專利名稱：：高保真度限制性內(nèi)切核酸酶的制作方法高保真度限制性內(nèi)切核酸酶
背景技術(shù)：
：限制性內(nèi)切核酸酶是以序列特異性方式切割雙鏈DNA的酶(Roberts，R.J.，ProcNatlAcadSciUSA,1025905-5908(2005)；Roberts,etal.,NucleicAcidsRes,311805-1812(2003)；Roberts,etal.，NucleicAcidsRes,33:D230-232(2005)；Alves,etal.,RestrictionEndonucleases,"ProteinEngineeringofRestrictionEnzymes,，，ed.Pingoud,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,NewYork,393-407(2004))。它們?cè)谠松镏惺瞧毡榇嬖诘?Raleigh，etal.，BacterialGenomesPhysicalStructureandAnalysis,Ch.8,eds.DeBruijin,etal.,Chapman&Hall,NewYork,78-92(1998))，其中它們形成限制修飾系統(tǒng)的一部分，其主要由內(nèi)切核酸酶和甲基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成。同源的(cognate)甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化與其配對(duì)內(nèi)切核酸酶識(shí)別的序列相同的特異性序列，并賦予被修飾DNA對(duì)內(nèi)切核酸酶切割的抗性，以便宿主DNA可以被恰當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)。然而，當(dāng)存在外源DNA侵入時(shí)，特別是噬菌體DNA侵入時(shí)，外源DNA將在其可被完全甲基化之前降解。限制修飾系統(tǒng)的主要生物功能是保護(hù)宿主免于噬菌體感染(Arber，Science，205:361-365(1979))。其他的功能也已被提出，例如涉及重組和轉(zhuǎn)座(Carlson,etal.，MolMicrobiol,27671-676(1998)；Heitman,GenetEng(NY)，15:57_108(1993)；McKane,etal.，Genetics,139:35_43(1995))。大約3，000種已知的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)它們的超過(guò)250種不同靶序列的特異性可以被考慮為它們最令人感興趣的特性。在發(fā)現(xiàn)第一種限制性內(nèi)切核酸酶的序列特異性性質(zhì)(Danna,etal.，ProcNatlAcadSciUSA,68:2913_2917(1971)；Kelly,etal.，JMolBiol，51:393-409(1970))之后，科學(xué)家們沒(méi)有花費(fèi)太長(zhǎng)時(shí)間發(fā)現(xiàn)了某些限制性內(nèi)切核酸酶在非最適條件下切割與其限定識(shí)別序列相似但不相同的序列(Polisky，etal.,ProcNatlAcadSciUSA,723310-3314(1975)；Nasri,etal.,NucleicAcidsRes,14811-821(1986))。該松弛的特異性(relaxedspecificity)被稱為限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性(staractivity)。已提出，限制性內(nèi)切核酸酶和DNA之間水介導(dǎo)的相互作用是特異性復(fù)合物和星復(fù)合物(starcomplexes)之間的主要差異(Robinson，etal.，JMolBiol，234:302-306(1993)；Robinson,etal.,ProcNatlAcadSciUSA，92:3444_3448(1995)，Sidorova,etal.，BiophysJ,872564-2576(2004))星號(hào)活性是分子生物學(xué)反應(yīng)中的問(wèn)題。星號(hào)活性在克隆載體或其他DNA中引入不希望的切割。在例如法醫(yī)應(yīng)用的情況中，在這種情況下某些DNA底物需要被限制性內(nèi)切核酸酶切割以產(chǎn)生獨(dú)特的指紋圖譜，星號(hào)活性將改變切割圖案特性，從而使分析復(fù)雜化。避免星號(hào)活性在例如鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(Walker,etal.,ProcNatlAcadSciUSA,89392-396(1992))和基因表達(dá)的系列分析(Velculescu,etal.，Science,270484-487(1995))的應(yīng)用中也是關(guān)鍵的。發(fā)明_既述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供組合物，所述組合物包含具有至少一個(gè)人工引入突變和至少2的總保真度指數(shù)(FI)改進(jìn)因子(overallfidelityindeximprovementfactor)的限制性內(nèi)切核酸酶，在預(yù)定的緩沖液中所述限制性內(nèi)切核酸酶能以與不存在所述人工引入突變的限制性內(nèi)切核酸酶的切割活性至少相似的切割活性切割底物，所述人工引入突變是靶向突變、飽和誘變或通過(guò)PCR擴(kuò)增過(guò)程引入的突變的至少一個(gè)的產(chǎn)物。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，人工引入突變中的至少一個(gè)是靶向突變，其是由用帶相反電荷的殘基置換天然存在的殘基產(chǎn)生的。丙氨酸或苯丙氨酸可以置換靶位點(diǎn)處的天然存在的殘基。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，上面描述類型的組合物包括選自下列的不存在人工引入突變的限制酶BamHI,EcoRI、Seal、Sail、SphI,PstI、NcoI,NheI,Sspl、NotI,SacI、PvuII、MfeI、HindIII、SbfI、EagI、EcoRV、AvrII、BstXI、PciI、HpaI、AgeI、BsmBI、BspQI、SapI、KpnI禾口BsaI。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式包括在表4中列出的組分。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供編碼在表4中列出的酶的任一種的DNA，包含該DNA的載體和從該載體表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供具有下列步驟的方法(a)鑒定在具有星號(hào)活性的限制性內(nèi)切核酸酶的氨基酸序列中，哪些氨基酸殘基是帶電荷的氨基酸；(b)在編碼該限制性內(nèi)切核酸酶的基因序列中，突變編碼一個(gè)或更多個(gè)帶電荷的殘基的一個(gè)或更多個(gè)密碼子；(c)產(chǎn)生在不同的帶電荷的殘基具有一個(gè)或更多個(gè)不同密碼子突變的基因序列文庫(kù)；(d)獲得突變的基因序列表達(dá)的蛋白質(zhì)組(asetofproteins)；和(e)測(cè)定每一表達(dá)蛋白質(zhì)在預(yù)定緩沖液中的FI和切割活性。該方法的一個(gè)實(shí)施方式包括在限定的緩沖液組中對(duì)屬于該蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)測(cè)定總FI改進(jìn)因子的步驟，其中例如，緩沖液組包含NEB1、NEB2、NEB3和NEB4緩沖液。該方法的一個(gè)實(shí)施方式包括上面描述的步驟和另外地，在突變帶電荷的氨基酸的密碼子的同一步驟或隨后步驟中，突變編碼羥化氨基酸或酰胺氨基酸的密碼子。在上面描述的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將除了酪氨酸以外的密碼子突變?yōu)楸彼?，將酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷Ｔ谝粋€(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用對(duì)一個(gè)或更多個(gè)突變密碼子的飽和誘變，改進(jìn)總FI改進(jìn)因子。附圖簡(jiǎn)述對(duì)于圖1-32*標(biāo)記表示其左側(cè)的泳道含有最低濃度的觀察到星號(hào)活性的酶。#標(biāo)記指示出不完全切割的泳道，該泳道與含有足夠完全切割底物的濃度的酶的泳道相鄰并位于其右側(cè)?；疑切伪硎鞠拗菩詢?nèi)切核酸酶濃度的連續(xù)減少(serialdecrease)0“U”表示酶單位。在圖1-32中描述的每一反應(yīng)中，反應(yīng)混合物含有3μ1體積的——除非另外規(guī)定-來(lái)自NewEnglandBiolabs,Inc.(NEB)，Ipswich，MA的緩沖液(參見(jiàn)表1和NEB目錄)，3μ1體積的——除非另外規(guī)定——來(lái)自NEB，Ipswich，MA的稀釋劑中的指定限制性內(nèi)切核酸酶(參見(jiàn)表1和NEB目錄)，以及不定體積的指定底物(含有0.6μg)和使反應(yīng)混合物達(dá)到總共30μ1的體積的水。在37°C下進(jìn)行反應(yīng)，溫育時(shí)間為1小時(shí)。在0.8%瓊脂糖凝膠上分析結(jié)果。當(dāng)反應(yīng)混合物總體積、底物量、反應(yīng)溫度或溫育時(shí)間與上述不同時(shí)，在圖的說(shuō)明中提供數(shù)值。在圖1、5、8、11_18和20_32中，在凝膠的右側(cè)提供理論消化圖譜。那些僅具有一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的底物應(yīng)該從超螺旋形式消化為一個(gè)線性帶。圖1顯示通過(guò)在NEB3緩沖液中使用稀釋劑A對(duì)WTScaI(1，200U)制劑進(jìn)行兩倍連續(xù)稀釋而消化1.2μ1λDNA底物(0.6μg)、并在瓊脂糖凝膠上檢查消化產(chǎn)物，對(duì)野生型(WT)ScaI的FI進(jìn)行的測(cè)定。沒(méi)有星號(hào)活性的限制性內(nèi)切核酸酶的最高濃度用實(shí)心箭頭顯示；和引起底物完全消化的最小濃度用空心箭頭示出。圖2A-D示出用WTBamHI或BamHI(E86P)酶消化0.5μ1pUC19底物(0.5μg)1小時(shí)的結(jié)果，所述WTBamHI或BamHI(E86P)酶是用稀釋劑A三倍連續(xù)稀釋的，其起始濃度為172U或512U。中間的泳道是NEBIkb標(biāo)記(NewEnglandBiolabs,Inc.(NEB),Ipswich,ΜΑ)。圖2Α示出使用NEBl緩沖液的結(jié)果。圖2Β示出使用ΝΕΒ2緩沖液的結(jié)果。圖2C示出使用ΝΕΒ3緩沖液的結(jié)果。圖2D示出使用ΝΕΒ4緩沖液的結(jié)果。圖3Α-Β示出在兩個(gè)時(shí)間期間BamHI(Ε86Ρ)活性的比較，其在ΝΕΒ2緩沖液使用0.6μ1PBR322底物(其僅包含1個(gè)BamHI切割位點(diǎn))，使用初始濃度600U、用稀釋劑A以2_倍連續(xù)稀釋的酶。圖3Α示出1小時(shí)的結(jié)果。圖3Β示出14小時(shí)的結(jié)果。圖4Α-Β示出在瓊脂糖凝膠上，在兩種不同的緩沖液中溫育14小時(shí)后，使用以稀釋劑A2倍連續(xù)稀釋的BamHI-HF(Ε163Α/Ε167Τ)，對(duì)0.6μ1pBR322底物的切割。圖4A示出使用NEB2緩沖液和600U初始濃度酶的結(jié)果。圖4B示出使用NEBl緩沖液和2，400U初始濃度酶的結(jié)果。圖5A-B示出在NEB4緩沖液中應(yīng)用BamHI-HF和WTBamHI的切割反應(yīng)的比較。該反應(yīng)在NEB4緩沖液中進(jìn)行，使用1.2μ1λDNA底物，處于使用稀釋劑A的2-倍連續(xù)稀釋中。圖5Α示出起始濃度1，200U的WTBamHI，其中FI等于4。圖5Β示出起始濃度2，400U的BamHI-HF，其中FI彡4000。圖6A-D示出在使用NEB稀釋劑C3_倍連續(xù)稀釋下，在NEB1-4緩沖液中WTEcoRI和EcoRI(K62A)的比較。反應(yīng)混合物包含在NEB1-4緩沖液中的2μ1λDNA底物(1μg)。圖6A示出兩倍連續(xù)稀釋后，在NEB2緩沖液中120UWTEcoRI和240U的EcoRI(K62A)的切割結(jié)果。圖6B示出兩倍連續(xù)稀釋后，在NEB4緩沖液中120UWTEcoRI和240U的EcoRI(K62A)的切割結(jié)果。圖6C示出兩倍連續(xù)稀釋后，在NEBl緩沖液中60UWTEcoRI和120U的EcoRI(K62A)的切割結(jié)果。圖6D示出兩倍連續(xù)稀釋后，在NEB3緩沖液中120UWTEcoRI和60U的EcoRI(K62A)的切割結(jié)果。圖7A-C示出用兩種不同的EcoRI突變體和WTEcoRI的切割結(jié)果。示出100，OOOU酶和其在稀釋劑C中的10倍連續(xù)稀釋物在10小時(shí)中的消化，其在各種緩沖液中使用0.6μ1的Litmus28底物進(jìn)行。在Litmus28底物中僅存在一個(gè)EcoRI切割位點(diǎn)。圖7A在NEB4緩沖液中的EcoRI突變體K62E。圖7B在NEB4緩沖液中的EcoRI突變體K62A。圖7C在EcoRI緩沖液中的WTEcoRI(參見(jiàn)NEB目錄2007-8)。圖8A-B示出在NEB4緩沖液中EcoRI-HF和WTEcoRI的比較。反應(yīng)使用1.2μ1λDNA底物，其處于使用稀釋劑C的2-倍連續(xù)稀釋下。圖8Α在ΝΕΒ4緩沖液中，具有19，200U起始濃度的WTEcoRI顯示FI=4。圖8Β在ΝΕΒ4緩沖液中，具有38，400起始濃度的UEcoRI-HF顯示FI=16，000。圖9A-B示出WTScaI(4.8U)、Seal(H193A)(9.6U)、Seal(S201F)(19.2U)和ScaI(H193A/S201F)(19.2U)的連續(xù)稀釋的比較。每一樣品最初稀釋1/10，然后在具有指定百分比甘油的NEB2緩沖液中2-倍連續(xù)稀釋。每一反應(yīng)混合物包含2μ1的λDNA底物(ιμg)°圖9A:5%甘油。圖9B:37%甘油。圖IOA-D示出WTScaI和Scal-HF(H193A/S201F)的比較。酶(如規(guī)定的單位濃度)各自用稀釋劑A以2.5-倍連續(xù)稀釋。該反應(yīng)混合物含有2μ1λDNA底物和ΝΕΒ1-4緩沖液。圖IOA在ΝΕΒ2緩沖液中切割。圖IOB在ΝΕΒ4緩沖液中切割。圖IOC在NEBl緩沖液中切割。圖IOD在ΝΕΒ3緩沖液中切割。圖IlA-H示出對(duì)SalI-HF和WTSalI的FI測(cè)定。兩種酶都使用稀釋劑A以2_倍連續(xù)稀釋。該反應(yīng)混合物含有2μ1HindIII-消化的λDNA底物。圖11A、B、C和D示出1，200U、1，200U、300U和1，200U的SalI-HF的連續(xù)稀釋，其分別在NEB1、2、3和4緩沖液中顯示FI^1，000、FI^2，000、FI^500和FI^2，000。圖11E、F、G和H示出19.2U、150U、9,600U和38.4U的WTSalI的連續(xù)稀釋，其分別在NEB1、2、3和4緩沖液中顯示FI=8、FI=UFI=32和FI=1。圖12A-B示出在NEB4緩沖液中與1.2μ1λDNA底物反應(yīng)的、在稀釋劑A中的SphI-HF(19，200U)和在稀釋劑B中的WTSphI(143，600U)的2-倍連續(xù)稀釋的結(jié)果。圖12Α示出WTSphI的切割。圖12Β示出SphI-HF的切割。圖13Α-Β示出分別在ΝΕΒ3和ΝΕΒ4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的PstI-HF(300U和150U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTPstI(2，400U和4，800U)對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑C中進(jìn)行。圖13Α示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中PstI-HF的切割。圖13Β示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中WTPstI的切割。圖14A-B示出分別在NEB3和NEB4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的NcoI-HF(4，800U和600U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTNcoI(4，800U和1，200U)對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑A中進(jìn)行。圖14Α示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中NcoI-HF的切割。圖14Β示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中WTNcoI的切割。圖15Α-Β示出分別在ΝΕΒ3和ΝΕΒ4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的NheI-HF(287，200U和76.8U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTNheI(9，600U和300U)對(duì)1.2μ1pXbaDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑A中進(jìn)行。圖15A示出NEB4緩沖液(上圖)和NEB3緩沖液(下圖)中NheI-HF的切割。圖15B示出NEB4緩沖液(上圖)和NEB3緩沖液(下圖)中WTNheI的切割。圖16A-B示出分別在NEB3和NEB4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的SspI-HF(9，600U禾Π38.4U)禾Π2-倍連續(xù)稀釋的WTSspI(19，200U禾Π19，200U)對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑C中進(jìn)行。圖16Α示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中SspI-HF的切割。圖16Β示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中WTSspI的切割。圖17Α-Β示出分別在ΝΕΒ3和ΝΕΒ4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的NotI-HF(287，200U和19，200U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTNotI(19，200U和76，800U)對(duì)1.2μIpXbaDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑C中進(jìn)行。圖17Α示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中NotI-HF的切割。圖17Β示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中WTNotI的切割。圖18Α-Β示出分別在ΝΕΒ3和ΝΕΒ4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的SacI-HF(4，800U和76.8U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTSacI(19，200U和1200U)對(duì)1.2μ1pXbaDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑A中進(jìn)行。圖18A示出NEB4緩沖液(上圖)和NEB3緩沖液(下圖)中SacI-HF的切割。圖18B示出NEB4緩沖液(上圖)和NEB3緩沖液(下圖)中WTSacI的切割。圖19A-B示出分別在NEB3和NEB4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的PvuII-HF(9，600U和19.2U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTPvuII(19，200U和300U)對(duì)0.6μ1PBR322DNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑A中進(jìn)行。圖19Α示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中PvuII-HF的切割。圖19Β示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中WTPvuII的切割。圖20Α-Β示出分別在ΝΕΒ3和ΝΕΒ4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的MfeI-HF(300U和19.2U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTMfeI(2，400U和38.4U)對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑A中進(jìn)行。圖20Α示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中MfeI-HF的切割。圖20Β示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中WTMfeI的切割。圖2IA-B示出分別在ΝΕΒ3和ΝΕΒ4緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的HindIII-HF(4，800U禾口1，200U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTHindIII(9，600U和4，800U)對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。連續(xù)稀釋在稀釋劑A中進(jìn)行。圖2IA示出ΝΕΒ4緩沖液(上圖)和ΝΕΒ3緩沖液(下圖)中HindIII-HF的切割。圖2IB示出NEB4緩沖液(上圖)和NEB3緩沖液(下圖)中WTHindIII的切割。圖22A-B示出在NEB4緩沖液中，使用稀釋劑C以2_倍連續(xù)稀釋SbfI-HF(起始濃度76，800U)和WTSbfI(起始濃度76，800U)，對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。圖22Α示出通過(guò)WTSbfI的切割。圖22Β示出通過(guò)SbfI-HF的切割。圖23Α-Β示出分別在ΝΕΒ2和NEBl緩沖液中，使用2_倍連續(xù)稀釋的EagI-HF(l,200U禾口600U)和2-倍連續(xù)稀釋的WTEagI(150U和38.4U)對(duì)1.2μ1pXbaDNA底物的切割，其應(yīng)用稀釋劑C。圖23A示出NEB2緩沖液(上圖)和NEBl緩沖液(下圖)中EagI-HF的切割。圖23B示出NEB2緩沖液(上圖)和NEBl緩沖液(下圖)中WTEagI的切割。圖24A-B示出在NEB4緩沖液中，使用稀釋劑A以2倍連續(xù)稀釋EcoRV-HF(起始濃度38，400U)和WTEcoRV(起始濃度:2400U)，對(duì)1.2μ1pXbaDNA底物的切割。圖24A示出通過(guò)WTEcoRV的切割。圖24B示出通過(guò)EcoRV-HF的切割。圖25A-B示出在NEB4緩沖液中，使用稀釋劑A以2倍連續(xù)稀釋AvrII-HF(起始濃度1，200U)和WTAvrII(起始濃度1，200U)，對(duì)1.2μ1Τ7DNA底物的切割。圖25Α示出通過(guò)WTAvrII的切割。圖25Β示出通過(guò)AvrII-HF的切割。圖26Α-Β示出在ΝΕΒ4緩沖液中，在稀釋劑A中2倍連續(xù)稀釋BstXI-HF(起始濃度300U)和WTBstXI(起始濃度38.4U)，對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。該反應(yīng)在55°C進(jìn)行。圖26A示出通過(guò)WTBstXI的切割。圖26B示出通過(guò)BstXI-HF的切割。圖27A-B示出在NEB4緩沖液中，使用稀釋劑A以2倍連續(xù)稀釋PciI-HF(起始濃度:600U)和WTPciI(起始濃度:300U)，對(duì)1.2μ1pXbaDNA底物的切割。圖27A示出通過(guò)WTPciI的切割。圖27B示出通過(guò)PciI-HF的切割。圖28A-B示出在NEB2緩沖液中，使用稀釋劑A以2倍連續(xù)稀釋HpaI-HF(起始濃度4，800U)和WTHpaI(起始濃度9，600U)，對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。圖28Α示出通過(guò)WTHpaI的切割。圖28Β示出通過(guò)HpaI-HF的切割。圖29Α-Β示出在ΝΕΒ4緩沖液中，使用稀釋劑C以2_倍連續(xù)稀釋AgeI-HF(起始濃度600U)和WTAgeI(起始濃度600U)，對(duì)1.2μ1pXbaDNA底物的切割。圖29A示出通過(guò)WTAgeI的切割。圖29B示出通過(guò)AgeI-HF的切割。圖30A-B示出在NEB4緩沖液中，使用稀釋劑C以2_倍連續(xù)稀釋BsmBI-HF(起始濃度300U)和WTBsmBI(起始濃度4，800U)，對(duì)1.2μ1λDNA底物的切割。該反應(yīng)在55°C下進(jìn)行。圖30A示出通過(guò)WTBsmBI的切割。圖30B示出通過(guò)BsmBI-HF的切割。圖31A-B分別示出MluCIM的DNA序列(SEQIDNO1)和蛋白序列(SEQIDNO2),用于EcoRI和MfeI的表達(dá)。圖32示出Hpyl66IIM的DNA序列(SEQIDNO:3)，用于SalI的表達(dá)。圖33A-B分別示出MfeI的DNA序列(SEQIDNO4)和蛋白序列(SEQIDNO5)。圖34A-B分別示出BstXI的DNA序列(SEQIDNO6)和蛋白序列(SEQIDNO7)。圖35A-B分別示出M.BstXI的DNA序列(SEQIDNO8)和蛋白序列(SEQIDNO9)。圖36A-B分別示出S.BstXI的DNA序列(SEQIDNO10)和蛋白序列(SEQIDNO11)。圖37A-B分別示出PciI的DNA序列(SEQIDNO12)和蛋白序列(SEQIDNO13)。圖38A-B分別示出M.PciI的DNA序列(SEQIDNO14)和蛋白序列(SEQIDNO15)。圖39示出編碼MI.EarI的DNA序列(SEQIDNO17)，所述MI.EarI識(shí)別CTCTTC并且在N4胞嘧啶或N6腺嘌呤處甲基化，用于克隆SapI和BspQI。圖40示出編碼M2.EarI的DNA序列(SEQIDNO:18)，所述M2.EarI識(shí)別CTCTTC并且在N4胞嘧啶或N6腺嘌呤處甲基化，用于克隆SapI和BspQI。圖4IA-B示出測(cè)定1μ1WTBspQI和1μ1突變體(K279P/R388F)BspQI(起始濃度分別為512U和1，024U)的FI的瓊脂糖凝膠，其通過(guò)使用稀釋劑A和NEBl緩沖液加10%甘油以2倍連續(xù)稀釋來(lái)切割ΙμpUC19DNA底物進(jìn)行。該反應(yīng)在50°C進(jìn)行。圖42示出測(cè)定5μ1WTSapI和5μ1突變體(Κ273Α)SapI(起始濃度分別為32U和16U)的FI的瓊脂糖凝膠，其通過(guò)使用稀釋劑A和ΝΕΒ2緩沖液加25%DMSO以2倍連續(xù)稀釋來(lái)切割PUC19DNA底物進(jìn)行。圖43Α-Β示出通過(guò)5μ1WTKpnI和5μ1D16N/E132A/D148EKpnl(初始濃度分別為32U和256U)得到的pXba的催化活性和星號(hào)活性。使用含有IOmMpH7.4的Tris_HCl、50mMKC1、0.ImMEDTAUmMDTT和50%甘油的稀釋劑在NEB2緩沖液中，以2-倍連續(xù)稀釋的該酶消化2μ1pXbaDNA底物(0.5μg)，其中使用水補(bǔ)充至50μ1的總體積。圖45Α示出WTKpnI的切割結(jié)果。圖45Β示出D16N/E132A/D148EKpnI的切割結(jié)果。圖44A-D示出表1中的酶的氨基酸序列，和以前沒(méi)有公開(kāi)的表1中酶的DNA序列。發(fā)明詳述本發(fā)明的實(shí)施方式提供選擇具有希望特性的限制性內(nèi)切核酸酶的一般方法。該一般方法依賴于適當(dāng)?shù)姆治鰷y(cè)定希望的限制性內(nèi)切核酸酶是否已經(jīng)產(chǎn)生。特別地，該一般方法的一個(gè)實(shí)施方式提供具有一組步驟的系統(tǒng)篩查方法。通過(guò)使用多種限制性內(nèi)切核酸酶實(shí)施數(shù)百個(gè)反應(yīng)，已經(jīng)推導(dǎo)出該方法。本文提供的實(shí)例的大多數(shù)涉及鑒定具有降低星號(hào)活性但是其切割活性至少與WT限制性內(nèi)切核酸酶相似的限制性內(nèi)切核酸酶。然而，期望可以成功地運(yùn)用同一方法以改變(修飾)限制性內(nèi)切核酸酶的其他性質(zhì)，例如涉及在期望緩沖液中的改進(jìn)的切割活性、熱穩(wěn)定性、在限定條件中的反應(yīng)速率等。如上所述，所關(guān)心的終點(diǎn)是將具有星號(hào)活性的限制性內(nèi)切核酸酶轉(zhuǎn)化為具有顯著減少星號(hào)活性的高保真度限制性內(nèi)切核酸酶。星號(hào)活性指單個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶在切割特異性方面的混亂。術(shù)語(yǔ)“星號(hào)活性降低”和“保真度增加”在本文可互換使用。盡管限制性內(nèi)切核酸酶特征為其在特定序列處切割DNA的性質(zhì)，但是一些限制性內(nèi)切核酸酶另外地在該DNA的第二(次級(jí))位點(diǎn)處無(wú)效率地切割DNA。該種次級(jí)切割可以一貫地發(fā)生或者可以僅僅在某些條件例如下列條件之一下出現(xiàn)濃度增加、某些緩沖液、溫度、底物類型、存儲(chǔ)和溫育時(shí)間。通常承認(rèn)對(duì)由構(gòu)成蛋白質(zhì)和決定特異性的數(shù)以百計(jì)的氨基酸產(chǎn)生的復(fù)雜環(huán)境所知甚少?，F(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)方法已經(jīng)利用晶體學(xué)來(lái)鑒定酶和其底物之間的接觸點(diǎn)。但是，晶體學(xué)對(duì)于在非自然化學(xué)環(huán)境中及時(shí)冷凍結(jié)構(gòu)方面具有局限性。使用現(xiàn)有的分析技術(shù)，已經(jīng)證明確定蛋白質(zhì)中任何位點(diǎn)處氨基酸的貢獻(xiàn)和底物分子結(jié)構(gòu)所起的作用的規(guī)則是難以捉摸的。例如，這里顯示，突變限制性內(nèi)切核酸酶中的一個(gè)氨基酸可以引起所有或部分的活性損失。在本文中，沒(méi)有提出結(jié)構(gòu)解釋以說(shuō)明為什么星號(hào)活性可以隨著高甘油濃度(>5%v/v)、高的酶與DNA比例(通常每iigDNA>100單位的酶)、低離子強(qiáng)度(<25mM的鹽)、高pH(>8.0)、存在有機(jī)溶劑(例如DMS0、乙醇)和用其他的二價(jià)陽(yáng)離子(Mn2\Co2+)取代Mg2+而增加。這里承認(rèn)因?yàn)橛绊懶翘?hào)活性的因素的多樣性，將必需在相同反應(yīng)條件和在相同的預(yù)定緩沖液中對(duì)WT和突變星號(hào)活性進(jìn)行比較，并且開(kāi)發(fā)任何高保真度酶必定能示出所述特性的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件——即使這些特性也在其他的反應(yīng)條件下觀察到。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及產(chǎn)生具有特定提高性質(zhì)的修飾的限制性內(nèi)切核酸酶，即具有增強(qiáng)的切割保真度而沒(méi)有總切割活性的顯著減少或從制造該蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的顯著產(chǎn)量下降。本文已經(jīng)發(fā)展用于發(fā)現(xiàn)具有提高性質(zhì)的突變體的方法是詳盡試驗(yàn)的結(jié)果，并且生成酶的性質(zhì)已經(jīng)在指定條件的背景中限定。本文描述的方法可用來(lái)在預(yù)定條件下改變?nèi)魏蜗拗菩詢?nèi)切核酸酶的酶促性質(zhì)，但是不限于所述具體的限定條件。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>該方法從負(fù)責(zé)同源活性和星號(hào)活性的氨基酸是不同的這一認(rèn)識(shí)而得出。本文描述的高保真度限制性內(nèi)切核酸酶的工程化顯示同源活性和星號(hào)活性可以分開(kāi)，并且存在影響這些不同活性的不同的關(guān)鍵氨基酸殘基。被發(fā)現(xiàn)影響星號(hào)活性的氨基酸的位置不一定在蛋白質(zhì)的活性部位內(nèi)發(fā)現(xiàn)。通過(guò)發(fā)展在確定FI(也參見(jiàn)Weietal.NucleicAcidRes.,36,9,e50(2008))和總保真度指數(shù)改進(jìn)因子的形式方面成功的標(biāo)準(zhǔn)，本文已經(jīng)第一次確定任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割性質(zhì)?！翱偙Ｕ娑戎笖?shù)改進(jìn)因子(overallfidelityindeximprovementfactor)，，指在選擇的緩沖液組中具有最大切割活性的突變體的最高FI除以具有最大切割活性的相應(yīng)WT內(nèi)切核酸酶的最高FI。選擇的組可以是大于1的任何大小，但是實(shí)際上將含有小于10種不同的緩沖液，并且更優(yōu)選地含有4種緩沖液。該組也可包括小于4種緩沖液。另外地而不僅僅對(duì)于由NEB1、NEB2、NEB3和NEB4組成的緩沖液組，至少2的總FI改進(jìn)因子應(yīng)優(yōu)選地適用于要求保護(hù)的發(fā)明的任何突變限制性內(nèi)切核酸酶。通過(guò)將相同量的酶與相同量和類型的底物在相同條件下反應(yīng)，并且視覺(jué)上比較電泳后凝膠上的切割圖，以便切割產(chǎn)物的量表現(xiàn)在誤差的標(biāo)準(zhǔn)容限內(nèi)是相同的并且其中定量相似性大于10%，可以測(cè)量“相似的切割活性”?！叭斯さ摹敝浮叭嗽斓摹??！皹?biāo)準(zhǔn)條件”指從在NEB1-4緩沖液中獲得的結(jié)果計(jì)算的總FI改進(jìn)因子。本文描述的一般方法已經(jīng)用27種限制性內(nèi)切核酸酶示例AgeI、Avrll、BamHI、Bsal、BsmBI、BspQI、BstXI、EagI、EcoRI、EcoRV、Hindlll、Hpal、Kpnl、Mfel、Ncol、Nhel、NotI,Pcil、PstI、PvuII、SacI,Sail、SapI,Sbfl、Seal、SphI和Sspl限制性內(nèi)切核酸酶。然而，如上所述，預(yù)期該方法對(duì)工程化具有顯著星號(hào)活性的任何限制性內(nèi)切核酸酶是有效的。該方法的實(shí)施方式利用一般的方法產(chǎn)生具有減少星號(hào)活性的突變體限制性內(nèi)切核酸酶。對(duì)于某些酶，已經(jīng)證明突變被確定在兩個(gè)同切點(diǎn)酶之間保守的帶電荷的殘基是有用的(參見(jiàn)例如實(shí)施例25中的Sapl)。然而，一般而言，該方法包括鑒定內(nèi)切核酸酶的蛋白序列內(nèi)所有的帶電荷和極性殘基的第一步驟。例如，帶電荷的氨基酸和極性殘基包括酸性殘基Glu和Asp；堿性殘基His、Lys和Arg；酰胺殘基Asn和Gin；芳族殘基Phe、Tyr和Trp；和親核殘基Cys。各殘基被靶向并突變?yōu)锳la，并且針對(duì)希望的保真度增加的性質(zhì)，篩查這些靶向突變的產(chǎn)物。如果獲得的突變體沒(méi)有一個(gè)提供令人滿意的結(jié)果，下一步是靶向突變所有的羥化氨基酸，即Ser、Thr和Tyr，優(yōu)選的突變是Ser和Thr突變?yōu)锳la和Tyr突變?yōu)镻he。也可能同時(shí)靶向突變兩類殘基，如在實(shí)施例16-23中所做的。突變?yōu)锳la可以被突變?yōu)閂al、Leu或lie所取代。在這些分析之后，如果上述步驟中產(chǎn)生的一種或更多種優(yōu)選的突變體在選擇的檢驗(yàn)下仍然具有低于標(biāo)準(zhǔn)的性能，這些突變體可以被選擇并再次突變?yōu)榱硗饪赡艿?8種氨基酸的每一種。這被稱為飽和誘變。飽和誘變提供EcoRI(實(shí)施例2)、部分BamHI(實(shí)施例1)和PvuII(實(shí)施例12)的優(yōu)選的高保真度突變體。依賴飽和誘變的結(jié)果，下一步將以靶向或隨機(jī)或者這兩種方式將另外的突變引入限制性內(nèi)切核酸酶。在實(shí)施例11中，SacI-HF包括在反向PCR期間偶然產(chǎn)生的隨機(jī)突變。在實(shí)施例20中，Pcil-HF是隨機(jī)突變的結(jié)果，而不是靶向突變的結(jié)果。在實(shí)施例26中，BspQI-HF含有被發(fā)現(xiàn)在增強(qiáng)保真度中協(xié)同作用的兩個(gè)突變。不同的靶向誘變方法例如反向PCR的應(yīng)用可包括在蛋白質(zhì)的第二位點(diǎn)引入非靶向突變。這些第二突變可偶然地提供需要的性質(zhì)(參見(jiàn)實(shí)施例20)。檢查那些具有多突變的突變酶是希望的，以確定是否所有的突變對(duì)觀測(cè)的效果是必需的。在實(shí)施例11中，雙突變體中Q117H對(duì)活性沒(méi)有影響。在實(shí)施例20中，另外的自發(fā)突變表現(xiàn)獨(dú)自為觀察到的提高的保真度的原因，而在實(shí)施例24中，各個(gè)突變協(xié)同地作用。在一些情況中，突變可提供除了提高的保真度之外的另外的優(yōu)點(diǎn)(參見(jiàn)例如BamHI，其中E163A或P173A引起酶變得更熱不穩(wěn)定)。根據(jù)其在一組標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的功能，選擇實(shí)施例中提供的突變體的高保真度/減少星號(hào)活性的性質(zhì)。如果選擇不同的緩沖液組合物，那么其他的突變可以是優(yōu)選的。然而，可以運(yùn)用相同的方法來(lái)發(fā)現(xiàn)突變體。表4列出運(yùn)用于每一限制性內(nèi)切核酸酶并在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中提供總FI改進(jìn)因子的突變。提供至少2的總FI改進(jìn)因子的高保真度限制性內(nèi)切核酸酶的工程化包括一個(gè)或<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>更多個(gè)下列步驟1.WT限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性的評(píng)估在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性的程度通過(guò)下列方法檢測(cè)對(duì)于適當(dāng)?shù)牡孜?，使用高初始濃度的原?Stock)內(nèi)切核酸酶和其連續(xù)稀釋物(例如2倍或3倍稀釋)，測(cè)定內(nèi)切核酸酶活性。限制性內(nèi)切核酸酶的初始濃度是不重要的，只要其足以使在至少一個(gè)濃度中觀察到星號(hào)活性，這樣通過(guò)稀釋，不再檢測(cè)到星號(hào)活性。適當(dāng)?shù)牡孜锖斜煌磧?nèi)切核酸酶活性切割的核苷酸序列，并且在其中可以觀察到星號(hào)活性。該底物可以是含有限制性內(nèi)切核酸酶基因的載體或第二DNA底物。在表2中使用的底物的實(shí)例是PBC4、pXba、T7、lambda和pBR322。原液限制性內(nèi)切核酸酶的濃度最初被選擇，以便星號(hào)活性可以容易地在WT和突變限制性內(nèi)切核酸酶中識(shí)別和分析。根據(jù)2007-08NEB目錄的指導(dǎo)，選擇適當(dāng)?shù)南♂尵彌_液例如NEB稀釋劑A、B或C進(jìn)行連續(xù)稀釋。連續(xù)稀釋的限制性內(nèi)切核酸酶與預(yù)定濃度的適當(dāng)?shù)牡孜镆苑磻?yīng)容器大小確定的總反應(yīng)體積進(jìn)行反應(yīng)。例如，在微量滴定板中進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)是方便的，在微量滴定板中，30yl反應(yīng)混合物是每孔適當(dāng)?shù)捏w積。因此，實(shí)例通常應(yīng)用30ill中0.6yg的底物，其相當(dāng)于50ill中的1yg底物。反應(yīng)混合物中的底物的量不是關(guān)鍵的，但是優(yōu)選其在反應(yīng)之間為恒定。切割反應(yīng)在預(yù)定溫度(例如25°C、30°C、37°C、50°C、55°C或65°C)下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間例如一小時(shí)。可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定切割產(chǎn)物，以測(cè)定上面定義的保真度指數(shù)。不是所有的限制性內(nèi)切核酸酶都具有顯著的星號(hào)活性，如從它們的FI確定的。然而，如果內(nèi)切核酸酶具有不超過(guò)大約250的最高FI和小于100的最低FI，那么該限制性內(nèi)切核酸酶被分類為具有顯著的星號(hào)活性。這樣的內(nèi)切核酸酶被選為酶工程的標(biāo)靶以增加對(duì)單一底物的保真度。在一些情況中，具有FI大于約500和FI小于約100的限制性內(nèi)切核酸酶也被工程化以獲得更好的切割活性。下面表2列出一些工程化限制性內(nèi)切核酸酶在工程化之前的FI。所有的樣品在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*底物λ是λ噬菌體DNA；λ(Η3)是HindIII-消化的λ噬菌體DNA；pXba是PUC19，具有XbaI-消化的腺病毒片段；pBC4較短形式的pXba；T7:T7DNA**FI_1到FI-4=NEB緩沖液1、2、3和4中的酶的保真度指數(shù)。括號(hào)中的數(shù)是與緩沖液組的任何緩沖液中突變體限制性內(nèi)切核酸酶的“最好”切割活性相比，在該緩沖液組的指定緩沖液中同一突變體限制性內(nèi)切核酸酶的相對(duì)切割活性的值。NEB緩沖液的組成如下NEBl=IOmMBisTris丙烷-HCl、IOmMMgCl2、lmM(25°CT，pH7.0)；NEB2:50mMNaClUOmMTris-HClUOmMMgCl2、ImM二硫蘇糖醇(25°C下，pH7.9)；NEB3=IOOmMNaCl、50mMTris-HClUOmMMgCl2、ImM二硫蘇糖醇(25°C下，ρΗ7·9)；ΝΕΒ4:50mM乙酸鉀、20mMTris-乙酸鹽、IOmM乙酸鎂、ImM二硫蘇糖醇(25°C下，ρΗ7·9)。***ΝΕΒ稀釋劑的組成如下。(在稀釋中使用稀釋劑代替水將保持反應(yīng)中甘油濃度為常數(shù)。)稀釋劑A:50mMKClUOmMTris_HCl、0.ImMEDTA、ImM二硫蘇糖醇、200mg/mlBSA。50%甘油(25°C下，ρΗ7·4)；稀釋劑B:300mMNaClUOmMTris_HCl、0.ImMEDTA、lmM二硫蘇糖醇、500mg/mlBSA、50%甘油(25°C下，ρΗ7·4)；稀釋劑C:250mMNaClUOmMTris_HCl、0.ImMEDTA、ImM二硫蘇糖醇、0·15%TritonX_100、200mg/mlBSA、50%甘油(25°C下，pH7.4)。2.高表達(dá)宿主細(xì)胞株的構(gòu)建如果宿主細(xì)胞能過(guò)表達(dá)針對(duì)其尋找減少星號(hào)活性的突變體限制性內(nèi)切核酸酶，這是方便的。如果該限制酶在大腸桿菌中高度表達(dá)，那么星號(hào)活性可以容易在粗提物中檢測(cè)至IJ，這簡(jiǎn)化了高保真度限制性內(nèi)切核酸酶的篩查。然而，突變的限制性內(nèi)切核酸酶可以在任何宿主細(xì)胞中表達(dá)，條件是宿主細(xì)胞以某些方式被保護(hù)免于從酶切割產(chǎn)生的毒性。這可能包括甲基化酶的存在；在提供接近基因組的屏障的細(xì)胞區(qū)室(例如包含體或周質(zhì))中產(chǎn)生；體外合成；在缺少宿主基因組中的切割位點(diǎn)的情況下在乳液(參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)12/035,872)中產(chǎn)生；在經(jīng)受內(nèi)含肽介導(dǎo)的連接的構(gòu)成部件中制造酶，等。為了生產(chǎn)，突變限制性內(nèi)切核酸酶的過(guò)表達(dá)可以使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如使用大腸桿菌(E.coli)宿主，將內(nèi)切核酸酶插入PUC19-衍生的表達(dá)載體，這是高拷貝的；和使用相對(duì)小的質(zhì)粒，其能持續(xù)表達(dá)重組蛋白質(zhì)。該載體可優(yōu)選地含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子例如Iac啟動(dòng)子和鄰近該啟動(dòng)子定位的多拷貝插入位點(diǎn)。可選地，可以選擇需要基因表達(dá)的IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。如果粗提物中的活性不是足夠的，那么在粗提物中限制性內(nèi)切核酸酶的柱純化步驟可被進(jìn)行。3.限制性內(nèi)切核酸酶的誘變編碼限制性內(nèi)切核酸酶內(nèi)的每個(gè)帶電荷的基團(tuán)或極性基團(tuán)的DNA可以被單獨(dú)靶向，并且突變的DNA被克隆并制備進(jìn)行檢測(cè)?？蓪⒍嗤蛔円雴为?dú)的限制性內(nèi)切核酸酶基因。限制性內(nèi)切核酸酶的靶向誘變可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法完成。本文使用的一個(gè)便利的方法是反向PCR。在該方法中，合成含有靶向密碼子加在該密碼子5’和3’側(cè)上的多個(gè)核苷酸(例如18nt)的互補(bǔ)引物對(duì)。通過(guò)評(píng)估目的氨基酸殘基周圍的目的內(nèi)切核酸酶的基因序列，可容易地完成適當(dāng)引物的選擇。通過(guò)REBASE和GenBank提供對(duì)基因序列的訪問(wèn)。本文在實(shí)施例中描述的內(nèi)切核酸酶的序列在圖31到38和44中提供。PCR的模板是含有限制性內(nèi)切核酸酶基因的質(zhì)粒。優(yōu)選地，聚合酶為高保真度聚合酶，例如Vent或De印VentDNA聚合酶。通過(guò)改變退火溫度和Mg2+濃度，可以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)突變的成功引入。然后，純化并優(yōu)選通過(guò)DpnI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將消化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)，其已經(jīng)使用相應(yīng)的甲基化酶預(yù)修飾。來(lái)自每個(gè)突變體的菌落被挑選并在與WT生長(zhǎng)條件相似的條件下生長(zhǎng)(例如，使用相似的生長(zhǎng)培養(yǎng)基、藥物選擇和溫度)。針對(duì)減少的星號(hào)活性，篩查所得限制性內(nèi)切核酸酶。4.篩查具有減少的星號(hào)活性的突變體限制性內(nèi)切核酸酶條件例如緩沖液組成、溫度和稀釋劑應(yīng)該被限定，以測(cè)定突變體限制性內(nèi)切核酸酶中的星號(hào)活性。表2和3示出重組內(nèi)切核酸酶在37°C下使用三種不同的稀釋劑在四種不同的緩沖液中突變之前和之后的FI。因此，可能確定哪些突變體具有至少2、超過(guò)10、至少50或超過(guò)500的總的希望提高的保真度指數(shù)因子并且選擇酶作為優(yōu)選的高保真度突變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，首先，在正常緩沖液條件下(不超過(guò)5%甘油)，篩查突變體限制性內(nèi)切核酸酶的活性。對(duì)于那些具有至少大約10%的WT限制性內(nèi)切核酸酶活性的突變體，在促進(jìn)星號(hào)活性的星號(hào)活性提高條件下——例如高甘油濃度和任選地高PH下，也測(cè)定活性。優(yōu)選地，選擇在正常的緩沖液中具有最小星號(hào)活性但是具有可接受的同源活性的突變體。然后，可提取質(zhì)粒并測(cè)序，以驗(yàn)證該突變體。在一些情況中，星號(hào)活性不容易測(cè)量——甚至在高甘油和高PH條件下。替代地，測(cè)量和比較不同緩沖液中的活性，并且NEB4與NEB3切割活性比率最高的突變體可進(jìn)一步針對(duì)星號(hào)活性改進(jìn)進(jìn)行檢測(cè)。5.對(duì)一個(gè)單個(gè)殘基的飽和誘變?nèi)缜懊娌糠炙龅?，第一步是將限制性?nèi)切核酸酶中的靶氨基酸突變?yōu)锳la。如果該結(jié)果不令人滿意，那么進(jìn)行飽和誘變。優(yōu)選地，這通過(guò)兩個(gè)方法之一進(jìn)行。一個(gè)方法是將意圖密碼子改為NNN。誘變后，在正常條件下和促進(jìn)星號(hào)活性的條件下分析多個(gè)菌落?？蛇x地，可以選擇不同的密碼子，用于進(jìn)行下列靶氨基酸的每一個(gè)的誘變，例如Ala:GCT；CysiTGC；Asp:GAC；Glu:GAA；His:CAC；Ile:ATC；Lys:AAA；Leu:CTG；Met:ATG；Asn:AAC；ProCCG；Gin:CAG；Arg:CGT；Ser:TCC；Thr:ACC；Val:GTT；Trp:TGG和Tyr:TAC。6.組合如果單一突變不充分減少星號(hào)活性，那么可以將超過(guò)一個(gè)的突變引入限制性內(nèi)切核酸酶基因。突變組合和飽和誘變可以以任何順序進(jìn)行。7.突變體純化和改進(jìn)的評(píng)估高保真度突變體可以以多種方式純化，其包括使用不同的色譜柱。對(duì)于常規(guī)的質(zhì)量評(píng)估，一個(gè)FPLC肝素柱足以從該制品除去DNA和非特異性核酸酶。包括離子交換柱、疏水柱、大小排阻柱和親和柱的多個(gè)柱可被用于進(jìn)一步純化。在四種NEB緩沖液中，測(cè)量純化的高保真度限制性內(nèi)切核酸酶的FI，并且將其與WT限制性內(nèi)切核酸酶的FI進(jìn)行比較。高保真度限制性內(nèi)切核酸酶在其最佳緩沖液中的FI與WT的FI的比率是總改進(jìn)因子。表3-示例性限制性內(nèi)切核酸酶的FI*<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*FI是不示出星號(hào)活性的最高濃度與完全消化底物的最低濃度的比率。**括號(hào)中的數(shù)是與緩沖液組的任何緩沖液中突變體限制性內(nèi)切核酸酶的最大切割活性相比，在該緩沖液組的指定緩沖液中同一突變體限制性內(nèi)切核酸酶的相對(duì)切割活性的值。表4-提供具有高保真度的限制性內(nèi)切核酸酶的突變<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>限制性內(nèi)具有彡2的總改進(jìn)FI因子的突變體的實(shí)例切核酸酶NotIK176A；R177A；R253A；K150APciIE78A/S133APstIE204G；K228A；K228A/A289V；D91APvuIIT46A；T46H；T46K；T46Y；T46GSacIQ117H/R154A/L284P；Q117H/R200ASailR82A；K93A；KlOlA；R107ASapIK273P；R380A；K273P/R380ASbfIK251ASealR18A；R112A；E119A；H193A；S201F；H193A/S201FSphID91A；D139A；D164A；KlOOASspIH65A；K74A；E78A；E85A；E89A；K109A；E118A；R177A；K197A；Y98F對(duì)每種酶的突變通過(guò)分號(hào)分開(kāi)。所有上面和下面引用的參考文獻(xiàn)，以及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/959，203，被通過(guò)引用并入。實(shí)施例在氨基酸用單字母代碼表示時(shí)，這擬為標(biāo)準(zhǔn)命名。該代碼的解答例如在NEB目錄2007/2008第280頁(yè)上提供。被用來(lái)克隆和作為底物的質(zhì)粒具有如下序列pLaczz2(SEQIDNO102)、pSyx20_lacIq(SEQIDNO105)、pBC4(SEQIDNO103)、pXba(SEQID.NO:104)和pAGR3(SEQIDNO:106)。pACYC在GenBankXO6403中描述，T7在GenBankNCOO1604中描述，pUC18在GenBankL09136中描述，和pRRS在Skoglundetal.Gene，881-5(1990)中描述。pSX33通過(guò)將IacI基因插入pLG339中EcoRI位點(diǎn)處進(jìn)行構(gòu)建。pLG339在Stoker，etal.Gene19,335-341(1982)中描述。本文使用的稱為NEB緩沖液的所有緩沖液可從NewEnglandBiolabs，Inc.(NEB)，Ipswich,MA獲得。實(shí)施例1工稈化高保真度BamHI1.提取包含BamHI甲基化酶和BamHI內(nèi)切核酸酶的質(zhì)粒用pUC18-BamHIR和pACYC184_BamHIM轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌宿主細(xì)胞，并且通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)小量制備技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)Qiagen小量制備方法(Qiagen，Valencia,CA)提取BamHIR。2.誘變靶的選擇克隆并測(cè)序BamHI和相關(guān)的限制性內(nèi)切核酸酶OkrAI。如果反應(yīng)在37°C下、在NEB緩沖液(1、2和4)中進(jìn)行，那么發(fā)現(xiàn)OkrAI具有顯著的星號(hào)活性。本分析檢驗(yàn)如此假設(shè)作為星號(hào)活性原因的氨基酸殘基(一個(gè)或更多個(gè))在BamHI和OkrAI內(nèi)切核酸酶之間是相似的。BamHI的完整蛋白序列(SEQIDNO19)為1MEVEKEFITDEAKELLSKDKLIQQAYNEVKTSICSPIffPATSKTFTINNT51EKNCNGVVPIKELCYTLLEDTYNWYREKPLDILKLEKKKGGPIDVYKEFI101ENSELKRVGMEFETGNISSAHRSMNKLLLGLKHGEIDLAIILMPIKQLAY151YLTDRVTNFEELEPYFELTEGQPFIFIGFNAEAYNSNVPLIPKGSDGMSK20IRSIKKffKDKVENKOkrAI的完整蛋白序列(SEQIDNO20)為1MKIKRIEVLINNGSVPGIPMILNEIQDAIKTVSffPEGNNSFVINPVRKGN51GVKPIKNSCMRHLHQKGffALEHPVRIKAEMRPGPLDAVKMIGGKAFALEff101ETGNISSSHRAINKMVMGMLERVIIGGVLILPSRDMYNYLTDRVGNFREL15IEPYFSVffRQFNLKDAYLAIVEIEHDSVDAQVSLIPKGTDGRAIR通過(guò)GCG對(duì)BamHI和OkrAI內(nèi)切核酸酶的蛋白序列的“最佳擬合(Bestfit)”相似性分析示出下列結(jié)果，其中上面的蛋白序列是BamHI，下面的蛋白序列是OkrAIbamhir.pepχokrair.pep.22IQQAYNEVKTSICSPIffPATSKTFTINNTEKNCNGVVPIKELCYTLLEDT71III:·.I.Il··IIIIIIIIIII18IPMILNEIQDAIKTVSWPEGNNSFVINPVRKG.NGVKPIKNSCMRHLHQK66.72YMYREKPLDILKLEKKKGGPIDVYKEFIENSELKRVGMEFETGNISSAH121III.III11:1IIIIIIIIM.67.GffALEHPVRI.KAEMRP.GPLDAVK.MIGG...KAFALEffETGNISSSH109.122RSMNKLLLGLKHGEIDLAIILMPIKQLAYYLTDRVTNFEELEPYFEL...168||.|I::INIIlIlllll·110RAINKMVMGMLERVIIGGVLILPSRDMYNYLTDRVGNFRELEPYFSVWRQ159...169..TEGQPFIFIGFNAEAYNSNVPLIPKGSDGMSKR201(SEQIDNO21)....IIIIIι.II.160FNLKDAYLAIVEIEHDSVDAQVSLIPKGTDGRAIR194(SEQIDNO22)發(fā)現(xiàn)BamHI中相似的帶電荷的殘基(D、E、H、K、R)是E28、K30、K52、K61、E77、K84、E86、K88、D94、K97、K106、E111、E113、H121、R122、K126、K146、D154、R155、E161、E163、E170、E182、K193、D196和R201。在上面的比較中，這些殘基被加下劃線。已知的突變體E77K、D94N、ElllK和E113K以前被報(bào)道為失活的(Xu，Shuang-yongetal.J.Bacteriol.2664425-4429(1991))，所以排除它們。最初的誘變選擇靶向22個(gè)共有的帶電荷的氨基酸殘基，將其突變?yōu)楸彼酔28A、K30A、K52A、K61A、K84A、E86A、K88A、K97A、K106A、H121A、R122A、K126A、K146A、D154A、R155A、E161A、E163A、E170A、E182A、K193A、D196A和R201A。3.BamHI的誘變選擇突變的點(diǎn)誘變通過(guò)反向PCR進(jìn)行。將相應(yīng)密碼子全部變?yōu)镚CA(丙氨酸)。下列引物用于誘變E28A5’ATTCAACAAGCATACAATGCAGTTAAAACATCTATTGT3’(SEQIDNO23)5，ACAAATAGATGTTTTAACTGCATTGTATGCTTGTTGAAT3'(SEQIDNO24)K30A5，CAAGCATACAATGAAGTTGCAACATCTATTTGTTCACCT3'(SEQIDNO25)5，AGGTGAACAAATAGATGTTGCAACTTCATTGTATGCTTG3'(SEQIDNO26)K52A5，ACGATTAACAACACCGAAGCAAATTGTAACGGTGTAGTA3'(SEQIDNO27)5，TACTACACCGTTACAATTTGCTTCGGTGTTGTTAATCGT3’(SEQIDNO28)K61A5，AACGGTGTAGTACCAATTGCAGAACTATGTTACACCTTA3'(SEQIDNO29)5’TAAGGTGTAACATAGTTCTGCAATTGGTACTACACCGTT3’(SEQIDNO30)K84A5，AACCCCCTTGATATACTTGCACTTGAAAAGAAAAAAGGT3'(SEQIDNO31)5，ACCTTTTTTCTTTTCAAGTGCAAGTATATCAAGGGGTTT3'(SEQIDNO32)E86A5，GATATACTTAAACTTGCAAAGAAAAAAGGTGGTCCG3'(SEQIDNO33)5，CGGACCACCTTTTTTCTTTGCAAGTTTAAGTATATCAAG3’(SEQIDNO34)K88A5，ATACTTAAACTTGAAAAGGCAAAAGGTGGTCCGATTGAT3'(SEQIDNO35)5，ATCAATCGGACCACCTTTTGCCTTTTTCAAGTTTAAGTAT3’(SEQIDNO36)K97A5，GGTCCGATTGATGTTTATGCAGAGTTCATAGAAAACAGT3'(SEQIDNO37)5，ACTGTTTTCTATGAACTCTGCATAAACATCAATCGGACC3，(SEQIDNO38)K106A5，ATAGAAAAACAGTGAACTTGCACGTGTAGGTATGGAA3'(SEQIDNO39)5，AAATTCCATACCTACACGTGCAAGTTCACTGTTTTCTAT3'(SEQIDNO40)H121A5，GGAAATATTAGTTCTGCCGCACGTTCAATGAACAAACTT3'(SEQIDNO41)5，AAGTTTGTTCATTGAAACGTGCGGCAGAACTAATATTCC3'(SEQIDNO42)R122A5’AATATTAGTTCTGCCCACGCATCAATGAACAAACTTCTA3’(SEQIDNO43)5，TAGAAGTTTGTTCATTGATGCGTGGGCAGAACTAATATT3’(SEQIDNO44)K126A5，GCCCACCGTTCAATGAACGCACTTCTATTAGGATTAAAACAT3’(SEQIDNO45)5，ATGTTTTAATCCTAATAGAAGTGCGGTCATTGAACGGTGGGC3’(SEQIDNO46)K146A5，ATTATCCTTATGCCTATTGCACAATTGGCCTATTATCTT3’(SEQIDNO47)5，AAGATAATAGGCCAATTGTGCAATAGGCATAAGGATAAT3'(SEQIDNO48)D154A5，TTGGCCTATTATCTTACAGCACGTGTTACCAATTTCGAG3'(SEQIDNO49)5’CTCGAAATTGGTAACACGTGCTGTAAGATAATAGGCCAA3’(SEQIDNO50)R155A5，GCCTATTATCTTACAGATGCAGTTACCAATTTCGAGGAA3'(SEQIDNO51)5，TTCCTCGAAATTGGTAACTGCATCTGTAAGATAATAGGC3’(SEQIDNO52)E161A5，CGTGTTACCAATTTCGAGGCATTAGAACCTTATTTTGAA3'(SEQIDNO53)5，TTCAAAATAAGGTTCTAATGCCTCGAAATTGGTAACACG3'(SEQIDNO54)E163A5，ACCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACT3'(SEQIDNO55)5，AGTAAGTTCAAAATAAGGTGCTAATTCCTCGAAATTGGT3'(SEQIDNO56)E170A5，CCTTATTTTGAACTTACTGCAGGACAACCATTTATTTTTATT3’(SEQIDNO57)5，AATAAAAATAAATGGTTGTGCTGCAGTAAGTTCAAAATAAGG3'(SEQIDNO58)E182A5，TTTATTTTTATTGGATTTAATGCTGCAGCTTATAATTCTAATGTC3’(SEQIDNO59)5，GACATTAGAATTATAAGCTGCAGCATTAAATCCAATAAAAATAAA3'(SEQIDNO60)K193A5，AATGTCCCTTTAATTCCCGCAGGTTCTGACGGTATGTCA3’(SEQIDNO61)5，TGACATACCGTCAGAACCTGCGGGAATTAAAGGGACATT3’(SEQIDNO62)D196A5’TTAATTCCCAAAGGTTCTGCAGGTATGTCAAAACGCTCA3’(SEQIDNO63)5，TGAGCGTTTTGACATACCTGCAGAACCTTTGGGAATTAA3’(SEQIDNO64)R201A5，TCTGACGGTATGTCAAAAGCATCAATTAAGAAATGGAAA3’(SEQIDNO65)5，TTTCCATTTCTTAATTGATGCTTTTGACATACCGTCAGA3'(SEQIDNO66)PCR反應(yīng)的反應(yīng)體積為100μ1，包含2μ1的每種PCR引物、1μ1pUC18_bamhiR、400μMdNTP、4單位的De印VentDNA聚合酶和10μ1IOx含有0、2或6μIMgSO4的Thermopol緩沖液加余量的水。PCR反應(yīng)條件是94°C進(jìn)行5min，然后25個(gè)循環(huán)的94°C30sec、55°C30sec、72°C4min，并且在72°C下最后延伸時(shí)間為7mins。PCR產(chǎn)物在標(biāo)準(zhǔn)Qiagen離心柱(Qiagen，Valencia,CA)上純化。用20單位的DpnI消化6到16μ1的PCR產(chǎn)物1小時(shí)。將消化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-bamHIM)。6個(gè)PCR反應(yīng)后，獲得工程化的22種突變中的14種E28A、K30A、K61A、E86A、K97A、H121A、K126A、K146A、E161A、E163A、E170A、E182A和R201A。從過(guò)夜培養(yǎng)物中的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中提取突變體蛋白質(zhì)，并且將其活性與WTBamHI比較。在有或者沒(méi)有5%甘油的NEB2緩沖液中，分析正常的酶活性，而在具有39.2%甘油的NEB2中測(cè)定星號(hào)活性，盡管最初可以使用較低百分比的甘油。用于不同的反應(yīng)的底物是pBR322、pUC19或XDNA。切割反應(yīng)在37°C下進(jìn)行30分鐘或1小時(shí)。發(fā)現(xiàn)突變體K97A、H121A、K126A、E161A、E182A、R201A是失活的(小于的WTBamHI活性)，而E28A、K146A、E163A、E170A突變體具有與WT酶相似水平的包括星號(hào)活性在內(nèi)的活性。發(fā)現(xiàn)與WTBamHI相比，三種突變體K30A、E86A和K126A具有顯著減少的星號(hào)活性。也發(fā)現(xiàn)K30A和E86A具有與WT酶相似的總切割活性，同時(shí)其示出星號(hào)活性明顯減少。相反，K126A僅具有25%的總WT酶切割活性，并且與對(duì)K30A和E86A觀察到的星號(hào)活性相比具有較不顯著的改進(jìn)。對(duì)pUC18-bamHIR質(zhì)粒再檢查顯示正常的高拷貝質(zhì)粒已突變?yōu)榈涂截愘|(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物對(duì)以將bamHIR基因轉(zhuǎn)移入高拷貝質(zhì)粒5’GGTGGTGCATGCGGAGGTAAATAAATGGAAGTAGAAAAAGAGTTTATTACTGAT3’(SEQIDNO:67)5’GGTGGTGGTACCCTATTTGTTTTCAACTTTATCTTTCCATTTCTTAATTGA3’(SEQIDNO68)模板是pUC18-bamhIRWT，其在K30A、E86A或K126A處帶有突變。PCR組合物包含5μ1模板、2μ1每種引物、400μΜdNTPUOμ1IOxThermopol緩沖液、4單位2μ1DeepVent聚合酶、72μ1H2O加0、2、6μ1MgS04。PCR條件是94°C持續(xù)5min，然后94°C30sec、55°C30sec和72°C40sec進(jìn)行25個(gè)循環(huán)和7分鐘的最終延伸時(shí)期。使用SphI和KpnI消化PCR產(chǎn)物，將其連接至具有相同的酶消化對(duì)的pUC19。將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入含有pACYC-bamHIM的感受態(tài)大腸桿菌。含有BamHIRK30A的pUC19形式的26個(gè)菌落和含有E86A的那些的12個(gè)被鑒定并生長(zhǎng)。檢查來(lái)自這些培養(yǎng)物的BamHI的活性。所有它們都具有活性。提取來(lái)自每個(gè)突變的五個(gè)菌落的質(zhì)粒并且來(lái)自每個(gè)突變的3個(gè)的BamHIR質(zhì)粒被測(cè)序。證實(shí)質(zhì)粒pUC19-BamHI(K30A)和pUC19_BamHI(E86A)的身份(identity)。使用pUC19_BamHI(K30A)載體重復(fù)那些在pUC18_BamHIR中不成功的突變。PCR混合物包含:1μ1模板和含有2μ1每種引物、400μMdNTPUOy1IOxThermopol緩沖液、4單位2μ1DeepVent聚合酶、76μ1H2O加0、2、6μ1100μMMgSO4的擴(kuò)增混合物。PCR條件是94°C持續(xù)5min，然后94°C30sec、55°C30sec和72°C3分30秒進(jìn)行25個(gè)循環(huán)和7分鐘的最終延伸時(shí)期。使用DpnI消化PCR產(chǎn)物，并且將其轉(zhuǎn)化入用pACYC-BamHIM轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌。在PUC19底物上檢測(cè)酶活性。反應(yīng)組合物為3μ1細(xì)胞提取物、3μ1ΝΕΒ2、3μ150%甘油、0.5μ10.5μgpUC19、20.5μ1H20。該反應(yīng)在37°C下進(jìn)行1小時(shí)。K30A/R122A、K30A/R155A和K30A/K193A是失活的。K30A/K52A和K30A/K88A是K30A活性的大約1/10。K30A/K106A、K30A/D154A和K30A/D196A的正常活性與K30ABamHI的活性相似。這三種突變體與K30A在高濃度甘油(39.2%)下的星號(hào)活性的比較顯示K30A/D196A具有與K30A相似的星號(hào)活性，K30A/D154A甚至具有比K30A更多的星號(hào)活性，并且K30A/K106A具有比K30A更少的星號(hào)活性。因?yàn)榧?xì)胞毒性，分離在PUC19載體中的BamHI的K106A突變的嘗試失敗。使用反向PCR，組合在K30、E86和K106位點(diǎn)上的突變K30A/E86A、E86A/K106A、K30A/K106A和K30A/E86A/K106A。K30A/E86A表現(xiàn)為優(yōu)選的突變體。純化后，發(fā)現(xiàn)BamHI突變體的FI在所有NEB緩沖液中提高25%。在K30和E86位點(diǎn)上，隨機(jī)進(jìn)行進(jìn)一步誘變對(duì)K30:5，CAAGCATACAATGAAGTTNNNACATCTATTTGTTCACCT3，(SEQIDNO69)5，AGGTGAACAAATAGATGTNNNAACTTCATTGTATGCTTG3，(SEQIDNO70)對(duì)E86:5，GATATACTTAAACTTNNNAAGAAAAAAAGGTGGTCCG3，(SEQIDNO71)5，CGGACCACCTTTTTTCTTNNNAAGTTTAAGTATATCAAG3，(SEQIDNO72)PCR組合物是1μ1模板(pUC19-BamHIR(K30A)或pUC19_BamHIR(E86A))并且使用如上描述的擴(kuò)增混合物。進(jìn)行PCR:94°C5min，然后94°C30sec、55°C30sec和72°C3分30秒25個(gè)循環(huán)和7分鐘的最終延伸時(shí)期。通過(guò)DpnI消化PCR產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-BamHIM)。對(duì)K30隨機(jī)突變選取共155個(gè)菌落，和對(duì)E86位點(diǎn)選取158個(gè)菌落。將菌落生長(zhǎng)過(guò)夜并制成細(xì)胞提取物。在具有42.5%甘油的NEB2緩沖液中用1μ1細(xì)胞提取物在37°C下，消化0.5μgpUC19，l小時(shí)。在具有39.2%甘油的NEB2緩沖液中，具有明顯更少星號(hào)活性的細(xì)胞提取物在37°C下在1、4、16倍稀釋下對(duì)0.5μgpUC19進(jìn)行重新分析30分鐘。對(duì)于觀察到具有減少星號(hào)活性的那些突變體，提取相應(yīng)的質(zhì)粒并且測(cè)序以證實(shí)突變?？偣?個(gè)克隆(#12、#66和#82)含有K30突變，并且總過(guò)33個(gè)克隆(#5、#15、#16、#19、#29、#47、#51、#55、#56、#58、#61、#69、#71、#73、#76、#82、#86、#88、#93、#94、#97、#98、#100、#104、#107、#113、#117、#118、#129、#132、#136、#139和#151)被測(cè)序。測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)#12和#66含有K30G突變，和#82含有K30N突變。令人驚奇地，所有33個(gè)突變是E86P突變，恰好在不同的密碼子中(CCA、CCT、CCC、CCG)。在這些密碼子中，CCG在大腸桿菌以最高頻率發(fā)生(克隆#98、#136和#139)。相應(yīng)于K30G、K30N和K30A的細(xì)胞提取物被連續(xù)稀釋為1、2、4、8、16和32倍，而E86P和E86A被連續(xù)稀釋1、2、4、8、16、32、64、128和256倍。連續(xù)稀釋的提取物與0.5μgPUC19在具有39.2%甘油的NEB2中在37°C下反應(yīng)30分鐘。在極端的條件下，E86P顯示比其他突變體更優(yōu)良。在上至32倍消化下，沒(méi)有明顯星號(hào)活性帶。E86P和K30突變體(K30G、K30N和K30A)之間的差異是如此大以致不另外需要在E86P突變體中組合這些突變中的任一個(gè)。對(duì)1μgλDNA——底物——測(cè)定BamHI(Ε86Ρ)活性(也用于WTBamHI活性測(cè)定)。在NEBl緩沖液中，在37°C下，進(jìn)行分析1小時(shí)。4.BamHI(E86P)和WTBamHI的詳細(xì)比較A.不同NEB緩沖液中BamHI(E86P)的活性使用λDNA底物在37°C下，在NEB1、NEB2、NEB3、NEB4和NEBBamHI緩沖液中測(cè)定純化的BamHI(E86P)的活性1小時(shí)。BamHI(E86P)在NEBl緩沖液和NEB2中是最有活性的，而在NEB3、NEB4和BamHI緩沖液中具有50%、50%和25%的活性水平。B.比較BamHI(E86P)和WTBamHI對(duì)pUC19的切割活性在pUC19中具有一個(gè)GGATCC位點(diǎn)(BamHI位點(diǎn))和6個(gè)AGATCC位點(diǎn)(BamHI星號(hào)活性位點(diǎn))，所以PUC19被選擇作為比較BamHI(E86P)和WTBamHI的優(yōu)選底物。在不同的緩沖液中，用NEB稀釋緩沖液A以1、3、9、27、81、243、729、2181、6561和19683倍連續(xù)稀釋的WTBamHI禾口BamHI(E86P)消化0.5mgpUC19。WTBamHI示出每種NEB正常緩沖液中的星號(hào)活性，而B(niǎo)amHI(E86P)根本沒(méi)有示出星號(hào)活性帶(圖2_5)。這證明BamHI(E86P)已經(jīng)極大地減少星號(hào)活性，同時(shí)保持同源切割活性。C.BamHI(E86P)禾ΠWTBmHI對(duì)λDNA底物切割活性的比較為了計(jì)算保真度指數(shù)，用稀釋緩沖液稀釋限制酶，并且將甘油濃度恒定保持在5%。在本文使用的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件中，λDNA底物濃度為1μg，并且總反應(yīng)體積為50μ1。為了保持酶體積為10%，酶以5μ1的體積加入。這等于在30μ1總體積中3μ1限制酶消化的0.6μg的底物。在NEB1、NEB2、NEB3、NEB4和NEBBamHI緩沖液中，從1到32768的12連續(xù)稀釋的3μ1WTBamHI和BamHI(Ε86Ρ)在37°C下對(duì)0.6mgλDNA消化1小時(shí)。表5在不同緩沖液中，WT和突變體BamHI的保真度指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>5.針對(duì)高保真度突變體的BamHI的進(jìn)一步改進(jìn)在一小時(shí)水平，BamHI(Ε86Ρ)表現(xiàn)為好的高保真度BamHI突變體。然而，盡管Ε86Ρ的星號(hào)活性在一小時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到，但是當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)(例如過(guò)夜或14小時(shí))，星號(hào)活性帶出現(xiàn)。(圖3)。繼續(xù)進(jìn)行對(duì)改進(jìn)高保真度BamHI的研究。6.其他帶電荷的和極性殘基的突變?cè)赟EQIDNO:19中位置2、4、5、6、10、11、13、14、18、19、20、43、51、62、69、70、76、77、78、81、87、89、94、98、101、104、107、111、113、132、133、135、137、160、167、200、204、205、207、208、209、211、213處，將其他帶電荷的殘基(Arg、Lys、His、Asp、Glu)突變?yōu)锳la。在pUC19-BamHI(K30A)的模板上進(jìn)行突變。在SEQIDNO:19的位置9、17、26、32、36、41、42、44、46、50、65、66、71、72、75、96、103、114、118、119、123、150、151、153、157、165、169、184、186、195、199、202處，將其他極性殘基(Ser、Thr和Tyr)突變?yōu)锳la，而將Tyr突變?yōu)镻he。通過(guò)使用相似的突變和篩查方法，發(fā)現(xiàn)下列突變具有減少的星號(hào)活性K30A/K87A、E86P/K87E、E86A/Y165F和K30A/E167A。鑒定E86P/K87E為在存在另外的DMSO情況下具有改進(jìn)性質(zhì)的突變體。然而，在正常反應(yīng)緩沖液中該突變體的活性比WTBamHI的活性低得多。進(jìn)行下列突變組合E86P/Y165F、E86P/E167A、E86P/Y165F/E167A、K30A/Y165F/E167A、K30G/Y165F/E167A、K30A/Y165F/E167A、E86A/Y165F/E167A。它們都具有低活性。到現(xiàn)在為止，發(fā)現(xiàn)對(duì)BamHI星號(hào)活性，E167A和Y165F具有強(qiáng)效果，K87A具有中等效果，以及K30A和E86A具有弱效果。E86P是在1小時(shí)水平而非過(guò)夜地減少星號(hào)活性的特異性突變。7.將E167和Y165突變?yōu)樗衅渌麣埢趐UC19-BamHI中，將E167突變?yōu)樗衅渌臍埢?，這通過(guò)將密碼子改變?yōu)镚CA-A1a、TGC-Cys、GAC-Asp、TTC-Phe、GGT-G1y、CAC-His、ATC-lie、AAA-Lys,CTG-Leu、ATG-Met、AAC-Asn、CCG-Pro、CAG-Gin、CGT-Arg、TCC-Ser,ACC-Thr,GTT-Val、TGG-Trp和TAC-Tyr進(jìn)行。在比較所有的突變體之后，優(yōu)選E167T突變，而與E167A相比，E167R、E167K、E167L和E167I突變示出在減少星號(hào)活性方面的改進(jìn)。也將Y165突變?yōu)樗衅渌被釟埢?，這通過(guò)將相應(yīng)的密碼子改變?yōu)镚CT——Ala,TGC-Cys,GAC-Asp,GAA-Glu、GGT-GlyXAC-His,ATC-lie,AAA-Lys,CTG-Leu、ATG-Met、AAC—Asn、CCG-Pro、CAG-Gin、CGT-Arg、TCC-Ser、ACC-Thr、GTT-Val、TGG-Trp進(jìn)行。在比較所有的突變體之后，Y165F的存在導(dǎo)致顯著的切割活性，而剛剛在上文列出的其他突變示出低活性或沒(méi)有切割活性。8.對(duì)BamHI(E167T)進(jìn)一步突變?cè)趐Uc19-BamHI(E167T)的模板上，將所有帶電荷的和極性殘基突變?yōu)锳la，方法同上。作為優(yōu)選突變，將E163A/E167T鑒定為BamHI_HF。9.BamHI-HF與WTBamHI的比較在E163處引入突變產(chǎn)生減少熱穩(wěn)定性的BamHI突變體，這與突變P173A被加入其他負(fù)責(zé)減少星號(hào)活性的突變時(shí)一樣。與BamHI(E86P)不同，BamHI-HF在NEB1-4緩沖液中過(guò)夜反應(yīng)沒(méi)有顯著的星號(hào)活性。圖4示出在NEBl和NEB2中的結(jié)果。因此，選擇BamHI(E163A/E167T)為優(yōu)選的高保真度BamHI。在37°C下，在所有四種NEB緩沖液中，用稀釋劑A，在λDNA底物上，測(cè)量BamHI-HF的保真度指數(shù)，并且與WT酶比較。表6=BamHI-HF和WTBamHI的比較BamHI-HFWTBamHI緩沖液活性保真度指數(shù)活性保真度指數(shù)改進(jìn)因子NEBl100%>800050%4>1000------ΝΕΒ250%>4000100%16>250ΝΕΒ312.5%>250100%12>8ΝΕΒ450%>400050%4>1000在NEBl中，BamHI-HF具有最高的活性，保真度指數(shù)為彡8000，在ΝΕΒ2和ΝΕΒ3中，WTBamHI具有最高的活性，并且最高的FI為32?？侳I改進(jìn)因子——其為每種突變體和WT酶在最好的緩沖液中的FI的比率，是彡8000/32=250倍。10.BamHI的另外突變預(yù)測(cè)E163A/E167T/P173A具有優(yōu)選的星號(hào)活性減少，并且另外是熱不穩(wěn)定的。檢測(cè)(E86P/K87S/K88P/E163S/E170T/P173A)。該突變體在比活性方面顯示10倍減少，而具有來(lái)自宿主細(xì)胞的補(bǔ)償增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。共享減少的熱穩(wěn)定性、減少的星號(hào)活性和可接受的比活性的其他BamHI突變體包括E86P/K87R/K88G/E163S/E170T/P173AE86P/K87P/K88R/E163S/E170T/P173A/E21IKE86P/K87T/K88R/E163S/E170T/P173A/N158SE86P/K87S/K88P/E163S/E170T/P173AE86P/K87G/K88S/E163S/E170T/P173AE86P/K87R/K88Q/E163S/E170T/P173A實(shí)施例2制備高保真度EcoRI1.EcoRI的表達(dá)對(duì)EcoRI的PCR使用下列引物GGTGGTGCATGCGGAGGTAAATAAATGTCTAATAAAAAACAGTCAAATAGGCTA(SEQIDNO73)GGTGGTGGTACCTCACTTAGATCTAAGCTGTTCAAACAA(SEQIDNO74)然后，用第二對(duì)限制性內(nèi)切核酸酶——SphI和Acc65I——消化PCR產(chǎn)物，并且連接入用同樣的第二對(duì)限制性內(nèi)切核酸酶消化的PUC19。然后，連接的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入用pACYC-MlucIM預(yù)修飾的感受態(tài)大腸桿菌。2.EcoRI的誘變靶氨基酸殘基的最初選擇是EcoRI與其同切點(diǎn)酶RsrI比較的結(jié)果，RsrI的星號(hào)活性也是已知的。EcoRI對(duì)RsrI.....4KKQSNRLTEQHKLSQGVIGIF⑶YAKAHDLAVGEVSKLVKKALSNEYPQL53II.III.IIII|.Ml.||.ιI.|10KGQALRLGIQQELGGGPLSIFGAAAQKHDLSIREVTAGVLTKLAEDFPNL59.....54SFRYRDSIKKTEINEALKKIDPDLGGTLFVSNSSIKPDGGIVEVKDDYGE103|.ιιIIIIlIlIII··11:11111Illl60EFQLRTSLTKKAINEKLRSFDPRLGQALFVESASIRPDGGITEVKDRHGN109.....104WRVVLVAEAKHQGKDIINIRNGLLVGKRGDQDLMAAGNAIERSHKNISEI153|||:|||.IllII.IIlIIIlllllllII110WRVILVGESKHQGNDVEKILAGVLQGKAKDQDFMAAGNAIERMHKNVLEL159.154ANFMLSESHFPYVLFLEGSNFLTENISITRPDGRVVNLEYNSGILNRLDR203|:||Imil.||:||||II.:|||||||·Il-111:1160RNYMLDEKHFPYVVFLQGSNFATESFEVTRPDGRVVKIVHDSGMLNRIDR209.....204LTAANYGMPINSNLCINKFVNHKDKSIMLQAASIYTQGDGREWDSKIMFE253IlllιιII||:|.I.I210VTASSLSREINQNYCENIVVRAGSFDHMFQIASLYCK..AAPffTAGEMAE257.254IMFDISTTSLRVLGRDL270(SEQIDNO75)I:·MM258AMLAVAKTSLRIIADDL274(SEQIDNO76)除了D91、E111和K113——其為已知的活性中心殘基，在兩種內(nèi)切核酸酶中，42個(gè)帶電荷的殘基是相同或相似的。帶電荷的殘基如下K4、R9、K15、K29、H31、D32、E37、E49、R56、R58、K63、E68、K71、D74、K89、E96、K98、K99、R105、H114、D118、K130、D133、D135、E144、R145、H147、K148、E152、E160、H162、E170、E177、R183、D185、R200、D202、R203、E253、R264、D269。將所有這些帶電荷的殘基突變?yōu)锳la(密碼子GCA、GCT、GCC或GCG)，并且突變的基因被如下擴(kuò)增和克隆擴(kuò)增混合物與在實(shí)施例1中使用的擴(kuò)增混合物相同(2μ1每種PCR引物，400mMdNTP，4單位De印VentDNA聚合酶，具有另外0、2、6μ1MgSO4WlOylIOxThermopol緩沖液，并且總反應(yīng)體積為100μ1)，并且加入到1μ1pUC19-EcoRI中。PCR反應(yīng)條件為94°C持續(xù)5min，然后25個(gè)循環(huán)的94°C30sec、55°C30sec、72°C3分30秒，并且在72°C下最后延伸時(shí)間為7min。PCR后，產(chǎn)物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Qiagen離心柱(Qiagen，Valencia,CA)純化。用20單位的DpnI消化16μ1的PCR產(chǎn)物1小時(shí)。將消化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入甲基化酶保護(hù)的感受態(tài)大腸桿菌制品。3.篩查EcoRI高保真度突變體對(duì)每一突變選取3個(gè)菌落，并且在具有氨芐青霉素和氯霉素的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。對(duì)PBR322和λDNA進(jìn)行活性分析以確保突變體與WTEcoRI至少具有相似的活性。然后，使用2倍連續(xù)稀釋的3μ1的細(xì)胞抽提物、12μ150%甘油、3μ1NEBl緩沖液、0.5μ1pBR322和11.5μ1水，檢測(cè)這些突變體，其在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。然而，沒(méi)有突變改進(jìn)星號(hào)活性的性能。從該結(jié)果，推導(dǎo)出在同切點(diǎn)酶之間有效突變不總是被識(shí)別為同源殘基。4.對(duì)剩余的32個(gè)帶電荷的殘基重復(fù)誘變?nèi)缭诓襟E2中所述的，通過(guò)靶向氨基酸殘基5、12、14、26、40、43、44、59、62、65、72、76、100、103、117、123、131、192、221、225、226、227、228、242、244、245、247、249、257、268、272和277，將所有剩余的32個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la。上面的數(shù)字相應(yīng)于EcoRI蛋白序列(SEQIDNO83)中的氨基酸位置。5.重復(fù)選擇從含有不同類型突變的每種樣品中選取四個(gè)菌落，并且在4ml具有CAM的LB中生長(zhǎng)。超聲處理后，在NEBl緩沖液中在正常甘油條件下，在λDNA底物上檢測(cè)細(xì)胞提取物。通過(guò)在3μ1ΝΕΒ2緩沖液中加入2倍連續(xù)稀釋的3μ1細(xì)胞提取物至0.5μ1的pUC19和23.5μ150%甘油以在反應(yīng)混合物中提供39.2%甘油的終濃度，具有相似活性的那些提取物在pUC19底物上再次檢測(cè)。在所有這些突變體中，發(fā)現(xiàn)Κ62Α是具有最少星號(hào)活性和高FI的突變。R9A、K15A、R123A、K130A、R131A、R183A突變體都示出星號(hào)活性的部分減少。令人感興趣地，含有靶向突變K5A的一個(gè)克隆示出部分改進(jìn)。另外地，測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)第二突變S2Y。分離這兩個(gè)突變顯示該分離物有效的突變是S2Y。D135A和R187AEcoRI也具有少得多的星號(hào)活性。然而，這些突變體的切割活性不是最佳的。6.EcoRI(K62A)與WTEcoRI的比較通過(guò)在四種不同NEB緩沖液中消化0.6μg的λDNA,在使用NEB稀釋緩沖液C進(jìn)行3倍連續(xù)稀釋中進(jìn)行并行比較(圖6)。EcoRI(Κ62Α)具有實(shí)質(zhì)上比WTEcoRI小的星號(hào)活性。通過(guò)測(cè)定EcoRI(Κ62Α)和WTEcoRI的保真度指數(shù)量度，進(jìn)行更定量的比較。保真度指數(shù)測(cè)量的條件與表2相同，其使用λDNA作為底物并使用稀釋緩沖液C。該反應(yīng)在37°C溫育1小時(shí)，并且在0.8%瓊脂糖凝膠上分析消化產(chǎn)物。表7=EcoRI(K62A)和WTEcoRI的保真度指數(shù)緩沖液EcoRI(K62A)IWTEcoRI"Mlι保真度指活性ι保真度指改進(jìn)因子數(shù)數(shù)NEBl50%3200050%250128NEB250%8000100%42000NEB312.5%4000100%25016NEB4100%32000100%48000EcoRI緩沖液12.5%4000100%250167.EcoRI的進(jìn)一步突變盡管對(duì)于λDNA底物，EcoRI(Κ62Α)并不明顯具有星號(hào)活性，但是使用Litmus28底物在10小時(shí)消化之后觀察到星號(hào)活性。與EcoRI緩沖液中的WTEcoRI相比，NEB4中的EcoRI(K62A)具有顯著減少的星號(hào)活性(圖7)。研究進(jìn)一步的改進(jìn)。通過(guò)如在實(shí)施例1中將K改變?yōu)橄鄳?yīng)密碼子，將EcoRI(K62)突變?yōu)樗衅渌陌被釟埢?。K62S和K62L與K62A相似。當(dāng)與EcoRI(K62A)相比時(shí)，EcoRI(K62E)具有彡100倍總保真度指數(shù)改進(jìn)因子，如在圖6中所示。EcoRI(K62E)被命名為EcoRI-HF。8.EcoRI-HF和WTEcoRI的比較通過(guò)在稀釋劑C中EcoRI-HF和WTEcoRIA上的FI測(cè)量，進(jìn)行定量比較。FI測(cè)量的條件與表2中相同，其使用ADNA作為底物。反應(yīng)條件是37°C持續(xù)1小時(shí)，并且在0.8%瓊脂糖凝膠上分析結(jié)果(圖8)。表8=EcoRI-HF和WTEcoRI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>發(fā)現(xiàn)總保真度指數(shù)改進(jìn)因子為64倍(EcoRI-HF在NEB4中的16000比NEB3中WTEcoRI的250)。實(shí)施例3工稈化高保真度ScaI1.ScaI的表達(dá)ScaI限制性內(nèi)切核酸酶和甲基化酶的序列在REBASE和GenBank中描述，并且在圖44(SEQIDNO97)中提供。將表達(dá)這些酶的基因插入質(zhì)粒以分別產(chǎn)生pRRS-Scal和pACYC184-ScaIM。然后，將pACYC184_ScaIM轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌宿主細(xì)胞。pRRS載體從pUC19得到，并且差異僅僅為存在多克隆位點(diǎn)。將pRRS-ScaIR轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-ScalM)以制造表達(dá)菌株。鋪板和細(xì)胞培養(yǎng)在30°C下進(jìn)行。2.ScaI的誘變ScaI具有兩種測(cè)序的同切點(diǎn)酶=LlaDI和NmeSI。然而，沒(méi)有已知的關(guān)于LlaDI或NmeSI的星號(hào)活性的信息，也沒(méi)有關(guān)于這些酶活性位點(diǎn)的任何信息。因此，最初選擇在該蛋白質(zhì)的位置4、8、11、12、14、18、25、27、30、37、39、40、43、46、51、57、61、68、72、74、80、86、97、103、108、112、114、119、120、121、127、128、129、133、135、139、140、141、147、152、156、158、159、161、162、171、172、175、179、182、184、187、172、175、192、193、195、200、222、227處所有58個(gè)帶電荷的殘基進(jìn)行靶向突變。上面的數(shù)字相應(yīng)于ScaI蛋白序列(SEQIDNO97)中的氨基酸位置。引物設(shè)計(jì)方法和PCR方法與對(duì)實(shí)施例1中BamHI和實(shí)施例2中EcoRI描述的相似。通過(guò)改變退火溫度和DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)誘變。用DpnI消化PCR產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌(pACYC184-ScaIM)。3.Seal高保真度突變體的選擇選取來(lái)自ScaI突變體的每個(gè)突變體的4個(gè)菌落，并且在30°C下、4ml具有IOOyg/mlAmp和33μβ/πι1Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。將每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行超聲處理，并且在NEB2緩沖液中對(duì)λDNA檢測(cè)活性。明顯具有活性的那些以10、100和1000倍稀釋再次檢驗(yàn)。因?yàn)镾caI具有非常顯著的星號(hào)活性，所以對(duì)于突變體對(duì)WT限制性內(nèi)切核酸酶，星號(hào)活性帶容易比較。具有減少的星號(hào)活性的那些用使用NEB稀釋緩沖液A進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋再次檢驗(yàn)。對(duì)每一突變體測(cè)量FI。對(duì)于NEB2緩沖液中的WTSeal，F(xiàn)I為1/8。發(fā)現(xiàn)具有相似活性水平的四種突變體與WTScaI相比具有大量減少的星號(hào)活性。突變體#6_3ScaI與WTScaI相比具有2倍的活性并且FI為4或32倍。#26-2ScaI與WT相比具有2倍的活性并且FI為8或64倍；#28-2ScaI與WT相比具有2倍的活性并且FI為120或1000倍；#54-3與WT具有相似的活性，并且FI為WT的250或2000倍。四種突變體#6_3、#26-2、#28-2和#54_3ScaI在存在36.7%甘油的情況下進(jìn)一步檢測(cè)消化λDNA底物。#54-3在減少星號(hào)活性方面示出比其他3種突變體更大的提高。在提取質(zhì)粒后，測(cè)序#6-3，并且發(fā)現(xiàn)其具有R18A的突變。測(cè)序#26-2，并且發(fā)現(xiàn)其具有R112A的突變。測(cè)序#28-2，并且發(fā)現(xiàn)其具有Ε119Α的突變。這些突變被預(yù)測(cè)到。然而，發(fā)現(xiàn)#54-3具有雙突變體——H193A/S201F。S201F是在PCR期間發(fā)生的自發(fā)第二突變，并且位于Η193Α突變的引物區(qū)域外。為了理解哪個(gè)殘基主要負(fù)責(zé)星號(hào)活性的減少，使用下列引物，將單一突變(S201F)引入ScaI5，-GATTGGGTGGCGCAGAAATTTCAAACGGGCCAGCAGTCG-3，(SEQIDNO77)5，-CGACTGCTGGCCCGTTTGAAATTTCTGCGCCACCCAATC-3，(SEQIDNO:78)。證實(shí)Seal(Η193Α),Seal(S201F)和Seal(H193A/S201F)的序列。在5%和37%甘油水平下，比較三種突變體和WTScaI(圖9)。與僅微弱有助于FI的Η193Α相反，S201F明顯有助于FI。然而，這兩種突變?cè)谔岣逨I方面表現(xiàn)是加和的。在5%甘油中，S201F沒(méi)有顯示星號(hào)活性，但是在37%甘油中顯示一些星號(hào)活性。在5%甘油中，Η193Α具有一些星號(hào)活性，在37%甘油中具有顯著的星號(hào)活性。然而，對(duì)于這兩種突變的組合，在5%或37%甘油中，都沒(méi)有檢測(cè)到星號(hào)活性。該發(fā)現(xiàn)不但示出具有羥基的氨基酸可以是星號(hào)活性的主要活性殘基，而且該突變的正確組合可以推動(dòng)保真度提高到非常高的水平。如果帶電荷的殘基的突變不能改進(jìn)星號(hào)活性，這里觀察到對(duì)Ser、Thr和Tyr的突變可成功提高保真度指數(shù)。將Seal(H193A/S201F)標(biāo)記為Scal-HF。4.ScaI-HF和WTScaI的比較37°C下，在不同的NEB緩沖液中，用NEB稀釋緩沖液A進(jìn)行的2.5倍連續(xù)稀釋下，對(duì)4種不同的NEB稀釋液中的IugADNA,比較ScaI-HF和WTSeal,1小時(shí)(圖10)。表9=ScaI-HF與WTScaI的保真度指數(shù)的比較ScaI-HFWTSealT緩沖液生ι保真度攝f活性ι保真度指數(shù)改進(jìn)因子NEBl12%2506%1/6416000NEB2100%120100%182000NEB3Wo200025%4500NEB4100%~2501%1/328000在NEB2和NEB4緩沖液中，ScaI-HF表現(xiàn)最好，其中最好的FI為250；在NEB2緩沖液中，WTScaI表現(xiàn)最好，其中FI為1/8?？侳I改進(jìn)因子為250/(1/8)=4000。實(shí)施例4工程化高保真度SalIl.Sall的表達(dá)SalI在用placzzl-SallR和pACYC_Hpyl66IIM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)，其中placzzl是PUC19質(zhì)粒，其利用Iac啟動(dòng)子表達(dá)插入到鄰近多拷貝位點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶基因。Hpyl66IIM保護(hù)SalI的外部4個(gè)堿基。2.SalI的誘變使用在先前實(shí)施例中相似的PCR方法，將SalI的86個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la5、6、8、9、12、13、19、27、31、34、35、37、42、43、45、50、60、63、65、67、73、82、83、84、90、93、97、100、101、103、107、109、111、114、116、119、126、129、131、134、140、143、145、147、148、156、157、164、168、172、173、174、180、181、186、190、191、193、210、218、226、232、235、237、238、244、246、250、256、257、258、259、260、261、264、266、271、275、297、300、304、305、306、308、309,311ο上面的數(shù)字相應(yīng)于SalI蛋白序列(SEQIDNO94)中的氨基酸位置。突變體在30°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。3.SalI-HF的選擇SalI-HF的選擇如在前面實(shí)施例中描述的進(jìn)行。主要差別是SalI的星號(hào)活性在粗提物中不能容易地分析——不論在5%甘油或更高甘油濃度中。甘油不僅促進(jìn)SalI的星號(hào)活性，而且極大地抑制同源活性。在5%甘油和37%甘油中，對(duì)HindIII消化的λDNA分析活性突變體。在所有4種NEB緩沖液中，檢測(cè)突變體#22、#26、#29、#31、#43和#51的切割活性。在不同條件和底物中數(shù)輪比較后，發(fā)現(xiàn)#31——SalI(R107A)——是優(yōu)選的突變體，其保留高的切割活性，但是顯示大量減少的星號(hào)活性。將SalI(R107A)標(biāo)記為SalI_HF。4.SalI-HF和WTSalI的比較測(cè)定SalI-HF和WTSalI的FI(圖11)。結(jié)果如在表10(下面)中所示出的表10SalI-HF和WTSalI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>在NEB2和NEB4緩沖液中，SalI-HF表現(xiàn)最好，其中FI都彡2000;WTSalI在NEB3緩沖液中表現(xiàn)最好，其中FI為4?？侳I改進(jìn)因子為≥2000/4=≥500。實(shí)施例5工程化高保真度SphI1.SphI的表達(dá)在大腸桿菌(placzzl-SphIR、pACYC184-CviAIIM)中表達(dá)SphI。CviAIIM保護(hù)SphI的內(nèi)部四個(gè)堿基。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.SphI的誘變使用在實(shí)施例1至實(shí)施例4中描述的方法，將SphI的所有帶電荷的殘基突變?yōu)锳la。進(jìn)行共71個(gè)突變3、5、12、18、21、24、25、30、31、35、43、46、51、54、57、58、60、61、72、75、77、78、87、90、91、95、100、104、107、108、110、113、120、123、124、125、129、130、131、139、140、142、146、147、155、157、159、164、170、172、173、175、178、184、186、190、194、196、197、198、206、207、209、212、215、221、227、230、231、232、235。上面的數(shù)字相應(yīng)于SphI蛋白序列(SEQIDNO98)中的氨基酸位置。3.SphI-HF的選擇每種突變的四個(gè)菌落在在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜?；钚赃x擇主要針對(duì)NEB2中的5%甘油和30%甘油中的pBR322。使用前面實(shí)施例的經(jīng)驗(yàn)，高保真度SphI的選擇是簡(jiǎn)單的。發(fā)現(xiàn)SphI突變體D91A、K100A、D139A和D164A顯著減少SphI中的星號(hào)活性。在它們中，K100A是具有最小星號(hào)活性的優(yōu)選突變。SphI(KlOOA)被命名為SphI-HF。4.SphI-HF和WTSphI的比較在它們各自優(yōu)選的緩沖液中，并行進(jìn)行SphI-HF和WTSphI的比較。使用NEB稀釋緩沖液A，將SphI-HF2倍連續(xù)稀釋，并且在NEB4中反應(yīng)，使用NEB稀釋緩沖液B，將WTSphI2倍連續(xù)稀釋。對(duì)λDNA的消化在圖12中進(jìn)行比較。表11SphI-HF和WTSphI的FI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在NEB4中，SphI-HF表現(xiàn)最好，其中FI彡2000；WTSphI在NEBl或NEB2中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是64?？侳I改進(jìn)因子為彡32。實(shí)施例6工程化高保真度PstI1.PstI的表達(dá)從大腸桿菌(pACYC-HpyCH4VM、pra594-PstIR)表達(dá)PstI。HpyCH4VM保護(hù)PstI的內(nèi)部四個(gè)堿基。PPR594是具有Amp抗性和ptac啟動(dòng)子的表達(dá)載體。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)，然后通過(guò)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物過(guò)夜。2.PstI的誘變使用在先前實(shí)施例中描述的方法，將92個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la。這些是8、10、11、14、25、26、38、40、41、44、45、47、58、61、63、66、67、69、73、74、77、78、82、85、88、91、92、94、95、99、104、105、116、119、127、128、136、142、145、146、150、151、152、156、159、169、170、174、176、179、180、184、188、191、197、202、204、207、212、214、217、218、226、227、228、231、236、237、238、239、240、246、251、257、258、261、263、273、282、284、286、287、295、297、302、305、306、309、313、314、319和320。上面的數(shù)字相應(yīng)于PstI蛋白序列(SEQIDNO91)中的氨基酸位置。在用DpnI消化PCR產(chǎn)物后，將樣品轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌(pACYC_HpyCH4VM)，并且在具有Amp和Cam的LB板上生長(zhǎng)。3.PstI-HF的選擇PstI-HF的選擇與前面的樣品相似。在5%甘油下，在λDNA上檢測(cè)正?；钚悦富钚裕⑶以讦ウ?緩沖液和20%DMSO的條件下在pBR322底物上檢測(cè)星號(hào)活性。DMSO比相同濃度的甘油更顯著地增強(qiáng)星號(hào)活性。在選擇期間，#26、#56和#65與WT相比，具有減少的星號(hào)活性。當(dāng)對(duì)每一個(gè)測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)突變?yōu)镈91A、E204G和K228A/A289V。將突變體#26PstI(D91A)標(biāo)記為Pstl-HF。4.PstI-HF和WTPstI的比較在NEB1-4緩沖液中，對(duì)λDNA底物，分別測(cè)量PstI-HF和WTPstI的FI。稀釋緩沖液是NEB稀釋緩沖液C。比較如在圖13中所示，并且結(jié)果在表12(下面)中列出。表12=PstI-HF和WTPstI的比較PstI-HFWTPstI緩沖液活性保真度指數(shù)活性保真度指數(shù)改進(jìn)因子NEBl12.5%>25050%32>8-------<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在ΝΕΒ2和ΝΕΒ4緩沖液中，PstI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI為彡2000；WTPstI在NEB3緩沖液中表現(xiàn)最好，其中FI為120。總FI改進(jìn)因子為彡2000/120=16倍。實(shí)施例7工稈化高保真度NcoIl.Ncol的表達(dá)在大腸桿菌(pSYX20-NcoIM、pRRS_NcoIR)中實(shí)現(xiàn)NcoI的表達(dá)。pRRS是pUC19衍生質(zhì)粒，并且PSYX20是與pRRS載體相容的低拷貝數(shù)質(zhì)粒。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp和卡那霉素(Kan)的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.NcoI的誘變將NcoI中所有66個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la。這些殘基是7、8、19、22、27、30、31、32、33、37、39、42、46、55、56、61、62、64、68、69、75、84、88、89、92、93、95、97、100、116、136、144、146、162、166、170、178、183、185、187、188、189、196、199、202、204、209、211、212、213、216、219、227、229、237、241、244、250、251、257、259、261、268、279、282、285。上面的數(shù)字相應(yīng)于NcoI蛋白序列(SEQIDNO88)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后進(jìn)行DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pSYX20-NcoIM)。3.NcoI-HF的選擇NcoI-HF的選擇與PstI-HF的選擇相似。如上所述，在5%甘油下，用λDNA作為底物，檢測(cè)活性。使用PBR322或λ在19%DMSO中測(cè)定星號(hào)活性。發(fā)現(xiàn)下面的突變改進(jìn)星號(hào)活性A2T/R31A、D56A、H143A、E166A、R212A和D268A。在這些突變體中，選擇NcoI(A2T/R31A)為NcoI-HF。4.NcoI-HF和WTNcoI的比較在NEB1-4緩沖液中，對(duì)λDNA,分開(kāi)測(cè)定NcoI-HF和WTNcoI的FI。比較在圖14中示出，并且結(jié)果在表13(下面)中列出。表13=NcoI-HF和WTNcoI的比較NcoI-HFWTNcoI<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在ΝΕΒ4中，NcoI-HF示出最大的星號(hào)活性減少，其中優(yōu)選的FI為彡16000；WTNcoI在ΝΕΒ1、ΝΕΒ2和ΝΕΒ4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI為120?？侳I改進(jìn)因子為彡16000/120=125。實(shí)施例8工稈化高保真度NheI1.NheI的表達(dá)NheI在用pACYC-NhelM和placzzl-NhelR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。placzzl是PUC19衍生質(zhì)粒。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.NheI的誘變將NheI中所有92個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la，其為下面的殘基5、6、7、14、17、19、22、25、28、31、38、39、42、47、49、52、56、58、59、60、64、74、75、76、77、80、91、93、104、105、110、112、116、117、123、126、130、131、133、135、137、147、149、152、159、160、165、167、170、171、174、179、183、195、202、205、207、209、210、211、214、216、218、221、225、231、241、243、244、250、252、256、257、259、264、266、267、281、285、287、288、289、291、297、300、307、313、315、318、321、324、325。上面的數(shù)字相應(yīng)于NheI蛋白序列(SEQIDNO89)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后進(jìn)行DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-NhelM)。3.NheI-HF的選擇根據(jù)前面的實(shí)施例，進(jìn)行NheI-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)和星號(hào)活性分析包含NEB4緩沖液以及分別5%甘油和39%甘油中的pBR322作為底物。發(fā)現(xiàn)僅一種突變顯著改進(jìn)NheI。這是E77A。選擇NheI(E77A)作為Nhel-HF。4.NheI-HF禾ΠWTNheI的比較在ΝΕΒ1-4緩沖液的每一種中，在pXba上，分開(kāi)測(cè)定NheI-HF和WTNheI的FI，pXba是含有來(lái)自腺病毒的XbaI消化片段的質(zhì)粒底物。比較在圖15中示出，并且結(jié)果在表14(下面)中列出。表14=NheI-HF禾口WTNheI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在NEBl緩沖液中，NheI-HF示出最佳活性，其中其FI為彡128,000。WTNheI在NEBl和NEB4緩沖液具有最大的活性，其中其最佳FI是32。所以，總FI改進(jìn)因子為彡128，000/32=^4000。實(shí)施例9工稈化高保真度ssdiLSspI的表達(dá)從用pACYC-SspIM和placzzl-SspIR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)Sspl。placzzl是pUC19衍生質(zhì)粒。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.SspI的誘變將SspI中所有81個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la；這些是3、8、12、13、18、19、20、35、40、42、44、47、52、60、62、65、68、69、72、74、76、77、78、79、83、85、88、89、90、96、100、108、109、118、119、127、128、129、131、132、137、144、153、154、155、156、158、165、168、170、172、177、178、179、181、185、186、187、191、194、195、197、202、204、215、222、229、237、240、246、250、256、257、259、260、264、265、267、268、269、274。上面的數(shù)字相應(yīng)于SspI蛋白序列(SEQIDNO99)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后進(jìn)行DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-SspIM)。3.SspI高保真度突變體的選擇在NEB4緩沖液以及分別5%甘油和39%甘油中，使用ΦΧ174底物，進(jìn)行NheI的標(biāo)準(zhǔn)同源和星號(hào)活性分析。突變體#16(H65A)、#20(K74A)、#23(E78A)、#26(E85A)、#28(E89A)、#33(K109A)、#34(E118A)、#52(R177A)、#62(K197A)、#67(D229A)都示出減少的星號(hào)活性。K109A示出星號(hào)活性的最大減少。決定尋求星號(hào)活性的進(jìn)一步改進(jìn)。4.進(jìn)一步突變將最初鑒定為Tyr的所有殘基突變?yōu)镻he，而將其他殘基CyS、Phe、Met、ASn、Gln、Ser,Thr和Trp突變?yōu)锳la。該組包括在下列位置處的95個(gè)殘基突變2、6、7、9、10、13、22、25、26、27、29、30、32、33、34、39、41、51、53、55、56、57、58、59、61、63、71、75、81、84、87、91、94、98、104、106、107、110、111、113、114、123、125、134、136、139、140、141、142、143、146、152、157、159、160、164、173、175、180、183、190、192、193、196、198、199、201、205、207、211、214、218、219、220、221、223、225、226、227、228、230、232、233、235、238、239、241、249、254、255、272、275、276、277、280。上面的數(shù)字相應(yīng)于SspI蛋白序列(SEQIDNO113)中的氨基酸位置。通過(guò)上面相同的方法，進(jìn)行PCR和選擇。在這些突變體中，發(fā)現(xiàn)Y98F具有最少的星號(hào)活性，并且其在這方面比SspI(K109A)好。將SspI(Y98F)標(biāo)記為SspI-HF，并且作為生產(chǎn)株儲(chǔ)存。5.SspI-HF和WTSspI的比較在NEB1-4緩沖液中，使用λDNA底物，分開(kāi)測(cè)定SspI-HF和WTSspI的FI。稀釋劑是NEBC。比較在圖16中示出，并且結(jié)果在表15(下面)中列出。表15=SspI-HF和WTSspI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在NEB4中，SspI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是500；WTSspI在NEB1、NEB2禾口NEB4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是64?？侳I改進(jìn)因子為500/64=8。實(shí)施例10工稈化高保真度NotI1.NotI的表達(dá)NotI在NEB4緩沖液中具有顯著的星號(hào)活性，并且在NEB3緩沖液中具有較少的星號(hào)活性。工程化NotI以在任何NEB緩沖液中減少星號(hào)活性。NotI在用pACYC184-EagIM和placzz2-NotIR轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌中表達(dá)。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.NotI的誘變將NotI中所有97個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la,如下列殘基:2、4、8、10、17、21、22、26、31、34、35、36、49、52、57、59、62、72、74、75、77、84、87、96、97、105、117、121、122、125、126、129、130、133、140、141、145、150、152、156、160、165、167、174、176、177、182、187、189、193、194、200、205、208、210、219、224、225、227、236、237、245、251、253、267、271、272、280、283、290、292、294、296、304、306、308、310、314、319、321、323、327、331、335、336、339、353、354、356、358、361、365、367、368、369、370、378、382。上面的數(shù)字相應(yīng)于NotI蛋白序列(SEQIDNO90)中的氨基酸位置。將突變體引入酶的方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入含有pACYC-EaglM的大腸桿菌。3.NotI-HF的選擇如在前面實(shí)施例中描述的，進(jìn)行NotI-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)同源和星號(hào)活性分析使用pXba底物，在NEB4緩沖液以及分別5%甘油和NEBExoI緩沖液(67mM甘氨酸-K0H，pH9.5,6.7mMMgCl2,IOmM2-巰基乙醇)以及37%甘油中進(jìn)行。#37(K150A)、#44(K176A)、#45(R177A)、#63(R253A)都示出減少的星號(hào)活性。K150A是優(yōu)選的減少星號(hào)活性的突變。選擇NotI(K150A)為Notl-HF。4.NotI-HF和WTNotI的比較在NEB1-4緩沖液中，使用pXba底物，分開(kāi)測(cè)定NotI-HF和WTNotI的FI。比較在圖17中示出，并且結(jié)果在表16(下面)中列出。表16=NotI-HF和WTNotI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>ND不可檢測(cè)，因?yàn)閮蓚€(gè)FI都是超出限度的不確定數(shù)。在NEB2中，NotI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是彡128000；WTNheI在NEB3中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是4000?？偙Ｕ娑戎笖?shù)改進(jìn)因子為>128000/400032。工程化NotI不但進(jìn)一步提高NotI的FI，而且改變最佳緩沖液。實(shí)施例11工稈化高保真度SacI1.SacI的表達(dá)SacI在用pLG_SacIM和pRRS_SacIR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。pRRS是pUC19衍生質(zhì)粒，pLG是低拷貝相容性質(zhì)粒。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp和Kan的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.SacI的誘變將SacI中所有101個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la，如下列殘基6、7、11、15、16、19、24、25、29、30、39、40、42、45、58、61、62、63、65、67、70、71、72、74、75、76、81、85、94、98、104、105、114、116、120、123、127、129、133、134、141、143、144、145、146、150、151、154、169、170、172、181、187、196、197、200、201、211、216、220、221、224、227、228、232、238、240、246、248、250、258、270、271、277、281、288、289、295、296、297、299、303、306、313、314、321、322、324、332、336、337、340、342、344、345、347、349、350、353、357。上面的數(shù)字相應(yīng)于SacI蛋白序列(SEQIDNO93)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pLG-SacIM)。3.SacI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成SacI-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)活性檢查使用pUC19、在NEB4中、具有5%甘油，并且星號(hào)活性檢查在39%甘油下、在NEB4緩沖液中對(duì)pUC19進(jìn)行。#52SacI(Q117H/R154A/L284P)和#60SacI(Q117H/R200A)都具有減少的星號(hào)活性，和SacIQ117H/R200A證明是優(yōu)選的突變。Q117H是來(lái)自模板的遺留突變，其不影響SacI的活性。選擇SacI(Q117H/R200A)為SacI-HF。4.SacI-HF和WTSacI的比較在NEB1-4緩沖液中，對(duì)pXba底物，分開(kāi)測(cè)定SacI-HF和WTSacI的FI。比較在圖18中示出，并且結(jié)果在表17(下面)中列出。表17=SacI-HF和WTSacI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)施例12工稈化高保真度PvuIILPvuII的表達(dá)PvuII在用pACYC-PvuIIM和placzz2_PvuIIR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。Placzz2是pUC19衍生質(zhì)粒；pACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.PvuII的誘變將PvuII中所有47個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la，如下列殘基3、5、8、11、15、18、21、25、26、30、34、38、54、55、58、61、66、68、70、75、78、83、84、85、93、95、105、110、114、116、118、119、121、125、126、128、129、130、134、136、137、138、143、147、151、152和155。上面的數(shù)字相應(yīng)于PvuII蛋白序列(SEQIDNO92)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-PvuIIM)。3.PvuII高保真度突變體的選擇PvuII-HF的選擇與前面的實(shí)施例相似。標(biāo)準(zhǔn)活性檢查使用入0嫩底物、在服84中、具有5%甘油，并且星號(hào)活性檢查在39%甘油下、在NEB4緩沖液中對(duì)pBR322進(jìn)行。沒(méi)有突變體具有高保真度PvuII的資格。4.另外的誘變步驟另外的誘變步驟是在PvuII中將所有Ser、Thr突變?yōu)锳la，將Tyr突變?yōu)镻he。突變的位置是:2、19、46、49、67、71、77、81、82、94、104、113、123、124、132、133、148、154和157。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-PvuIIM)。PvuII(T46A)表現(xiàn)具有比WTPvuII更少的星號(hào)活性，然而，期望進(jìn)一步改進(jìn)。將T46突變?yōu)樗衅渌被釟埢?，這通過(guò)將密碼子改變?yōu)橄鄳?yīng)氨基酸進(jìn)行。在所有這些突變中，T46H、T46K、T46Y、T46G都比T46A更好。選擇T46G作為PvuII_HF。5.PvuII-HF和WTPvuII的比較在NEB1-4緩沖液中，使用稀釋劑A，分開(kāi)測(cè)定PvuII-HF和WTPvuII對(duì)pBR322的FL·比較在圖19中示出，并且結(jié)果在表18(下面)中列出。表18=PvuII-HF和WTPvuII的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在ΝΕΒ4中，PvuII-HF表現(xiàn)最好，其中FI是500；WTPvuII在NEBl和NEB4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是250?？侳I改進(jìn)因子為500/250=2。盡管總FI改進(jìn)因子對(duì)PvuII不高，但是在NEB4中FI提高2000倍。實(shí)施例13工稈化高保真度MfeIl.Mfel的表達(dá)MfeI在用pACYC-MluCIM和pRRS-MfelR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。pRRS是pUC19衍生質(zhì)粒；PACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。MluCIM甲基化AATT，其是MfeI的內(nèi)部四個(gè)核酸序列。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.MfeI的誘變分三批進(jìn)行MfeI的誘變。第一批是所有的帶電荷的殘基，將其突變?yōu)锳la，如下列氨基酸位置5、9、19、24、36、39、44、45、47、48、50、60、61、64，65、72、83、87、90、92、93、98、100、101、103、107、109、110、115、119、120、121、124、132、135、142、143、144、153、155、158、159、161、162、164、165、171、172、175、181、184、187、188、192、195、196、198、199、200；第二批是具有羥基的所有殘基Ser、Thr和Tyr，其中Ser和Thr被改變?yōu)锳la，并且Tyr被改變?yōu)镻he0所述殘基是在4、7、21、28、38、40、43、53、74、75、76、81、89、91、112、122、127、134、136、157、167、170、173、177、185和200。第三批是殘基Cys,Phe、Met、Asn、Gin、Trp，都改變成Ala,所述殘基是在:10、12、13、25、26、29、31、32、35、51、55、67、68、77、78、84、88、96、102、105、117、123、126、141、148、149、152、168、169、174、176、178、179、180、183、191、193、194。上面的數(shù)字相應(yīng)于MfeI蛋白序列(SEQIDNO5)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-MluCIM)。3.MfeI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成MfeI-HF的選擇。在NEB4中，應(yīng)用5%甘油、使用ΦΧ174底物測(cè)定切割活性，并且在NEB4中，應(yīng)用39%甘油、使用ΦΧ174底物測(cè)定星號(hào)活性。該酶的顯著困難是許多突變改進(jìn)了酶的切割活性且星號(hào)活性減少，但是比WT酶需要更高的甘油濃度。MfeI(K50A)是一個(gè)實(shí)例，其在高濃度甘油中具有減少的星號(hào)活性和高切割活性，而在較低甘油濃度中，所述活性是低的。MfeI(Y173A)也減少星號(hào)活性。優(yōu)選的突變?yōu)镼13A/F35Y。F35Y的突變來(lái)自模板，并且Q13A是靶向突變。將MfeI(Q13A/F35Y)標(biāo)記為MfeI-HF。4.MfeI-HF禾口WTMfeI的比較在NEB1-4緩沖液中，對(duì)λDNA底物，分開(kāi)測(cè)定MfeI-HF和WTMfeI的FI，其中在NEB稀釋劑A中進(jìn)行稀釋。比較在圖20中示出，并且結(jié)果在表19(下面)中列出。表19=MfeI-HF禾口WTMfeI的比較MfeI-HFWTMfeIT"緩沖液性保真度指數(shù)活性保真度指IT改進(jìn)因子NEBl100%>1000100%32>32ΝΕΒ225%>25012.5%16>16ΝΕΒ313%>Τ63%8>2ΝΕΒ4100%>500100%32>16在NEBl和ΝΕΒ4中，MfeI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI為彡1000；在NEBl和ΝΕΒ4中，WTMfeI表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI為32?？侳I改進(jìn)因子是彡1000/32=32倍。實(shí)施例14工稈化高保真度HindIIILHindIII的表達(dá)HindIII在用pUC19-HindIIIRM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)，所述pUC19-HindIIIRM含有HindIII內(nèi)切核酸酶和甲基化酶基因。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.HindIII的誘變將HindIII中88個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la。這些是2、3、7、8、14、20、22、34、37、39、42、45、52、55、61、62、66、69、74、84、87、89、94、100、101、109、111、114、117、120、123、124、126、128、132、134、135、136、137、138、153、158、162、163、171、172、180、182、183、190、197、198、201、202、207、209、214、215、218、222、225、227、228、229、237、238、243、244、245、249、250、251、254、255、261、265、266、267、270、274、275、281、283、286、290、293、296、297。在位置4、11、15、17、18、19、21、23、26、27、30、31、36、38、46、57、58、59、60、63、64、76、77、80、82、83、88、91、99、102、103、104、112、113、116、118、121、122、125、131、133、139、143、146、147、148、149、151、152、154、155、157、159、160、164、168、169、170、178、184、185、187、188、189、191、193、194、195、199、200、203、204、206、210、211、212、213、216、217、219、220、221、224、230、232、233、236、240、241、246、252、253、256、258、262、263、264、277、278、279、280、284、287、288、294、295、299處，將所有殘基Cys、Met、Asn、Gin、Ser、Thr、Trp改變?yōu)锳la，而將Tyr改變?yōu)镻he。上面的數(shù)字相應(yīng)于HindIII蛋白序列(SEQIDNO85)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株ER3081。3.HindIII-HF的選擇使用與前面的實(shí)施例相似的方法，完成HindIII-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)活性檢查使用入0嫩、在服84中并具有5%甘油，并且星號(hào)活性在具有39%甘油的NEB4緩沖液中使用λDNA底物測(cè)量。發(fā)現(xiàn)HindIII的兩個(gè)突變體具有減少的星號(hào)活性。這些是HindIII(Κ198Α)和S188P/E190A。將HindIII(Κ198Α)標(biāo)記為HindIII-HF。4.HindiII-HF和WTHindi11的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，使用λDNA底物，用稀釋劑B，分開(kāi)測(cè)定HindIII-HF和WTHindIII的FI。比較在圖21中示出，并且結(jié)果在表20(下面)中列出。表20:HindIII-HF和WTHindIII的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在ΝΕΒ2中，HindIII-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡64000;WTHindIII在NEB2中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是250?？侳I改進(jìn)因子是4000/120=32。實(shí)施例15工稈化高保真度SbfIl.Sbfl的表達(dá)SbfI在用pUC19_SbfIRM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.SbfI的誘變將SbfI中78個(gè)帶電荷的殘基突變?yōu)锳la。這些殘基是5、8、15、18、23、27、30、34、46、49、50、53、58、63、66、70、71、74、81、82、83、85、86、87、90、94、103、115、120、121、127、132、135、136、143、144、147、150、152、154、164、169、170、183、184、187、188、192、196、204、206、208、213、214、215、218、219、226、228、230、233、237、238、239、241、248、251、253、257、258、259、260、262、266、282、284、285、288、293、297、299、304、305、307、311、316和322。也將SbfI中的Ser和Thr殘基突變?yōu)锳la。將Tyr突變?yōu)镻he。靶向下列位置3、4、5、10、13、16、31、35、38、54、55、56、68、76、78、80、88、109、111、116、119、129、131、137、146、162、174、197、198、201、205、210、224、252、263、270、272、286、298、315、321。也將下列位置的另外55個(gè)Cys、Phe、Met、Asn、Gln、Trp殘基突變?yōu)锳la:2、24、26、29、32、51、62、65、67、72、84、91、92、95、97、101、104、106、110、112、114、117、124、134、140、157、160、171、178、179、185、189、193、212、217、225、231、243、245、247、256、265、268、277、279、280、281、283、287、289、290、296、301、313和317。上面的數(shù)字相應(yīng)于SbfI蛋白序列(SEQIDNO96)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將突變的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株ER2984。3.SbfI-HF的選擇如在前面的實(shí)施例中描述的，完成SbfI-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)活性檢查使用λDNA、在ΝΕΒ4中并具有5%甘油，并且星號(hào)活性檢查針對(duì)λDNA在核酸外切酶I緩沖液中進(jìn)行。將SbfI(K251A)標(biāo)記為Sbfl-HF。4.SbfI-HF和WTSbfI的比較在NEB1-4緩沖液中，對(duì)λDNA，用稀釋劑C，分開(kāi)測(cè)定SbfI-HF和WTSbfI的FI。比較在圖22中示出，并且結(jié)果在表21(下面)中列出。表21SbfI-HF禾口WTSbfI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>在NEBl和ΝΕΒ4中，SbfI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是1000；WTSbfI在NEBl中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是8?？侳I改進(jìn)因子是1000/8=125倍。實(shí)施例16工稈化高保真度EagI1.EagI的表達(dá)EagI在用pBR322-EagIRM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。細(xì)胞在30°C下，在具有20μg/ml四環(huán)素的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.EagI的誘變將Asp、Glu、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Asn和Gln殘基突變?yōu)锳la。將Tyr突變?yōu)镻he0這些是下列殘基2、3、4、5、6、9、13、14、17、19、21、23、27、35、36、37、40、42、43、44、45、46、49、51、53、55、56、58、60、66、67、69、71、72、73、74、75、77、78、80、82、86、87、92、93、94、95、98、99、100、102、103、104、105、112、113、114、116、117、119、122、125、127、132、134、135、137、139、140、141、145、147、148、150、152、154、155、156、157、160、162、163、164、166、169、172、173、176、177、178、179、182、185、187、188、189、193、196、197、201、202、203、204、205、206、208、209、212、217、220、221、222、224、225、230、235、236、237、238、239、240、241、243、245、246、247、248、251、255、257、258、259、260、263、264、265、266、270、272、273、275、276、277、279、280、283、286、288、289、291、295、296。上面的數(shù)字相應(yīng)于EagI蛋白序列(SEQIDNO82)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株ER3081中，并且在具有四環(huán)素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)。3.EagI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例不同的方法，完成EagI-HF的選擇，所述方法使用高濃度甘油、高濃度DMSO或高pH。在粗提物中，因?yàn)楸磉_(dá)太低而不能示出星號(hào)活性，純化每一突變體以檢查星號(hào)活性會(huì)是非常冗長(zhǎng)的。根據(jù)前面的實(shí)施例，推斷與NEB3相比，在NEB4中HF內(nèi)切核酸酶傾向具有增加的切割活性。因此，粗提物中EagI的活性在NEB3和NEB4中都測(cè)量；選擇具有最高NEB4/NEB3比率的一個(gè)。將EagI(H43A)標(biāo)記為EagI_HF。4.EagI-HF和WTEagI的比較在NEB1-4緩沖液的每一個(gè)中，對(duì)pXba底物，分開(kāi)測(cè)定EagI-HF和WTEagI的FI。比較在圖23中示出，并且結(jié)果在表22(下面)中列出。表22=EagI-HF和WTEagI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>在NEB2和NEB4中，Eagl-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是500；WTEagI在NEB3和NEB4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是250?？侳I改進(jìn)因子是500/250=2。實(shí)施例17工稈化高保真度EcoRV1.EcoRV的表達(dá)EcoRV在用pACYC-EcoRVM和placzzl-EcoRV轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。Placzzl是PUC19衍生質(zhì)粒，并且pACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.EcoRV的誘變MCys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr禾口Trp殘基改變?yōu)锳la。將Tyr改變?yōu)镻he。這些是2、4、5、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19、21、25、27、29、31、35、36、37、38、41、42、44、45、47、48、49、53、54、57、58、59、61、64、65、67、68、69、70、71、72、74、75、76、78、79、81、82、84、85、86、90、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、123、125、126、127、128、131、132、136、138、139、140、143、144、145、146、147、149、150、151、152、154、155、157、158、161、163、164、167、169、171、172、173、174、179、183、185、186、187、188、191、193、195、196、197、198、199、201、203、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、226、227、228、229、230、231、232、234、235、236、237、238、239、241、242、244和245。上面的數(shù)字相應(yīng)于EcoRV蛋白序列(SEQIDNO84)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為Dpnl消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-EcoRVM)。3.EcoRV-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成EcoRV-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)活性檢查在NEB4中、應(yīng)用5%甘油使用pXba進(jìn)行，并且星號(hào)活性檢查針對(duì)pXba、應(yīng)用39%甘油在核酸外切酶I緩沖液中進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)EcoRV(D19A/E27A)與WTEcoRV相比具有減少的星號(hào)活性。將該突變體標(biāo)記為EcoRV-HF。對(duì)于該突變體，E27A是靶向突變，并且D19A是自發(fā)突變。雙突變體比D19A和E27A單突變體在星號(hào)活性方面具有更大的減少。4.EcoRV-HF和WTEcoRV的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)pXba底物，分開(kāi)測(cè)定EcoRV-HF和WTEcoRV的FI。比較在圖24中示出，并且結(jié)果在表23(下面)中列出。表23EcoRV-HF和WTEcoRV的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在ΝΕΒ2和ΝΕΒ4中，EcoRV-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡64000;WTEcoRV在NEB3中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是1000?？侳I改進(jìn)因子為>64000/1000=64。實(shí)施例18工稈化高保真度AvrIIl.Avrll的表達(dá)AvrII在用pUC19-AvrIIRM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。細(xì)胞在30°C下，在具有Amp的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.AvrII的誘變MCys>Asp、Glu、Phe>His、Lys>Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr禾口Trp殘基突變?yōu)锳la。將Tyr改變?yōu)镻he。這些是2、3、4、6、8、9、10、12、15、17、19、20、22、23、27、29、30、31、32、34、36、40、41、42、43、44、46、47、48、50、51、53、55、56、57、58、59、60、65、68、70、72、74、75、76、77、79、80、82、83、84、86、87、88、94、95、96、97、100、104、105、106、107、108、110、112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、126、127、129、130、131、132、134、136、139、142、143、144、145、150、151、152、153、154、156、157、158、161、163、164、165、166、168、169、173、174、177、178、181、182、184、186、187、188、189、190、191、192、195、198、200、202、206、207、211、215、216、220、223、224、226、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、243、244、245、246、248、249、253、255、256、260、262、264、265、266、267、268、269、270、272、274、276、277、278、279、280、281、284、285、286、288、289、290、291、299、302、303、304、305、306、308、310、312、314、315、316、318、321、322、324、325、328、331、333、335、337、338、339、340、342、343、346、347、348、350、351、353、354、355、356、358。上面的數(shù)字相應(yīng)于AvrII蛋白序列(SEQIDNO80)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株ER2984中。3.AvrII-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成AvrII-HF的選擇。切割活性在NEB4中應(yīng)用5%甘油使用pBC4測(cè)定，并且星號(hào)活性在具有39%甘油的ExoI緩沖液中應(yīng)用pBC4測(cè)定。突變體#16(M29A)、#57(E96A)、#60(Y104F)、#62(K106A)、#154(S127A)、#170(F142A)都示出改進(jìn)。將AvrII(Y104F)標(biāo)記為AvrII-HF。4.AvrII-HF和WTAvrII的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)T7DNA底物，使用稀釋劑B，分開(kāi)測(cè)定AvrII-HF和WTAvrII的FI。比較在圖25中示出，并且結(jié)果在表24(下面)中列出。表24=AvrII-HF和WTAvrII的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>在NEBl和NEB4中，AvrII-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是1000;WTAvrII在NEBl和NEB4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是64?？侳I改進(jìn)因子是1000/64=16。實(shí)施例19工稈化高保真度BstXI1.BstXI的表達(dá)BstXI在用pACYCBstXIMS和pUC19_BstXIR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。pACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。BstXI必須具有甲基化酶基因和特異性基因以具有甲基化酶功能。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.BstXI的誘變?nèi)缦?，在BstXI中，進(jìn)行237個(gè)氨基酸突變。將Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp突變?yōu)锳la。將Try突變?yōu)镻he0這些是4、6、7、9、11、12、14、15、17、18、20、21、22、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、42、43、46、48、50、53、54、57、58、59、60、62、63、64、65、66、71、72、73、75、76、78、80、81、82、83、84、86、89、91、93、94、95、96、97、98、103.105、106、108、110、111、112、114、117、118、120、123、124、125、126、127、128、129、130、131、137、138、139、141、142、144、145、146、148、151、152、153、154、155、156、159、162、163、166、168、169、171、172、173、174、175、176、177、178、182、185、188、189、191、193、194、195、196、198、199、201、204、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、223、228、229、230、233、235、236、238、239、240、244、245、248、249、250、253、254、255、258、259、260、261、263、264、265、267、268、269、272、276、277、278、279、280、282、285、286、287、288、289、291、293、294、295、300、301、302、304、305、306、308、309、312、314、317、318、319、320、323、324、325、326、330、331、333、334、335、337、343、344、345、346、347、349、353、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、367、369、371、373、374、376、377、378、379、380、381、382和383。上面的數(shù)字相應(yīng)于BstXI蛋白序列(SEQIDNO7)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-BstXIMS)。3.BstXI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成BstXI-HF的選擇。切割活性在NEB4中應(yīng)用5%甘油使用pBC4測(cè)定，并且星號(hào)活性在具有39%甘油的NEB4緩沖液中使用pBC4DNA底物測(cè)定。突變體#36(Y57F)、#44(N65A)、#48(E75A)、#49(N76A)和#124(K199A)都具有減少的星號(hào)活性。將BstXI(N65A)標(biāo)記為BstXI-HF。4.BstXI-HF和WTBstXI的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)λDNA底物，使用稀釋劑Α，分開(kāi)測(cè)定BstXI-HF和WTBstXI的FI。比較在圖26中示出，并且結(jié)果在表25(下面)中列出。表25=BstXI-HF和WTBstXI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>在NEB2和NEB4中，BstXI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡250;WTBstXI在NEB2、NEB3和NEB4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是32?？侳I改進(jìn)因子為>250/32=8。實(shí)施例20工稈化高保真度PciIl.Pcil的表達(dá)PciI在用pACYC-PcilM和placzzl-PcilR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。placzzl是PUC19衍生質(zhì)粒，pACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.PciI的誘變禾l」MCys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr，$PciI中151個(gè)氨基酸殘基。將Trp改變?yōu)锳la，和將Tyr改變?yōu)镻he。這些是2、3、4、6、8、9、10、11、12、14、17、18、19、21、24、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、41、44、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、60、63、67、68、69、71、74、75、78、80、81、82、85、86、91、92、95、97、98、101、103、104、107、109、113、114、115、118、119、120、121、122、124、126、127、129、130、131、132、133、135、136、137、138、143、145、146、147、148、149、151、152、153、154、155、157、158、159、161、164、165、167、172、175、178、179、180、182、184、185、186、190、192、193、196、197、198、199、200、202、203、206、207、209、210、215、218、221、222、228、229、230、231、232、233、234、235、237、238、239、241、242、243、244、246、247、248、253、254、255、256。上面的數(shù)字相應(yīng)于PciI蛋白序列(SEQIDNO15)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-PcilM)。3.PciI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成PciI-HF的選擇。切割活性在NEB4中應(yīng)用5%甘油使用SalI-切割pBR322測(cè)定，并且星號(hào)活性在具有39%甘油的ExoI緩沖液中使用SalI-切割pBR322測(cè)定。雙突變體PciI(E78A/S133A)具有減少的星號(hào)活性和強(qiáng)的切割活性。該突變體不是上面描述的靶向突變之一，而是偶然隨機(jī)事件。4.PciI-HF和WTPciI的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)pXba底物，使用稀釋劑A，分開(kāi)測(cè)定PciI-HF和WTPciI的FI。比較在圖27中示出，并且結(jié)果在表26(下面)中列出。表26=PciI-HF^PWTPciI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在ΝΕΒ2、ΝΕΒ3和ΝΕΒ4中，PciI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡2000；WTPciI在NEB3中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是120。總FI改進(jìn)因子為彡2000/120=16。實(shí)施例21工稈化高保真度HoaI1.HpaI的表達(dá)HpaI在用pACYC-MselM和placzzl-HpalR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。placzzl是PUC19衍生質(zhì)粒，pACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Cam的LB中生長(zhǎng)過(guò)夜。2.HpaI的誘變利用Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser和Thr突變HpaI中的156個(gè)氨基酸殘基。將Trp改變?yōu)锳la，和將Tyr改變?yōu)镻he。這些是7、8、9、13、14、16、17、19、20、21、22、23、26、27、29、30、33、34、35、36、37、38、40、41、42、46、47、48、50、51、56、57、59、60、65、67、69、71、72、74、75、78、79、80、81、82、83、84、85、86、89、91、93、94、95、99、100、104、105、106、108、109、110、113、115、117、119、121、122、123、124、127、128、130、131、133、135、136、137、138、139、141、142、146、147、149、150、152、156、158、159、160、162、164、165、166、167、168、169、170、172、173、176、177、180、181、182、184、185、187、188、190、191、192、193、195、196、197、202、204、206、208、209、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、228、230、231、233、234、235、236、237、238、240、241、242、243、244、245、247、248、249。上面的數(shù)字相應(yīng)于HpaI蛋白序列(SEQIDNO86)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-MselM)。3.HpaI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例不同的方法，完成HpaI-HF的選擇。在NEB2緩沖液中，使用λDNA底物，測(cè)定切割活性和星號(hào)活性。在ΝΕΒ2中，該HpaI具有比在ΝΕΒ4中多得多的星號(hào)活性，并且可在5%甘油中明顯觀察到。HpaI(Y29F)和HpaI(Ε56Α)都是優(yōu)選的具有減少星號(hào)活性的突變。將HpaI(Ε56Α)標(biāo)記為Hpal-HF。4.HpaI-HF和WTHpaI的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)λDNA底物，使用稀釋劑A，分開(kāi)測(cè)定HpaI-HF和WTHpaI的FI。比較在圖28中示出，并且結(jié)果在表27(下面)中列出。表27=HpaI-HF和WTHpaI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>在ΝΕΒ2中，HpaI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡2000；WTPciI在ΝΕΒ4中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是16?？侳I改進(jìn)因子為彡2000/16=120。實(shí)施例22工稈化高保真度AgeIl.Agel的表達(dá)AgeI在用pRRS-AgeIRM和psyx20_laclq轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。pRRS是pUC19衍生質(zhì)粒，psyX20-laCIq是低拷貝相容性質(zhì)粒，其帶有在IacIq啟動(dòng)子下表達(dá)的lacl。細(xì)胞在37°C下，在具有Amp和Kan的LB中生長(zhǎng)至200Klett單位，然后用0.5mMIPTG在25°C下誘導(dǎo)過(guò)夜。AgeI的表達(dá)極難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樗遣环€(wěn)定的。2.AgeI的誘變利用Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser和Thr突變AgeI中149個(gè)氨基酸殘基。將Trp改變?yōu)锳la，和將Tyr改變?yōu)镻he。這些是2、4、6、7、9、14、16、18、19、21、22、23、24、25、26、27、29、30、31、32、37、38、40、42、43、44、45、49、51、53、55、56、58、60、62、64、65、67、68、69、72、73、75、77、78、79、82、83、85、86、87、88、90、91、92、94、96、97、102、103、104、105、110、111、114、116、119、120、122、123、128、129、130、134、135、138、139、140、142、144、146、147、148、152、153、155、157、159、166、168、170、173、174、176、177、178、182、183、185、186、188、192、195、198、200、201、206、211、212、214、217、219、220、222、223、224、225、226、227、229、231、233、234、235、237、238、239、240、241、243、245、247、248、250、251、253、255、256、258、260、262、265、266、267、268、269、271、272。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(psyX20-laCIq)。上面的數(shù)字相應(yīng)于AgeI蛋白序列(SEQIDNO79)中的氨基酸位置。3.AgeI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成AgeI-HF的選擇。標(biāo)準(zhǔn)活性檢查在NEB4中應(yīng)用5%甘油使用pXba進(jìn)行，并且星號(hào)活性檢查在具有39%甘油的NEB4緩沖液中對(duì)pXba進(jìn)行。因?yàn)楸磉_(dá)系統(tǒng)的困難性，在獲得有意義的突變體之前，重復(fù)該選擇八次。兩個(gè)突變體——S201A和R139A——具有減少的星號(hào)活性，并且將R139A標(biāo)記為AgeI_HF。4.AgeI-HF和WTAgeI的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)pXba底物，使用稀釋劑A，分開(kāi)測(cè)定AgeI-HF和WTAgeI的FI。比較在圖29中示出，并且結(jié)果在表28(下面)中列出。表28=AgeI-HF和WTAgeI的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>在NEBl和ΝΕΒ4中，AgeI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡500；WTAgeI在ΝΕΒ3中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是16。總FI改進(jìn)因子為彡500/16=32。實(shí)施例23工稈化高保真度BsmBILBsmBI的表達(dá)BsmBI在用pACYC-BsmAIM、ptaczz2_BsmBIR和psyx20_laclq轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)。PtacZZ2是pUC19衍生質(zhì)粒，其攜帶誘導(dǎo)型ptac啟動(dòng)子，pACYC是低拷貝相容性質(zhì)粒。BsmAIM(GTCTC)遮蓋(cover)BsmBI(CGTCTC)特異性。psyx20_laclq是低拷貝載體，其具有強(qiáng)的IacI表達(dá)。細(xì)胞在37°C下生長(zhǎng)，然后，在具有Amp、Cam和Kan的LB中誘導(dǎo)。2.BsmBI的誘變禾Ij用Cys>Asp、Glu、Phe>His、Lys>Met、Asn、Gin、Arg、Ser禾口Thr突變BsmBI中358個(gè)氨基酸殘基。將Trp改變?yōu)锳la，和將Tyr改變?yōu)镻he。這些是8、9、12、13、14、15、17、18、19、20、21、24、25、26、27、28、29、31、33、37、38、40、42、43、44、46、47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、60、61、62、63、64、65、66、67、69、70、72、76、78、79、80、81、82、83、84、88、91、93、95、96、98、99、101、103、104、105、106、109、110、111、113、114、115、117、118、119、120、121、122、124、126、127、128、130、131、132、133、134、135、138、141、143、144、145、147、149、150、154、155、157、158、160、162、163、164、165、166、167、168、169、172、174、175、176、177、179、180、181、182、184、185、186、188、189、191、194、195、197、200、201、203、205、206、207、208、211、212、213、214、215、216、217、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、231、232、233、235、236、237、238、239、240、242、243、247、250、251、252、257、258、260、262、263、264、265、266、268、269、271、273、274、279、280、282、283、284、287、288、289、292、294、295、296、297、299、300、301、302、303、304、305、306、307、309、310、313、314、315、316、317、318、320、321、324、325、326、328、331、332、333、334、335、336、339、340、341、342、343、344、345、348、349、351、352、353、355、356、357、358、360、361、363、364、366、367、368、370、372、375、376、377、379、381、382、384、385、386、388、389、390、393、394、395、396、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、418、421、424、425、426、428、430、431、432、433、434、436、437、438、439、442、443、444、445、446、446、448、449、450、451、452、453、454、457、458、460、461、462、464、466、467、468、470、471、472、473、474、477、478、479、480、482、483、484、485、486、487、488、489、491、492、495、496、497、498、499、500、502、503、504、505、506、507、510、511、515、516、517、518、519、522、523。上面的數(shù)字相應(yīng)于BsmBI蛋白序列(SEQIDNO81)中的氨基酸位置。方法與在前面實(shí)施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后為DpnI消化。然后，將處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(pACYC-BsmAIM，psyx20_laclq)。3.BsmBI-HF的選擇使用與前面實(shí)施例相似的方法，完成BsmBI-HF的選擇。切割在NEB4中應(yīng)用5%甘油使用λDNA測(cè)定，并且星號(hào)活性在具有39%甘油的ΝΕΒ4緩沖液中使用Litmus28i測(cè)定。優(yōu)選的突變體包括H230A、D231A和N185Y/R232A。標(biāo)記N185Y/R232A為BsmBI_HF。4.BsmBI-HF和WTBsmBI的比較在NEB1-4緩沖液中的每一種中，對(duì)λDNA底物，使用稀釋劑Α，分開(kāi)測(cè)定BsmBI-HF和WTBsmBI的FI。比較在圖30中示出，并且結(jié)果在表29(下面)中列出。表29=BsmBI-HF和WTBsmBI的比較BsmBI-HFIWTBsmBI緩沖液活性I保真度指數(shù)I保真度指數(shù)改進(jìn)因子““NEBl100%3212.5%32ΝΕΒ2100%>50050%"8>64ΝΕΒ312.5%>64100%120>0^ΝΕΒ4100%>50025%4>120在NEBl、ΝΕΒ2和ΝΕΒ4中，BsmBI-HF表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選FI是彡500；WTBsmBI在ΝΕΒ3中表現(xiàn)最好，其中優(yōu)選的FI是120?？侳I改進(jìn)因子為彡500/120=4。實(shí)施例24工稈化H有減Φ號(hào)活丨牛的BsdQI奪體LBspQI限制性內(nèi)切核酸酶的位點(diǎn)定向誘變用1(1^和411^的？5乂33131~1]\11]\12和？2213(；1-80轉(zhuǎn)化大腸桿菌。]\1EarI(CTCTTC)也修飾BspQI位點(diǎn)(GCTCTTC)，并因此使用pSX33_earIMlM2(圖17和18)共轉(zhuǎn)化和修飾大腸桿菌染色體。WT氨基酸序列在圖16中示出。將BspQI中122個(gè)帶電荷的或不帶電荷的氨基酸殘基(Arg、Lys,His、Glu、Asp、Gin、Asn、Cys)通過(guò)位點(diǎn)定向誘變改變?yōu)锳la。在下列條件下，進(jìn)行PCR:DNA變性，98°C持續(xù)30sec，1個(gè)循環(huán)；DNA變性/引物退火/延伸，98°C持續(xù)10sec，55°C到65°C進(jìn)行30sec，72°C持續(xù)2min，進(jìn)行18個(gè)PCR循環(huán)；72°C持續(xù)15min，l個(gè)循環(huán)。在100μ1反應(yīng)中，2單位的PhusionDNA聚合酶(NEB,Ipswich,MA)UmMdNTP、10ng至IjIOOng模板DNA、20μ15χ反應(yīng)緩沖液、0.04μM引物、無(wú)菌水至100μ1總體積。用DpnI消化PCRDNA,以破壞模板DNA(Dam甲基化的)并與pSX33_earIMlM2共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。培養(yǎng)各轉(zhuǎn)化體過(guò)夜(5mlLB,50yg/mlKmK和100μg/mlAmpK)，并且分成兩份。一份(1.5ml)通過(guò)離心收獲，并通過(guò)在超聲處理緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.5，0.ImMDTT,50mMNaCl，10%甘油)中超聲處理進(jìn)行裂解。細(xì)胞提取物在50°C下加熱1小時(shí)，并且通過(guò)離心除去變性的大腸桿菌蛋白。在PUC19DNA上，分析澄清的溶胞產(chǎn)物的限制性活性和星號(hào)活性。BspQI星號(hào)活性分析條件1μgpUC19DNA、5ylIOxNEB緩沖液1、25%DMSO、2.5μ1澄清細(xì)胞提取物、無(wú)菌去離子水至50μ1總體積，并且在50°C下溫育1小時(shí)。通過(guò)電泳，在0.8到瓊脂糖凝膠中，解析消化的DNA。收獲第二份細(xì)胞培養(yǎng)物(未誘導(dǎo)的)，并通過(guò)Qiagen離心柱純化方法(Qiagen,Valencia,CA)制備質(zhì)粒DNA。通過(guò)大-染料雙脫氧-終止子-測(cè)序方法(Big-dyedideoxy-terminatorsequencingmethod)，測(cè)序bspQIR等位基因，以證實(shí)期望的突變。在鑒定減少星號(hào)活性突變體之后，獲得新轉(zhuǎn)化體，并且制造IPTG-誘導(dǎo)的培養(yǎng)物。再次分析限制性活性和星號(hào)活性，以證實(shí)在所有四種緩沖液中與WT酶相比減少的星號(hào)活性。在通過(guò)位點(diǎn)定向誘變構(gòu)建的122個(gè)BspQI突變體中，兩種BspQI變體——R388A和K279A——顯示減少的星號(hào)活性。在緩沖液1和10%甘油中，R388A的星號(hào)活性減少大約16倍。然而，R388A在高酶濃度下仍舊顯示星號(hào)活性。BspQI變體K279A也顯示減少的星號(hào)活性(在減少星號(hào)活性方面>8-倍改進(jìn))。為了進(jìn)一步在高酶濃度下減少星號(hào)活性，將R388和K279取代為Phe、Pro、Tyr,Glu、Asp或Leu。分析各種R388X和K279X突變體的IPTG-誘導(dǎo)的細(xì)胞提取物的限制性活性和星號(hào)活性。發(fā)現(xiàn)R388F或K279P在細(xì)胞提取物或純化酶中顯示最小的星號(hào)活性。氨基酸取代不影響比活性。為了仍進(jìn)一步減少BspQI星號(hào)活性，通過(guò)位點(diǎn)定向誘變，將兩種氨基酸取代組合進(jìn)一個(gè)突變體酶中(雙突變體，K279P/R388F)。該雙突變體在具有10%甘油的緩沖液1和緩沖液2中缺少星號(hào)活性(圖41B)。表30=BspQI-HF對(duì)WTBspQI<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實(shí)施例25工程化具有減少星號(hào)活性的SapI變體在BspQI中發(fā)現(xiàn)保守的K279和R388氨基酸殘基，其中在SapI中相應(yīng)位置是K273和R380。6xHis標(biāo)記SapI表達(dá)克隆首先在pUC19中構(gòu)建。SapI表達(dá)菌株是用KmK和AmpE的pSX33-earIMlM2和pUC_SapI轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。通過(guò)位點(diǎn)定向誘變，將Lys273到Pro(K273P)和Arg380到Phe(R380F)的氨基酸取代引入到SapI0也構(gòu)建SapI單突變體R380A。當(dāng)進(jìn)行限制性活性和星號(hào)活性反應(yīng)時(shí)，SapI變體R380A和K273P/R380F都示出減少的星號(hào)活性(圖42)。PCR、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA制備和酶活性分析如對(duì)BspQI描述的進(jìn)行，除了在37°C下，測(cè)定SapI活性。6xHis-標(biāo)記SapI變體K273P/R380F通過(guò)Ni-NTA柱色譜純化，并且示出在存在25%DMSO或5%甘油情況下，顯示減少的星號(hào)活性。實(shí)施例26工程化KpnI高保真度突變體包含兩種活性的KpnI已被改變?yōu)榫哂休^低星號(hào)活性的突變體(國(guó)際發(fā)明者A·布蘭查德,孫大鵬,張鵬華,徐雙勇,朱振宇,管勝昔,陳少康,魏華申請(qǐng)人:新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司