xiàn)有培養(yǎng)方法相比，得到的細(xì)胞在安全性和分化能力方面格外優(yōu)異。
本發(fā)明的藥物由于即便在目前認(rèn)為缺乏有效性的在疾病的亞急性期以后施予的情況下，也會(huì)發(fā)揮治療效果，所以在發(fā)病前無(wú)需調(diào)制應(yīng)施予的細(xì)胞，發(fā)病后從對(duì)象采集進(jìn)行培養(yǎng)即可，因此可以大幅地減輕對(duì)象的負(fù)擔(dān)。另外，本發(fā)明的藥物由于通過(guò)靜脈內(nèi)注射可以幫助修復(fù)體內(nèi)任意的損傷部位，所以對(duì)對(duì)象的侵襲少，另外，無(wú)需手術(shù)、可以在通常的處置室等中進(jìn)行施予，所以可以削減醫(yī)療人員的負(fù)擔(dān)和醫(yī)學(xué)成本。進(jìn)而，本發(fā)明的藥物由于對(duì)多個(gè)不同組織發(fā)揮幫助修復(fù)的效果，所以適用范圍廣，特別是可以同時(shí)有效地處置對(duì)象中多個(gè)不同的損傷部位。



圖1圖1為表示添加到骨髓液中的肝素的量為0.1U/mL(◆)或267U/mL(■)時(shí)人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的曲線圖。
圖2圖2為表示添加到骨髓液中的極微量(左)或2mL(右)肝素時(shí)從培養(yǎng)開(kāi)始4日后細(xì)胞數(shù)的曲線圖。添加的肝素為極微量時(shí)，細(xì)胞數(shù)增加約40倍。
圖3圖3為表示在肝素的添加量為0.1U/mL、添加了人成人血清(◆)或FBS(■)的培養(yǎng)基中間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的曲線圖。
圖4圖4為表示將大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在添加了各種量肝素的含有10％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的增殖率的曲線圖(從上開(kāi)始依次為1U/mL、10U/mL、100U/mL、1000U/mL)。
圖5圖5為表示將大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在添加了肝素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)(◆)和將同等量的肝素添加到骨髓液中后在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)(■)的增殖率的曲線圖。
圖6圖6為表示在肝素的添加量為0.1U/mL、添加了人成人自體血清(實(shí)線)或FBS(虛線)中的任一種的αMEM培養(yǎng)基中人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的曲線圖。
圖7圖7為表示在肝素的添加量小于0.1U/mL，添加谷氨酰胺時(shí)(◆)或不添加谷氨酰胺時(shí)(■)人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的曲線圖。
圖8圖8為表示將未經(jīng)肝素處理(◆)、經(jīng)肝素處理(■)、經(jīng)肝素+精蛋白處理后(▲)的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在含有FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)增殖率的曲線圖。
圖9圖9為表示本發(fā)明的藥物的治療機(jī)理的圖。縱軸、橫軸、箭頭分別表示癥狀的輕重、從發(fā)病開(kāi)始的經(jīng)過(guò)時(shí)間、本發(fā)明的藥物的施予時(shí)間。在從箭頭開(kāi)始的右側(cè)，上側(cè)的曲線、下側(cè)的曲線分別表示接受施予劑的施予的對(duì)象癥狀的變化與未接受施予的對(duì)象癥狀的變化。
圖10圖10為本發(fā)明的藥物施予前(左)及施予2周后(右)的缺血性神經(jīng)疾病患者的腦MRI圖像。損傷部位以白色部分表示。
圖11圖11為表示缺血性神經(jīng)疾病患者施用本發(fā)明的藥物前后過(guò)程中的腦梗塞水平(NIHSS美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所腦卒中等級(jí)(●)、JSS日本腦卒中學(xué)會(huì)腦卒中等級(jí)(■)、MRS校正等級(jí)(▲))變化的曲線圖。箭頭表示施予細(xì)胞的時(shí)點(diǎn)。
圖12圖12為本發(fā)明的藥物施予前(左)及施予1周后(右)的缺血性神經(jīng)疾病患者的溫度記錄圖像。表示高溫的深色區(qū)域在施予1周后明顯縮小。
圖13圖13為表示本發(fā)明的藥物施予前及施予后時(shí)的糖尿病患者的血糖值(BS●)、血中Glu A1濃度(■)及血中HbA1C濃度(▲)變化的曲線圖?？v軸的左邊、右邊分別表示mg/dl、％，橫軸表示施予日為0天時(shí)的天數(shù)。箭頭表示細(xì)胞(本發(fā)明的藥物)施予的時(shí)點(diǎn)。
圖14圖14為表示本發(fā)明的藥物施予前及施予后時(shí)的前列腺增生患者的PSA值變化的曲線圖。箭頭表示細(xì)胞(本發(fā)明的藥物)施予時(shí)點(diǎn)。
圖15圖15為表示本發(fā)明的藥物施予前及施予后時(shí)的肝障礙病患者的γ-GTP值(左)和GOT(右◆)及GPT(右■)變化的曲線圖。箭頭表示細(xì)胞(本發(fā)明的藥物)施予時(shí)點(diǎn)。
圖16圖16為表示本發(fā)明的藥物施予前及施予后時(shí)的腎障礙患者的β2-微球蛋白值變化的曲線圖。箭頭表示細(xì)胞(本發(fā)明的藥物)施予時(shí)點(diǎn)。
圖17圖17為表示本發(fā)明的藥物施予前及施予后時(shí)的高脂血癥患者的中性脂肪變化的曲線圖。箭頭表示細(xì)胞(本發(fā)明的藥物)施予時(shí)點(diǎn)。
圖18圖18為表示本發(fā)明的藥物施予前及施予后時(shí)的高級(jí)腦功能障礙患者(癡呆和失語(yǔ)癥)的SLTA試驗(yàn)結(jié)果和WAIS-R試驗(yàn)結(jié)果變化的曲線圖。
圖19圖19表示從MRI和血管新生的方面在各組中比較大鼠腦梗塞模型中的由本發(fā)明的藥物施予產(chǎn)生的治療效果的結(jié)果(圖中從左側(cè)開(kāi)始依次為(i)非移植組、(ii)細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(iii)導(dǎo)入血管生成素基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(iv)導(dǎo)入VEGF基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(v)導(dǎo)入血管生成素和VEGF基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖20圖20表示從行為學(xué)方面在各組中比較大鼠腦梗塞模型中的由本發(fā)明的藥物施予產(chǎn)生的治療效果的結(jié)果(圖中從左側(cè)開(kāi)始依次為(i)非移植組、(ii)細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(iii)導(dǎo)入血管生成素基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(iv)導(dǎo)入VEGF基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(v)導(dǎo)入血管生成素和VEGF基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖21圖21表示利用Tunnel陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(A)、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)(B)評(píng)價(jià)大鼠心肺停止模型(復(fù)蘇后腦病)中的由本發(fā)明的藥物施予產(chǎn)生的治療效果的結(jié)果(左對(duì)照組、右細(xì)胞施予組*p＜0.05)。
圖22圖22表示利用水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠心肺停止模型中的由本發(fā)明的藥物施予產(chǎn)生的治療效果的結(jié)果(*p＜0.05)。
圖23圖23為利用平板運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)本發(fā)明的移植了人間充質(zhì)干細(xì)胞的脊髓損傷模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的曲線圖(圖中從左側(cè)開(kāi)始依次為移植6小時(shí)后、1日后、3日后、7日后、14日后)。
本說(shuō)明書(shū)包括作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的專(zhuān)利申請(qǐng)2007-235436號(hào)(2007年9月11日申請(qǐng))、專(zhuān)利申請(qǐng)2007-236499號(hào)(2007年9月12日申請(qǐng))、專(zhuān)利申請(qǐng)2007-267211號(hào)(2007年10月12日申請(qǐng))、專(zhuān)利申請(qǐng)2007-278049號(hào)(2007年10月25日申請(qǐng))、專(zhuān)利申請(qǐng)2007-278083號(hào)(2007年10月25日申請(qǐng))的說(shuō)明書(shū)中記載的內(nèi)容。

具體實(shí)施例方式 以下詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的細(xì)胞增殖的方法。
本發(fā)明的方法是將從活體采集的試樣中的細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)使之增殖的方法，其特征在于，在含有同種血清的培養(yǎng)基中，在不大量與抗凝劑接觸的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞。在此，優(yōu)選上述同種血清被檢驗(yàn)出對(duì)血清癌標(biāo)志物及/或感染因子為陰性，另外，優(yōu)選采集細(xì)胞的受試者的自體血清。
在本發(fā)明中，被檢查的血清癌標(biāo)志物的例子，包括鐵蛋白、CEA、AFP、BFP、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、STN、DUPAN-2、SLX、ST-439、SPAN-1、SCC、PSA、G-精漿蛋白、TPA、CYFRA、PAP、NSE、C肽、PIVKA、Pro-GRP、HCGβ、彈性蛋白酶、β2微球蛋白、S-NTX、抗p53抗體、HER2。另外，感染因子的例子包括HIV、ATL、HB、HC、梅毒、人微小病毒B19等。
本發(fā)明中使用的試樣是指包括具有增殖能力及/或可用于組織的修復(fù)·再生的細(xì)胞的體液及/或組織，例如可以舉出骨髓液、血液(末梢血或臍帶血)或淋巴液等體液；肌肉組織、骨組織、皮膚、淋巴系組織、脈管或消化器官等組織；或胚胎(除人胚胎)等。從活體采集的試樣直接取該試樣的整體，或者根據(jù)需要進(jìn)行處理(例如無(wú)效成分的除去、特定細(xì)胞成分的純化、酶處理等)后，用于本發(fā)明的增殖方法。
在本說(shuō)明書(shū)中“細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不與抗凝劑接觸”是指從細(xì)胞采集開(kāi)始到整個(gè)培養(yǎng)期間中的任意時(shí)點(diǎn)下實(shí)質(zhì)上減少使用的抗凝劑的量，例如是指添加抗凝劑直至用抗凝劑溶液潤(rùn)濕用于細(xì)胞采集的容器(采血管等)內(nèi)壁的程度，或者完全不添加抗凝劑，或者開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)實(shí)質(zhì)上除去試樣中的抗凝劑的情況。
為了更迅速且大量地得到細(xì)胞增殖，優(yōu)選采集試樣時(shí)添加的抗凝劑的量少，為了避免凝血，將采集的細(xì)胞在采集后迅速(例如30分鐘以?xún)?nèi))進(jìn)入培養(yǎng)步驟。較優(yōu)選細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不與抗凝劑接觸。通過(guò)以上操作，可以得到現(xiàn)有的約3～100倍的驚人的增殖率。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，添加到從活體采集的試樣中的(即，預(yù)先添加到收集采集的試樣的采血管中)抗凝劑的量相對(duì)于試樣的容積小于5U/mL、優(yōu)選小于2U/mL、更優(yōu)選小于0.2U/mL。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)從活體采集的試樣中的細(xì)胞時(shí)，存在于培養(yǎng)基中的抗凝劑的量相對(duì)于培養(yǎng)基的容積小于0.5U/mL、優(yōu)選小于0.2U/mL、最優(yōu)選小于0.02U/mL。更具體而言，預(yù)先減少用于試樣采集的采血管的抗凝劑的量及/或調(diào)節(jié)添加到培養(yǎng)基中的抗凝劑的量使開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的抗凝劑的量相對(duì)于培養(yǎng)基的容積小于0.5U/mL。
另外，在本說(shuō)明書(shū)中“抗凝劑”是指存在于體液中或培養(yǎng)基中的情況下，與細(xì)胞表面結(jié)合，與存在于細(xì)胞外基質(zhì)的具有抗血液凝固作用的蛋白質(zhì)相互作用，抑制細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞之間或細(xì)胞與基質(zhì)發(fā)生粘合的物質(zhì)，典型地使用例如肝素及肝素衍生物(例如特開(kāi)2005-218308A號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的在構(gòu)成肝素的D-葡糖胺6位進(jìn)行脫硫酸所得的糖胺聚糖等)或它們的鹽。
在本發(fā)明的方法中，用于增殖細(xì)胞的培養(yǎng)基只要是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中通常使用的培養(yǎng)基即可，沒(méi)有特別限定，為了得到更迅速且大量的增殖，優(yōu)選含有血清的培養(yǎng)基。所用的含有血清的培養(yǎng)基以如本說(shuō)明書(shū)中以下其他位置所記載的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以相對(duì)于培養(yǎng)基小于12％的量加入血清制得?？紤]提供血清的個(gè)體的負(fù)擔(dān)，血清量越少越優(yōu)選；考慮在得到所期望的迅速促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的范圍內(nèi)，則優(yōu)選為1％～20容積％，較優(yōu)選為3～12容積％、更優(yōu)選為5～10容積％。
在本發(fā)明的方法中使用的血清是哺乳動(dòng)物的血清，是培養(yǎng)的細(xì)胞所來(lái)自的個(gè)體的血清(自體血清)。但是，培養(yǎng)的細(xì)胞是人細(xì)胞的情況下，可能難以采集自體血清時(shí)，即使使用異種動(dòng)物血清(例如FBS)或者與人類(lèi)同種的其他個(gè)體的血清(同種血清)，也可以得到高的增殖效率，只要在細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不與抗凝劑接觸的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)即可。但是，例如與FBS相比，使用人血清時(shí)，在不添加抗凝劑時(shí)，本發(fā)明的效果表現(xiàn)得更顯著。血清可以是來(lái)自末梢血的血清，也可以是來(lái)自臍帶血的血清。
利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞只要是從含有血液成分的試樣中調(diào)制，使之附著進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞即可，例如可以舉出間充質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、角膜干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞等成體干細(xì)胞(somatic stem cell)；胎兒干細(xì)胞等胚胎干細(xì)胞單核細(xì)胞(不包括人胚胎)；成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，但不限定于這些。
一方面，本發(fā)明的方法適于增殖干細(xì)胞，并用于例如增殖間充質(zhì)干細(xì)胞。
間充質(zhì)干細(xì)胞是指微量存在于間葉組織的間質(zhì)細(xì)胞中的具有多分化能力及自我復(fù)制能力的干細(xì)胞，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其不僅可以分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等結(jié)締組織細(xì)胞，還具有分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞的能力。
一方面，本發(fā)明的方法可用于增殖人類(lèi)細(xì)胞。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，增殖的細(xì)胞也可以是除人之外的動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠等嚙齒類(lèi)；黑猩猩等靈長(zhǎng)類(lèi)；牛、山羊、綿羊等偶蹄目；馬等奇蹄目；兔、狗、貓等)的細(xì)胞。
進(jìn)而，在本發(fā)明的方法的實(shí)施方式之一中，可以使干細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下增殖。
通常，在未分化的狀態(tài)下增殖的干細(xì)胞增殖率及導(dǎo)入活體內(nèi)后的存活率高。例如在缺血性腦疾病的治療等需要迅速且大量的細(xì)胞增殖的情況下，通過(guò)保持在未分化的狀態(tài)下使采集的干細(xì)胞增殖，可以在短時(shí)間內(nèi)得到所需的細(xì)胞數(shù)。
相反，在細(xì)胞分化成的特定細(xì)胞種類(lèi)是所期望的情況下，使干細(xì)胞或母細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下大量增殖，然后，通過(guò)進(jìn)行分化誘導(dǎo)，也可以得到大量的分化的細(xì)胞，所述分化誘導(dǎo)是通過(guò)添加誘導(dǎo)分化成所期望的細(xì)胞種類(lèi)的已知生長(zhǎng)因子或?qū)刖哂猩鲜鲂再|(zhì)的基因等而進(jìn)行的。
在本發(fā)明的實(shí)施方式之一中，優(yōu)選培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為5,500個(gè)/cm2以上時(shí)使之進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞的性質(zhì)及分化的方向性有影響。例如培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度如果超過(guò)8,500個(gè)/cm2，則細(xì)胞的性質(zhì)發(fā)生變化，所以?xún)?yōu)選最大在8,500個(gè)/cm2以下使之進(jìn)行傳代培養(yǎng)，較優(yōu)選在5,500個(gè)/cm2以上的時(shí)點(diǎn)下使之進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
另外，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)基每周至少更換一次。
為了供給細(xì)胞培養(yǎng)及增殖所需的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)促進(jìn)因子等，以及為了除去由細(xì)胞代謝生成的乳酸等廢產(chǎn)物，保持培養(yǎng)基的pH恒定，需要進(jìn)行培養(yǎng)基的更換。培養(yǎng)基更換的周期依賴(lài)于細(xì)胞的種類(lèi)、培養(yǎng)條件等進(jìn)行選擇，特別是在使用含有人血清的培養(yǎng)基時(shí)，考慮血清供體的負(fù)擔(dān)，優(yōu)選盡量少的次數(shù)，例如利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，每周至少更換一次培養(yǎng)基，較優(yōu)選每周進(jìn)行1～2次培養(yǎng)基的更換。由于利用本發(fā)明的方法，縮短了上述直至得到所需細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)天數(shù)，從而減少了培養(yǎng)基更換使用的血清的量。
在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式之一中，可以反復(fù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞的總數(shù)達(dá)到100,000,000個(gè)以上。
由于通過(guò)利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)細(xì)胞，得到高于通常3～100倍的增殖率，所以可以在短時(shí)間內(nèi)得到大量的細(xì)胞。所需的細(xì)胞數(shù)能夠根據(jù)使用該細(xì)胞的目的進(jìn)行變化，例如認(rèn)為用于由腦梗塞而導(dǎo)致的缺血性腦疾病的治療的移植中所需的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)為10,000,000個(gè)以上。使用本發(fā)明的方法，典型地可以在12日內(nèi)提供10,000,000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞。至今尚未實(shí)現(xiàn)如此迅速的細(xì)胞增殖，利用本發(fā)明的方法使之首次實(shí)現(xiàn)。此外，上述方法中得到的細(xì)胞自身也具有優(yōu)異的增殖效率。通過(guò)在含有血清的培養(yǎng)基中在實(shí)質(zhì)上不含有肝素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，可以提供如此迅速的細(xì)胞增殖和如此高增殖效率的(快速增殖)細(xì)胞，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是令人極其驚奇的。
本發(fā)明的方法中得到的細(xì)胞是高分化能力的安全的細(xì)胞，發(fā)明者人等將其命名為“成體基干細(xì)胞”(somatic fundamental stem cell)。對(duì)于本發(fā)明的方法中得到的“成體基干細(xì)胞”，特定基因的表達(dá)量與使用異種血清(例如FBS)的培養(yǎng)時(shí)相比，有變化(表達(dá)/不表達(dá)、降低/增加)。
例如表1中表示在自體血清培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面抗原(CD抗原)組；及在自體血清培養(yǎng)干細(xì)胞中不表達(dá)的CD抗原組。本發(fā)明的方法中得到的細(xì)胞的特征在于表1記載的陽(yáng)性CD抗原組中的至少90％表達(dá)，并且陰性CD抗原組中的至少90％不表達(dá)。本發(fā)明的方法中得到的細(xì)胞的特征在于在異種血清(例如FBS)培養(yǎng)中表達(dá)的分化標(biāo)志物CD24不表達(dá)，這表明本發(fā)明所述的細(xì)胞維持了未分化的狀態(tài)。
表3中表示在5種情況下共同表現(xiàn)增減的細(xì)胞因子。進(jìn)而，表4中表示在5種情況下在表達(dá)量上共同具有2倍以上差的基因群。如上述表中所示，本發(fā)明的方法中得到的細(xì)胞表達(dá)一系列增殖因子，特別是對(duì)于EGF，與利用異種血清(例如FBS)的培養(yǎng)方法相比，其表達(dá)水平高。暗示這可能是本發(fā)明的細(xì)胞對(duì)增殖有利的原因。
進(jìn)而，表2中表示FBS培養(yǎng)細(xì)胞和自體血清培養(yǎng)細(xì)胞中5種情況下共同表現(xiàn)增減的增殖因子的相關(guān)因子。如上述表所示，對(duì)于本發(fā)明的方法中得到的細(xì)胞，與利用異種血清(例如FBS)的培養(yǎng)方法相比，癌相關(guān)基因群的表達(dá)或表達(dá)水平較低。需要說(shuō)明的是，作為不受歡迎的癌相關(guān)基因，可以舉出EWI-FLI-1、FUS-CHOP、EWS-ATF1、SYT-SSX1、PDGFA、FLI-1、FEV、ATF-1、WT1、NR4A3、CHOP/DDIT3、FUS/TLS、BBF2H7、CHOP、MDM2、CDK4、HGFR、c-met、PDGFα、HGF、GFRA1、FASN、HMGCR、RGS2、PPARγ、YAP、BIRC2、lumican、鈣調(diào)結(jié)合蛋白、ALCAM、Jam-2、Jam-3、鈣粘蛋白II、DKK1、Wnt、核干細(xì)胞因子、神經(jīng)纖維瘤蛋白、RB、CDK4、p16、MYCN、端粒、hTERT、ALT、Ras、TK-R、CD90、CD105、CD133、VEGFR2、CD99、ets、ERG、ETV1、FEV、ETV4、MYC、EAT-2、MMP-3、FRINGE、ID2、CCND1、TGFBR2、CDKNIA、p57、p19、p16、p53、IGF-1、c-myc、p21、細(xì)胞周期蛋白D1、p21等。
在本說(shuō)明書(shū)中，“表達(dá)量降低(或增加)”是指基于本領(lǐng)域公知的算法(基因芯片算法(AFFYMETRIX))的“信號(hào)的對(duì)數(shù)比(Signal Log Ratio)”為“-1≤”或“1≤”(即，基因表達(dá)量相對(duì)基線的比例為2倍以上(表4))、較優(yōu)選為“-2≤”或”2≤”(即，基因表達(dá)量相對(duì)基線的比例為4倍以上)。本說(shuō)明書(shū)中使用的情況下，“表中記載的基因”是指由表中記載的“探針組號(hào)”識(shí)別的特定的基因(包括保持該基因功能的突變體。)。上述基因與用基因符號(hào)表示的基因相對(duì)應(yīng)?；蚍?hào)是由美國(guó)NCBI命名的與各基因唯一對(duì)應(yīng)的名稱(chēng)。AFFYMETRIX公司的NetAffix數(shù)據(jù)庫(kù)中記載了探針組號(hào)和基因符號(hào)對(duì)應(yīng)的詳細(xì)情況，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是容易理解的。用于表示基因時(shí)，“突變體”可以與“基因突變體”互換使用，其是指包括下述任一種堿基序列的突變體(I)在特定基因的堿基序列中缺失、置換或添加1個(gè)或多個(gè)堿基得到的堿基序列；(II)與特定基因可在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列；或者(III)與特定基因的堿基序列的至少80％相同的堿基序列。這些突變體均保持所述特定基因的功能。在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“基因的功能”可以與“由該基因編碼的蛋白質(zhì)的功能”互換使用。由“表中記載的基因”編碼的蛋白質(zhì)是功能為公知的蛋白質(zhì)，用于確認(rèn)其功能的分析系統(tǒng)也是本領(lǐng)域公知的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，容易地制作上述基因突變體，并且可以容易地確認(rèn)其功能。例如對(duì)于雜交的具體的步驟及“嚴(yán)格的”雜交條件，可以按照“Molecular CloningA Laboratory Manual第3版，J.Sambrook及D.W.Russll編，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(2001)”(本說(shuō)明書(shū)中作為參考引用。)中記載的方法之類(lèi)的公知的方法進(jìn)行。
在本發(fā)明中，CD抗原組“表達(dá)”、或“不表達(dá)”是指使用Affymetrix公司的基因芯片操作軟件(GCOS)的分析模式時(shí)得到的結(jié)果。另外，由表中記載的保持基因功能的基因突變體編碼的蛋白質(zhì)可以是由表中記載的基因編碼的蛋白質(zhì)突變體。在用來(lái)表示蛋白質(zhì)時(shí)，“突變體”可以與“蛋白質(zhì)突變體”互換使用，其是指包括下述氨基酸序列的突變體，所述氨基酸序列由特定基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或添加而得到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以通過(guò)采用本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，容易地制作上述蛋白質(zhì)突變體，并且可以容易地確認(rèn)其功能。
本發(fā)明的細(xì)胞是具有可以用于組織修復(fù)及再生的增殖能力的細(xì)胞。作為組織修復(fù)及再生中使用的供體細(xì)胞，可以舉出自體或同種異體的組織干細(xì)胞或成體干細(xì)胞或胚性干細(xì)胞。因此，本發(fā)明的細(xì)胞可以是來(lái)自組織干細(xì)胞、成體干細(xì)胞或胚性干細(xì)胞的細(xì)胞?？紤]到倫理的問(wèn)題、感染癥的危險(xiǎn)性或使用免疫抑制劑的必要性等，本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自自體細(xì)胞、特別是可以非侵襲地確保供體細(xì)胞的成體干細(xì)胞(例如骨髓細(xì)胞)的細(xì)胞。
組織干細(xì)胞、成體干細(xì)胞或胚性干細(xì)胞可以由哺乳動(dòng)物個(gè)體的組織或體液供給，作為上述細(xì)胞的供給源中優(yōu)選的組織，例如可以舉出肌肉組織、骨組織、脂肪組織、皮膚、淋巴系組織、脈管、消化器官、毛發(fā)根、牙齒髓及胚胎(不包括人胚胎)等；作為供給源中優(yōu)選的體液，例如可以舉出骨髓液、血液(末梢血或臍帶血)及淋巴液等。特別是修復(fù)及再生對(duì)象為神經(jīng)系統(tǒng)組織時(shí)，作為供體細(xì)胞的供給源，例如可以舉出骨髓、末梢血、臍帶血、胎兒胚胎、腦等，修復(fù)及再生的對(duì)象為造血組織時(shí)，可以舉出骨髓、末梢血、臍帶血、胎兒胚胎等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)容易地調(diào)制目的細(xì)胞。
由于本發(fā)明的細(xì)胞是可以用于組織的修復(fù)及再生的細(xì)胞，所以?xún)?yōu)選粘合性的細(xì)胞，更優(yōu)選來(lái)自于下述細(xì)胞的細(xì)胞，例如間充質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、角膜干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞等成體干細(xì)胞；胎兒干細(xì)胞等胚胎干細(xì)胞單核細(xì)胞(不包括人胚胎)；成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。為了在急性期神經(jīng)疾病的治療中使用細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞應(yīng)優(yōu)選來(lái)自干細(xì)胞，特別優(yōu)選來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是指微量存在于間葉組織的間質(zhì)細(xì)胞中的具有多分化能力及自我復(fù)制能力的干細(xì)胞，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其不僅可以分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等結(jié)締組織細(xì)胞，還具有分化神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞的能力。在此情況下，由于干細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下增殖率及導(dǎo)入活體內(nèi)后的存活率高，所以本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自干細(xì)胞的未分化狀態(tài)下的細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自人的細(xì)胞，但也可以為來(lái)自除人之外哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠等嚙齒類(lèi)；黑猩猩等靈長(zhǎng)類(lèi)；牛、山羊、綿羊等偶蹄目；馬等奇蹄目；兔、狗、貓等)的細(xì)胞。
在本說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行使用時(shí)，自體血清是細(xì)胞所來(lái)自個(gè)體的血清(自體血清)，然而，難以使用自體血清時(shí)，即使使用其他成人的人血清，也可以得到高的增殖率。
如上所述，本發(fā)明的細(xì)胞在同種的，特別是在自體血清存在下的增殖率高于異種血清存在下的增殖率，而且是維持在更加未分化狀態(tài)下具有高分化能力的，安全的細(xì)胞。作為本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞的種類(lèi)、所期望分化的方向及水平、以及所需的增殖率等，從本領(lǐng)域中公知的各種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(例如Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)、NPBM、αMEM等)中適當(dāng)?shù)剡x擇，優(yōu)選使用DMEM。
另一方面，利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞也可以在用于組織修復(fù)·再生的藥物的制造。
通過(guò)將治療藥物施予受試體，可以修復(fù)、再生喪失了功能的對(duì)象的組織，所述治療藥物含有采用本發(fā)明的增殖方法得到的細(xì)胞作為有效成分。特別是使用間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，可以修復(fù)、再生缺血性腦疾病的腦組織(參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)WO02/00849A1號(hào)公報(bào))。本說(shuō)明書(shū)中涉及的情況下，組織的修復(fù)、再生與功能的修復(fù)、再生意義相同，例如，修復(fù)·再生神經(jīng)系統(tǒng)組織時(shí)的治療效果，包括神經(jīng)的保護(hù)作用(例如軸突的再次有髓化)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的補(bǔ)充)、腦血管新生作用、神經(jīng)再生等。具體而言，作為含有利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞的藥物的治療效果，其實(shí)體是指組織的修復(fù)、再生，其現(xiàn)象是指組織的功能障礙的修復(fù)、再生。將增殖的細(xì)胞用于組織的修復(fù)·再生時(shí)，優(yōu)選預(yù)先經(jīng)過(guò)末梢血確認(rèn)供體細(xì)胞源未被HIV、ATL、HB、HC、梅毒、人微小病毒B19等感染。
另外，在實(shí)施方式之一中，也可以將利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞用于疾病或病原體感染的診斷。例如通過(guò)考察從受試體采集并在體外增殖的細(xì)胞中含有的癌相關(guān)基因的狀態(tài)，可以診斷癌變的危險(xiǎn)性。
另外，受試體被朊病毒病感染時(shí)，用通常的檢查方法難以檢測(cè)，但通過(guò)利用本發(fā)明的方法使細(xì)胞增殖而迅速地使異常的朊病毒擴(kuò)增至檢測(cè)靈敏度以上，進(jìn)行朊病毒病的診斷。
或者也可以將利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞用于體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)。
作為含有利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞的組織修復(fù)·再生用藥物，例如可以舉出包括利用本發(fā)明的方法體外擴(kuò)增得到的細(xì)胞與藥學(xué)可以允許的稀釋劑、賦形劑及/或基材組合得到的注射(例如包括神經(jīng)前體細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞、淋巴球細(xì)胞等的注射)及移植用植入物(例如心肌細(xì)胞片材、人工皮膚、人工角膜、人工牙根、人工關(guān)節(jié)等)，但不限定于此。
也可以將含有利用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞的藥物用于神經(jīng)系統(tǒng)組織的修復(fù)·再生。例如也可以增殖自身間充質(zhì)干細(xì)胞，用于缺血性神經(jīng)疾病處置的藥物。在優(yōu)選的實(shí)施方式之一中，上述藥物中含有的細(xì)胞為來(lái)自被施予細(xì)胞的受試體的細(xì)胞(自體細(xì)胞)。
作為成為上述細(xì)胞療法對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如可以舉出中樞性及末梢性的脫髓鞘疾病、中樞性及末梢性的退化疾病、腦卒中(包括腦梗塞、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血)、腦腫瘤、包括癡呆的高級(jí)功能障礙、精神疾病、癲癇、外傷性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括頭部外傷、腦挫傷、脊髓損傷)、脊髓梗塞以及克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、庫(kù)魯病、牛海綿狀腦病、羊瘙癢病等朊病毒病，但不限定于此。
利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞在除神經(jīng)系統(tǒng)疾病之外的疾病處置中也有用。例如為了治療急性白血病，也可以體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞將其移植到骨髓中。在通常的骨髓移植中，需要的細(xì)胞數(shù)為自身移植的情況下，受體的每單位體重一般為2×108個(gè)，異體移植的情況下，為4×108個(gè)；因此從細(xì)胞供體采集的骨髓液的量可能達(dá)到1000mL，但通過(guò)利用本發(fā)明的方法在體外使細(xì)胞迅速地增殖，可以減輕細(xì)胞供體身體的負(fù)擔(dān)。另外，為了治療病毒感染等，也可以將從患者的末梢血采集的T淋巴球利用本發(fā)明的方法在體外進(jìn)行擴(kuò)增，將其移植給同一患者。
用于組織修復(fù)·再生的細(xì)胞補(bǔ)充中使用的供體細(xì)胞源可以從自體或異體的組織干細(xì)胞或成體干細(xì)胞或胚性干細(xì)胞中得到，但如果考慮倫理的問(wèn)題、感染癥的危險(xiǎn)性或使用免疫抑制劑的必要性等的困難，則優(yōu)選自體移植療法，所述自體移植療法使用自體細(xì)胞，特別是可以非侵襲地確保供體細(xì)胞的成體干細(xì)胞(例如骨髓細(xì)胞)。難以進(jìn)行自體移植療法的情況下，也可以利用來(lái)自他人或其他動(dòng)物的細(xì)胞。只要供體細(xì)胞的開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的試樣中含有的抗凝劑的量小于5U/mL，則可以是剛培養(yǎng)前采集的試樣中含有的細(xì)胞，也可以是冷凍保存的細(xì)胞。此外，也可預(yù)先增殖自體細(xì)胞，進(jìn)行冷凍保存，患病時(shí)將其施予，例如利用國(guó)際公開(kāi)WO 2005/001732A1號(hào)公報(bào)中記載的治療用細(xì)胞的配送支援體系的治療模型。
細(xì)胞源優(yōu)選已知會(huì)分化成作為修復(fù)·再生對(duì)象的特定組織的細(xì)胞種類(lèi)的細(xì)胞，例如與之相同胚層系的細(xì)胞或全能性干細(xì)胞，然而，還發(fā)現(xiàn)了在一定程度上會(huì)分化成其他胚層的干細(xì)胞(例如胎兒干細(xì)胞)再分化成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞等其他組織的細(xì)胞(例如WO 02/00849A1號(hào)公報(bào)中記載的細(xì)胞)，考慮到這一發(fā)現(xiàn)，只要可以利用公知的分化誘導(dǎo)因子等誘導(dǎo)分化成所期望的細(xì)胞種類(lèi)，則也可以使用來(lái)自不同胚層系細(xì)胞的組織。
當(dāng)修復(fù)對(duì)象的組織為神經(jīng)系統(tǒng)組織時(shí)，作為供體細(xì)胞源，例如可以舉出來(lái)自骨髓、末梢血、臍帶血、胎兒胚胎、腦等的細(xì)胞。當(dāng)修復(fù)對(duì)象的組織為造血組織時(shí)，可以舉出骨髓、末梢血、臍帶血、胎兒胚胎等中含有的造血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞等。
使用來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞用于神經(jīng)系統(tǒng)組織的修復(fù)，存在以下優(yōu)點(diǎn)1)可以期待顯著的效果；2)副作用的危險(xiǎn)性低；3)可以期待充分的供體細(xì)胞的供給；4)為非侵襲的治療，可以進(jìn)行自體移植；因此，5)感染癥的風(fēng)險(xiǎn)低；6)不用擔(dān)心免疫排斥反應(yīng)；7)不存在倫理的問(wèn)題；8)容易被社會(huì)接受；9)易于廣泛用于普通醫(yī)療保障等。進(jìn)而，骨髓移植療法已經(jīng)是臨床實(shí)踐中使用的治療方法，安全性也經(jīng)過(guò)了確認(rèn)。另外，來(lái)自骨髓的干細(xì)胞遷移性高，不僅可以通過(guò)局部移植，還可以通過(guò)靜脈內(nèi)施予到達(dá)目的損傷組織，而達(dá)到其治療效果。
骨髓液的采集可以如下進(jìn)行，例如麻醉(局部或全身麻醉)成為采集源的動(dòng)物(包括人)，將針刺入胸骨或骼骨，用注射器進(jìn)行吸引。另外，對(duì)于臍帶血確立的技術(shù)如下直接對(duì)出生兒進(jìn)行針刺臍帶，用注射器進(jìn)行吸引，采集臍帶血進(jìn)行保存。在現(xiàn)有的方法中，為了防止引起在采集的骨髓液中血液成分的凝固，使用抗凝劑，相反，在本發(fā)明的方法中，如上所述不使用抗凝劑。
將含有利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞的藥物送達(dá)到損傷組織的方法，可以包括例如利用外科方法的局部移植、靜脈內(nèi)施予、腰椎穿刺施予、局部注入施予、皮下施予、皮內(nèi)施予、腹腔內(nèi)施予、肌肉內(nèi)施予、腦內(nèi)施予、腦室內(nèi)施予或靜脈施予等。另外，也可以使利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞包含或接種在移植物、細(xì)胞片材基材、人工關(guān)節(jié)等中將其移植到活體內(nèi)。
例如用于神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)時(shí)，給患者注射的細(xì)胞的移植可以如下進(jìn)行，用人工腦脊髓液和生理鹽水等使移植的細(xì)胞在懸浮的狀態(tài)下充滿注射器，通過(guò)手術(shù)露出損傷的神經(jīng)組織，用注射針將其直接注入上述損傷部位。在使用遷移性高到足以在組織內(nèi)移動(dòng)的程度的細(xì)胞(例如WO 02/00849A1號(hào)公報(bào)中記載的細(xì)胞等)的情況下，可以移植到損傷部位的附近，另外，甚至可以將上述細(xì)胞注入到腦脊髓液中來(lái)期待效果。在上述情況下，由于可以用通常的腰椎穿刺注入細(xì)胞，并且這種方法是優(yōu)選的，因?yàn)闊o(wú)需對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)，僅需要局部麻醉，可以在診室內(nèi)處置患者。進(jìn)而，還可以期待注入到靜脈內(nèi)的效果。因此，可以用通常輸血的方式進(jìn)行移植，實(shí)現(xiàn)在病房進(jìn)行移植操作，考慮到這個(gè)方面是優(yōu)選的。
本發(fā)明的細(xì)胞增殖中適用的培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)、所期望分化的方向及水平、以及所需的增殖率等進(jìn)行選擇。例如增殖用于神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，作為優(yōu)選的培養(yǎng)基，除以下所示的Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)之外，還可以舉出神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(NPBMClontech制)、αMEM培養(yǎng)基等，但不限定于此。以上述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加上述血清，進(jìn)而根據(jù)需要加入氨基酸等營(yíng)養(yǎng)因子、抗生素、生長(zhǎng)促進(jìn)因子及/或生長(zhǎng)因子等。
作為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的具體例，可以舉出以以下濃度(mg/L)含有以下成分的Dulbecco改進(jìn)的培養(yǎng)基 CaCl2(無(wú)水物)160～240 KCL320～480 Fe(NO3)3·9H2O0.08～1.2 MgSO4(無(wú)水物)80～120 NaCl5120～7680 NaHCO32960～4440 NaH2PO4·H2O100～150 D-葡萄糖3600～5400 酚紅12～18 丙酮酸鈉88～132 L-精氨酸·HCl67～101 L-半胱氨酸·2HCl50～76 L-組氨酸·HCl·H2O34～50 L-異亮氨酸84～126 L-亮氨酸84～126 L-賴(lài)氨酸·HCl117～175 L-甲硫氨酸24～36 L-苯基丙氨酸53～79 L-絲氨酸34～50 L-蘇氨酸76～114 L-色氨酸13～19 L-酪氨酸(二鈉鹽)83～125 L-纈氨酸75～113 氯化膽堿3.2～4.8 D-Ca-泛酸3.2～4.8 葉酸3.2～4.8 i-肌醇5.8～8.6 煙酰胺3.2～4.8 吡哆醛·HCl3.2～4.8 核黃素0.3～0.5 硫胺·HCl3.2～4.8 根據(jù)期望，也可以單獨(dú)或合并使用細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中通常使用的抗生素(例如青霉素、鏈霉素等)。優(yōu)選合并使用多種抗生素，例如合并使用青霉素和鏈霉素時(shí)，相對(duì)于培養(yǎng)基分別為0.5～2容積％，優(yōu)選為0.8～1.2容積％。
作為培養(yǎng)基中含有的低分子氨基酸，可以舉出L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-抗壞血酸及L-谷氨酸。在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中通常使用的培養(yǎng)基中含有上述氨基酸作為營(yíng)養(yǎng)素。
進(jìn)而，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)基總量的0.1～2％(重量/容積)添加谷氨酰胺，這對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的迅速增殖是必不可少的，進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)了進(jìn)行補(bǔ)充使培養(yǎng)中的谷氨酰胺保持為0.1～2％(重量/容積)，進(jìn)一步促進(jìn)迅速的增殖。
也可以根據(jù)需要，在上述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)·生長(zhǎng)促進(jìn)因子及/或分化誘導(dǎo)因子。生長(zhǎng)·生長(zhǎng)促進(jìn)因子及分化誘導(dǎo)因子，根據(jù)所期望分化的方向及水平、所需的增殖率等進(jìn)行選擇。例如可以舉出抗壞血酸及煙酰胺等維生素類(lèi)；NGF及BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；BMP等成骨因子；上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、IL-2等細(xì)胞因子，但不限定于此。
具體而言，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法例如如下進(jìn)行。
1.利用用上述肝素液潤(rùn)濕了內(nèi)壁的注射器將從活體采集的試樣以100倍以下的稀釋率、優(yōu)選10倍以下的稀釋率、更優(yōu)選約2倍～6倍左右的稀釋率，加入預(yù)先在37±0.5℃下保存的培養(yǎng)基中，將其接種在培養(yǎng)皿上，在37±0.5℃、5％的二氧化碳中進(jìn)行培育。培養(yǎng)基的更換每周至少進(jìn)行一次，一般每周進(jìn)行1～2次。在合適的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中加入血清及所需的助劑調(diào)制培養(yǎng)基，利用過(guò)濾滅菌機(jī)進(jìn)行滅菌，分成小份，在4℃的冰箱中保管，使用前預(yù)先維持在37±0.5℃下。如果超過(guò)37.5℃，則死亡的細(xì)胞增加；如果低于36.5℃，則細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩。二氧化碳濃度優(yōu)選在5±1％的范圍內(nèi)。在整個(gè)步驟中將與細(xì)胞接觸的溶液保持在同樣的溫度范圍內(nèi)，其結(jié)果是促進(jìn)增殖的迅速化。
2.確認(rèn)細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿的基材后，吸引培養(yǎng)基及培養(yǎng)基中懸浮的血球成分，將其分離、除去。然后，使用磷酸緩沖生理鹽水作為清洗液，清洗附著的干細(xì)胞表面。
3.繼代培養(yǎng)以培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞達(dá)到5,500個(gè)/cm2以上的時(shí)點(diǎn)為指標(biāo)，在匯合度(confluence)60～80％、優(yōu)選65～75％的時(shí)點(diǎn)下進(jìn)行，使細(xì)胞密度不超過(guò)8,500個(gè)/cm2。繼代培養(yǎng)時(shí)，在每個(gè)培養(yǎng)基中添加3mL主要包括胰蛋白酶及根據(jù)需要加入的EDTA(乙二胺四乙酸)的剝離劑，在37±5℃下培育3～5分鐘后，確認(rèn)附著的干細(xì)胞剝離。利用傾注法用分離液對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行更換，將培養(yǎng)基中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)定的離心管中，通過(guò)離心分離，沉淀細(xì)胞使之繼代。反復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)、培養(yǎng)基更換、繼代的循環(huán)，至少使間充質(zhì)干細(xì)胞的總數(shù)達(dá)到100,000,000個(gè)以上。培養(yǎng)基的更換每周至少進(jìn)行一次。
通過(guò)反復(fù)進(jìn)行以上的循環(huán)，可以迅速地得到目標(biāo)細(xì)胞數(shù)(例如間充質(zhì)干細(xì)胞的情況下，可以在兩周以?xún)?nèi)得到1×108個(gè)細(xì)胞)。
根據(jù)期望，也可以使用容易進(jìn)行增殖后的細(xì)胞剝離的細(xì)胞支架材料。作為優(yōu)選的支架材料的例子，可以舉出多孔質(zhì)的無(wú)機(jī)類(lèi)陶瓷、微柱(例如日立制作所制納米柱細(xì)胞培養(yǎng)片材)、無(wú)紡布、蜂窩狀薄膜等，但不限定于此。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，也可以預(yù)先將誘導(dǎo)增殖及分化的例如BDNF基因、PLGF基因、GDNF基因或IL-2基因等基因轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞中?；蛘吲囵B(yǎng)的細(xì)胞也可以為轉(zhuǎn)染了端粒酶基因等永生化基因的永生細(xì)胞。對(duì)于上述基因的轉(zhuǎn)染，例如在WO03/038075A1號(hào)公報(bào)等中進(jìn)行了公開(kāi)。
從上述以例子的形式舉出的培養(yǎng)基、支架劑、助劑、增殖因子及/或基因轉(zhuǎn)染等中選擇可產(chǎn)生所期望的增殖率及/或誘導(dǎo)分化成特定細(xì)胞種類(lèi)的組合是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。
利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞也可以直接施用于組織的修復(fù)·再生，為了提高治療效率，可以以任意地添加各種藥劑的組合物的形式或在轉(zhuǎn)染基因之后，施予或移植細(xì)胞。例如可以舉出下述實(shí)現(xiàn)上述目的的方法添加進(jìn)一步提高利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞組織內(nèi)增殖率的物質(zhì)、促進(jìn)其分化成所期望細(xì)胞的物質(zhì)或提高組織內(nèi)存活率的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加具有阻止使移植的細(xì)胞受到損傷的生物組織不良影響的效果的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加延長(zhǎng)供體細(xì)胞壽命的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加以抑制免疫細(xì)胞為目的的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加激活能量代謝的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加提高供體細(xì)胞的組織內(nèi)趨化能力(chemotactic activity)的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因；添加改善血流的物質(zhì)及/或轉(zhuǎn)染具有上述效果的基因等，但不限定于此。
細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選在GMP基準(zhǔn)的細(xì)胞調(diào)制設(shè)施“CPC(Cell ProcessingCenter)”中進(jìn)行。對(duì)對(duì)象施予的“臨床級(jí)細(xì)胞”的調(diào)制優(yōu)選在下述CPC內(nèi)進(jìn)行，所述CPC是應(yīng)在無(wú)菌狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作的特別設(shè)計(jì)的設(shè)施，更具體而言，通過(guò)空調(diào)控制、室內(nèi)壓力控制、溫度濕度控制、粒子計(jì)數(shù)器、HEPA過(guò)濾器等確保清潔度。另外，優(yōu)選經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不僅保障CPC設(shè)施本身，還保障CPC內(nèi)使用的所有機(jī)器的性能，并隨時(shí)監(jiān)測(cè)·記錄其功能，期望CPC內(nèi)的細(xì)胞處理操作應(yīng)完全按照“標(biāo)準(zhǔn)操作指南”進(jìn)行嚴(yán)格地管理·記錄。
本發(fā)明的藥物也可以包括除間充質(zhì)干細(xì)胞之外的細(xì)胞種類(lèi)作為細(xì)胞成分，但優(yōu)選細(xì)胞成分中所占的間充質(zhì)干細(xì)胞的比例高。因此，在本發(fā)明的藥物的優(yōu)選方式中，間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)相對(duì)于藥物中含有的全部細(xì)胞數(shù)的比例為50％以上、優(yōu)選為75％以上、較優(yōu)選為80％以上、更優(yōu)選為90％以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為95％以上、特別優(yōu)選為98％以上、最優(yōu)選不含除間充質(zhì)干細(xì)胞之外的細(xì)胞種類(lèi)，例如實(shí)質(zhì)上不含造血干細(xì)胞等。細(xì)胞成分中所占的間充質(zhì)干細(xì)胞的比例可以如下容易地確定，例如將藥物中含有的細(xì)胞用對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞具有特異性的1種或2種以上標(biāo)志物(例如CD105、CD73、CD166、CD9、CD157等表面抗原)的標(biāo)志性抗體進(jìn)行標(biāo)志，采用流式細(xì)胞儀等進(jìn)行分析。
本發(fā)明的藥物中含有的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)越多越好，但如果考慮對(duì)對(duì)象的施予時(shí)機(jī)和需要培養(yǎng)的時(shí)間，則發(fā)揮效果的最小量是實(shí)用的。因此，在本發(fā)明的藥物的優(yōu)選的實(shí)施方式中，間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為107個(gè)以上、優(yōu)選為5×107個(gè)以上、較優(yōu)選為108個(gè)以上、更優(yōu)選為5×108個(gè)以上。
作為除上述間充質(zhì)干細(xì)胞之外的細(xì)胞種類(lèi)，在目的是幫助修復(fù)神經(jīng)組織的情況下，是從例如骨髓、臍帶血、末梢血或胎兒肝中分離得到的、能夠分化成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞，可以舉出下述細(xì)胞，所述細(xì)胞包括具有LIN-、SCA-1+、CD10+、CD11D+、CD44+、CD45+、CD71+、CD90+、CD105+、CDW123+、CD127+、CD164+、纖連蛋白+、ALPH+、膠原酶-1+特征的間質(zhì)細(xì)胞，或具有AC133+特征的細(xì)胞等，但不限定于此，可以使用能夠分化成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的其他任意的細(xì)胞種類(lèi)。
上述間質(zhì)細(xì)胞可以如下得到，例如從骨髓細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞離心分離得到的細(xì)胞成分中選擇具有CD45等細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞。另外，還可以如下調(diào)制從脊椎動(dòng)物采集的骨髓細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞，即，使用對(duì)根據(jù)其比重分離為充分的時(shí)間，以800g在溶液中進(jìn)行密度梯度離心，離心后，回收其比重位于1.07～1.1g/ml范圍內(nèi)的細(xì)胞成分。此處“根據(jù)其比重分離為充分的時(shí)間”是指在用于密度梯度離心的溶液內(nèi)，對(duì)細(xì)胞根據(jù)其比重占據(jù)相應(yīng)位置的充分的時(shí)間，通常為10～30分鐘左右。回收的細(xì)胞成分的比重優(yōu)選在1.07～1.08g/ml的范圍內(nèi)、例如為1.077g/ml。作為用于密度梯度離心的溶液，可以使用Ficol液和Percol液，但不限定于此。
具體而言，首先，將從脊椎動(dòng)物采集的骨髓液或臍帶血與之同等量的溶液(PBS+2％BSA+0.6％檸檬酸鈉+1％青霉素-鏈霉素)溶液混合，取其中的5mL與Ficol+Paque液(1.077g/ml)混合，進(jìn)行離心(以800g計(jì)20分鐘)，提取單核細(xì)胞成分。將該單核細(xì)胞成分與用于細(xì)胞清洗的培養(yǎng)溶液(αMEM、12.5％FBS、12.5％馬血清、0.2％i-肌醇、20mM葉酸、0.1mM 2-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1μM氫化可的松、1％抗生素-抗真菌溶液)混合，進(jìn)行離心(2000rpm、15分鐘)。然后，除去離心后的上清液后，回收沉淀的細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)(37℃、5％CO2)。
上述AC133+細(xì)胞可以如下得到，例如從骨髓細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞或末梢血細(xì)胞離心分離得到的細(xì)胞成分中選擇具有AC133的細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞。另外，作為其他的實(shí)施方式，也可以如下調(diào)制AC133+細(xì)胞，即，將從脊椎動(dòng)物采集的胎兒肝細(xì)胞以2000rpm根據(jù)其比重分離為充分的時(shí)間，在溶液中進(jìn)行密度梯度離心，離心后，收集比重在1.07～1.1g/ml范圍內(nèi)含有的細(xì)胞成分，從上述細(xì)胞成分中回收具有AC133+特征的細(xì)胞。此處“根據(jù)其比重分離為充分的時(shí)間”是指在用于密度梯度離心的溶液內(nèi)，細(xì)胞占有與其比重相應(yīng)位置的充分的時(shí)間，通常為10～30分間左右。作為用于密度梯度離心的溶液，可以使用Ficol液和Percol液，但不限定于此。
具體而言，首先在L-15溶液內(nèi)清洗從脊椎動(dòng)物采集的肝臟組織，進(jìn)行酶處理(在含有L-15+0.01％脫氧核苷核酸酶I、0.25％胰蛋白酶、0.1％膠原酶的溶液中，在37℃下30分鐘)，移液以制備分散細(xì)胞。對(duì)成為上述分散細(xì)胞的胎兒肝細(xì)胞進(jìn)行離心分離。清洗如上所述得到的細(xì)胞，利用AC133抗體從清洗后的細(xì)胞中回收AC133+細(xì)胞。由此，可以從胎兒肝細(xì)胞中調(diào)制能夠分化成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞。利用抗體的AC133+細(xì)胞的回收可以利用磁珠或利用細(xì)胞分類(lèi)器(FACS等)來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的藥物優(yōu)選為非口服施予制劑、較優(yōu)選為非口服全身施予制劑、特別優(yōu)選靜脈內(nèi)施予制劑。作為適于非口服施予的劑型，沒(méi)有限定，可以舉出溶液型注射劑、懸濁型注射劑、乳濁液型注射劑、用時(shí)調(diào)制型注射劑等注射劑和移植片等。非口服施予用制劑可以為水性或非水性的等滲性無(wú)菌溶液或混懸液的形態(tài)。具體而言，例如可以將其與藥理學(xué)上允許的載體或介質(zhì)，具體而言，無(wú)菌水和生理鹽水、培養(yǎng)基、PBS等生理緩沖液、植物油、乳化劑、混懸劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、運(yùn)載體、防腐劑、粘合劑等適當(dāng)組合，制劑化成適當(dāng)?shù)膯挝凰幜渴┯栊螒B(tài)。
作為注射用的水溶液，沒(méi)有限定，例如可以舉出生理鹽水、培養(yǎng)基、PBS等生理緩沖液、含有葡萄糖和其他助劑的等滲液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等，也可以與適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦├绱?，具體而言乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、及/或非離子型表面活性劑例如聚山梨酸酯80、HCO-50等合并使用。
在本發(fā)明中，損傷是指活體因體內(nèi)及/或體外的主要原因而受到全身性或局部性的任何障礙。因此，本發(fā)明中的損傷中包括各種外傷、梗塞、退行性病變、組織破壞等各種狀態(tài)。另外，損傷部位也包括全身的各種組織，例如腦、神經(jīng)、腎臟、胰臟、肝臟、心臟、皮膚、骨、軟骨等。損傷部位可以為一處，也可以為多處。本發(fā)明的藥物對(duì)各種組織有效果，由于可以經(jīng)單次施予一次性修復(fù)多處損傷部位，所以對(duì)具有多處損傷部位的對(duì)象的治療特別有效。作為引起損傷的主要原因，例如可以舉出物理的外力(事故、燒傷、爆炸等)、各種缺血性疾病(腦梗塞、脊髓梗塞等缺血性神經(jīng)疾病、心肌梗塞等缺血性心臟疾病等)、各種炎癥、糖尿病、各種感染癥、自身免疫疾病、腫瘤、對(duì)毒物的暴露、中樞性及末梢性的脫髓鞘疾病、中樞性及末梢性的變性疾病、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦腫瘤、包括癡呆的高級(jí)功能障礙、精神疾病、癲癇、克羅伊茨費(fèi)爾特一雅各布病、庫(kù)魯病、牛海綿狀腦病、羊瘙癢病等朊病毒病等，但不限定于此。本發(fā)明中的損傷一般是指伴有組織功能喪失及/或降低的損傷。
作為組織功能的喪失及/或降低，沒(méi)有限定，例如可以舉出如果為神經(jīng)組織，則包括疼痛、麻木、感覺(jué)減退等感覺(jué)障礙，麻痹、痙攣、半身不遂、肢體晃動(dòng)、步行障礙、運(yùn)動(dòng)遲緩和身體笨拙等運(yùn)動(dòng)障礙，頭痛、記憶障礙、意識(shí)障礙、語(yǔ)言障礙、驚厥、震顫、癡呆、幻覺(jué)、行動(dòng)異常等腦功能障礙，頭暈?zāi)垦?、眩暈、暈厥、排尿障礙、排汗障礙等自律神經(jīng)障礙等；如果為腎臟，則包括排泄功能、電解質(zhì)·水分平衡等體液平衡的調(diào)節(jié)功能、內(nèi)分泌功能的喪失及/或降低等；如果為胰臟，則包括外分泌功能及內(nèi)分泌功能的喪失及/或降低等；如果為肝臟，則包括物質(zhì)代謝功能、物質(zhì)合成功能、外分泌功能的喪失及/或降低等；如果為心臟，則包括血液輸出功能、內(nèi)分泌功能的喪失及/或降低等。某種組織受到損傷的導(dǎo)致的具體功能的喪失及/或降低及其伴有的癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
另外，損傷部位的修復(fù)、再生與功能的修復(fù)、再生意義相同，作為治療效果，例如修復(fù)·再生神經(jīng)系統(tǒng)組織時(shí)，包括神經(jīng)的保護(hù)作用(例如軸突的再次有髓化)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的補(bǔ)充)、腦血管新生作用、神經(jīng)再生等。具體而言，作為本發(fā)明的藥物的治療效果，其實(shí)體是指組織的修復(fù)、再生，其現(xiàn)象是指組織的功能障礙的修復(fù)、再生。例如如果為腦的損傷，則治療效果的實(shí)體為浮腫的降低、軸突的再次有髓化、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增加、血管新生、神經(jīng)再生等，就現(xiàn)象而言，表現(xiàn)為腦血流的恢復(fù)、麻痹的恢復(fù)、疼痛和麻木等的輕減等。上述效果可以通過(guò)損傷組織的物理學(xué)檢查，例如X射線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲波檢查、內(nèi)窺鏡檢查、活組織檢查等進(jìn)行確認(rèn)，除此之外，也可以通過(guò)各種血液學(xué)檢查、生物化學(xué)檢查、內(nèi)分泌學(xué)檢查、運(yùn)動(dòng)功能檢查、腦功能檢查、認(rèn)知功能檢查等進(jìn)行確認(rèn)。
本發(fā)明的藥物的“幫助修復(fù)”損傷部位一般是指通過(guò)施予本發(fā)明的藥物，本劑的成分協(xié)助、支持生物的修復(fù)機(jī)制，與不施予本劑的情況下相比，促進(jìn)、增強(qiáng)損傷部位的修復(fù)，但不僅限于此，還包括抑制損傷部位的損傷擴(kuò)大化和嚴(yán)重化，抑制進(jìn)行中的損傷，以及促進(jìn)其恢復(fù)。通過(guò)本劑的施予，在損傷部位形成了良好的，適于生物的修復(fù)功能得到發(fā)揮環(huán)境。具體而言，本發(fā)明的藥物產(chǎn)生的對(duì)修復(fù)的幫助，不限定于此，例如也可以通過(guò)細(xì)胞因子的分泌、血管新生及/或組織再生而得到(參見(jiàn)圖9)。
另外，通過(guò)本發(fā)明的藥物，還可以產(chǎn)生下述各種改善，例如在伴有腎功能不全的損傷腎臟中，BUN值及/或肌酸酐值等腎功能指標(biāo)的改善；伴有胰臟朗格漢斯小島的胰島素分泌功能降低的損傷胰臟中，胰島素分泌和血糖值、血中Glu A1濃度及/或血中HbA1C濃度等糖尿病指標(biāo)的改善；在由缺血性心臟病引起的損傷心臟中，血中前列腺素D合成酶濃度及/或血中高半胱氨酸濃度等的改善；在伴有肝功能不全的損傷肝臟中，GOT值、GPT值及/或γ-GTP值等肝功能指標(biāo)的改善等。
在本發(fā)明的藥物的優(yōu)選實(shí)施方式中，對(duì)損傷部位進(jìn)行處置后施予該藥物。此處，對(duì)損傷部位進(jìn)行的處置典型地是指損傷的超急性期和急性期的處置，例如包括抑制損傷擴(kuò)大的處置和外科性修復(fù)損傷的處置等。另外，在其他的優(yōu)選實(shí)施方式中，以幫助活體所具備的自律性修復(fù)能力為目的，施予本發(fā)明的藥物。
另外，優(yōu)選在損傷的亞急性期以后施予本發(fā)明的藥物。亞急性期是指由損傷導(dǎo)致的癥狀的惡化期(超急性期和急性期)之后逐漸康復(fù)的恢復(fù)期，例如腦梗塞的情況下，是指發(fā)病后1～2個(gè)月的時(shí)間。
作為本發(fā)明的藥物中的間充質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)自從具有損傷部位的對(duì)象采集的細(xì)胞、自體的間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)使用自體細(xì)胞，可以避免排異反應(yīng)和感染等的危險(xiǎn)。另外，自體間充質(zhì)干細(xì)胞可以在損傷發(fā)生前采集，也可以在損傷發(fā)生后采集。損傷發(fā)生前采集時(shí)，由于難以預(yù)測(cè)損傷的發(fā)生，所以需要隨意地純化·增殖采集的細(xì)胞，然后通過(guò)冷凍保存等方法進(jìn)行保存。損傷發(fā)生后采集時(shí)，純化·增殖采集的細(xì)胞后，可以直接施予對(duì)象，也可以通過(guò)冷凍保存等方法進(jìn)行保存(例如利用-152℃下的超低溫冰箱)，把握時(shí)機(jī)適當(dāng)施予。另外，可以一次性施予全部的細(xì)胞，也可以保存一部分，根據(jù)需要追加施予。
需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中的用語(yǔ)“對(duì)象”是指任意的生物個(gè)體，優(yōu)選動(dòng)物、較優(yōu)選哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選人的個(gè)體。在本發(fā)明中，對(duì)象一般具有損傷部位。
也可以將本發(fā)明用于評(píng)價(jià)其體外培養(yǎng)的細(xì)胞是否為可用于生物組織的修復(fù)及再生的細(xì)胞。在實(shí)施方式之一中，本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法包括測(cè)定應(yīng)評(píng)價(jià)的細(xì)胞中特定基因的表達(dá)量的步驟。在實(shí)施方式之一中，本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法可以包括測(cè)定應(yīng)評(píng)價(jià)的細(xì)胞中表1～4中記載的基因中的至少一種的表達(dá)量的步驟。本實(shí)施方式的評(píng)價(jià)方法也可以進(jìn)一步包括將表1～4中記載的基因中的至少一種基因的表達(dá)量與其在對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行比較的步驟。
在本發(fā)明中，對(duì)照細(xì)胞可以使用下述細(xì)胞，所述細(xì)胞為由與應(yīng)評(píng)價(jià)的細(xì)胞相同供給源調(diào)制得到的、且使用異種血清培養(yǎng)的細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞中的目的基因的表達(dá)量可以在測(cè)定應(yīng)評(píng)價(jià)的細(xì)胞中的目的基因的表達(dá)量的同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，也可以預(yù)先取得。具體而言，本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法也可以進(jìn)一步包括測(cè)定對(duì)照細(xì)胞中的目的基因的表達(dá)量的步驟。
將本發(fā)明用于表2～4的B中記載的基因時(shí)，該基因?yàn)槟康幕?，?yīng)評(píng)價(jià)的細(xì)胞中的目的基因的表達(dá)量低于對(duì)照細(xì)胞中的該基因的表達(dá)量時(shí)，評(píng)價(jià)其為可以用于生物組織修復(fù)及再生的細(xì)胞。將本發(fā)明用于表2～4的A中記載的基因時(shí)，該基因?yàn)槟康幕?，?yīng)評(píng)價(jià)的細(xì)胞中的目的基因的表達(dá)量高于對(duì)照細(xì)胞中的該基因的表達(dá)量時(shí)，評(píng)價(jià)其為可以用于生物組織修復(fù)及再生的細(xì)胞。
在本發(fā)明中，基因表達(dá)量的測(cè)定可以基于mRNA的量進(jìn)行，也可以基于蛋白質(zhì)的量進(jìn)行。如上所述，“表中記載的基因”是指表中記載的由“探針組號(hào)”確定的特定基因(包括保持其基因功能的突變體。)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，由于可以根據(jù)表中的“基因名稱(chēng)”容易地理解，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地構(gòu)筑測(cè)定mRNA的量中所需序列的工具(例如引物或探針)的同時(shí)，可以容易地得到蛋白質(zhì)的量的測(cè)定中所需的抗體。另外，本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法也可以以本實(shí)施例中記載的系統(tǒng)中基因表達(dá)量的比是基線4倍以上為指標(biāo)來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法也可以包括將在應(yīng)評(píng)價(jià)細(xì)胞的同種血清存在的條件下的增殖率與異種血清存在條件下的增殖率進(jìn)行比較的步驟。本發(fā)明優(yōu)選用于來(lái)自人的細(xì)胞，在上述情況下，異種血清優(yōu)選為FBS。至今為止，已知人血清與FBS相比，促進(jìn)增殖活性明顯差，單獨(dú)使用人血清顯示不充分的促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，因此無(wú)法預(yù)測(cè)到能夠通過(guò)比較使用人血清(特別是自體血清)時(shí)的細(xì)胞增殖率與使用FBS時(shí)的細(xì)胞增殖率，評(píng)價(jià)其是否可以用于生物組織的修復(fù)及再生。
實(shí)施例 舉出以下實(shí)施例以更具體地說(shuō)明利用本發(fā)明的方法進(jìn)行的細(xì)胞增殖，及含有利用本發(fā)明的方法增殖的細(xì)胞的用于組織修復(fù)·再生的藥物，并非意指本發(fā)明的范圍受任何限定。在不脫離本發(fā)明主旨的范圍內(nèi)，在細(xì)胞培養(yǎng)及/或細(xì)胞療法領(lǐng)域中具有公知常識(shí)及技術(shù)的人員可以對(duì)其進(jìn)行各種改變。
實(shí)施例1 使用預(yù)先用微量肝素(每1mL骨髓液為0.1U)潤(rùn)濕內(nèi)壁的采血管，從腦疾病患者采集60mL骨髓液，添加到210mL培養(yǎng)基中，使總量為270mL。將含有上述骨髓液的培養(yǎng)液進(jìn)行18等分，將每15mL接種至150mm直徑的培養(yǎng)皿(IWAKI制組織培養(yǎng)皿 #3030-150)中，每個(gè)培養(yǎng)皿添加5mL培養(yǎng)基，使每個(gè)培養(yǎng)皿的總量為20mL。接種后，將這些培養(yǎng)皿靜置在不同的培養(yǎng)箱(incubator)中(每個(gè)培養(yǎng)箱放置9個(gè)培養(yǎng)皿)，在37+0.5℃、5％二氧化碳?xì)夥障逻M(jìn)行培養(yǎng)。骨髓液預(yù)先通過(guò)末梢血的檢查確認(rèn)沒(méi)有被HIV、ATL、HB、HC、梅毒、人微小病毒B19等感染。
將56.8mL來(lái)自自己末梢血的血清、5.7mL抗生素(由青霉素10,000U/mL、鏈霉素10mg/mL組成)及5.7mL谷氨酰胺(292.3mg/L)添加到500mL Dulbecco’s Modified Eagle培養(yǎng)基中來(lái)調(diào)制培養(yǎng)基，進(jìn)行過(guò)濾滅菌，分成小份，在4℃的冰箱中保管。這些培養(yǎng)基在使用前預(yù)先維持在37℃下。
在第4日，清洗附著在培養(yǎng)容器的間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，為此，用吸引的方法分離、除去培養(yǎng)基及培養(yǎng)基中浮游的血球成分，然后，使用5mL磷酸緩沖生理鹽水作為清洗液，清洗附著的間充質(zhì)干細(xì)胞表面6次。
在第8日，進(jìn)行第一繼代培養(yǎng)時(shí)，為此，在用5mL磷酸緩沖生理鹽水清洗后，為了剝離附著的干細(xì)胞，將4mL分離液(0.25％胰蛋白酶-2.21mM EDTA)添加到培養(yǎng)皿中，于37℃下溫育3分鐘，確認(rèn)剝離。將同等量的培養(yǎng)基加入到含有與皿分離后的細(xì)胞的分離液中，利用傾倒法回收全部量。將9個(gè)培養(yǎng)皿量的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至9支離心管中，通過(guò)離心分離機(jī)以800rpm離心5分鐘。除去離心分離后各離心管的上清液，加入DMEM收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞溶液再次以800rpm離心5分鐘。離心分離后，除去各離心管的上清液，加入300mL培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。將上述細(xì)胞溶液分在15個(gè)培養(yǎng)皿中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，與初代培養(yǎng)同樣地在37±0.5℃下、在二氧化碳濃度為5％中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)剩余的9個(gè)培養(yǎng)皿也進(jìn)行同樣的繼代培養(yǎng)操作。
在第13日，與上述同樣地進(jìn)行清洗、剝離、離心分離，利用血細(xì)胞計(jì)計(jì)測(cè)分成小份中的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果達(dá)到1.1×106個(gè)，所以再進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在第20日，進(jìn)行同樣的細(xì)胞數(shù)計(jì)測(cè)，結(jié)果由于細(xì)胞總數(shù)達(dá)到1.0×108，所以進(jìn)行清洗、剝離、離心分離，將其懸浮于冷凍保存液(20.5mL經(jīng)通常的過(guò)濾滅菌得到的RPMI、20.5mL從患者采集的自體血清、5mL葡聚糖、5mL DMSO)中于-150℃下進(jìn)行冷凍。細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞的比率為98％以上(CD105陽(yáng)性(陽(yáng)性率＝99.9％)、CD34陰性(陰性率＝98.8％)、CD45陰性(陰性率＝98.5％))。
比較例1 除改變?cè)嚇又懈嗡氐暮繛?mL(267U/mL)之外，在全部與實(shí)施例1同樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果示于圖1及圖2。僅添加極微量(0.1U/mL)肝素時(shí)，從培養(yǎng)開(kāi)始4日后，得到8×105個(gè)的增殖；另一方面，添加2mL肝素時(shí)，得到2×104個(gè)的增殖；因此當(dāng)肝素為微量時(shí)，得到約40倍的增殖率(圖1及圖2)。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，從培養(yǎng)開(kāi)始12日后的細(xì)胞數(shù)以添加了極微量肝素的細(xì)胞計(jì)增加至1.4×107個(gè)；另一方面，添加了2mL肝素的細(xì)胞為2.9×106個(gè)(圖1)。上述結(jié)果表明，肝素的添加對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制效果的同時(shí)，確認(rèn)即使在抗凝劑的添加量為極微量或?qū)嵸|(zhì)上不添加時(shí)，仍可以利用本發(fā)明的方法使細(xì)胞迅速地增殖，這些結(jié)果進(jìn)而表明，通過(guò)使試樣中肝素的量為極微量，得到顯著的增殖率的改善。
比較例2 除使用FBS代替來(lái)自人末梢血的血清之外，在全部與實(shí)施例1同樣的條件下培養(yǎng)8天。通過(guò)細(xì)胞數(shù)計(jì)測(cè)進(jìn)行的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度的比較示于圖3。在本發(fā)明的條件下培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，使用人的成人血清時(shí)，與使用FBS的情況相比，從培養(yǎng)開(kāi)始5日后得到約2.6倍的增殖率，8日后得到約6倍的增殖率。上述結(jié)果表明，在人骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)中，通過(guò)使試樣中肝素的量為極微量，使用人的成人血清，得到高于FBS的增殖率。
比較例3 使用大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將肝素分別以1U/mL、10U/mL、100U或1000U/mL添加到與實(shí)施例1同樣的培養(yǎng)基中，對(duì)從大鼠的2只大腿骨采集的骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。除使用FBS代替來(lái)自人末梢血的血清之外，在全部與實(shí)施例1同樣的條件進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果示于圖4。結(jié)果表明培養(yǎng)基中的肝素濃度越高，對(duì)增殖的抑制效果變得越高。
比較例4 使用大鼠間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。第1組用4mL DMEM從大鼠的1只大腿骨中擠出骨髓液，得到合計(jì)略大于4mL的試樣。將上述試樣加入到36mL添加了160U肝素的DMEM中，開(kāi)始培養(yǎng)。培養(yǎng)基中的肝素濃度為4U/mL。第2組用4mL添加了160U肝素的DMEM，從大鼠的1只大腿骨中擠出骨髓液，得到合計(jì)略大于4mL的試樣。將上述試樣在直接暴露于高濃度肝素的狀態(tài)下于室溫下放置5分鐘后，加入36mL DMEM，開(kāi)始培養(yǎng)。培養(yǎng)基中的肝素濃度為4U/mL。上述兩組的細(xì)胞數(shù)的變化示于圖5。在第2組中，與第1組相比，觀察到顯著的增殖率的降低。上述結(jié)果暗示試樣采集時(shí)(或進(jìn)行培養(yǎng)前)添加肝素到細(xì)胞試樣中的情況與添加肝素到培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基中的情況相比，細(xì)胞的增殖效率降低。
實(shí)施例2 除代替DMEM使用αMEM培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基之外，在全部與實(shí)施例1同樣的條件進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果示于圖6。確認(rèn)了在使用αMEM培養(yǎng)基時(shí)，也通過(guò)抑制肝素的量，利用人血清得到比FBS迅速的增殖。
比較例5 除培養(yǎng)基中不含有谷氨酰胺之外，全部與實(shí)施例1同樣地培養(yǎng)7天。通過(guò)細(xì)胞數(shù)計(jì)測(cè)得到的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖速度的比較示于圖7。從培養(yǎng)開(kāi)始1周后，觀察到使用谷氨酰胺時(shí)比缺乏谷氨酰胺時(shí)增殖率約為1.6倍。上述結(jié)果表明，為了間充質(zhì)干細(xì)胞迅速的增殖，需要添加谷氨酰胺。
實(shí)施例3 〔方法〕 采集大鼠的3只大腿骨，分別用DMEM(5ml)洗出骨髓細(xì)胞，添加下述物質(zhì)調(diào)制3組樣品。
(i)DMEM(5ml) (ii)DMEM(5ml)+添加2μl肝素 (iii)DMEM(5ml)+添加2μl肝素+2μl魚(yú)精蛋白用DMEM清洗各樣品，將其加入到10mL培養(yǎng)液(DMEM+10％FBS+1％青霉素/鏈霉素+2mM L-谷氨酰胺)中，將其接種至10cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)14天。繼代培養(yǎng)在細(xì)胞密度超過(guò)5,500個(gè)/cm2的時(shí)點(diǎn)下進(jìn)行。
〔結(jié)果〕 如圖8所示，不經(jīng)過(guò)肝素處理的細(xì)胞與經(jīng)過(guò)肝素處理的細(xì)胞相比，初期量多、增殖率也高，在上述情況下培養(yǎng)8～11日時(shí)顯著。另外，加入了作為抑制肝素活性的物質(zhì)的魚(yú)精蛋白的細(xì)胞，與經(jīng)過(guò)肝素處理的細(xì)胞同樣地初期量與增殖率均低。
實(shí)施例4 細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不與肝素接觸的狀態(tài)、即在低濃度的肝素條件下，將自體血清培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與FBS培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較。
[cDNA的合成及純化] 將按照實(shí)施例1的方法得到的在含有自己血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與按照比較例2的方法得到的在含有FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞分別調(diào)節(jié)至1×107細(xì)胞/樣品，利用RNeasy Protect Min試劑盒(QIGEN，Cat.No.74124)從其中分別提取總RNA。使用QIA shredder(QIAGEN，Cat.No.79654)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壞。將得到的RNA溶液調(diào)節(jié)至0.5μg/μl，使用安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技)，檢查RNA的質(zhì)量。
利用基因芯片真核聚-A RNA對(duì)照試劑盒(AFFYMETRIX，P/N900433)及MessageAmpII-生物素增強(qiáng)試劑盒(Ambion，目錄#1791)，合成第一鏈cDNA。具體而言，向在70℃下反應(yīng)10分鐘的反應(yīng)溶液(I)中加入反應(yīng)溶液(II)，在20μl的反應(yīng)體系中于42℃使之反應(yīng)2小時(shí)。
反應(yīng)溶液(I) 總RNA(0.5μg/μl) 2μl 稀釋的聚-A RNA對(duì)照 2μl T7-寡(dT)引物，50μM1μl 不含核糖核酸酶的水 7μl 合計(jì)10μl 反應(yīng)溶液(II) 10倍濃縮的第一鏈緩沖液 2μl dNTP混合物 4μl 核糖核酸酶抑制劑 1μl ArrayScript 1μl 合計(jì) 8μl 然后，利用MessageAmpII-生物素增強(qiáng)試劑盒(Ambion，目錄#1791)，合成及純化第二鏈cDNA。具體而言，將反應(yīng)溶液(III)加入反應(yīng)后的反應(yīng)溶液(II)中在100μl的反應(yīng)體系中于16℃使之反應(yīng)2小時(shí)，使用附屬于試劑盒的cDNA筒式過(guò)濾器，最終將24μl不含核酸酶的水分2次添加到過(guò)濾器中，將其溶出，由此純化cDNA。
反應(yīng)溶液(III) 不含核酸酶的水 63μl 10倍稀釋的第二鏈緩沖液 10μl dNTP混合物 4μl DNA聚合酶2μl 核糖核酸酶H 1μl 合計(jì) 80μl [IVT反應(yīng)] 利用MessageAmpII-生物素增強(qiáng)試劑盒(Ambion，目錄#1791)，進(jìn)行IVT反應(yīng)及aRNA的純化。具體而言，使反應(yīng)溶液(IV)在37℃下反應(yīng)14小時(shí)后，加入60μl不含核酸酶的水停止反應(yīng)，利用附屬于試劑盒的aRNA筒式過(guò)濾器，最終將100μl不含核酸酶的水添加到過(guò)濾器中，將其溶出，由此純化aRNA。將得到的RNA溶液調(diào)節(jié)至20μg/32μl，利用安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技)，檢查RNA的質(zhì)量。
(反應(yīng)溶液IV) 雙鏈cDNA 20μl 生物素-NTP混合物 12μl T7 10倍濃縮的反應(yīng)緩沖液 4μl T7酶混合物 4μl 總計(jì) 40μl [雜交混合物的調(diào)制] 利用MessageAmpII-生物素增強(qiáng)試劑盒(Ambion，目錄#1791)，將aRNA進(jìn)行片段化，調(diào)制雜交混合物。具體而言，使反應(yīng)溶液(V)在94℃下反應(yīng)35分鐘后，利用基因芯片表達(dá)3’-擴(kuò)增試劑雜交對(duì)照試劑盒(AFFYMETRIX，P/N900454)調(diào)制雜交混合物，在99℃下使之反應(yīng)5分鐘后，在45℃下使之反應(yīng)5分鐘。
(反應(yīng)溶液V) aRNA(20μg/32μl) 32μl 5倍濃縮的片段分析緩沖液 8μl 總計(jì) 40μl (雜交混合物) cRNA片段 30μl 對(duì)照寡核苷酸B2 5μl 20倍濃縮的真核生物雜交對(duì)照 15μl 鯡魚(yú)精子DNA(10mg/ml) 3μl BSA(50mg/ml) 3μl 2倍濃縮的雜交混合物* 150μl DMSO 30μl 水 64μl 總計(jì) 300μl *雜交緩沖液(1×濃縮；100mM MES，0.1M[Na+]，20mM EDTA，0.01％ Tween-20) [雜交] 將基因芯片人基因組U133 Plus 2.0 Array(AFFYMETRIX，P/N900466)用1×雜交緩沖液充滿，在60rpm、45℃的條件下進(jìn)行雜交10分鐘。之后，除去1×雜交緩沖液，用調(diào)制得到的雜交混合物將其充滿，在60rpm、45℃的條件下雜交一夜。
[清洗及染色] 將清洗緩沖液A(6×SSPE，0.01％ Tween-20)、清洗緩沖液B(100mM MES，0.1M[Na+]，0.05％ Tween-20)及水裝載在洗滌工作站(Fluidics Station)上，通過(guò)GCOS(基因芯片操作軟件)的程序進(jìn)行初始化。然后，除去雜交混合物，將用清洗緩沖液A充滿的序列以及SAPE混合溶液(1×染色劑緩沖液，2mg/ml BSA，10μg/ml SAPE)及抗體混合溶液(1×染色劑緩沖液，2mg/ml BSA，0.1mg/ml Goat IgG儲(chǔ)備液，3μg/ml生物素標(biāo)記抗體)裝載在洗滌工作站上。之后，通過(guò)GCOS的程序進(jìn)行清洗及染色。
[掃描] 將序列設(shè)置在基因序列掃描儀中，進(jìn)行掃描及解析。
解析結(jié)果示于表1～4。
[表1] 細(xì)胞表面抗原(CD抗原)的表達(dá)
[表2] 增殖因子相關(guān)因子的表達(dá) A、增加的基因組
B、減少的基因組
[表3] 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá) A、增加的基因組
B、減少的基因組
[表4] 表達(dá)量上差2倍以上的基因組 A、增加的基因組
B、減少的基因組
[結(jié)果] 表1中給出了在FBS培養(yǎng)細(xì)胞和自體血清培養(yǎng)細(xì)胞中5種情況下共同增減的細(xì)胞表面抗原。表2中列舉了5種情況下共同表現(xiàn)增減的生長(zhǎng)因子相關(guān)因子。另外，表3中給出了在5種情況下共同表現(xiàn)增減的細(xì)胞因子。進(jìn)而，表4中給出5種情況下在表達(dá)量上共同具有2倍以上差的基因組。
如表1所示，可知對(duì)于自體血清培養(yǎng)細(xì)胞，F(xiàn)BS培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的分化標(biāo)志物CD24不表達(dá)，表明維持更加未分化的狀態(tài)。另外，如表2～4所示，可知自體血清培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)一系列的增殖因子，某些增殖因子與FBS培養(yǎng)細(xì)胞相比，表達(dá)有增加。進(jìn)而，本分析的結(jié)果確認(rèn)對(duì)于自體血清培養(yǎng)細(xì)胞，一系列的癌相關(guān)基因組的表達(dá)低、因此高度安全。
由以上確認(rèn)對(duì)于本發(fā)明的自體血清培養(yǎng)方法，可以不使用FBS，以高的增殖效率培養(yǎng)細(xì)胞，并且可以得到更安全且具有高分化能力的細(xì)胞。
實(shí)施例5 患者(52歲、男性)因缺血性神經(jīng)疾病(腦梗塞右內(nèi)頸動(dòng)脈閉塞)而于2007年2月4日引發(fā)左半身麻痹，于同年2月19日轉(zhuǎn)院至札幌醫(yī)科大學(xué)附屬病院。作為治療前的癥狀，包括左半身麻痹、特別是上肢感到強(qiáng)烈的麻痹；完全無(wú)法打開(kāi)或握緊拳；無(wú)法握緊或松開(kāi)物體(積木等)；無(wú)法將手臂舉到高于肩的位置；也無(wú)法彎曲或伸展手臂。如實(shí)施例1中記載從上述患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞使之增殖，在其全部中加入冷凍保存液(20.5mL經(jīng)通常的過(guò)濾滅菌得到的RPMI和20.5mL從患者采集的自體血清、5mL葡聚糖、5mL DMSO)，制造治療藥。需要說(shuō)明的是，預(yù)先通過(guò)末梢血的檢查，確認(rèn)骨髓液沒(méi)有被HIV、ATL、HB、HC、梅毒、人微小病毒B19等感染。將上述治療藥于3月19日靜脈內(nèi)施予上述患者30分鐘。確認(rèn)完全沒(méi)有副作用。
結(jié)果 上述患者在細(xì)胞治療前全部5個(gè)左手指患有運(yùn)動(dòng)功能障礙，但施予細(xì)胞的次日早晨完全無(wú)法運(yùn)動(dòng)的左手手指變得可以活動(dòng)，可以握緊或打開(kāi)拳。1周后發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能改善，變得可以靠拐杖運(yùn)動(dòng)。2周后，通過(guò)MRI確認(rèn)腦梗塞顯著縮小(圖10)。另外，握緊或打開(kāi)拳變得更迅速，也可以握緊或松開(kāi)積木。也變得可以將手臂舉到高于肩的位置，可以作出“萬(wàn)歲”的姿勢(shì)(將雙臂伸向空中)。還變得可以彎曲或伸展肘及手臂。細(xì)胞治療前后的過(guò)程中，采用用于評(píng)價(jià)腦梗塞的公知的等級(jí)(NIHSS美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所腦卒中等級(jí)、JSS日本腦卒中學(xué)會(huì)腦卒中等級(jí)、MRS校正等級(jí))將上述患者的腦梗塞水平的變化示于圖11。
圖10為上述患者的腦MRI圖像。觀察到右大腦的腦梗塞處被損傷的部位(白色部分)縮小。另外，圖12為相同患者的腦血流圖像，確認(rèn)治療1周后，損傷部位處的腦血流恢復(fù)。與上述運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)一同，上述結(jié)果證實(shí)，通過(guò)施予本藥劑，顯示出亞急性期以后顯著的改善效果。與上述運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)一同，上述結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的藥物的施予對(duì)亞急性期以后的腦梗塞顯示出顯著的改善效果。
實(shí)施例6 患者(50多歲、女性)長(zhǎng)期患有自發(fā)性Willis環(huán)閉塞癥(煙霧病)，由此引發(fā)左半身麻痹。與實(shí)施例1同樣地從上述患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)病開(kāi)始到約2個(gè)月后對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。通過(guò)施予后進(jìn)行的MRI(PWI)檢查，確認(rèn)腦血流改善。
實(shí)施例7 患者(60多歲、男性)因動(dòng)脈粥樣硬化血栓癥而引發(fā)左半身麻痹。與實(shí)施例1同樣地從上述患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)病開(kāi)始到4個(gè)月后對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果確認(rèn)，從施予次日開(kāi)始硬直緩和和關(guān)節(jié)可活動(dòng)的區(qū)域擴(kuò)大，之后肌力的恢復(fù)顯著，也可以進(jìn)行握力的計(jì)測(cè)(4kg)。進(jìn)而，從施予開(kāi)始約2個(gè)月半后可以獨(dú)立行走，左手也恢復(fù)到可以實(shí)際使用的水平。
實(shí)施例8 患者(50多歲、男性)因動(dòng)脈粥樣硬化血栓癥而引發(fā)左半身麻痹。與實(shí)施例1同樣地從上述患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)病開(kāi)始到6周后對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果表明，從施予次日開(kāi)始手指的活動(dòng)改善，之后肌力的恢復(fù)顯著，也可以進(jìn)行握力的計(jì)測(cè)(8kg)。另外，能更快地進(jìn)行更細(xì)致的操作，也恢復(fù)了指尖的力量如可以分開(kāi)筷子等，可以進(jìn)行日常生活中有用的動(dòng)作。
實(shí)施例9 患者(60多歲、男性)因動(dòng)脈粥樣硬化血栓癥而引發(fā)左半身麻痹。與實(shí)施例1同樣地從上述患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)病開(kāi)始到5周后對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果表明，施予當(dāng)日的晚上，主要發(fā)現(xiàn)下肢運(yùn)動(dòng)改善；施予次日，甚至發(fā)現(xiàn)手的運(yùn)動(dòng)改善。之后運(yùn)動(dòng)功能繼續(xù)改善。
實(shí)施例10 患者(70多歲、男性)因腔隙性腦梗死而引發(fā)左半身麻痹及言語(yǔ)不清。與實(shí)施例1同樣地從上述患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)病開(kāi)始到8周后對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果確認(rèn)從施予的次日早晨，腳趾變得可以活動(dòng)，肩和肘的活動(dòng)也有改善。然后，從施予3日后，恢復(fù)到手指可以活動(dòng)的程度。
實(shí)施例11 與實(shí)施例1同樣地從慢性糖尿病患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施予前約為190mg/dl左右的血糖值在施予后約1個(gè)月達(dá)到正常值，得到改善，除此之外，其他糖尿病指標(biāo)也有顯著的改善(圖13)。
實(shí)施例12 與實(shí)施例1同樣地從前列腺增生患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為前列腺增生指標(biāo)的PSA值與施予前相比，施予后有顯著的改善(圖14)。
實(shí)施例13 與實(shí)施例1同樣地從肝障礙患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為肝障礙指標(biāo)的γ-GTP值、GOT值、GPT值與施予前相比，施予后有顯著的改善(圖15)。
實(shí)施例14 與實(shí)施例1同樣地從腎障礙患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)一同患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為腎障礙指標(biāo)的β2-微球蛋白值與施予前相比，施予后有顯著的改善，除此之外，其他腎障礙指標(biāo)(BUN值及/或肌酸酐值)也有顯著的改善(圖16)。
實(shí)施例15 與實(shí)施例1同樣地從高脂血癥患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為高脂血癥指標(biāo)的中性脂肪值與施予前相比，施予后有顯著的改善，除此之外，其他高脂血癥指標(biāo)也有顯著的改善(圖17)。
實(shí)施例16 與實(shí)施例1同樣地從高級(jí)腦功能障礙/失語(yǔ)癥患者采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)同一患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施予。施予前后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)失語(yǔ)癥檢查(SLTA)和韋克斯勒成人智力檢查(WAIS-R)。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)與施予前相比，SLTA及WAIS-R的值有有意義的改善(圖18)。
實(shí)施例17 與實(shí)施例1同樣地從健康人采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)大鼠腦梗塞模型(大腦中動(dòng)脈閉塞模型)調(diào)制上述人間充質(zhì)干細(xì)胞。然后，分成下述組，進(jìn)行治療，所述組包括(i)非移植組、(ii)細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(iii)導(dǎo)入血管生成素基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(iv)導(dǎo)入VEGF基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組、(v)導(dǎo)入血管生成素和VEGF基因的細(xì)胞(1.0×106)靜注組，對(duì)治療效果進(jìn)行比較研究。利用MRI評(píng)價(jià)治療效果的結(jié)果(圖19A)發(fā)現(xiàn)(ii)、(iii)、(v)組中有治療效果，其治療效果的強(qiáng)弱為(v)＞(iii)＞(ii)。
另外，在血管新生方面分析治療效果的結(jié)果(圖19B)發(fā)現(xiàn)(ii)、(iii)、(iv)、(v)組中有治療效果，其治療效果的強(qiáng)弱為(v)＞(iii)＞(iv)＞(ii)。
另外，在行為學(xué)方面采用踏車(chē)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)分析治療效果的結(jié)果(圖20)發(fā)現(xiàn)(ii)、(iii)、(v)組中有治療效果，其治療效果的強(qiáng)弱為(v)＞(iii)＞(ii)。
實(shí)施例18 與實(shí)施例1同樣地從健康人采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)大鼠心肺停止模型靜脈內(nèi)施予上述人間充質(zhì)干細(xì)胞(1.0×106)，判定治療效果。通過(guò)治療，凋亡被抑制(Tunnel陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)減少)(圖21)，存活的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量也多(圖22)。另外采用水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)腦高級(jí)功能的結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組中有改善。
實(shí)施例19 與實(shí)施例1同樣地從健康人采集間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)經(jīng)椎板切除的大鼠脊髓(Th 11)使用NYU impactor，制成脊髓損傷模型，在6小時(shí)后、1日后、3日后、7日后、14日后將上述人間充質(zhì)干細(xì)胞(1.0×106)通過(guò)大腿靜脈進(jìn)行移植，采用踏車(chē)試驗(yàn)進(jìn)行經(jīng)時(shí)的運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)。即，在設(shè)計(jì)成以20米/分鐘運(yùn)動(dòng)，對(duì)停止運(yùn)動(dòng)的大鼠進(jìn)行電擊的踏車(chē)上，對(duì)形成腦梗塞前的大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，使之1周運(yùn)動(dòng)2日、1日運(yùn)動(dòng)20分鐘，將各組中的經(jīng)時(shí)恢復(fù)的程度制成曲線圖。橫軸為時(shí)間、縱軸為最大速度。發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后、6小時(shí)后及1日后移植的組中，有明顯的治療效果(圖23)。
以本說(shuō)明書(shū)中引用的全部發(fā)行物、專(zhuān)利及專(zhuān)利申請(qǐng)直接作為參考引入本說(shuō)明書(shū)中。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性 本發(fā)明可以迅速提供一種對(duì)組織的修復(fù)·再生顯示出顯著效果的治療藥。上述治療藥提供的迅速化，特別對(duì)早期的細(xì)胞療法為有效的疾病，例如腦神經(jīng)受到損傷的患者的腦神經(jīng)再生等具有非常大的效果，進(jìn)而，緩解細(xì)胞提供者的不足及身體的負(fù)擔(dān)。利用本發(fā)明的方法制造的藥物不僅作為治療藥的效果是顯而易見(jiàn)的，而且由于通過(guò)迅速地進(jìn)行提供，擴(kuò)大治療效果，從而顯著地改善患者的生活質(zhì)量(QOL)，同時(shí)也減輕護(hù)理者的負(fù)擔(dān)及護(hù)理費(fèi)用，所以也有利于減輕社會(huì)的負(fù)擔(dān)，對(duì)老齡化社會(huì)作出貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種使細(xì)胞增殖的方法，是將從活體采集的試樣中的細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)使之增殖的方法，所述方法包括在含有同種血清(包括自體和異體)的培養(yǎng)基中，在實(shí)質(zhì)上不與抗凝劑接觸的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述同種血清被檢驗(yàn)出對(duì)血清癌標(biāo)志物及/或感染因子為陰性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，同種血清為采集細(xì)胞的受試者自體血清。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，血清癌標(biāo)志物為選自鐵蛋白、CEA、AFP、BFP、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、STN、DUPAN-2、SLX、ST-439、SPAN-1、SCC、PSA、G-精漿蛋白、TPA、CYFRA、PAP、NSE、C肽、PIVKA、Pro-GRP、HCGβ、彈性蛋白酶、β2微球蛋白、S-NTX、抗p53抗體、HER2中的1種或2種以上。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，感染因子為選自HIV、ATL、HB、HC、梅毒、人微小病毒B19中的1種或2種以上。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使添加到采集的試樣中的抗凝劑的量相對(duì)于所述試樣的容積小于5U/mL。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基中的抗凝劑的量小于0.5U/mL。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，抗凝劑為肝素、肝素衍生物或它們的鹽。
8.如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，培養(yǎng)基中的血清含量為1～20容積％。
9.如權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，細(xì)胞為干細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，細(xì)胞為人細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下增殖。
13.如權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞的密度達(dá)到5,500個(gè)/cm2以上的時(shí)點(diǎn)下使之進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
14.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，每周至少更換一次培養(yǎng)基。
15.如權(quán)利要求1～14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，反復(fù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞的總數(shù)達(dá)到100,000,000個(gè)以上。
16.一種離體培養(yǎng)的人細(xì)胞，所述細(xì)胞是利用權(quán)利要求1～15中任一項(xiàng)所述的方法增殖的細(xì)胞，其特征在于，CD24不表達(dá)。
17.一種離體培養(yǎng)的人細(xì)胞，所述細(xì)胞是利用權(quán)利要求1～15中任一項(xiàng)所述的方法增殖的細(xì)胞，其特征在于，表1記載的陽(yáng)性CD抗原組中的至少90％表達(dá)，并且陰性CD抗原組中的至少90％不表達(dá)。
18.如權(quán)利要求16或17所述的離體培養(yǎng)的人細(xì)胞，其特征在于，由下述基因組成的基因組中的任一種基因均不異常表達(dá)，所述基因包括EWI-FLI-1、FUS-CHOP、EWS-ATF1、SYT-SSX1、PDGFA、FLI-1、FEV、ATF-1、WT1、NR4A3、CHOP/DDIT3、FUS/TLS、BBF2H7、CHOP、MDM2、CDK4、HGFR、c-met、PDGFα、HGF、GFRA1、FASN、HMGCR、RGS2、PPARγ、YAP、BIRC2、lumican、鈣調(diào)結(jié)合蛋白、ALCAM、Jam-2、Jam-3、鈣粘蛋白II、DKK1、Wnt、核干細(xì)胞因子、神經(jīng)纖維瘤蛋白、RB、CDK4、p16、MYCN、端粒、hTERT、ALT、Ras、TK-R、CD90、CD105、CD133、VEGFR2、CD99、ets、ERG、ETV1、FEV、ETV4、MYC、EAT-2、MMP-3、FRINGE、ID2、CCND1、TGFBR2、CDKNIA、p57、p19、p16、p53、IGF-1、c-myc、p21、細(xì)胞周期蛋白D1、p21。
19.一種制造組織修復(fù)再生用藥物的方法，所述方法是利用權(quán)利要求16～18中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞制造組織修復(fù)再生用藥物。
20.一種組織修復(fù)再生用藥物，所述藥物含有權(quán)利要求16～18中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物，其中，細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，所述藥物經(jīng)靜脈內(nèi)施予、腰椎穿刺施予、腦內(nèi)施予、腦室內(nèi)施予、局部施予或動(dòng)脈內(nèi)施予，用于幫助損傷部位的修復(fù)或者因年齡增長(zhǎng)而導(dǎo)致的老化部位的修復(fù)。
22.如權(quán)利要求21所述的藥物，所述藥物在疾病或障礙的亞急性期以后進(jìn)行施予。
23.如權(quán)利要求22所述的藥物，其中，通過(guò)細(xì)胞因子的分泌、血管新生及/或神經(jīng)再生來(lái)幫助損傷部位的修復(fù)。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中，損傷部位為腎臟。
25.如權(quán)利要求24所述的藥物，其中，幫助修復(fù)伴有BUN值及/或肌酸酐值及/或β2微球蛋白值的改善。
26.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中，損傷部位為胰臟。
27.如權(quán)利要求26所述的藥物，其中，幫助修復(fù)伴有血糖值、血中Glu A1濃度及/或血中HbA1C濃度的改善。
28.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中，損傷部位為心臟。
29.如權(quán)利要求28所述的藥物，其中，幫助修復(fù)伴有血中前列腺素D合成酶濃度及/或血中高半胱氨酸濃度的改善。
30.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中，損傷部位為肝臟。
31.如權(quán)利要求30所述的藥物，其中，幫助修復(fù)伴有GOT值、GPT值及/或γ-GTP值的改善。
32.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中，損傷部位為腦。
33.如權(quán)利要求32所述的藥物，其中，幫助修復(fù)伴有SLTA值及/或WAIS-R值的改善。
34.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中，損傷部位為前列腺。
35.如權(quán)利要求34所述的藥物，其中，幫助修復(fù)伴有PSA值的改善。
36.如權(quán)利要求22或23所述的藥物，其中，疾病或障礙為腎障礙、肝障礙、包括糖尿病的胰臟障礙、前列腺增生、高脂血癥、包括失語(yǔ)癥及癡呆的高級(jí)腦功能障礙、復(fù)蘇后腦病、心臟疾病及脊髓損傷中的任一種。
37.一種試劑盒，是用于調(diào)制權(quán)利要求16～18中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括填充了培養(yǎng)基的容器，所述培養(yǎng)基中含有小于0.5U/mL的抗凝劑。
38.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中，抗凝劑為肝素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于活體組織的修復(fù)·再生的安全且有效的藥物，涉及一種使從活體采集的細(xì)胞在體外迅速且大量地增殖的方法。具體而言，本發(fā)明涉及將從活體采集的試樣中的細(xì)胞在含有同種血清(包括自體和異體)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)使之增殖的方法，所述同種血清優(yōu)選預(yù)先被檢驗(yàn)出對(duì)血清癌標(biāo)志物及/或感染因子為陰性，且添加到采集的試樣中的抗凝劑(例如肝素或肝素衍生物或它們的鹽等)的量相對(duì)于該試樣的容積小于5U/mL，或者使開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基中的抗凝劑的量小于0.5U/mL。本發(fā)明還涉及該方法的利用。
文檔編號(hào)C12N5/074GK101802174SQ20088010658
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2008年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者本望修, 寶金清博 申請(qǐng)人:北海道公立大學(xué)法人札幌醫(yī)科大學(xué)