專利名稱：：根據(jù)粘彈性性質(zhì)分離生物對象的方法根據(jù)粘彈性性質(zhì)分離生物對象的方法本發(fā)明涉及一種在具有不同粘彈性性質(zhì)的溶液中分離生物對象的方法，其中所述方法包括允許較高粘彈性生物對象通過膜而同時保留較低粘彈性生物對象在膜以上的過濾步驟，和回收步驟，其中在膜以上或膜上回收分離的較低粘彈性生物對象和/或在過濾液中回收分離的較高粘彈性生物對象。有利地，生物對象是細(xì)胞。更有利地，回收的細(xì)胞是活細(xì)胞。在優(yōu)選的具體實施方式中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的具體實施方式中，細(xì)胞是胎兒細(xì)胞并且該方法用于產(chǎn)前的診斷。經(jīng)常需要為了異常和疾病的征兆而檢查生物樣品和標(biāo)本。作為一個例子，為了癌癥的指征可能需要檢查血液樣品或脊髓液樣品中的細(xì)胞。因為這類樣品可能含有數(shù)百萬的細(xì)胞，非常有利的是分離不感興趣的大多數(shù)細(xì)胞和液體，從而濃縮感興趣的細(xì)胞。在血液和脊髓液中需要除去血漿、紅細(xì)胞紅血液細(xì)胞和白細(xì)胞(白血液細(xì)胞)，從而濃縮小量的不是正常存在和可能顯示異常征兆如癌癥的細(xì)胞。因為白細(xì)胞經(jīng)常與感興趣的細(xì)胞非常相似，難以不損失而除去這些細(xì)胞。然后產(chǎn)生的濃縮的感興趣的細(xì)胞用于進(jìn)一步分析?，F(xiàn)在可用的用于分離細(xì)胞類型的方法包括通過尺寸分離、通過離心分離(密度/比重)和根據(jù)化學(xué)或生物化學(xué)性質(zhì)的分類。當(dāng)兩類細(xì)胞非常不同時，通過離心分離作用得很好，如分離白血液細(xì)胞和紅血液細(xì)胞的例子中。但是當(dāng)兩類細(xì)胞具有相似的密度和尺寸時，如白血液細(xì)胞和癌細(xì)胞，離心不起作用。基于離心的細(xì)胞分離的進(jìn)一步局限是細(xì)胞的密度不是恒定的，因為甚至死細(xì)胞都與其外界和環(huán)境的條件反應(yīng)。使用通過抗體結(jié)合細(xì)胞至表面抗原的基于免疫的化學(xué)通過(生物)化學(xué)性質(zhì)而分離是昂貴、費力和耗時的。許多步驟可以使細(xì)胞丟失因此減少了這類方法的分離效率。另外，如果細(xì)胞沒有匹配的抗原，和/或如果抗原被其他血成分所遮掩細(xì)胞將丟失。血漿蛋白可以包被循環(huán)中的細(xì)胞(一種可能的癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的方法)因此防止了其被抗體所識別。通過該方法分離的細(xì)胞通常是難以用視覺檢查結(jié)果的形式。通常通過過濾膜或具有特異性孔尺寸的一系列一個或多個空心管的過濾而進(jìn)行通過尺寸的分離。比孔大的細(xì)胞留在過濾膜的一側(cè)同時小細(xì)胞通過過濾膜并在過濾膜的另一側(cè)被收集。在該分離方法中，使用固定劑穩(wěn)定細(xì)胞的膜，如使用甲醛。但是，固定劑的作用后細(xì)胞不再是活的，并且不能培養(yǎng)。另外，如果兩類細(xì)胞具有重疊的尺寸分布(一類細(xì)胞的某些部分比另一類細(xì)胞的大而另一部分比其小)，然后過濾膜不能有效地分離兩類細(xì)胞，造成一些感興趣的細(xì)胞的丟失，因此降低分離效率。因此，通過上面方法的分離可以從生物化學(xué)上和機(jī)械性破壞細(xì)胞，因此改變細(xì)胞的形態(tài)，并抑制隨后的處理和分析。因此需要一種方法，其允許分離可能具有相同尺寸或重疊尺寸分布的不同的生物對象，并且有利地其不使所述生物對象變性，以便于在細(xì)胞的情況下，分離的細(xì)胞是活的并可以進(jìn)一步培養(yǎng)。本發(fā)明人制作了一種新的適應(yīng)本領(lǐng)域需要的分離方法。根據(jù)本方法，根據(jù)其不同的生物性質(zhì)分離生物對象，即使尺寸是相同的或重疊的。另外，該方法允許有利地回收進(jìn)一步用于培養(yǎng)應(yīng)用的生物對象。因此本發(fā)明涉及一種通過對象類型分離對象的方法，其中，不同的對象類型不能完全通過尺寸、形狀和密度(白細(xì)胞和某些癌細(xì)胞是兩個重要的例子)而區(qū)分。該方法還提供高的分離效率，其允許使用較小的樣品尺寸，具有較小的丟失感興趣對象的風(fēng)險。另外，不從生物化學(xué)上和形態(tài)上破壞感興趣的對象，該方法不干擾隨后的處理和分離，并保留所產(chǎn)生對象的正確形態(tài)。不使用感興趣對象的化學(xué)/生物化學(xué)制備(所有這樣的已知制備本質(zhì)上修飾這樣對象的生物化學(xué)和/或生物物理和形態(tài)性質(zhì))。然后分離的對象可以容易地以病理學(xué)家優(yōu)選的方法呈現(xiàn)在幻燈片上，或通過自動可視系統(tǒng)閱讀，或保留在液體溶液中用于隨后的處理。因此，本發(fā)明的主題是一種分離溶液中多種天然生物對象的方法，其中所述生物對象由至少一種天然較低粘彈性生物對象類型和一種天然較高粘彈性生物對象類型組成，并且該天然較低粘彈性生物對象具有比天然較高粘彈性生物對象低的粘彈性性質(zhì)，其中該天然較低粘彈性生物對象是循環(huán)胎兒細(xì)胞和腫瘤或癌細(xì)胞中的至少一種，該方法包括-溶液的過濾步驟，其中O膜是多孔的并且孔的直徑在天然較低粘彈性生物對象的直徑以下并且也在部分天然較高粘彈性生物對象的直徑以下，并允許天然較高粘彈性生物對象通過膜而同時保留天然較低粘彈性生物對象在膜以上，并且O應(yīng)用控制性力量，使其保持在低于強(qiáng)迫天然較低粘彈性生物對象通過膜需要的預(yù)定力量，并高于或等于強(qiáng)迫天然較高粘彈性生物對象通過孔需要的預(yù)定力量，禾口-回收步驟，其中在膜以上或在膜上回收分離的天然較低粘彈性生物對象和/或在過濾液中回收分離的天然較高粘彈性生物對象。貫穿整個申請必須理解，術(shù)語"天然的"用于定性在取樣和根據(jù)本發(fā)明方法的回收步驟之間不被化學(xué)/生物化學(xué)修飾的對象或性質(zhì)。生物對象可以是任何類型，如細(xì)胞、細(xì)菌、病毒和酵母，這樣的列舉是非限制性的。溶液中的生物對象可以獲自任何生物樣品。生物樣品可以是體液，如血液、脊髓液、尿、任何組織或腫瘤活組織切片。該方法不限于液體生物樣品。作為例子可以預(yù)處理固體組織活組織切片以將組織打碎成單個細(xì)胞。然后可以將細(xì)胞懸浮于防腐液體。其還可以是水和土壤樣品、植物組織和液體等。有利地，多種生物對象是至少兩種細(xì)胞類型。需要分離的細(xì)胞可以是任何類型。這些可以是天然存在于血液的細(xì)胞，如巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、噬堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、干細(xì)胞和血液和免疫系統(tǒng)的定向祖細(xì)胞(committedprogenitor)。需要分離的細(xì)胞還可以屬于其它來源。其可以是上皮細(xì)胞(角質(zhì)化上皮細(xì)胞、濕分層屏障上皮細(xì)胞、外分泌分泌性上皮細(xì)胞)，來自內(nèi)臟的細(xì)胞，外分泌腺和泌尿生殖道，內(nèi)皮細(xì)胞，代謝和儲存細(xì)胞(肝細(xì)胞、白色脂肪細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞、肝脂肪細(xì)胞)，屏障功能性細(xì)胞(肺、內(nèi)臟、外分泌腺和泌尿生殖道)，封閉的體內(nèi)腔上排列的上皮細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)分泌性細(xì)胞，收縮性細(xì)胞，感覺傳感細(xì)4胞，自發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞，感覺器官和外周神經(jīng)元支持細(xì)胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，透鏡狀細(xì)胞，色素細(xì)胞，生殖細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞。需要分離的細(xì)胞還可以是疾病細(xì)胞如突變細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞和屬于如任意上面細(xì)胞分類類型的細(xì)胞。在優(yōu)選的具體實施方式中，回收的細(xì)胞類型預(yù)定為需要在進(jìn)一步分裂和培養(yǎng)擴(kuò)增后通過生物、遺傳、免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)方法分析。因此，回收的細(xì)胞有利地是活細(xì)胞并且用于過濾步驟的溶液不含有任何殺死分離細(xì)胞的試劑。在另一個具體實施方式中，處理回收的細(xì)胞類型以用于通過生物、遺傳和生物化學(xué)或免疫組織化學(xué)的方法的進(jìn)一步分析，但無需進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增。在另一個具體實施方式中，將目標(biāo)細(xì)胞回收至膜上以后，抽提其核酸材料用于進(jìn)一步分析。核酸(DNA、RNA)可以允許鑒定遺傳缺陷或目標(biāo)細(xì)胞中的特異性表達(dá)的基因。細(xì)胞骨架是貫穿真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的三維聚合體支架。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)主要由肌動蛋白絲、微管、中間絲和附屬蛋白組成。其提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)并影響細(xì)胞的運動性以及粘彈性性質(zhì)。細(xì)胞的粘彈性性質(zhì)決定由于機(jī)械力量造成的細(xì)胞變性程度，因此影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。對活細(xì)胞粘彈性性質(zhì)的測定需要量化生理條件下細(xì)胞的力對于應(yīng)變的關(guān)系。幾篇論文描述了可以用于測定粘彈性性質(zhì)的技術(shù)，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。已經(jīng)描述了許多系統(tǒng)以便測定細(xì)胞的流變性/粘彈性性質(zhì)，包括微量吸管吸引術(shù)(EvansE.和YeungA.，Biophys.J.(1989)，56，151-160.)、穿透膜的微孔(FrankR.S.，TsaiM.A.JBiomechEng.(1990);112，277-82)、光學(xué)鑷子(AshkinA.和DziedzicJ.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)，86，7914-7918)、原子力顯微鏡檢查法(BenoitM.等人NatureCellBiol.(2000)，2，313-317)。這些技術(shù)可以與適當(dāng)?shù)牧髯冃阅Ｐ吐?lián)合。微量吸管吸引術(shù)技術(shù)是經(jīng)常使用的測定細(xì)胞粘彈性性質(zhì)的方法。該技術(shù)的優(yōu)點是測定溶液中和生理環(huán)境中細(xì)胞的粘彈性性質(zhì)。一個例子是通過微量吸管吸引術(shù)技術(shù)測定肝細(xì)胞和肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞的粘彈性(WuZZ和al.，Biorheology，2000，37，279-290)。根據(jù)本發(fā)明，在方法的第一步，根據(jù)細(xì)胞的天然粘彈性性質(zhì)通過經(jīng)過含有適當(dāng)尺寸的孔的膜的過濾步驟而分選細(xì)胞。優(yōu)選地，在過濾步驟中應(yīng)用控制性力量，將其保持在低于強(qiáng)迫天然較低粘彈性生物對象通過膜需要的預(yù)定力量，和高于或等于強(qiáng)迫天然較高粘彈性生物對象通過孔需要的預(yù)定力量。根據(jù)本發(fā)明，語句"控制性力量"用于指明在過濾步驟中所用的用于強(qiáng)迫天然較高粘彈性生物對象通過含有適當(dāng)尺寸孔的膜，同時保留天然較低粘彈性生物對象并保持需要分離的細(xì)胞的完整性的力量。該應(yīng)用的力量產(chǎn)生于過濾膜的兩面之間產(chǎn)生的差異性壓強(qiáng)，力量=(差異性壓強(qiáng))x(生物對象的表面積)。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實施方式，該應(yīng)用的力量產(chǎn)生于離心應(yīng)用的加速度，例如在生物對象上，力量=加速度x(生物對象的質(zhì)量)。在本發(fā)明中，感興趣的循環(huán)細(xì)胞的分離(起始于周圍血液樣品)是基于白細(xì)胞和感興趣的循環(huán)細(xì)胞之間粘彈性性質(zhì)的差異。在特定的具體實施方式中，天然較低粘彈性細(xì)胞是腫瘤或癌細(xì)胞或胎兒細(xì)胞。本發(fā)明中使用的膜顯示疏水性質(zhì)并且大多是惰性和強(qiáng)韌的，在壓力下形成恒定的孔尺寸。用于本發(fā)明的膜是，例如聚碳酸酯膜。聚碳酸酯膜具有上述的性質(zhì)和將分離的細(xì)胞從膜轉(zhuǎn)移至用于細(xì)胞的生物鑒定的載玻片上的高效細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率。在特定的具體實施方式中，天然較低粘彈性細(xì)胞是腫瘤或癌細(xì)胞。在第二特定的具體實施方式中，天然較低粘彈性細(xì)胞是胎兒細(xì)胞。優(yōu)選，胎兒細(xì)胞是母體血液中循環(huán)的胎兒細(xì)胞。優(yōu)選，過濾步驟中應(yīng)用的控制性力量相當(dāng)于由20-190千帕斯卡的差異性壓強(qiáng)引起的力量，有利地為40-60千帕斯卡，更有利地為45-55千帕斯卡，并且孔的平均直徑為3-15iim，有利地為6-10iim，更有利地為8-10ym，因此允許在膜上或在膜以上回收腫瘤細(xì)胞或胎兒細(xì)胞?？壮叽绾蛻?yīng)用的控制性力量之間良好的適合性是需要的?；蛘撸?0-4(TC的溫度進(jìn)行該過濾步驟。事實上，正常的、胎兒的和癌性循環(huán)細(xì)胞顯示不同的粘彈性性質(zhì)?？茖W(xué)文獻(xiàn)指出大多數(shù)白細(xì)胞的細(xì)胞類型具有折疊的膜。膜的去折疊給予白細(xì)胞粘彈性性質(zhì)，其允許細(xì)胞在壓力下伸長并且無損傷地通過微量吸管尖端，即使尖端為白細(xì)胞直徑的1/4以下(EEvans和AYeung，(1989)BiophysicalJournal56:151-160)。嗜中性粒細(xì)胞，其直徑尺寸為10-12iim，可以通過3iim的孔。詳細(xì)地不同類型的白細(xì)胞為參小淋巴細(xì)胞〇代表20-25%的白細(xì)胞，具有6-8ym的直徑，核球形或卵圓形，染色質(zhì)為致密的團(tuán)、細(xì)胞質(zhì)少和染色淡藍(lán)色。參中型淋巴細(xì)胞〇代表1.5-2.0%的白細(xì)胞，具有8-12ym的直徑，染色質(zhì)較不致密，較多的細(xì)胞質(zhì)和傾向于包圍更多的核。參嗜中性粒細(xì)胞〇代表60-70%的白細(xì)胞，具有10-12ym的直徑，核有2_8個裂片、染色質(zhì)為致密的粗糙團(tuán)塊，細(xì)胞質(zhì)為嗜酸性具有嗜中性顆粒，雌性中3%嗜中性粒細(xì)胞有裂片上的"鼓槌"，〇1_2%嗜中性粒細(xì)胞有馬蹄形核并且細(xì)胞質(zhì)具有顆粒。參單核細(xì)胞O代表3-8^的白細(xì)胞，為最大的白細(xì)胞，具有20iim的直徑，凹陷的核，淡色細(xì)胞質(zhì)豐富和嗜堿性、不均一(泡沫狀)外觀的可以含有少數(shù)精細(xì)的嗜苯胺藍(lán)的顆粒的細(xì)胞質(zhì)。參嗜曙紅細(xì)胞O代表多達(dá)5%的白細(xì)胞，具有12-15iim的直徑，核較少為裂片狀，通常僅為二裂片，細(xì)胞質(zhì)成塊，但不如嗜中性粒細(xì)胞中那么致密，細(xì)胞質(zhì)充滿大量的大的嗜曙紅(嗜酸性)顆粒，染色為淡粉色。參嗜堿性粒細(xì)胞〇代表1%以下的白細(xì)胞，具有14i！m的直徑，核大而有兩個裂片，更精細(xì)質(zhì)地的染色質(zhì)，所以核染色更淡，細(xì)胞質(zhì)充滿可以遮蓋核的大的深藍(lán)染色顆粒(嗜堿性)(黑莓外觀)。其它類型的細(xì)胞缺少這種折疊的膜，因此通過細(xì)胞直徑以下的孔有困難。與白細(xì)胞尺寸相比，膜孔尺寸越小，需要越大的差異性壓強(qiáng)以迫使白細(xì)胞通過孔。例如隨著細(xì)胞的形態(tài)從正常發(fā)展成癌細(xì)胞，某些情況下膜變厚而其它情況下變薄(GangZhang等人2002，WorldJGastroenterol;8(2)，243-246)。當(dāng)細(xì)胞膜變薄時，其更容易損傷和裂解。感興趣的細(xì)胞的損傷閾值提供了可以應(yīng)用于膜而不造成感興趣的細(xì)胞損傷的差異性壓強(qiáng)的上限。因此似乎惡性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)粘彈性性質(zhì)的降低。本專利的方法是分離細(xì)胞類型的有效方法并依賴于不同細(xì)胞之間粘彈性性質(zhì)的差異。作為一個例子，在根據(jù)細(xì)胞的粘彈性性質(zhì)分離血液樣品中的循環(huán)細(xì)胞的情況下，具有保守性8m孔尺寸的應(yīng)用40-60千帕斯卡差異性壓強(qiáng)的聚碳酸酯膜(從大片8ymWhatman聚碳酸酯Nuclopore膜自定義切下的)可以在20-40°C的溫度使用。由于這些細(xì)胞的粘彈性，這將足夠通過大多數(shù)白細(xì)胞，雖然75X的這些細(xì)胞的尺寸大于8iim。另一方面其它細(xì)胞，即大于8m直徑的非白細(xì)胞將被阻滯。為了將白細(xì)胞從其他類型小于8m直徑的細(xì)胞分離，可以根據(jù)較高壓力的相應(yīng)需求使用小至4iim的膜，所述壓力只受細(xì)胞損傷閾值的限制或受迫使感興趣的細(xì)胞類型通過膜的限制。使用聚碳酸酯膜是因為其是疏水性的，主要是惰性的，和強(qiáng)韌的具有低彈性，使得甚至在壓力下也保持孔尺寸的恒定。另外聚碳酸酯膜具有將細(xì)胞從膜轉(zhuǎn)移至載玻片的高效細(xì)胞轉(zhuǎn)移率。優(yōu)選，含有細(xì)胞類型的溶液是由血液樣品離心步驟形成的單核細(xì)胞組分。在特定的具體實施方式中，較低粘彈性細(xì)胞是循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。在另一個具體實施方式中，至少一種細(xì)胞類型是胎兒細(xì)胞類型。優(yōu)選地，胎兒細(xì)胞是母體血液中循環(huán)的胎兒細(xì)胞。胎兒細(xì)胞存在于母體循環(huán)中。從母體血液中成功分離胎兒細(xì)胞將打開以非侵入性方法隨后遺傳分析胎兒細(xì)胞(FISH、PCR、測序)替代對母親和胎兒有內(nèi)在風(fēng)險的侵入性產(chǎn)前診斷方法(絨膜絨毛取樣或羊膜穿剌)的新途徑。已知三種不同的胎兒細(xì)胞在母體血液中循環(huán)滋養(yǎng)細(xì)胞、胎兒白細(xì)胞和胎兒紅細(xì)胞(見綜述Bianchi，BritishJournalofHaematology，1999)。位于絨毛外(絨毛外)的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞在第一個妊娠三個月期間遷移至胎盤床的母體組織中。這一浸入過程對于滋養(yǎng)細(xì)胞是獨特的并誘導(dǎo)母體脊髓動脈的血管適應(yīng)性。因此，滋養(yǎng)細(xì)胞的特異性亞群作為正常的特征出現(xiàn)在母體血液中(見綜述0udejans等人2003，PrenatalDiagnosis)。第一個波在第一個妊娠三個月的中間到達(dá)頂峰，第二個波在第一個妊娠三個月的結(jié)尾到達(dá)頂峰。本發(fā)明的第二方面是一種體外產(chǎn)前診斷，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法，其中至少兩種細(xì)胞類型中的一種是如上所述的胎兒細(xì)胞類型。如果我們考慮在l毫升血中有7百萬個白細(xì)胞，不同類型白細(xì)胞的數(shù)目和尺寸描述如下-小淋巴細(xì)胞6-8iim的尺寸，1575000/ml，代表22.5%的白細(xì)胞-中型淋巴細(xì)胞8-12iim的尺寸，1225/ml，代表0.02%的白細(xì)胞-嗜中性粒細(xì)胞10-12iim的尺寸，4620000/ml，代表66%的白細(xì)胞-單核細(xì)胞20iim的尺寸，385000/ml，代表5.5%的白細(xì)胞-嗜曙紅細(xì)胞12-15iim的尺寸，350000/ml，代表5%的白細(xì)胞-嗜堿性細(xì)胞14iim的尺寸，70000/ml，代表1%的白細(xì)胞-胎兒細(xì)胞大約12iim的尺寸，5/ml，代表0.00007%的白細(xì)胞總數(shù)。我們將通過隨附的實施例看到根據(jù)本發(fā)明的方法非常適合于分離母體血液中循環(huán)的胎兒細(xì)胞。雖然上面的描述具有許多特殊性，這些不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明的范圍，而是作為其現(xiàn)在優(yōu)選的具體實施方式的范例。許多其它衍生和變形在本發(fā)明的教導(dǎo)范圍內(nèi)是可能的。圖la，lb，lc，ld:通過壓強(qiáng)差異或離心力強(qiáng)迫通過較小孔的細(xì)胞的緊密相關(guān)的概念圖。圖2a是圖解表示具有重疊尺寸分布的兩種細(xì)胞群。細(xì)胞群A具有比細(xì)胞群B大的平均尺寸。另一方面，細(xì)胞群A具有比細(xì)胞群B高的粘彈性性質(zhì)。在圖2b的情況下，已經(jīng)通過常規(guī)尺寸過濾至膜上的經(jīng)典分離處理了細(xì)胞群A+細(xì)胞群B的混合物。該方案顯示細(xì)胞分布在膜以上或膜上。細(xì)胞尺寸小于過濾膜孔尺寸的將保留在膜以上或膜上。注意過濾后兩種保留群體之間的大量重疊。以較小的孔尺寸，較多的A類細(xì)胞與B類細(xì)胞保留在一起，因此降低了感興趣細(xì)胞的濃度(B類細(xì)胞)。相反，以較大的孔，較多B類細(xì)胞(感興趣的細(xì)胞)丟失，降低了對B類細(xì)胞的總敏感性。同樣，分布曲線的位置和形狀將在患者和患者之間變化。因為分布的這種重疊和變化，所以通過尺寸的常規(guī)過濾在分離兩種細(xì)胞類型中表現(xiàn)差。在圖2c的情況下，已經(jīng)以本發(fā)明的原理使用控制性壓強(qiáng)差異處理細(xì)胞群A+細(xì)胞群B的混合物以改善回收和富集。甚至當(dāng)A類細(xì)胞大于膜的洞(孔)尺寸時，A類細(xì)胞將通過，因為其與B類細(xì)胞相比具有較高粘彈性性質(zhì)。B類細(xì)胞將不通過孔膜，除非細(xì)胞尺寸在膜孔尺寸以下或接近膜孔尺寸。圖2c代表使用本發(fā)明的原理保留在膜以上或膜上的細(xì)胞的分布。注意與圖2b相比圖2c中分離的高效率。圖3:使用本發(fā)明的方法從種植MCF7細(xì)胞的不知情樣品中回收的MCF7細(xì)胞。圖4:過濾裝置(見實施例_附錄A的步驟6.e))圖5:從膜上回收細(xì)胞(見實施例_附錄A的步驟10)附圖詳細(xì)說明圖la，lb，lc，ld是通過離心力的壓強(qiáng)差異而強(qiáng)迫通過較小孔的細(xì)胞的概念圖。a)通過經(jīng)孔的液體流將細(xì)胞吸引至空孔(頂部或離心力的較高壓力)圖lab)壓強(qiáng)差異或離心力開始使細(xì)胞變形并折疊細(xì)胞將其推進(jìn)孔中。圖lbc)細(xì)胞被壓強(qiáng)差異或離心力推著穿過孔。圖lcd)細(xì)胞被穿過孔的液體流從孔中排出。圖ld推動細(xì)胞穿過較小孔所需的力量(壓強(qiáng)差異或離心)取決于細(xì)胞的尺寸和粘彈性性質(zhì)。對象的粘彈性性質(zhì)是允許對象彈性折疊，彎曲，扭曲其形狀，流穿比物體小的孔和通道的性質(zhì)。文獻(xiàn)指出白血液細(xì)胞(白細(xì)胞)具有相對高的粘彈性性質(zhì)；這允許其流穿小直徑通道并通過身體的精微血管到達(dá)組織。腫瘤或癌細(xì)胞和來自母體血液的胎兒細(xì)胞可以是與白血液細(xì)胞相比相似的尺寸。但是發(fā)現(xiàn)腫瘤或癌細(xì)胞和胎兒細(xì)胞具有相當(dāng)?shù)偷奶烊徽硰椥孕再|(zhì)。因此腫瘤或癌細(xì)胞或胎兒細(xì)胞與相似尺寸的白血液細(xì)胞比需要相當(dāng)大的力量以推動其通過小直徑的？L。腫瘤或胎兒細(xì)胞將被小孔的尺寸所滯留并且不通過圖la中的點。利用兩種細(xì)胞類型粘彈性性質(zhì)的差別使得細(xì)胞能夠以細(xì)胞類型分離。使用本性質(zhì)的細(xì)胞分選是一種獨特的方法并且是本發(fā)明的基礎(chǔ)。實施例A-實施例#1:腫瘤或癌細(xì)胞下面概括的程序描述了從人類血液樣品中分離癌細(xì)胞的方法。樣品或者取自癌癥患者，目的在于分離內(nèi)源性患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞?；蛘撸鳛橛糜隍炞C本發(fā)明的實驗?zāi)Ｐ?，將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞植于來自健康志愿者的血液樣品中。在后者的設(shè)定中，目的是評估分離程序的產(chǎn)率和敏感性。相似的程序可以用于從母體血液中純化胎兒細(xì)胞。1.儀器和試劑*培養(yǎng)的癌細(xì)胞具有紫色蓋子的Becton-DickinsonVacutainer管(4mL)(EDTA抗凝血劑)從人類受試者安全收集血的放血術(shù)人員洗瓶中的乙醇(40%和60%)有涂層或無涂層的潔凈玻璃顯微鏡載玻片(推薦新的ErieScientificSuperfrostPlusslides,按照制造商的指南儲存打開的載玻片盒子)帶至室溫的Ficoll-Paque差異性離心介質(zhì)(AmershamBioscience#17-1440-02)能夠裝有>12mL的離心管(推薦15_mLFalcon圓錐形底的管)，和能夠達(dá)到用于從周圍血中分離單核細(xì)胞組分的Ficoll-Paque產(chǎn)品的特異性速度的吊桶式離心機(jī)細(xì)的彎的無鋸齒尖端的鑷子用于操作膜無頭的5mL注射器x2滑動頭(BD-ref301603)下列物品需要經(jīng)常洗滌(對于大的處理運行推薦購買更多)。每種包括2個制造商Kimble-Kontes953701-0000玻璃漏斗蓋，25mm，15mL953702-0001燒結(jié)玻璃支持基座(預(yù)期在裝置的將來形式，玻璃器皿將由可拋性制品替代)消耗性試劑盒#1，含有膜(從大張8iimWhatman聚碳酸酯Nuclopore濾膜自定義剪切)；海綿(從由Lendellmanufacturing生產(chǎn)的大張親水聚氨酯泡沫橡膠自定義剪切)；10cm硅管注射器頭；12cm硅管注射器頭(頭的長度取決于使用的離心管的形狀和長度。其它材料如硬塑料和不銹鋼也可以用作頭)樣品固定劑(推薦>95%乙醇)9免疫染色試劑和儀器，本發(fā)明的另一個版本中，玻璃器皿可以由可拋性一次使用的塑料器皿替代。然后省略了洗滌步驟。2.種植方法根據(jù)常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)程序收集培養(yǎng)的癌細(xì)胞(優(yōu)選不過于傾向于成團(tuán)的細(xì)胞系)，例如，洗滌細(xì)胞容器，通過以適當(dāng)長時間胰蛋白酶消化而分離，然后通過離心收集。重懸收集的細(xì)胞并在90%培養(yǎng)基/10%血清溶液(溶液A)中洗滌，然后再離心收集。使用血液細(xì)胞計數(shù)器，從很好分散的儲存液中取已知體積而測定儲存液的細(xì)胞密度(細(xì)胞/體積)。從健康志愿者的周圍循環(huán)中收集4-mL全血液樣品。在具有作為抗凝血劑的EDTA的商售&cwto/we^中收集血液。然后通過系列稀釋分散的儲存液而以已知標(biāo)準(zhǔn)值將培養(yǎng)的癌細(xì)胞加入血液樣品。溶液A用作貫穿系列的稀釋劑。在該系列的每個步驟中，和最后種植的血液樣品中，將管子輕柔地混合以使細(xì)胞分散。標(biāo)準(zhǔn)值代表植入樣品的細(xì)胞的大約數(shù)量；因為細(xì)胞混合物的異質(zhì)性，使用系列稀釋方法不能獲得準(zhǔn)確的需要數(shù)量的細(xì)胞。為了準(zhǔn)確的種植值(特別是在低細(xì)胞數(shù)時)，推薦使用顯微操作或流式細(xì)胞術(shù)的方法。3.富集方法將細(xì)胞從收集管轉(zhuǎn)移至合適的離心管。.使用具有12cm頭的5mL注射器于室溫緩慢地將3.OmlFicoll-Paque梯度離心介質(zhì)注射至離心管的管底。'在運行的結(jié)尾部分使用或不使用制動，于400g離心血液樣品30分鐘。應(yīng)該通過不包括離心時間的30分鐘的總批次處理時間確定批次的尺寸。估計批次的最大尺寸應(yīng)該為4-6個樣品。通過將配有10cm硅管頭附件的5-ml注射器的頭浸入淡黃層水平以下而從離心管中吸走單核細(xì)胞組分(或淡黃層)。以穩(wěn)定的方式吸直到吸到小量的血清。應(yīng)該將頭稍微放低一點，應(yīng)該繼續(xù)吸直到再吸到小量的血清。將吸到的淡黃層直接加到膜上，該膜用40%的乙醇預(yù)處理并具有約10ml40%的乙醇留在裝置的頂室中，通過將一些液體吸回注射器中并再排出而沖洗注射器。將內(nèi)容物過濾至頂室中保留約3ml。通過加入10ml40%的乙醇洗滌樣品并反向沖洗膜。根據(jù)需要重復(fù)直到過濾結(jié)束(過濾液是清的并且流速是恒定的)。對于一些樣品通過膜的流速可能變得非常緩慢，需要在內(nèi)容物達(dá)到3ml的標(biāo)記前反向沖洗。過濾至約lml的標(biāo)記，然后緩慢過濾內(nèi)容物直到液體剛剛從膜上除去；不要令膜干掉。在分散的癌細(xì)胞富集后，通過從裝置上去掉膜而將細(xì)胞放置在載玻片上，將過濾側(cè)的細(xì)胞朝上放置于最少以60%的乙醇飽和的海綿上。將顯微鏡載玻片壓在海綿上以致膜在玻璃載玻片和海綿之間而形成"三明治"，引起細(xì)胞從膜向載玻片的壓力轉(zhuǎn)移。或者還可以通過離心步驟重懸過濾膜上的細(xì)胞。應(yīng)該注意還可以使用穿過過濾膜的細(xì)胞。小心地向后剝離膜以便不打亂顯微鏡載玻片上的轉(zhuǎn)移的細(xì)胞團(tuán)。，將載玻片浸入固定劑用于以后的生物學(xué)分析，如用感興趣抗體的免疫染色分析。4.替代性的富集方法下列程序描述用于培養(yǎng)和擴(kuò)增回收細(xì)胞的富集方法。在該替代性的具體實施方式的方法中，40%的乙醇溶液被等滲緩沖溶液替代。將血液從收集管轉(zhuǎn)移至合適的離心管?？梢杂眯×苛姿猁}緩沖鹽水(PBS)洗滌血液收集管，并加入離心管。*使用具有12cm頭的5ml注射器于室溫緩慢將3.OmLFicoll-Paque梯度離心介質(zhì)注射至離心管的管底。在運行的結(jié)尾部分使用或不使用制動于400g的速度離心30分鐘血液樣品。應(yīng)該通過不包括離心時間的30分鐘的總批次處理時間確定批次的尺寸。估計批次的最大尺寸應(yīng)該為4-6個樣品。通過將配有10cm硅管頭附件的5-ml注射器的頭浸入淡黃層水平以下而從離心管中吸走單核細(xì)胞組分(或淡黃層)。以穩(wěn)定的方式吸直到吸到小量的血清。應(yīng)該將頭稍微放低一點，應(yīng)該繼續(xù)吸直到再吸到小量的血清。，將吸到的淡黃層直接加到膜上，該膜用維持細(xì)胞完整性和存活性的溶液預(yù)處理。該溶液(稱為培養(yǎng)緩沖液)可以是含有10%血清體積的等滲緩沖溶液。在加入單核細(xì)胞組分之前可以有約10ml的該培養(yǎng)基緩沖液保留在裝置的頂室中。通過將一些液體吸回注射器中并再排出而沖洗注射器。，將內(nèi)容物過濾至頂室中保留約3ml。通過加入10ml培養(yǎng)緩沖液洗滌樣品并反向沖洗膜。根據(jù)需要重復(fù)直到過濾結(jié)束(過濾液是清的并且流速是恒定的)。對于一些樣品通過膜的流速可能變得非常緩慢，需要在內(nèi)容物達(dá)到3ml的標(biāo)記前反向沖洗。此時，可以通過至少兩種替代性方法將富集的組分用于細(xì)胞培養(yǎng)的目的方法l:在富集的組分過濾至約3mL標(biāo)記后，重懸過濾室內(nèi)的內(nèi)容物。然后吸出重懸的組分并置于適合細(xì)胞培養(yǎng)的容器中。方法2在將富集的組分過濾至約3ml的標(biāo)記后，緩慢過濾掉過濾室中剩余的液體直到該液體剛剛從膜以上除去，不要令膜干掉。然后將膜本身從裝置上除去并直接置于含有細(xì)胞培養(yǎng)基的用于細(xì)胞培養(yǎng)的容器。結(jié)果和外源性腫瘤細(xì)胞一起種植血液細(xì)胞該實驗中，以4-120個細(xì)胞種植不知情的樣品。通過免疫組織化學(xué)檢測的分析顯示回收了每個樣品中80%以上的種植細(xì)胞。見圖3。5.附錄附錄A:用于種植的富集實施例的詳細(xì)操作說明書1.將10cm和12cm的硅管連接至兩個5ml注射器。2.將血液從收集管轉(zhuǎn)移至合適的離心管。3.可以用小量磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)<1ml洗滌血液收集管，并加入離心管。4.于室溫以3.0ml的Ficoll-Paque梯度離心介質(zhì)充滿注射器。將12cm硅管的頭置于離心管的底部。緩慢將3.0ml的Ficoll-Paque注射進(jìn)管的底部。5.在運行的結(jié)尾使用部分剎車或無制動以400g的速度離心血液樣品30分鐘(離心機(jī)具有水平的擺動式吊桶)。應(yīng)該通過不包括離心時間的30分鐘的總批次處理時間確定批次的尺寸。估計依賴操作器速度的批次的最大尺寸應(yīng)該為每30分鐘4-6個樣品。6.將新的膜置于裝置上(見圖4)。為了除去膜下的空氣預(yù)處理膜i.將頂端充滿10mL40%的乙醇ii.吸出(F)約5mliii.反向沖洗(BK)iv.吸出(F)約2mlv.反向沖洗(BK)vi.吸出(F)約1mlvii.以40%乙醇加至10ml標(biāo)記以上。應(yīng)該沒有空氣泄露進(jìn)系統(tǒng)的指示。注意(F)和(BK)是指儀器控制。7.通過將配有10cm硅管頭附件的5-ml注射器的頭浸入淡黃層的水平以下而從離心管中吸走單核細(xì)胞組分(或淡黃層)，并以穩(wěn)定的方式吸直到吸到小量的血清。應(yīng)該將頭稍微低一點并應(yīng)該繼續(xù)吸直到再吸到小量的血清。通過手握持管子可以被置于支架上所替代。將吸到的淡黃層直接加到具有10ml40%乙醇的膜上。通過將一些液體吸回注射器中并再排出而沖洗注射器器。8.將內(nèi)容物過濾(F)至保留在頂室中約3ml。通過加入10ml40%的乙醇洗滌樣品并反向沖洗(BK)膜。根據(jù)需要重復(fù)直到過濾結(jié)束(過濾液是清的并且流速是恒定的)。對于一些樣品通過膜的流速可能變得非常緩慢，需要在內(nèi)容物達(dá)到3ml的標(biāo)記前反向沖洗。9.過濾至約1ml標(biāo)記然后緩慢過濾(S)內(nèi)容物直到液體剛剛從膜以上除去；不要令膜干掉。10.富集分散的癌細(xì)胞后，通過從裝置上除去膜而將細(xì)胞置于載玻片上。將顯微鏡載玻片壓在海綿上以致膜在玻璃載玻片和海綿之間形成"三明治"，引起細(xì)胞從膜向載玻片的壓力轉(zhuǎn)移。除去夾子，通過直著向上抬起而除去過濾裝置的頂端。使用細(xì)鑷子除去膜，小心不要觸摸含有細(xì)胞的中心區(qū)。在某些情況下，膜粘在膜裝置的頂端，在這種情況下使用鑷子輕輕將膜從頂端拉下并移開。需要特別小心不要在拉膜時橫過頂端，因為細(xì)胞層接觸到頂端部分會被弄污。將膜的細(xì)胞面朝上置于以60%乙醇浸潤的海綿并預(yù)加載至提供的模具。調(diào)整膜以使膜在4個柱之間并平接至2個短柱。膜的長軸將橫跨載玻片。將載玻片置于膜上如圖中顯示，標(biāo)記面應(yīng)該朝下。輕輕在海綿的中心上按壓載玻片約5-8秒。解除壓力(見圖5)。將載玻片從海綿上抬起(膜將粘在載玻片上)。將載玻片的標(biāo)記面朝上。小心地向后剝離膜以便不打亂顯微鏡載玻片上轉(zhuǎn)移的細(xì)胞團(tuán)。11.為了以后用感興趣的抗體進(jìn)行免疫染色分析，將載玻片浸入固定劑中(建議使用95%的乙醇作為固定劑)。12.按壓(F)控件幾秒以從膜支持物的底部除去任何殘余的過濾液。附錄B-儀器控制和連接在需要泵給出時間從廢液瓶中清除空氣之前幾分鐘應(yīng)該打開廢液瓶真空泵。然后在清潔前將泵關(guān)掉以便允許廢液瓶達(dá)到大氣壓力。儀器具有瞬時開關(guān)的按鈕(F)，按壓該按鈕而吸出過濾液。該儀器進(jìn)一步具有瞬時開關(guān)的按鈕(BK)，按壓該按鈕而反向沖洗。為了防止空氣進(jìn)入系統(tǒng)該開關(guān)應(yīng)該只簡短地按壓一秒以下。只有當(dāng)膜以上有液體和(F)按鈕用了幾秒之后才進(jìn)行反向沖洗。該儀器進(jìn)一步具有瞬時開關(guān)的按鈕(S)，用于從系統(tǒng)中緩慢除去過濾液。B-實施例ft2:胎兒細(xì)胞通過以SV40的早期區(qū)域轉(zhuǎn)染原代人類第一個妊娠三個月的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞而衍生人類絨毛外源自滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞系SGHPL-4。SGHPL-4細(xì)胞保留了正常絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的很多特征，如表達(dá)細(xì)胞角蛋白_7、BC-1、HLA-G、CD9、hPL和HCG(Choy和Manyonda，1998;Cartwright等人，1999，Prefumo等人2004b)并且其表現(xiàn)與原代細(xì)胞相同的行為方式(Ga卿athy等人Hum.R印rod.21(5):1295)。因此SGHPL4細(xì)胞系是用于證明我們的從血液樣品中分離胎兒細(xì)胞技術(shù)的獨特能力的最好細(xì)胞模型。在此我們顯示從含有每ml血液中5個SGHPL-4細(xì)胞的血液樣品開始，對胎兒細(xì)胞的回收在80%以上。與處理前的0.00005%相比，分離的胎兒細(xì)胞的純度為5%。l-胎兒細(xì)胞的分離程序下列程序描述了使用附錄A和B中所述的裝置從血液樣品中分離胎兒細(xì)胞的方法。對于所有下列步驟，調(diào)整裝置的差異性壓強(qiáng)，即兩室之間的壓強(qiáng)，至40-60千帕斯卡的值，溫度為20-40°C。預(yù)先準(zhǔn)備具有洗滌溶液的系統(tǒng)，該溶液保持細(xì)胞的完整性和存活性，即IX的PBS。將血液樣品(5ml)直接加入裝置的頂室內(nèi)。將內(nèi)容物過濾并通過加入5mL的洗滌溶液洗滌樣品。重復(fù)該步驟5次。在每個洗滌步驟，不要令膜干掉。從裝置上除去膜并將"細(xì)胞朝上"置于適當(dāng)?shù)谋砻嬗糜谶M(jìn)一步處理固定分離的細(xì)胞(例如用于免疫熒光或FISH)。將過濾膜用lml4X的多聚甲醛處理10分鐘，然后以lmlIXPBS洗滌4次。分離的細(xì)胞的培養(yǎng)-將過濾膜置于含有合適培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，-或者，將存在于過濾膜上的細(xì)胞重懸于1ml培養(yǎng)基并置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。此時，可以通過免疫熒光、FISH或任何用于遺傳診斷的其他方法學(xué)鑒定感興趣的細(xì)胞，即胎兒細(xì)胞。2.循環(huán)血液樣品的制備從周圍循環(huán)中收集全血液樣品，將血液收集至含有抗凝血劑(肝素、EDTA)的15ml聚丙烯管中。3.以SGHPL-4細(xì)胞的摻加實驗根據(jù)常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)程序收集被認(rèn)為是胎兒細(xì)胞(見前述)的SGHPL-4細(xì)胞，例如，洗滌細(xì)胞容器，通過胰蛋白酶消化適當(dāng)長的時間而分離細(xì)胞，然后通過離心收集。收集的細(xì)胞重懸于一定體積的無血清培養(yǎng)基并使用頂端有蓋子的計數(shù)室進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。從健康志愿者的周圍循環(huán)中收集5ml全血液樣品。在含有抗凝血劑的15ml聚丙烯管中收集血。然后通過系列稀釋分散的儲存液將SGHPL-4細(xì)胞以已知的標(biāo)準(zhǔn)值加入血液樣品中。在系列的每個步驟中和最終種植的血液樣品中，輕柔混合管子而使細(xì)胞分散。4.免疫熒光檢測在膜上分離的SGHPL4細(xì)胞根據(jù)胎兒細(xì)胞分離程序所述的用于胎兒細(xì)胞分離的說明書處理如第3點所述制備的血液樣品。在該過程的結(jié)尾，將膜從裝置上除去并以lmL4%的多聚甲醛處理10分鐘，然后以lmLIXPBS洗滌4次。所有下列步驟在室溫進(jìn)行向膜上(面朝上)加入lmlIXPBS、0.1%Triton,持續(xù)10分鐘。以lmlIXPBS洗滌膜10分鐘。以lml的由IXPBS、0.25%明膠組成的溶液處理膜30分鐘。*以100微升的由IXPBS、0.12%明膠、具有1:200稀釋的抗-SV40大T、小t抗原單克隆抗體(BDPharmingen，catn°554150)組成的溶液孵育膜1小時。以lmlIXPBS洗滌膜3次，每次5分鐘。'以100微升由1XPBS、0.12%明膠，含有1:50-1:200稀釋的第二熒光抗體(山羊抗_小鼠CY3，Jackson)組成的溶液孵育膜1小時。以lmlIXPBS洗滌膜3次，每次5分鐘。加入有熒光染色DAPI(4'，6-二脒基-2-苯噴哚，SIGMA)的50ml抗褪色溶液(VectaShield，VectorLaboratoriesInc.)并以合適的蓋玻片(22mmX32mm)覆蓋膜。5.結(jié)果在該實驗中，以每毫升血液5-50個SGHPL4細(xì)胞種植不知情樣品。處理膜以進(jìn)行使用針對SGHPL-4細(xì)胞表達(dá)的和不在白細(xì)胞中表達(dá)的抗原的特異性抗體的免疫熒光細(xì)胞檢測。所述的實施例中，使用小鼠抗-SV40大T、小t抗原單克隆抗體。在程序的結(jié)尾，通過免疫熒光檢測的分析顯示每個樣品中80%以上種植的細(xì)胞被回收。下面的表顯示在膜上分離的不同細(xì)胞類型的數(shù)目。通過使用適當(dāng)?shù)臑V光片在熒光顯微鏡上觀察而計數(shù)細(xì)胞。以用于DAPI染色的濾光片計數(shù)所有有核細(xì)胞的數(shù)目，以用于CY3染色的濾光片計數(shù)SGHPL-4細(xì)胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>計算胎兒細(xì)胞樣分離物的富集。每毫升循環(huán)血液中白細(xì)胞總數(shù)為4百萬-1千萬。通過本發(fā)明的方法富集的胎兒細(xì)胞樣超過105，這從下面的表中可見<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6.膜上分離的SGHPL-4細(xì)胞的FISH分析為了該分析，從女性健康志愿者的周圍循環(huán)中收集血液樣品。以每毫升IOO個SGHPL-4細(xì)胞種植不知情樣品。SGHPL-4細(xì)胞為XY，女性健康志愿者的白細(xì)胞為XX。根據(jù)胎兒細(xì)胞分離程序中所述的胎兒細(xì)胞分離說明書處理第3點中所述制備的血液樣品。在胎兒細(xì)胞分離過程的結(jié)尾，將膜從裝置上除去并以lmL4%多聚甲醛處理10分鐘，然后以lmlIXPBS洗滌膜4次。根據(jù)試劑盒"2ColorX&YProbePanel"，OnCellSystem，Catalog#ASXY的說明書手冊進(jìn)行FISH實驗。以允許明確地將XY與XX細(xì)胞區(qū)分開的熒光顯微鏡的合適的濾光片分析紅色和綠色信號。這些結(jié)果證明可以在膜上的分離的細(xì)胞上進(jìn)行多重FISH實驗。7.胎兒細(xì)胞分離的優(yōu)化參數(shù)的確定循環(huán)的稀有細(xì)胞的分離依賴于允許其通過比其直徑小的膜孔尺寸的白細(xì)胞粘彈性性質(zhì)。該性質(zhì)依賴兩個室間應(yīng)用的差異性壓強(qiáng)，以及溫度。8.檢測膜上分離的胎兒細(xì)胞用于遺傳分析可以通過針對由胎兒細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記和白細(xì)胞不表達(dá)的標(biāo)記的特異性抗體鑒定膜上分離的胎兒細(xì)胞?？梢杂糜阼b定滋養(yǎng)細(xì)胞的商售抗體在下表中列出抗體標(biāo)記Sigma抗細(xì)胞角蛋白18細(xì)胞角蛋白Sigma15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>或者，文獻(xiàn)中所述的針對特異性標(biāo)記的滋養(yǎng)細(xì)胞的其他抗體如下(PMID:PubMedIDentifier):<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>PAI-1(血纖維蛋白溶酶原激活抑制劑-1)停入件滋養(yǎng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記。PMID:2473276由于抑制血纖維蛋白溶酶原激活劑功能在調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解和細(xì)胞停入中起重要作用。PMID:12398812存在于絨毛合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞中并與絨毛膜絨毛表面上的纖維蛋白類類纖維蛋白聚焦共存?；搴吞ケP床外絨毛間質(zhì)性滋養(yǎng)細(xì)胞以及血管滋養(yǎng)細(xì)胞也是PAI-1陽性的。PAI-1將特異性絨毛外侵入性滋養(yǎng)細(xì)胞限定在母體蛻膜內(nèi)。PMID:11095924<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權(quán)利要求一種分離溶液中多種天然生物對象的方法，其中天然生物對象由至少一種天然較低粘彈性生物對象類型和天然較高粘彈性生物對象類型組成，并且天然較低粘彈性生物對象具有比天然較高粘彈性生物對象低的粘彈性性質(zhì)，其中天然較低粘彈性生物對象是下列至少一種循環(huán)胎兒細(xì)胞和腫瘤或癌細(xì)胞，該方法包括-溶液的過濾步驟，其中○膜是多孔的并且孔的直徑在天然較低粘彈性生物對象的直徑以下并且也在部分天然較高粘彈性生物對象的直徑以下，允許天然較高粘彈性生物對象通過膜同時保留天然較低粘彈性生物對象在膜以上，和○應(yīng)用控制性力量，將其保持在低于迫使天然較低粘彈性生物對象通過膜需要的預(yù)定力量，并高于或等于迫使天然較高粘彈性生物對象通過孔需要的預(yù)定力量，和-回收步驟，其中在膜以上或在膜上回收分離的天然較低粘彈性生物對象和/或在過濾液中回收分離的天然較高粘彈性生物對象。2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中控制性力量對應(yīng)于由20-190千帕斯卡的差異性壓強(qiáng)產(chǎn)生的力量，有利地為40-60千帕斯卡，更有利為45-55千帕斯卡，并且孔的平均直徑為3-15i！m，有利地為8-10i！m，因此允許在膜以上回收天然較低粘彈性生物對象。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中多種天然生物對象為至少兩種細(xì)胞類型。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中回收的細(xì)胞類型為活細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求3至4任一項所述的方法，其中含有細(xì)胞類型的溶液為由血液樣品離心步驟產(chǎn)生的單核細(xì)胞組分。6.根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項所述的方法，其中一種細(xì)胞類型是胎兒細(xì)胞類型。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中胎兒細(xì)胞為存在于母體血液中的胎兒細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其中在過濾步驟中，溫度為20-40°C。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中膜是聚碳酸酯膜。全文摘要本發(fā)明涉及一種分離溶液中具有不同粘彈性性質(zhì)的生物對象的方法，其中所述方法包括允許較高粘彈性生物對象通過膜同時保留較低粘彈性生物對象在膜以上的過濾步驟，和回收步驟，其中在膜以上或在膜上回收分離的較低粘彈性生物對象和/或在過濾液中回收分離的較高粘彈性生物對象。有利地，該生物對象是細(xì)胞。更有利地，回收的細(xì)胞為活細(xì)胞。在優(yōu)選的具體實施方式中，細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的具體實施方式中，細(xì)胞為胎兒細(xì)胞，并且該方法可應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。文檔編號C12N5/00GK101730738SQ200880020874公開日2010年6月9日申請日期2008年6月19日優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日發(fā)明者A·普雷斯塔,F·勒瓦,L·沙法爾,R·拉茨申請人:海若診斷公司;康能普視生物科技有限公司